CN105543228A - 一种快速将水稻转化为香稻的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速将水稻转化为香稻的方法。是利用CRISPR/Case技术，利用水稻香味代谢过程中相关基因序列，在其特定的位点设计载体，通过农杆菌转化将此元件转到非香的水稻中，将此基因在定点的位置造成缺失突变，使此基因沉默，造成香味物质不能正常代谢而大量积累，由普通水稻成为香稻，再通过自交或杂交将遗传转化基因片段与被剪辑的基因分离，在不影响水稻的其它基因结构和性状，快速得到纯合可以稳定遗传的香稻。

Description

一种快速将水稻转化为香稻的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体涉及通过基因工程技术培育香稻植株的方法。
背景技术
水稻是世界最重要的粮食作物之一，世界多数人口都以水稻作为主食。随着人们生活水平的提高以及健康意识的不断增强，营养丰富、品质优良的功能型稻米越来越受到人们的青睐。
香稻以其气味芳香而得名,香稻的香味可存在于水稻植株除根部外的茎、叶、花、稻米中。香米不仅在蒸煮后溢出芳香扑鼻的香气,而且营养品质优良,富含各种氨基酸和蛋白质,在国际市场上优质香米的售价是普通稻米的2～3倍,在国际稻米贸易中占有重要的地位
研究表明，香稻含有多种挥发性化合物，而直接与水稻香味相关的挥发性物质为2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2AP)。由于甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2功能的缺失会导致2AP前体物质的增加，从而积累2AP使稻米产生香味。自Bradbury等首先发现水稻第8染色体Badh2基因第7外显子8bp缺失及3bp突变产生无功能蛋白导致水稻香味以来，该基因序列已经有13处位点的变异被相继报道。因此只要对甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2缺失或突变就可以提高水稻的香味。
CRISPR/Cas(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)是最新出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。CRISPR/Cas是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点切断双链DNA。在基因组编辑过程中，tracrRNA和crRNA可以融合成为1条RNA(sgRNA)表达同样可以起到靶向剪切的作用。CRISPR/Cas9的优点是操作简单，对基因组的效率高。需要对某一个靶位点编辑的时候，只需要表达相应的sgRNA即可，不需要对Cas9核酸酶进行改造。它可对任何物种的基因组进行高效率的定向编辑。
常规选育香稻是通过与香稻杂交或回交选育，周期长还将不利基因带入，利用CRISPR/Cas9技术，选择Badh2基因的目标靶位点，构建gRNA靶点质粒，并导入到目标水稻的基因组中对目标靶点剪辑，将Badh2基因沉默，积累2AP使稻米产生香味。再通过自交或杂交将遗传转化的元件与剪辑后的基因分离得到纯合的可以稳定遗传的香稻。
发明内容
利用CRISPR/Cas技术，根据水稻香味代谢过程中相关基因序列，筛选出该基因靶点位置，以靶点基因序列为基础构建gRNA靶点质粒，并导入到目标水稻的基因组中对目标靶点剪辑将其沉默，使香味相关物质不能代谢或分解，造成香味物质大量积累，使稻米产生香味，再通过自交或杂交将遗传转化的元件与剪辑的基因分离，在不影响水稻的其它基因结构和性状，快速得到纯合的可以稳定遗传的香稻。其中，本发明所述基因的概念是指包括基因的5’端非编码区、外显子、内含子和3’端非编码区。
