CN114561486A - 一种用于功能标记检测水稻香味基因badh2的引物及试剂盒和方法 - Google Patents

一种用于功能标记检测水稻香味基因badh2的引物及试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于功能标记检测水稻香味基因badh2的引物及试剂盒和方法，四引物PCR扩增体系中，引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；所述badh2基因为水稻香味基因；所述Badh2基因为水稻非香基因。本发明针对badh2基因第七外显子突变类型的检测标记还存在操作复杂、成本高的缺点，为了能更快的、更有效的将香味基因badh2应用到水稻品质育种项目中，本发明提供了一种香味基因badh2的功能标记的开发方法，利用该方法设计的功能标记能提高badh2基因在分子标记辅助选择育种的准确性及降低检测费用。

Description

一种用于功能标记检测水稻香味基因badh2的引物及试剂盒 和方法
技术领域
本发明涉及一种检测水稻香味基因的引物，具体涉及一种用于功能标记检测水稻香味基因badh2的引物及试剂盒和方法。
背景技术
香稻因其浓郁的香味和口感极佳而受到许多消费者的喜爱。随着人民生活水平的提高，对香稻的需求量随之增加。香稻品种的培育利用传统育种方法具有效率低、准确性低、耗费高等劣势，分子标记辅助选择能很好的解决传统育种带来各种问题。
鉴于香味性状的重要性，香稻品种的培育与香味产生机制的研究受到许多育种专家的重视。前人对香米香味成分进行了大量研究，多数的研究结果表明，香米香味的主要成分是2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)。国内外学者对香稻香味性状的遗传学研究结果认为，8号染色体上编码甜菜碱醛脱氢酶2(Badh2)的基因与水稻香味直接相关。研究结果显示，香稻badh2的第7个外显子存在8个碱基的缺失和3个碱基的变异的多态性，产生无功能的BADH2蛋白，从而使BADH2酶的作用底物2-AP的代谢途径中断，香味物质2-AP不断积累，致使水稻的叶片和籽粒产生香味。为了更好的利用badh2，王丰等(一种水稻香味基因功能标记的开发，中国水稻科学，2008,22(4):347-352)基于badh2的第7个外显子存在8个碱基的缺失，开发出一个功能标记，对广东省农科院提供的16份香稻品种进行了检测；徐小龙等(24种香稻品种甜菜碱醛脱氢酶2基因突变位点的分析及分子标记开发；植物分类与资源学报；2011年06期)分别设计了检测badh2第7和第2外显子突变的功能性分子标记，对适宜上海周边种植的24份香稻品种进行了检测。
尽管badh2的功能位点已经确定，也有一些相应的功能标记报道，但前期开发功能标记还存在操作复杂，成本高等缺点。因此，开发简便易行、低成本、易于判断的badh2的功能标记将有极大促进香稻的分子标记辅助育种的进程。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于功能标记检测水稻香味基因badh2的引物及试剂盒和方法，该标记能够判断待检测水稻的香味基因及非香基因，能提高badh2基因在分子标记辅助选择育种的准确性。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于功能标记检测badh2和Badh2基因的引物对，四引物PCR扩增体系中，引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8所示；或，两引物PCR扩增体系中，引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，及SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5所示，及SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6所示；其中，所述badh2基因为水稻香味基因；所述Badh2基因为水稻非香基因。
在四引物的PCR扩增中体系中，加入分别与badh2与Badh2完全匹配的引物时，产生的区别badh2与Badh2的特异PCR片段较模糊，这主要原因可能在四引物扩增体系中，产生SEQ ID No.3+SEQ ID No.4组合的PCR产物-1，模板完全匹配引物SEQ ID No.6与下游引物SEQ ID No.4形成PCR产物-2，PCR产物-2其中一条链能以PCR产物-1为模板进行扩增，最终形成PCR产物-1大片段。
为避免上述这个情况，在本发明在核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示引物的5’端引入不匹配碱基，引入原则：引入2个以上碱基，至引入的碱基的前一个碱基非T(常规PCR产物3’端会产生一个游离的A，刚好与T配对)为止(参见图1)，如引物序列SEQ IDNo.8，引入AATA，AATA的前一个碱基为G；又如引物序列SEQ ID No.7，引入AATT，AATT的前一个碱基为G。在本发明中两引物中均引入了4个不匹配碱基，改良引物的核苷酸序列如SEQID No.7(Xian7IX-1R)、SEQ ID No.8(Xian7INF-1)所示。与模板5’端有4碱基不匹配的引物SEQ ID No.8引物与SEQ ID No.4引物形成的PCR产物-3的核苷酸序列与PCR产物-1的核苷酸序列在3’端存在连续5个碱基的不匹配，最终无法产物内扩增，提高了badh2基因的检测率与准确性。
