CN116479038B

CN116479038B - 一种获得非转基因香味增加藜麦的方法

Info

Publication number: CN116479038B
Application number: CN202310695459.7A
Authority: CN
Inventors: 张康; 冉毅东; 高崑; 张立肖; 徐虎
Original assignee: Beijing Qiheshengke Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Qiheshengke Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-06-13
Filing date: 2023-06-13
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2043-06-13
Also published as: CN117481033A; CN116479038A

Abstract

本发明提供了一种获得具有香味增加性状的藜属植物的方法，具体地，本发明提供了减少表达CqBADH2基因的用途。本发明首次发现，通过抑制或减少藜属植物CqBADH2基因的表达，可以显著提高藜属植物的香味。另外，本发明首次实现了藜麦中利用基因编辑技术同时精确编辑多个基因或等位基因，并完成了的稳定递送，为藜麦的靶向分子育种提供了良好的平台。

Description

一种获得非转基因香味增加藜麦的方法

技术领域

本发明属于生物技术育种领域，涉及一种获得香味增加藜麦的方法，特别涉及一种利用基因组编辑技术定点突变主栽藜麦甜菜碱醛脱氢酶的CqBADH2.1、CqBADH2.2基因，获得藜麦增香的育种材料的方法。

背景技术

藜麦（Chenopodium quinoa）是一种拥有7000年历史的古老作物，原产于安第斯山脉，兴盛于印加文明，是一种耐寒耐旱的、能够适应于不能纬度和海拔的植物。其藜麦种子中的蛋白质含量高达14%，其中48%的氨基酸为人体必需氨基酸。联合国粮农组织（FAO）认为藜麦是唯一一种能够满足人体基本营养需求的单体植物。被誉为人类完美的“全营养品”、人类移民太空的“理想粮食”。

藜麦是异源四倍体，由祖先二倍体A基因组（C. pallidicaule）和B基因组（C.suecicum）杂交而成，其基因组的复杂性导致目前还没有成功建立起高效的离体再生体系和遗传转化体系，使得分子育种进程受阻。Fayza Ruzayq AI Gethami等人建立了以藜麦子叶节为起始外植体的再生体系(Fayza Ruzayq AI Gethami and Hameda EI Sayed AhmedEI Sayed. In Vitro:Influence of Various Concentrations of Plant GrowthRegulators (BAP&NAA)and Sucrose on Regeneration of Chenopodium quinoa WilldPlant. Journal of Advance in Biology& Biotechnology (2020))。王燕芳等人建立了藜麦发根农杆菌和原位转化藜麦叶片的方法(Yanfang Wang et al., The Establishmentof Two Efficient Transformation Systems in Quinoa. Research Square. 2021)，但没有获得稳定的再生植株。

本文是首次在藜属植物藜麦中利用CRISPR/Cas9技术同时精确编辑多个基因或等位基因，完成了的稳定递送，为藜麦的靶向分子育种提供了良好的平台。在本发明的遗传转化体系的基础上，获得了敲除CqBADH2.1、CqBADH2.2的突变体植株，该突变体植株具有香味增加的表型。而在本研究出现之前，仅在二倍体玉米、大豆、水稻中实现该基因的编辑。本研究的出现，填补了在藜麦作物研究上的空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种获得具有香味增加的藜属植物的方法，特别是提供一种或的具有香味增加的藜麦的方法，并解决了获得稳定的再生藜麦的技术问题。

本发明的第一目的是提供一种获得具有香味增加的藜属植物的方法，其中所述方法包括靶向基因组修饰，与缺乏所述靶向基因组修饰的藜属植物相比，所述靶向基因组修饰赋予藜属植物CqBADH2基因的减少表达。

优选的，所述藜属植物为藜麦。

优选的，所述CqBADH2基因包括具有SEQ No.1中所示的序列或其功能变体的CqBADH2.1、具有如SEQ No.4中所示的序列或其功能变体的CqBADH2.2。