首先，香味代谢相关基因可以选择对香味有重要作用的基因，只要其表达下调或缺失即能导致香味物质的积累，增加稻谷的香味。本发明中，优选甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2，其功能的缺失会导致与水稻香味相关的挥发性物质为2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2AP)前体物质的增加，从而积累2AP使稻米产生香味。
因此利用CRISPR/Cas技术，选择与代谢香味相关的基因Badh2，在其序列中找到可以剪辑的NGG目标靶点，根据目标靶点周边的基因序列，设计基因打靶gRNA组装序列，构建gRNA靶点质粒，通过农杆菌转化法将目标基因转到水稻基因组中。对基因Badh2目标靶点进行精确的剪辑，将基因Badh2沉默，从而积累2AP使稻米产生香味，而不影响其它的基因和功能。再通过自交或杂交将遗传转化到水稻基因组中的基因片段与被剪辑的基因分离，在不影响水稻的其它的基因和功能，快速得到纯合可以稳定遗传的香稻。
下面对本发明的具体内容进行描述。
本发明提供一种与水稻香味代谢过程中相关基因序列中NGG特异性结合的crRNA的21-23bp的gRNA核苷酸序列。
优选地，与水稻香味代谢过程中相关基因序列中NGG特异性结合的crRNA的21-23bp的gRNA核苷酸序列(不算NGG长度一般为18-20bp,本发明设计了18bp和NGG共21bp)，其序列如SEQIDNO：2至13任一所示。
根据敲出Badh2基因的靶点设计gRNA靶点的相关基因的序列转化到水稻中相关质粒的基因序列，其序列如SEQ果IDNO：14至18任一所示。
T7-gRNA-FPg引物，其序列如：
TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC所示，其中，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN是SEQIDNO：2至13任一所示的序列。
本发明还提供一种带有Badh2基因敲出后的基因序列的香稻的制备方法，其特征在于：
利用CRISPR/Cas技术，选择与代谢香味相关的基因Badh2，在其序列中找到可以剪辑的NGG目标靶点，根据目标靶点周边的基因序列，设计基因打靶gRNA组装序列，构建gRNA靶点质粒，通过农杆菌转化法将目标基因转到水稻基因组中；对基因Badh2目标靶点进行精确的剪辑，将基因Badh2沉默，从而积累2AP使稻米产生香味，而不影响其它的基因和功能；再通过自交或杂交将遗传转化到水稻基因组中的基因片段与被剪辑的基因分离，快速得到纯合可以稳定遗传的香稻。
具体包括以下步骤：
(1)在Badh2基因中找到具有NGG特异性结合crRNA的21bp的核苷酸序列，即gRNA靶点位置；
(2)根据步骤(1)中的特异性的核苷酸序列进行gRNA靶位设计，再利用体外酶切活性检测SSTgRNA靶点效率；
(3)根据步骤(2)中体外切割活性检测结果，选择酶切效率高的靶点，构建gRNA质粒；
(4)将构建的gRNA质粒通过农杆菌转化法转到水稻的基因组中；
(5)Cas9核酸酶在gRNA的引导下定向切割该基因序列,造成DNA的双链断裂，利用DSB的修复机制,实现基因的定点敲除；
(6)Badh2基因被定点敲出后的植株通过自交或受体亲本杂交将转基因的片段与敲出的基因分离得到遗传稳定的香稻。
优选地，与水稻香味代谢过程中相关基因序列中NGG特异性结合的crRNA的21bp的gRNA核苷酸序列，其序列如SEQIDNO：2至13任一所示。
优选地，根据敲出Badh2基因的靶点设计gRNA靶点的相关基因的序列转化到水稻中相关质粒的基因序列，其序列如SEQ果IDNO：14至18任一所示。
优选地，T7-gRNA-FPg引物，其序列如：
TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC所示，其中，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN是SEQIDNO：2至13任一所示的序列。