本发明的另一目的是提供一种用于功能标记检测badh2和Badh2基因的试剂盒，该试剂盒中的引物为所述的用于功能标记检测badh2和Badh2基因的引物对。
本发明的另一目的是提供一种所述的用于功能标记检测badh2和Badh2基因的引物对的应用，该应用为以下任意一种：
(1)用于鉴定或筛选含有香味基因badh2或非香基因Badh2的水稻；
(2)用于分子标记辅助选择育种。
本发明的另一目的是提供一种用于功能标记检测badh2和Badh2基因的方法，该方法包含：利用核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的引物对待检测的水稻品种的基因组DNA进行PCR，根据结果判断：若有两条PCR产物且大小为441bp、204bp，则检测水稻中含有纯合香味基因badh2；若有两条PCR产物且大小为441bp、288bp，则检测水稻中含有纯合非香基因Badh2；若有三条PCR产物且大小为441bp、204bp、288bp，则检测水稻中含有杂合基因。或者，该方法包含：利用核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的引物对待检测的水稻品种的基因组DNA进行PCR，若扩增产物的大小为440bp，则PCR体系正常；再利用核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.5所示引物或如SEQID No.4、SEQ ID No.6所示引物对待检测的水稻品种的基因组DNA进行PCR，根据结果判断：若核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.5所示引物扩增的产物的大小为204bp，且核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示引物无扩增产物，则检测水稻中携有纯合香味基因badh2；若核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.5所示引物无扩增产物，且核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示引物扩增的产物的大小为288bp，则检测水稻中含有纯合非香基因Badh2；若核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.5所示引物扩增的产物的大小为204bp，且核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示引物扩增的产物的大小为288bp，则检测水稻中含有杂合基因。
本发明的另一目的是提供一种对非香水稻品种的改良方法，该方法包含：以含有香味badh2基因的水稻材料为父本，以待改良的纯合非香基因Badh2水稻为轮回母本进行杂交，利用SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8引物组成的PCR体系进行检测，从中选出有PCR产物且大小为441bp、204bp、288bp的植株为父本，与轮回亲本进行进一步杂交；待轮回后代农艺性状基本与轮回亲本一致后，再自交套袋收种，再用利用SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8引物体系对后代进行检测，从中选出有PCR产物且大小为441bp、204bp的植株，获得含有香味基因Badh2纯合植株。
本发明的用于功能标记检测水稻香味基因badh2的引物及试剂盒和方法，具有以下优点：
本发明针对badh2基因第七外显子突变类型，设计了SEQ ID No.3～8，在两引物扩增体系中，先通过SEQ ID No.3和SEQ ID No.4评估PCR体系是否正常，再通过SEQ ID No.3和SEQ ID No.5及SEQ ID No.4和SEQ ID No.6判断基因型；在四引物体系中，通过SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8的扩增结果进行判断，能够更快的、更有效的判断水稻的基因型。
本发明针对badh2基因第七外显子突变类型的检测标记，通过本发明的四引物体系能更快的、更有效的将香味基因badh2应用到水稻品质育种项目中，该标记能提高badh2基因在分子标记辅助选择育种的准确性及降低检测成本。
附图说明
图1为本发明功能标记引物设计示意图。
图2为本发明实施例1的功能标记PCR检测结果。