优选的，所述功能变体与其相应的CqBADH2核苷酸序列具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%的序列同一性。

进一步优选的，所述CqBADH2.1和CqBADH2.2同时减少表达。

在一个实施方式中，所述靶向基因组修饰为插入、缺失或取代。

在一个实施方式中，所述基因组修饰的方法包括基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、基因编辑技术、导入基因/蛋白的抑制剂或其任意组合。

在一个实施方式中，所述基因编辑技术包括CRISPR/Cas、TALEN、ZFN、大范围核酸酶或其任意组合。

在一个实施方式中，所述靶向基因组修饰的靶位点包含5’-ggctccaattgcccttccta-3’ (SEQ No.9)的核苷酸序列或其互补序列。

优选的，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas技术；其中所述CRISPR/Cas技术中Cas效应蛋白选自Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e (或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cast10d、Cas12、Cas13、Cas14、CasX、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1 (或CasA)、Cse2 (或CasB)、Cse3 (或CasE)、Cse4 (或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cpf1、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966及其任何组合。

在一个实施方式中，所述方法包括如下步骤：在藜属植物中引入Cas效应蛋白以及靶向CqBADH2基因靶位点的sgRNA；筛选具有靶向基因组修饰的植物。

优选的，所述基因组修饰是由在藜属植物中引入包含以下的构建体产生：（a）Cas效应蛋白DNA，和选自SEQ No.16或SEQ No.17或二者组合的sgRNA序列；或（b）包含Cas效应蛋白和选自SEQ No.16或SEQ No.17或二者组合的sgRNA序列的核糖核蛋白（RNP）复合物。

进一步优选的，所述构建体使用以下方法引入植物细胞内：农杆菌介导递送、基因枪递送、聚乙二醇介导递送、病毒介导递送、纳米颗粒借调递送或通过嫁接的DNA递送。

进一步优选的，所述方法包括使具有靶向基因组修饰的植物再生的步骤。

在一个实施方式中，所述再生步骤包括将植物材料接种于不定芽诱导培养基。

优选的，所述不定芽诱导培养基包括基础盐培养基和激素成分。

进一步优选的，所述激素成分含有2-3 mg/L反式玉米素核苷（tZT）、0.5mg/L 三碘苯甲酸（TIBA）、0.5-1mg/L 萘乙酸（NAA）。

进一步优选的，所述激素成分含有2 mg/L 反式玉米素核苷（tZT）、0.5mg/L 三碘苯甲酸（TIBA）、0.5mg/L 萘乙酸（NAA）。

本发明的第二目的是提供一种sgRNA的分离的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自SEQ No.16或SEQ No.17。

在一个实施方式中，所述核苷酸序列用于藜属植物CqBADH2基因靶向基因组修饰的用途。

本发明的第三目的是提供一种引物对的分离的核苷酸序列，其中所述引物对的核苷酸序列与选自SEQ No.28和SEQ No.29的核苷酸序列具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%的序列同一性。

在一个实施方式中，所述核苷酸序列作为引物对用于鉴定或筛选具有香味增加性状的藜属植物的用途，所述藜属植物的基因组内含有CqBADH2.1和CqBADH2.2的减少表达。