本发明提供一种DNA，该DNA包括：(a)整体有义编码DNA片段，它由编码对代谢香味相关的基因任一区域的带有NGG有义RNA的有义编码基因组DNA片段连接而成；(b)启动子序列，它与通过间隔区连接之后的DNA片段可操作地连接。
其中，所述对代谢香味相关的基因是甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2，其cDNA全长7776bp，包含有15个外显子，有多个特异性结合的crRNA的21-23bp的核苷酸序列，优选了第1、2和7外显子中的特异性结合的crRNA的21bp的核苷酸序列。进一步，编码甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2有义DNA片段相应于GenBank:EU770319.1所示序列的第1245位到4154位碱基之间的片段，具有NGG特异性结合的crRNA的21bp的核苷酸序列。
启动子可以采用任何有利于在水稻植株中启动基因表达的启动子，例如水稻肌动蛋白(actin)和玉米泛素(ubiquitin)基因的启动子，优选为水稻源启动子。
本发明还提供含有上述DNA的表达载体，最优选为植物表达载体.相应地，本发明进一步提供含有上述表达载体的细胞系。
本发明提供一种培育香稻植株的方法，利用上述表达载体转化水稻，在转化的水稻植株中选择香稻植株，优选包括进一步培育植株获得能稳定遗传的香稻品种。
上述方法具体步骤包括：根据代谢香味相关的基因甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2的基因序列，找到具有NGG特异性结合的crRNA的21-23bp的核苷酸序列，检测以上gRNA靶点体外酶切活性。根据Cas9/gRNA的內源活性结果，选用活性较高的gRNA构建出特异的gRNA的表达载体(目标靶点可以是单靶点，也可以是多靶点)。再通过农杆菌转化法转化到水稻基因组中，将基因Badh2剪辑使其沉默，从而积累2AP使稻米产生香味，而不影响其他的基因和功能。再通过自交或杂交将遗传转化gRNA靶点质粒中的基因片段与剪辑的基因分离，在不影响水稻的其他性状，快速得到纯合可以稳定遗传的香稻。
转化水稻的方法可根据本领域常规知识来选择，例如基因枪法、农杆菌介导法、PEG介导法或花粉管通道法等，本发明中采用的转化方法优选为农杆菌介导法。转化水稻的表达载体可根据选择的转化方法来确定。
转化水稻的原始品种可以是生产中需要的水稻品种，包括粳稻和籼稻，本发明优选的品种是水稻粳稻品种。
本发明的有益效果在于，首次利用CRISPR/Cas技术，将基因Badh2剪辑沉默，从而积累2AP使稻米产生香味，而不影响其它的基因和功能。再通过自交或杂交将遗传转化gRNA靶点质粒中的基因片段与剪辑的基因分离，在不影响水稻的其他性状，快速得到纯合可以稳定遗传的香稻。
附图说明：
图1：gRNA靶点(包括PAM序列)可通过搭桥PCR的方式构建到PCR产物中。
图2：琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果，对比与两个对照gRNA估算活性。
图3：图3A是VK005‐1质粒图谱，图3B是适用于单子叶植物，特别用于水稻，潮霉素抗性的载体。
图4：gRNA质粒序列和图谱。
具体实例
一、试验优选甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2，其功能的缺失会导致2AP前体物质的增加，从而积累2AP使稻米产生香味。其基因序列:GenBank:EU770319.1(参见SEQIDNO：1)
二、靶点的设计
在Badh2基因序列中任何NGG的位点都可以作为靶点，设计用于基因敲除的gRNA靶点：灰色背景为PAM序列。
第一外显子选择
gRNA靶位点位置1:GCCACGGCGATCCCGCAGCGG
gRNA靶位点位置2:GCGGCAGCTCTTCGTCGCCGG