图3为本发明实施例1的四引物PCR扩增体系中PCR产物为引物扩增示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1水稻香味基因badh2功能标记的开发
1、功能标记引物设计及验证
根据水稻非香味基因Badh2(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)与香味基因badh2基因(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)的序列特点及在第七外显子区的8碱基差异，设计核苷酸序列如SEQ ID No.3(引物Xian7F)、SEQ ID No.4(引物Xian7R)所示的引物对，用于扩增区域包含badh2基因第七外显子的差异区(参见图1，图中，badh2为香味基因序列，Bahd2为无香味基因序列，数字142，218分别代表未显示的核苷酸的数目，各引物位置及序列均在图上标注)，是否为香稻均可扩增约440bp的条带，该扩增片段可作为内参对照，该片段的有无可以用于评估PCR体系是否正常(参见图2的A中的泳道1、2、3，图中A：引物Xian7F、Xian7R的PCR扩增结果；图中M：DNAMarker；泳道1：香与非香品种杂交F1代植株；泳道2：香味品种；泳道3：非香品种；泳道4：水(阴性对照))。
为了区别基因badh2与Badh2，分别设计核苷酸序列如SEQ ID No.5(Xian7IXR)、SEQ ID No.6(Xian7INF)的引物对，其中SEQ ID No.5所示的引物与香味基因badh2序列完全匹配(参见图1)，该引物与核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的引物进行对向扩增，形成204bp的badh2的特异性PCR条带(参见图2的B的泳道1、2，图中B：引物Xian7F、Xian7IXR的PCR扩增结果)。核苷酸序列如SEQ ID No.6的引物与非香基因Badh2序列匹配，可与核苷酸序列如SEQ ID No.4所示引物进行对向扩增，形成288bp的Badh2的特异性PCR条带(参见图2的C的泳道1、3，图中C：引物Xian7R、Xian7INF的PCR扩增结果)。为了在一个PCR反应体系中同时区分水稻植株中badh2与Badh2的纯合、杂合基因型，将上述序列如SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6的四引物置于一个PCR扩增中体系中，PCR结果显示，用于区别badh2与Badh2的特异PCR片段较模糊，可能会导致判断错误(参见图2的D的泳道1、2、3，图中D：引物Xian7F、Xian7R、Xian7IXR、Xian7INF组合的PCR扩增结果)。
非香味基因Badh2的第七外显子序列(SEQ ID No.1)：
AGTGACTGGATTAGGTTCTGAAGCCGGTGCTCCTTTGTCATCACACCCTGGTGTAGACAAGGTACAGCTATTCCTCCTGTAATCATGTATACCCCATCAATGGAAATGATATTCCTCTCAATACATGGTTTATGTTTTCTGTTAGGTTGCATTTACTGGGAGTTATGAAACTGGTAAAAAGATTATGGCTTCAGCTGCTCCTATGGTTAAGGTTTGTTTCCAAATTTCTGTGGATATTTTTTGTTCTCTTTCTACTAACTCTCTATTATCAATTCTCAATGTTGTCCTTTTCTTTTAACTCCTTTACTTTTTAGAATTGTGATCAAGACACTTTGAGCATCATTCTAGTAGCCAGTTCTATCCTGTTTCTTACCTTTTTATGGTTCGTCTTTTCTTGACAGCCTGTTTCACTGGAACTTGGTGGAAAAAGTCCTATAGTGGTGTTTGATG。
香味基因Badh2的第七外显子序列(SEQ ID No.2)：
AGTGACTGGATTAGGTTCTGAAGCCGGTGCTCCTTTGTCATCACACCCTGGTGTAGACAAGGTACAGCTATTCCTCCTGTAATCATGTATACCCCATCAATGGAAATGATATTCCTCTCAATACATGGTTTATGTTTTCTGTTAGGTTGCATTTACTGGGAGTTATGAAACTGGTATATATTTCAGCTGCTCCTATGGTTAAGGTTTGTTTCCAAATTTCTGTGGATATTTTTTGTTCTCTTTCTACTAACTCTCTATTATCAATTCTCAATGTTGTCCTTTTCTTTTAACTCCTTTACTTTTTAGAATTGTGATCAAGACACTTTGAGCATCATTCTAGTAGCCAGTTCTATCCTGTTTCTTACCTTTTTATGGTTCGTCTTTTCTTGACAGCCTGTTTCACTGGAACTTGGTGGAAAAAGTCCTATAGTGGTGTTTGATG。
引物Xian7F的核苷酸序列(SEQ ID No.3)为：
AGTGACTGGATTAGGTTCT；
引物Xian7R的核苷酸序列(SEQ ID No.4)为：