在一个实施方式中，提供一种用于确定藜属植物中存在或不存在CqBADH2基因组靶向修饰的检测试剂盒，其中所述试剂盒含有所述的引物。

本发明的第四目的是提供一种用于促进藜属植物愈伤组织诱导和分化的不定芽培养基。

进一步优选的，所述激素成分含有2-3 mg/L 反式玉米素核苷（tZT）、0.5mg/L 三碘苯甲酸（TIBA）、0.5-1mg/L 萘乙酸（NAA）。

本发明的第五目的是提供一种用于促进藜属植物材料诱导和分化的方法。

在一个实施方式中，将藜属植物材料接种于所述不定芽培养基。

本发明的主要优点在于：

（1）本发明首次发现，通过抑制或减少藜属植物藜麦CqBADH2基因的表达，可以显著提高其香味。

（2）本发明首次实现了藜麦中利用基因编辑技术同时精确编辑多个基因或等位基因，完成了的稳定递送，为藜麦的靶向分子育种提供了良好的平台。

附图说明

图1.藜麦发根农杆菌介导的瞬时转化状态图；图1的A左上对应CqBADH2-g1，右上对应CqBADH2-g2，左下对应CqBADH2-g3，右下对应CqBADH2-g4，在24℃±1℃黑暗培养72h状态图；图1的B自左至右依次对应CqBADH2-g1、CqBADH2-g2、CqBADH2-g3、CqBADH2-g4共培养后放在CQ3培养基上的状态图；图1的C自左至右依次对应CqBADH2-g1、CqBADH2-g2、CqBADH2-g3、CqBADH2-g4，放在CQ3培养基上14天后的状态图。

图2. CqBADH2-g1、CqBADH2-g2、CqBADH2-g3、CqBADH2-g4、CqBADH2-g5酶切结果图。

图3.根癌农杆菌转化培养状态图。

图4. CqBADH2-g3转化植株酶切图，其中138株植株分别在图4A-C中条带自左至右、自上而下依次编号。

图5. 突变体QE12和QE28的测序图。

图6. Cqbadh2纯合突变体成熟籽粒（T2代）中2-AP含量测定。

图7. 不同基础盐对发根农杆菌转化效率的影响。

具体实施方式

通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本发明的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明作出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。

实施例1、藜麦CqBADH2.1基因的获取及sgRNA的设计

利用BLAST网站，获取藜麦CqBADH2.1(SEQ No. 1)、CqBADH2.2(SEQ No. 4)基因序列、CDS序列（SEQ No. 2、5）及氨基酸序列（SEQ No. 3、6）。详情如下。在CqBADH2.1和CqBADH2.2基因同源区段设计sgRNA。根据网站http://crispor.tefor.net/crispor.py，设计靶点如下：

表1：CqBADH2.1和CqBADH2.2基因同源区段的靶位点设计

注：下划线的序列表示PAM序列

实施例2、靶点的选择并构建敲除载体

一、载体构建

1、根据CqBADH2.1和CqBADH2.2基因同源区段的靶点，合成相应的靶点引物，引物序列如下：

表2：靶点引物序列设计

注：大写字母表示引物序列，小写字母的序列表示粘性末端。

2、链接载体

第一步，将pKSE401载体用BsaI酶切，条带大小15429bp+ 1225bp，胶回收骨架部分即1529bp大小条带。酶切体系为：质粒4 ng、BsaI 2.5 μL、Buffer 5 μL、其余由H₂O补足50μL体系。

第二步，将CqBADH2-g1、CqBADH2-g2、CqBADH2-g3、CqBADH2-g4、CqBADH2-g5靶点引物分别退火成双链DNA后与pKSE401载体（BsaI酶切后）通过T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，分别命名pKSE401-CqBADH2-g1、pKSE401-CqBADH2-g2、pKSE401-CqBADH2-g3、pKSE401-CqBADH2-g4、pKSE401-CqBADH2-g5。退火体系为：上游引物1 μL、下游引物1 μL、其余由1×Easy Taq Buffer 补足10 μL体系。退火程序为：94 ℃变性5 min，然后90℃-80℃进行梯度循环，在90℃变性1 min，80℃延伸1 min，共8个循环，每个循环降低1℃，4℃保存。连续体系为：退火产物1 μL、pKSE401 1μL、T4 DNA ligase 0.5 μL、T4 DNAligase Buffer 1 μL、H₂O 6.5 μL。