第2外显子选择
gRNA靶位点位置3:ACGTGGACGCGGCGGTGGCGG
gRNA靶位点位置4:TGGACGCGGCGGTGGCGGCGG
gRNA靶位点位置5:GCGCGGGAGGCGCTGAAGAGG
gRNA靶位点位置9:AGTACCTCCGCGCAATCGCGG
gRNA靶位点位置10:TCCGCGCAATCGCGGCCAAGG
第7外显子选择
gRNA靶位点位置6:TGGCTTCAGCTGCTCCTATGG
gRNA靶位点位置7:CAGCTGCTCCTATGGTTAAGG
gRNA靶位点位置8:GAAACAAACCTTAACCATAGG
(其反向互补序列为:CCTATGGTTAAGGTTTGTTTC)
gRNA靶位点位置11:TGTTAGGTTGCATTTACTGGG
gRNA靶位点位置12:TACTGGGAGTTATGAAACTGG
具体位置见Badh2基因(SEQIDNO：1)画线部分，SEQIDNO：1中，中间划线的为缺失区域，框内序列均为外显子序列，灰色背景的为需要设计靶点的外显子序列。
三、体外酶切活性检测SSTgRNA靶点效率
1、gRNA靶位设计(灰色标记为PAM序列)根据(二)gRNA靶位点位置设计:
2、体外cas9酶切活性检测gRNA靶点活性
2.1体外转录gRNA
合成引物T7-gRNA-FPg：NNNNNNNNNNNNNN是gRNA靶点(不带PAM序列)
使用T7‐gRNA‐FPg和gRNA‐RP引物对，以标准gRNA片段为模板做PCR，PCR产物120bp左右，过柱(如全式金的EP101‐01)纯化(使用DEPCH2O洗脱DNA)后测浓度，作为后续体外转录的DNA模板。
PCR反应体系：
组分 用量
gRNA质粒 10ng
T7‐gRNA‐FPg(10μM) 1.5μl
gRNA‐RP(10μM) 1.5μl
2×Pfu Mix 25μl
DEPC H2O up to 50μl
1.3％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果
同时准备标准gRNA1(g1)和标准gRNA2(g2)的PCR产物：
使用标准gRNA1(g1)引物g1‐FP或者标准gRNA2(g2)引物g2‐FP和gRNA‐RP引物对，以标准gRNA片段为模板做PCR，PCR反应体系参考上面所示。PCR产物120bp左右，过柱纯化(注意使用DEPCH2O洗脱DNA)后测浓度，作为后续体外转录的DNA模板。
2.2酶切DNA的准备
将gRNA靶点(包括PAM序列)可通过搭桥PCR的方式构建到PCR产物中。如图1所示。
序列如下：
NNNNNNNNN(270bp)MMMMMMMMMMM(gRNA靶位点位置，含有PAM序列)NNNNNNNNNNN(450bp)，其中N是已知任意一段基因序列，M是靶基因序列，目的是验证酶切效率。
酶切之前片段大小为740bp，酶切之后目的条带大小应分别为：280bp+460bp左右。
2.3Cas9/gRNA体外酶切反应
按照如下反应体系次序加样，准备酶切反应：建议每次酶切反应，同时做标准靶点的gRNA酶切反应，做为阳性参照进行活性比对。
琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果(参见图2)，对比与两个对照gRNA估算活性。
样品gRNA靶点评价说明：
标准gRNA1(g1)和标准gRNA2(g2)经过SSAluciferase检测过活性，其SSA活性分别为：
标准gRNA1(g1)＝3，
标准gRNA2(g2)＝10，因此
若样品gRNA的酶切效率<标准gRNA1(g1)，表明样品gRNA靶点活性比较差，不建议使用；
若40％‐50％≥样品gRNA的酶切效率≥标准gRNA1(g1)，表明样品gRNA靶点活性合格；
若标准gRNA2(g2)≥样品gRNA的酶切效率≥40％‐50％，表明样品gRNA靶点活性良好，建议使用
若样品gRNA的酶切效率≥标准gRNA2(g2)，表明样品gRNA靶点活性非常高，建议使用。