CATCAAACACCACTATAGGAC；
引物Xian7IXR的核苷酸序列(SEQ ID No.5)为：
CCATAGGAGCAGCTGAAATATA；
引物Xian7INF的核苷酸序列(SEQ ID No.6)为：
GAAACTGGTAAAAAGATTATGGC。
2、功能标记引物的优化及验证
在上述实验中发现：在四引物的PCR扩增中体系中，加入分别与badh2与Badh2完全匹配的引物时，产生的区别badh2与Badh2的特异PCR片段较模糊，这主要原因可能在四引物扩增体系中，产生Xian7F+Xian7R组合的PCR产物-1，模板完全匹配引物Xian7INF与下游引物Xian7R形成PCR产物-2，PCR产物-2其中一条链能以PCR产物-1为模板进行扩增，最终形成PCR产物-1大片段(参见图3)。
为避免上述这个情况，在本发明在核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示引物的5’端引入不匹配碱基，引入原则：引入2个以上碱基，至引入的碱基的前一个碱基非T(常规PCR产物3’端会产生一个游离的A，刚好与T配对)为止(参见图1)，如引物序列SEQ IDNo.8，引入AATA，AATA的前一个碱基为G；又如引物序列SEQ ID No.7，引入AATT，AATT的前一个碱基为G。在本发明中两引物中均引入了4个不匹配碱基，改良引物的核苷酸序列如SEQID No.7(Xian7IX-1R)、SEQ ID No.8(Xian7INF-1)所示。
引物Xian7IX-1R的核苷酸序列(SEQ ID No.7)为：
AATTCCATAGGAGCAGCTGAAATATA；
引物Xian7INF-1的核苷酸序列(SEQ ID No.8)为：
AATAGAAACTGGTAAAAAGATTATGGC。
利用改良引物替换核苷酸序列SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示引物，PCR结果显示序列SEQ ID No.3与SEQ ID No.7所示引物对、SEQ ID No.4与SEQ ID No.8所示引物对均能得到明亮的PCR条带(参见图2的E、F，图中E：引物Xian7F、Xian7IX-1R的PCR扩增结果；图中F：引物Xian7R、Xian7INF-1的PCR扩增结果)。在四引物置PCR扩增中体系中，加入改良的SEQID No.7、SEQ ID No.8引物，均可产生明晰的badh2或Badh2的特异性条带(参见图2的G，图中G：引物Xian7F、Xian7R、Xian7IX-1R、Xian7INF-1组合的PCR扩增结果)，提高了badh2基因的检测率与准确性。
如图3所示，为本发明实施例1的四引物PCR扩增体系中PCR产物为引物扩增示意图(各引物位置及序列均在图上标注，5’、3’为DNA序列方向)，PCR产物-1为核苷酸序列如SEQID No.3、SEQ ID No.4所示引物PCR扩增；PCR产物-2为核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6所示引物PCR扩增；PCR产物-3为核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.8所示引物PCR扩增。与模板完全匹配的SEQ ID No.6引物与SEQ ID No.4引物形成的PCR产物-2的核苷酸序列能以PCR产物-1的核苷酸序列为模板进行扩增，最终形成PCR产物-1大片段。与模板5’端有4碱基不匹配的引物SEQ ID No.8引物与SEQ ID No.4引物形成的PCR产物-3的核苷酸序列与PCR产物-1的核苷酸序列在3’端存在连续5个碱基的不匹配，最终无法产物内扩增。
实施例2适合水稻香味基因badh2功能标记的应用
首先，提取待改良水稻亲本材料的总DNA，利用核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示四引物组成的PCR体系进行检测，从而明确各亲本材料是否携有香味基因badh2：
(1)若待检测样品中能扩增441bp、204bp的PCR片段，则表明待改良水稻材料中携有纯合香味基因badh2；
(2)若检测材料中能扩增441bp、288bp的PCR片段，则表明待改良水稻材料中为非香味基因Badh2纯合；
(3)若检测样品中能扩增441bp、204bp、288bp的PCR片段，则表明检测样品为Badh2与badh2杂合基因型。
其次，以含有纯合香味基因badh2的水稻材料为父本，以待改良的纯合非香基因Badh2水稻为轮回母本进行杂交，得到F1杂交植株，利用核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示四引物组成的PCR体系进行检测，从中选出有PCR产物且大小为441bp、204bp、288bp的杂合植株为父本，与轮回亲本进行进一步杂交；待轮回后代农艺性状基本与轮回亲本一致后，再自交套袋收种，再用利用SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8引物体系对后代进行检测，从中选出有PCR产物且大小为441bp、204bp的植株，即为香味基因Badh2的纯合植株。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序 列 表