培养1 d后，对第二天长出的单斑进行菌落PCR验证，PCR引物如下：

表3：验证引物设计

菌落PCR鉴定阳性的单斑进行测序，选取测序正确的单斑，提取质粒，用于后续实验。

二、靶点的选择

1、发根农杆菌介导的瞬时转化体系

将构建好的pKSE401-CqBADH2-g1、pKSE401-CqBADH2-g2、pKSE401-CqBADH2-g3、pKSE401-CqBADH2-g4、pKSE401-CqBADH2-g5五个载体分别导入发根农杆菌K599（菌株抗性为Kan）中，划线接种于LB固体培养基（10 g/L蛋白胨+ 5 g/L酵母粉+ 5 g/L氯化钠+ 15 g/L琼脂+ 25 mg/L利福平+ 50 mg/L卡那霉素，pH 7.0）上，28℃恒温箱过夜培养。挑取单菌落接种于LB液体培养基（LB固体培养基不加琼脂）中，28℃，220 rpm振荡培养过夜。第二天于18℃，3500rpm离心15min，弃上清液，用培养液CQ1（1.6g/L B5培养基（荷兰Duchefa G0210）+ 0.5g/L吗啉乙磺酸+ 0.1g/L谷氨酰胺+ 0.1g/L天冬酰胺+ 20g/L蔗糖+ 200μM乙酰丁香酮）重新悬浮。利用Eppendorf BioPhotometer plus仪器测定菌液浓度。首先选取OD₆₀₀档位，在比色皿中加入500 μL CQ1液体校对归零，而后到处液体并用蒸馏水冲洗比色皿内部，控干。加入加入500 μL重悬菌液，测定OD₆₀₀值，通过CQ1液体调整，直至OD₆₀₀= 0.5± 0.05。

以主栽藜麦品种的种子消毒（用75%酒精浸泡30s，然后用无菌水冲洗1次，接着用有效氯含量5%的NaClO溶液浸泡30-40 min，期间不断轻轻摇动，然后用无菌水冲洗5次。）后置于发芽培养基CQ0（MS含维生素基础盐（美国Phytotech M519）+ 30g/L 蔗糖+ 8g/L琼脂）上10天的幼苗为外植体，切除1/2下胚轴和胚根。放入菌液，在真空抽气泵中抽气10min。而后置于200 rpm的摇床上侵染20 min。在无菌环境下，弃液体并用无菌滤纸吸干多余菌液，转化后的外植体摆放在铺放一层滤纸的共培养基CQ2（1.6g/L B5培养基+ 0.5g/L吗啉乙磺酸+ 0.1g/L谷氨酰胺+ 0.1g/L天冬酰胺+ 20g/L蔗糖+ 200μM乙酰丁香酮+ 8g/L琼脂）上，24℃±1℃黑暗培养72h。共培养后将外植体转移至毛状根诱导培养基CQ3（MS含维他命基础盐+ 0.5g/L吗啉乙磺酸+ 0.1g/L谷氨酰胺+ 0.1g/L天冬酰胺+20g/L蔗糖+ 8g/L琼脂+400mg/L特美汀）上。25℃±2℃黑暗培养14天。不同阶段的培养状态如图1所示。

2、靶点选择鉴定体系

分别从导入CqBADH2-g1、CqBADH2-g2、CqBADH2-g3、CqBADH2-g4、CqBADH2-g5靶点修饰的样本中各取100根根毛，提取基因组DNA。以该DNA为模板，进行PCR/RE（PolymeraseChain Reaction/Restriction digestion）实验分析。PCR/RE分析方法参考了文献Shan Q.et al. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium usingTALENs. Molecular Plant (2013)，其中，PCR扩增所用引物为：

表4：PCR/RE扩增引物

PCR/RE的酶切图显示，只有CqBADH2-g3的酶切图发生突变。如图2所示，箭头指示发生突变的目的条带。结果表明，只有CqBADH2-g3靶点引物能够同时敲除CqBADH2.1和CqBADH2.2，并且具有敲除活性。