3、根据酶切条带的灰度换算为gRNA活性结果如下：
四、gRNA质粒构建
1、gRNA的设计：
根据体外切割活性检测报告，选择靶点1、3、8、9、12进行gRNA质粒构建
2、gRNA质粒构建方法和过程
构建gRNA质粒可以选择不同的载体骨架和试剂盒，本实验选择VK005‐01试剂盒，其成分和操作如下：
植物Cas9/gRNA质粒构建试剂盒(Catalog.No.VK005‐01)
(单子叶植物，特别用于水稻，潮霉素抗性)
产品组成
保存条件:请将产品于‐20℃保存，避免反复冻融
产品说明
此试剂盒能快速方便地将gRNA靶点序列插入到Cas9/gRNA质粒中。构建好的Cas9/gRNA质粒能够同时表达植物密码子优化的Cas9蛋白及gRNA，应用CRISPR技术进行目标基因的敲除和编辑。
特性：1)玉米Ubi启动子表达植物密码子优化的Cas9蛋白；
2)单子叶的3’UTR提高Cas9蛋白表达水平；
3)水稻U6启动子表达gRNA，特别适用于水稻；
4)35S启动子表达潮霉素抗性
5)多个gRNA构建到同一载体中
试剂盒使用前gRNA靶点引物的设计与合成
请按照如下格式设计引物oligo：
Target-Sense：5’-CAG-gRNAsense
Target-Anti：5’-AAC-gRNAanti
例如设计的gRNA的靶点位置为CAGTTCTAAATAATGGCATGG(其中：识别序列大约18-20bp；灰色背景：PAM序列)。按照gRNA的靶点序列设计下面的oligo，并进行合成，注意：oligo不能加上PAM序列。
Target-Sense：5’-CAGCAGTTCTAAATAATGGCA-3’(正向序列)
Target-Anti：5’-AACTGCCATTATTTAGAACTG-3’(反向互补序列)
步骤一：oligo二聚体(oligoduplex)的形成
CAGNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNCAA
将合成的oligo分别稀释成10μM，按如下比例混合
混匀后，按照如下程序处理：
95℃3min
95℃到25℃缓慢冷却，例如‐1℃/20S或者将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温
16℃5min
步骤二：oligo二聚体插入到载体中
16℃反应2小时。
步骤三：转化
取步骤二的最终产物5‐10μL加入到刚解冻的50μLDH5a感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30分钟，42℃热激90秒，冰上静置2分钟，然后加入500微升无抗LB，置于37℃恒温摇床中，170转，复苏一小时后涂卡纳抗性(Kana+)的平板。
阳性克隆的鉴定
挑3至5个白色菌落摇菌，进行测序。这个质粒为低拷贝，请注意要收集4ml菌液抽提质粒，浓度太低测序结果就会不理想。如果第一次测序得不到正确结果，请加送5个测序样品，进行测序。
sqprimer:GATGAAGTGGACGGAAGGAAGGAG。测序结果例子见文档后。
质粒图谱：请参见图3。
测序例子(证明构建的载体带有靶基因的序列和序列的正确)。
反向测序，请反向互补测序结果后，再进行序列比对。
CCACGGCCCACTTTTCTCCGTGGTGGGGAGATCCAGCTAGAGGTCCGGCCCACAAGTGGCCCTTGCCCCGTGGGACGGTGGGATTGCAGAG
CGCGTGGGCGGAAACAACAGTTTAGTACCACCTCGCTCACGCAACGACGCGACCACTTGCTTATAAGCTGCTGCGCTGAGGCTCAG…gRN
A…Target…GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT
TTACTAGTTTTGATCTTGAAAGATCTTTTATCTTTAGAGTTAAGAACTCTTTCGTATTTTGGTGAGGTTTTATCCTCTTGAGTTTTGGTCA