<110> 海南大学三亚南繁研究院
<120> 一种用于功能标记检测水稻香味基因badh2的引物及试剂盒和方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<400> 8
aatagaaact ggtaaaaaga ttatggc 27

Claims (5)

1.一种用于功能标记检测badh2和Badh2基因的引物对，其特征在于，四引物PCR扩增体系中，引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；或，
两引物PCR扩增体系中，引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，及SEQID NO.3、SEQ ID NO.5所示，及SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6所示；
其中，所述badh2基因为水稻香味基因；所述Badh2基因为水稻非香基因。
2.一种用于功能标记检测badh2和Badh2基因的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中的引物为如权利要求1所述的用于功能标记检测badh2和Badh2基因的引物对。
3.一种如权利要求1所述的用于功能标记检测badh2和Badh2基因的引物对的应用，其特征在于，该应用为以下任意一种：
(1)用于鉴定或筛选含有香味基因badh2或非香基因Badh2的水稻；
(2)用于分子标记辅助选择育种。
4.一种用于功能标记检测badh2和Badh2基因的方法，其特征在于，该方法包含：
利用核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的引物对待检测的水稻品种的基因组DNA进行PCR，根据结果判断：
若有两条PCR产物且大小为441bp、204bp，则检测水稻中含有纯合香味基因badh2；
若有两条PCR产物且大小为441bp、288bp，则检测水稻中含有纯合非香基因Badh2；
若有三条PCR产物且大小为441bp、204bp、288bp，则检测水稻中含有杂合基因；
或，该方法包含：
利用核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的引物对待检测的水稻品种的基因组DNA进行PCR，若扩增产物的大小为440bp，则PCR体系正常；
再利用核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.5所示引物或如SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6所示引物对待检测的水稻品种的基因组DNA进行PCR，根据结果判断：
若核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.5所示引物扩增的产物的大小为204bp，且核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示引物无扩增产物，则检测水稻中携有纯合香味基因badh2；
若核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.5所示引物无扩增产物，且核苷酸序列如SEQID No.4、SEQ ID No.6所示引物扩增的产物的大小为288bp，则检测水稻中含有纯合非香基因Badh2；
若核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.5所示引物扩增的产物的大小为204bp，且核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示引物扩增的产物的大小为288bp，则检测水稻中含有杂合基因。
5.一种对非香水稻品种的改良方法，其特征在于，该方法包含：
以含有香味badh2基因的水稻材料为父本，以待改良的纯合非香基因Badh2水稻为轮回母本进行杂交，利用SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8引物组成的PCR体系进行检测，从中选出有PCR产物且大小为441bp、204bp、288bp的植株为父本，与轮回亲本进行进一步杂交；
待轮回后代农艺性状基本与轮回亲本一致后，再自交套袋收种，再用利用SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8引物体系对后代进行检测，从中选出有PCR产物且大小为441bp、204bp的植株，获得含有香味基因Badh2纯合植株。
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