实施例3、利用根癌农杆菌法转化pKSE401-CqBADH2-g3载体

下一步，将构建好的pKSE401-CqBADH2-g3载体导入根癌农杆菌GV3101（菌株抗性为Kan）中，同实施例2一样进行摇菌。用悬浮培养液CQ4（25mL/L YR大量20×母液+ 5mL/LYR微量100×母液+ 5mL/L YR铁盐100×母液+ 1mL/L YR维生素1000×母液 + 0.5g/L吗啉乙磺酸+ 2.5mg/L五水硫酸铜+ 20g/L麦芽糖+ 2mg/L反式玉米素核苷+ 0.5mg/L三碘苯甲酸+ 0.5mg/L萘乙酸+ 200μM乙酰丁香酮）重悬。利用Eppendorf BioPhotometer plus仪器测定菌液浓度。首先选取OD₆₀₀档位，在比色皿中加入500 μL CQ1液体校对归零，而后到处液体并用蒸馏水冲洗比色皿内部，控干。加入加入500 μL重悬菌液，测定OD₆₀₀值，通过CQ1液体调整，直至OD₆₀₀= 0.8± 0.05。其中特殊培养基母液配置如下表所示，无机药品均采购自生工生物工程（上海）股份有限公司：

表5. YR大量20×母液配制

表6. YR微量100×母液配制

表7. YR维生素1000×母液配制（过滤灭菌，分装，-20℃冰箱中保存）

表8. YR铁盐100×母液配制

本实施例以主栽藜麦品种彩藜为例，将彩藜的种子消毒（同实施例2）后置于发芽培养基CQ0（MS培养基基盐（含维生素）+ 30g/L蔗糖+ 8g/L琼脂）上7天的幼苗（实生芽开始萌发之际），横向切除下胚轴、胚根及子叶，留取子叶3mm，下胚轴2mm，形成“W”形状，并纵向批切生长点0.5mm（图3A）。放入菌液，在真空抽气泵中抽气15 inHg维持10min。而后置于200rpm的摇床上侵染3h。在无菌环境下，弃液体并用无菌滤纸吸干多余菌液，转化后的外植体摆放在共培养基CQ5（25mL/L YR大量20×倍母液+ 5mL/L YR微量100×母液+ 5mL/L YR铁盐100×母液+ 1mL/L YR维生素1000×母液+ 0.5g/L吗啉乙磺酸+ 2.5mg/L五水硫酸铜+20g/L麦芽糖+ 2mg/L反式玉米素核苷+ 0.5mg/L三碘苯甲酸+ 0.5mg/L萘乙酸+ 200uM乙酰丁香酮+ 8g/L琼脂糖）上，24℃±1℃黑暗培养72h，图3B。共培养后将外植体转移至丛生芽诱导培养基CQ6（50mL/L YR大量20×母液+ 10mL/L YR微量100×母液+ 10mL/L YR铁盐100×母液+ 1mL/L YR维生素1000×母液+ 0.5g/L吗啉乙磺酸+ 2.5mg/L五水硫酸铜+ 20g/L麦芽糖+ 2mg/L反式玉米素核苷+ 0.5mg/L三碘苯甲酸+ 0.5mg/L萘乙酸+ 7g/L聚乙烯吡咯烷酮+ 9g/L琼脂+ 400mg/L特美汀）上。24℃±1℃光照培养4- 6周，光照强度4000- 6000lx，光照16 h/d（图3C）。将获得的不定芽，分割后转入不定芽伸长诱导培养基CQ7（50mL/LYR大量20×母液+ 10mL/L YR微量100×母液+ 10mL/L YR铁盐100×母液+ 1mL/L YR维生素1000×母液+ 0.5g/L吗啉乙磺酸+ 2.5mg/L五水硫酸铜+ 20g/L麦芽糖+ 0.1mg/L苄氨基嘌呤+ 0.01mg/L萘乙酸+ 1g/L活性炭+ 8g/L琼脂+ 300mg/L特美汀）上。24℃±1℃光照培养2-4周，光照强度4000- 6000lx，光照16h/d，得到伸长不定芽（图3D-1）。将获得的伸长不定芽截取下来，转接到生根培养基CQ8（MS含维生素基础盐+ 0.5g/L吗啉乙磺酸+ 0.1g/L谷氨酰胺+ 0.1g/L天冬酰胺+ 20g/L蔗糖+ 0.5mg/L吲哚丁酸（生工生物工程（上海）股份有限公司A600725）+ 8g/L琼脂+ 200mg/L特美汀）上。24℃±1℃光照培养2周，光照强度4000-6000 lx，光照16 h/d，得到转化植株。