TAGACCTATTCATGGCTCTGATACCAATTTTTAAGCGGGGGCTTATGCGGATTATTTCTTAAATTGATAAGGGGTTATTAGGGGGTATAGG
GTATAAATACAAGCATTCCCTTAGCGTATAGTATAAGTATAGTAGCGTACCTCTATCAAATTTCCATCTTCTTACCTTGCACAGGGCCTGC
AACCTTATCCTTCCTTGTCTTCCTCCTTCCTTCCGTCCACTTCATCATATTTAAACCAAACCTACGGGGGAGTCAACGT测序引物
一对或多个靶点构建到同一个表达质粒方法：
1.分别把gRNA靶点g1,g2,g3,g4构建到VK005‐01载体中,分别命名：
VK005‐01‐g1；
VK005‐01‐g2；
VK005‐01‐g3；
VK005‐01‐g4；
2.构建VK005‐01‐g1g2:VK005‐01‐g1用AscI+SpeI酶切，跑胶回收短带(rU6:890bp),插入到用AscI+AvrII酶切的VK005‐01‐g2中。命名：VK005‐01‐g1g2
3.构建VK005‐01‐g3g4:VK005‐01‐g3用AscI+SpeI酶切，跑胶回收短带(rU6:890bp),插入到用AscI+AvrII酶切的VK005‐01‐g4中。命名：VK005‐01‐g3g4
4.构建VK005‐01‐g1g2g3g4:VK005‐01‐g1g2用AscI+SpeI酶切，跑胶回收短带(rU6:2x890bp),插入到用AscI+AvrII酶切的VK005‐01‐g3g4中。命名：VK005‐01‐g1g2g3g4
以此类推，将多个靶点串联在一起构建到同一个表达质粒中。用AscI+SpeI酶切进行克隆的验证，检测酶切带的大小与串联的片段大小是否一致。因为由于为重复序列，两端测序有可能无法测通。
3、构建gRNA质粒结果
一.gRNA质粒序列和图谱(参见图4)：
测序结果(反向测序引物sqprimer:GATGAAGTGGACGGAAGGAAGGAG)：Bhad2-g1见SEQIDNO：14-SEQIDNO：18。
五、遗传转化
1、农杆菌感受态细胞的制备
(l)将根癌农杆菌EHA105划板于LB(含利福平40mg/L形f)固体培养基上，28℃培养2‐3天，挑取单菌落。
(2)把EHA105单菌落接种于2mlSOB培养液，12小时后取种子液，接种于400mlSOB培养液中，28℃，180rmp,培养至OD550。＝0.5‐0.6。以下操作在冰上进行。
(3)2200rpm，4℃，离心10分钟收集农杆菌，菌体用10％甘油悬浮。
(4)2500rpm，4℃，离心10分钟，收集菌体，去掉上清。再用10％甘油悬浮菌体。
(5)2500rpm，4℃，离心10分钟，收集菌体，去掉上清。加少量10％甘油重悬菌体，将农杆菌菌液分装到预冷的1.5ml离心管中，‐70℃保存备用。
2、电激转化农杆菌
(l)用实施例一中构建好的发夹RNAi表达载体IRSACK，通过电激转化上述制备的感受态农杆菌细胞EHA105。电激参数为:200Ω，1700V，25μF。电激后将菌体转入1mlSOC中。
(2)28℃，摇菌2‐3小时后，取10μl按梯度涂布于含卡那霉素Kan(50mg/LKan)和利福平Rif(40mg/LRif)的固体培养基上。
(3)2天后，挑单菌落接种与含相应抗生素LB液体培养基中培养，抽提质粒，并且保存于20％的甘油中。
3、表达载体IRSACK在农杆菌中的稳定性检测
用相应限制性内切酶切割用表达载体IRSACK转化的农杆菌和含表达载体IRSACK的大肠杆菌中提取的质粒，观察二者的酶切带型是否一致。如果从农杆菌中所提质粒酶切效果不好，可以将此质粒电激导入大肠杆菌，再用相应的限制性内切酶进行酶切，观察酶切带型是否和预计一致。选择表达载体IRSACK在农杆菌中稳定的农杆菌于-70℃保存，以用于转化水稻。
4、农杆菌介导水稻遗传转化
(1)水稻基本培养基试剂配方
(2)植物激素母液配方
1)1.0mg/ml2,4-D母液
①称取100mg2,4-D，置于小烧杯内；
②加少量无水乙醇使之完全溶解；
③把2，4-D酒精溶液缓缓加入磁力搅拌器上的水中，如果出现沉淀，需要重新配制；
④定容至100ml，4℃保存。
2)1.0mg/mlα-NAA母液
①称取100mgα-AA置于小烧杯内:
②用1N的KOH溶液溶解NAA；
③用水定容至100ml，4℃保存。
3)1.0mg/ml6-BA母液
①称取100mg6-BA置于小烧杯内:
②加少量的浓盐酸，用玻棒研磨成糊状，再加入少量浓盐酸，使之完全溶解；
③用水稀释并定容至100ml，4℃保存。
4)lmg/mlKT
称取100mgKenetin，用少量1NKOH溶解，用水稀释定容至100ml，过滤灭菌后，分装入无菌小管中，-20℃保存。
5)100mM乙酰丁香酮(As)
称取196.2mgAs，用5mlDMSO直接溶解，定容至10ml，分装入无菌小管中，-20℃保存。(3)水稻培养基
诱导及继代培养基:N6培养基十2.0mg/L2，4-D+500mg/L脯氨酸+300mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3.0mg/LPhytagel；pH5.9
预培养培养基:N6培养基+2.0mg/L2，4-D+600mg/L水解酪蛋白+20g/L蔗糖+7.0g/LAgar+10.0g/LGlueose+100μmol/LAs；PH5·6
共培养培养基:N6培养基+2.0mg/L2，4-D+800mg/L水解酪蛋白+20g/L蔗糖+7.0g/LAgar+10.0g/LGlueose+100μmol/LAs；PH5·6
筛选培养基:N6培养基十2.0mg/L2，4-D+600mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7.Og/LAgar+50mg/LLHyg+200mg/LCarb:PH6.0
预分化培养基:MS培养基+2.0mg/L6-BA+2.0mg/LKT+0.2mg/LNAA+0.2mg/LIAA+600mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7.0g/LAgar+50mg/LHyg+200mg/LCab；PH5.9
分化培养基:Ms培养基+2.0mg/L6-BA+2.Omg/LKT+0.2mg/LNAA+0.2mg/LLAA+1.0g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3.0g/L；Phytagel:pH6.0
生根培养基:1/2MS大量培养基+1/2MS微量培养基+铁盐+MS有机+20g/L蔗糖+3.0g/LPhytagel；PH5.8
农杆菌悬浮培养基:1/2N6培养基+2.0mg/L2，4-D+800mg/L水解酪蛋白+20mg/L蔗糖；PH5.4
YEB培养基:蛋白陈5g,酵母提取液1g,牛肉浸膏5g,蔗糖5g,MgSO4·7H2O0.4929g,加水溶解，调节pH至7.0，定容至1000ml。若配制固体培养基加Agar15g/L，高压灭菌。
(4)胚性愈伤组织的诱导和继代培养
1)将农院238和吉粳88号各1000粒成熟种子剥去颖壳，用75％乙醇浸洗1分钟，转入0.1％升汞浸泡15分钟，再用灭菌超纯水冲洗5次后用滤纸吸干。
2)将种子置于愈伤组织诱导培养基上，25℃，暗培养3-4周。
3)从种子盾片附近长出的愈伤组织块剥离下来，置愈伤组织继代培养基上继代2-3次(每代15天)，25℃，暗培养。
4)然后转移到预培养基上25℃，暗培养一周，即可获得用于转化的愈伤组织。
(5)农杆菌的活化
将-70℃保存的发夹RNAi表达载体IRSACK的农杆菌划板于含Kan(50mg/L)和Rif(40mg/L)的LB固体培养基上，28℃暗培养2-3天，取单菌落摇菌于含相应抗生素的液体培养基YEB中，于28℃培养2天。离心收集农杆菌体，用悬浮液调节菌液浓度为OD600＝0.8-1.0，用于浸染愈伤组织。