另外，我们使用相同转化方法在藜麦品种青藜2号中进行转化，同样得到了转化植株。青藜2号培养得到的伸长不定芽如图3D-2所示。本实施例表明本发明的转化条件具有普适性。

实施例4、突变体检测

分别取实施例3中彩藜CqBADH2-g3的转化植株，提取基因组DNA。以该DNA为模板，进行PCR/RE实验分析（分析方法同实施例2）。取样138株（图4A-C中条带自左至右、自上而下依次编号），其中检测到4株突变体，分别是第3、第7、第12、第28个条带（图4A），对应样品编号为QE3、QE7、QE12、QE28。

利用引物M13F和gRNA-sc-R（如实施例2）进行PCR检测发现其中2株为阴性，分别是QE12、QE28。利用引物D-CqBADH2-F3和D-CqBADH2-R3对QE12和QE28进行扩增，并对扩增产物进行测序，测序结果如图5所示，其中加框碱基表示突变。

测序结果表明：本实施例的突变体QE12和QE28为Cqbadh2.1和Cqbadh2.2的双突突变体，其中QE12为Cqbadh2.1纯合突变，基因型为-1bp，Cqbadh2.2杂合突变，基因型为-2bp；QE28为Cqbadh2.1纯合突变，基因型为+1bp，Cqbadh2.2纯合突变，基因型为+1bp/-1bp。

实施例5：2-AP含量检测

2-乙酰-1-吡咯啉（简称2-AP）是谷物产生香味的重要挥发物，甜菜碱醛脱氢酶（BADH2）的不同突变类型均可以导致这种挥发物积累，从而产生香味。我们利用GC-MS代谢组学技术，对Cqbadh2.1、 Cqbadh2.2双突变体成熟籽粒（T2代）中2-AP进行定量分析，含量测定结果如图6所示。结果表明，两个Cqbadh2双突变体（QE12、QE28）与野生型相比的2-AP含量显著增加，即Cqbadh2双突变体可以产生香味增加的性状。

实施例6：藜麦发根培养基筛选

依据实施例2中，发根农杆菌介导的瞬时转化体系。我们将CQ1和CQ2中的1.6g/LB5培养基（1/2 B5）分别调整为3.2g/L B5培养基（B5）、2.2g/L MS培养基（1/2 MS）和4.4g/LMS培养基（MS），其余条件保持不变，利用CqBADH2-g3的发根农杆菌在青藜2号中进行发根试验，并进行相应PCR检测。结果如图7所示。

PCR结果表明，与其他三种培养基相比，用1.6g/L B5（1/2 B5）侵染和共培养后，诱导的藜麦毛根转化效率最高，达到了52.5%。

实施例7：藜麦丛生芽诱导培养基筛选

选取青藜2号的种子，按照实施例2中记载方法对种子进行消毒，CQ0上发芽7天后，切取外植体，分别接种于不同的不定芽诱导培养基上，每个处理放30个外植体，重复3次。向YR盐（50mL/L YR大量20×母液+ 10mL/L YR微量100×母液+ 10mL/L YR铁盐100×母液+1mL/L YR维生素1000×母液）基础培养基中添加不同浓度的反式玉米素核苷（tZT）、三碘苯甲酸（TIBA）、萘乙酸（NAA）、苄氨基嘌呤（BA）等常见植物激素进行不同浓度的组合，旨在获得高效诱导芽的激素配比，如下表9。每隔2周转接一次，5周后统计不定芽诱导率。

表9：不同激素组合对不定芽的影响

结果表明，20种组合对藜麦不定芽的诱导有一定影响。随着tZT浓度的增加，不定芽发生率逐步上升，在一定范围内提高tZT的浓度能在一定程度上提高不定芽芽发生率；但过高浓度的tZT会降低不定芽芽发生率，使之持续愈伤化；当ZT浓度为2 mg/L时外植体愈伤诱导率为98.64％，形成不定芽发生率平均接近94.50％，植株保持有较好的整齐性和稳定性；当tZT浓度达到3 mg/L及以上时，愈伤组织增多，分化成不定芽数量降低。综上，tZT最适浓度范围为2-3 mg/L，NAA最适浓度范围为0.5-1 mg/L。TIBA添加后，能够中和tZT导致的玻璃化现象，并且使不定芽能够更好地刺激后分裂，最适浓度范围为0.5mg/L。所以，2 mg/LtZT+ 0.5 mg/L NAA+ 0.5 mg/L TIBA为不定芽诱导培养的最佳激素组合配方。另一方面，我们与现有技术文献发现与现有技术文献（朱木兰等，一种藜麦子叶节离体再生方法，CN202110221582.6 [P]. 首次公开日2021-06-25）报道的不定芽诱导情况进行对比。使用该现有技术文献中的不定芽诱导培养基（MS盐+ 1 mg/L BA+ 0.1 mg/L NAA）代替本实施例的不定芽诱导培养基，其余处理方法和材料同本实施例，统计得到不定芽培养诱导率为23.46±3.78%，远低于本发明tZT、NAA、TIBA的诱导效率。由此可见，本发明还提出了一种具有高诱导效率的激素组合。

Claims

1.一种获得具有香味增加的藜属植物的方法，所述方法为对CqBADH2核苷酸序列的靶位点进行靶向基因组修饰，所述靶向基因组修饰赋予藜属植物CqBADH2基因的减少表达，所述靶位点为SEQ No.9所示的核苷酸序列或其互补序列，其中所述CqBADH2的等位基因包括具有SEQ No.1中所示的序列的CqBADH2.1、具有如SEQ No.4中所示的序列的CqBADH2.2；所述CqBADH2.1和CqBADH2.2同时减少表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶向基因组修饰为插入、缺失或取代。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基因组修饰所采用的技术为CRISPR/Cas技术。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因组修饰所采用的技术为CRISPR/Cas技术；其中所述CRISPR/Cas技术中Cas效应蛋白选自Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cast10d、Cas12、Cas13、Cas14、CasX、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Cse3、Cse4、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cpf1、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966及其任何组合。

5.根据权利要求3所述的方法，其包括如下步骤：

在藜属植物中引入Cas效应蛋白以及靶向CqBADH2基因靶位点的sgRNA；筛选具有靶向基因组修饰的植物。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因组修饰是由在藜属植物中引入包含以下的构建体产生：（a）Cas效应蛋白DNA，和选自SEQ No.16或SEQ No.17或二者组合的sgRNA序列；或（b）包含Cas效应蛋白和选自SEQ No.16或SEQ No.17或二者组合的sgRNA序列的核糖核蛋白复合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述构建体使用以下方法引入植物细胞内：农杆菌介导递送、基因枪递送、聚乙二醇介导递送、病毒介导递送、纳米颗粒介导递送或通过嫁接的DNA递送。

8.根据权利要求5所述的方法，其中进一步包括使具有靶向基因组修饰的植物再生的步骤，所述再生步骤包括将植物材料接种于不定芽诱导培养基。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述不定芽诱导培养基包括基础盐培养基和激素成分；所述激素成分含有2-3mg/L反式玉米素核苷、0.5mg/L三碘苯甲酸、0.5-1mg/L萘乙酸。