(6)农杆菌浸染及共培养
挑取淡黄色、致密、颗粒状的胚性愈伤组织于小玻璃瓶中，用上述调节好浓度的农杆菌浸泡愈伤组织20分钟，期间摇动几次。取出愈伤组织，用滤纸吸去菌液，置于超净台中，用无菌风吹，然后转移到共培养基上，于25℃暗培养3天。
(7)抗性愈伤组织的筛选
将上述共培养后的愈伤组织取出，用无菌水冲洗5-7次后，在400ppm羧苄青霉素的无菌水中浸泡30分钟，取出愈伤组织置于滤纸上，在超净台里吹干(5个小时以上)。干燥后的愈伤组织转移到筛选培养基上，筛选2次，每次2周。
(8)抗性愈伤组织的预分化和分化
挑选直径为1-2mm生长状态好、结构致密、淡黄色的抗性愈伤组织，转移至预分化培养基上，于25℃暗培养一周，然后转移至分化培养基上，于28℃，光照培养3-4周，愈伤组织开始分化出小苗。
(9)转化植株的生根培养和移苗
将3-4cm的幼苗转入生根培养基里，于28℃，光照培养，待根系生长良好后，打开瓶口，练苗1周，然后转移到温室或试验基地中生长。

Claims (10)

1.与水稻香味代谢过程中相关基因序列中NGG特异性结合的crRNA的21-23bp的gRNA核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的与水稻香味代谢过程中相关基因序列中NGG特异性结合的crRNA的21-23bp的gRNA核苷酸序列，其序列如SEQIDNO：2至13任一所示。
3.根据敲出Badh2基因的靶点设计gRNA靶点的相关基因的序列转化到水稻中相关质粒的基因序列，其序列如SEQ果IDNO：14至18任一所示。
4.T7-gRNA-FPg引物，其序列如：
TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC所示，其中，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN是SEQIDNO：2至13任一所示的序列。
5.一种带有Badh2基因敲出后的基因序列的香稻的制备方法，其特征在于：
利用CRISPR/Cas技术，选择与代谢香味相关的基因Badh2，在其序列中找到可以剪辑的NGG目标靶点，根据目标靶点周边的基因序列，设计基因打靶gRNA组装序列，构建gRNA靶点质粒，通过农杆菌转化法或其它转化法将目标基因转到水稻基因组中；对基因Badh2目标靶点进行精确的剪辑，将基因Badh2沉默，从而积累2AP使稻米产生香味，而不影响其它的基因和功能；再通过自交或杂交将遗传转化到水稻基因组中的基因片段与被剪辑的基因分离，快速得到纯合可以稳定遗传的香稻。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：
（1）在Badh2基因中找到具有NGG特异性结合crRNA的21-23bp的核苷酸序列，即gRNA靶点位置；
（2）根据步骤（1）中的特异性的核苷酸序列进行gRNA靶位设计，再利用体外酶切活性检测SSTgRNA靶点效率；
（3）根据步骤（2）中体外切割活性检测结果，选择酶切效率高的靶点，构建gRNA质粒；
（4）将构建的gRNA质粒通过农杆菌转化法或其它转化法转到水稻的基因组中；
（5）Cas9核酸酶在gRNA的引导下定向切割该基因序列,造成DNA的双链断裂，利用DSB的修复机制,实现基因的定点敲除；
（6）Badh2基因被定点敲出后的植株通过自交或受体亲本杂交将转基因的片段与敲出的基因分离得到遗传稳定的香稻。
7.根据权利要求5或6所述的的制备方法，其特征在于：与水稻香味代谢过程中相关基因序列中NGG特异性结合的crRNA的21-23bp的gRNA核苷酸序列，其序列如SEQIDNO：2至13任一所示。
8.根据权利要求5或6所述的的制备方法，其特征在于：根据敲出Badh2基因的靶点设计gRNA靶点的相关基因的序列转化到水稻中相关质粒的基因序列，其序列如SEQ果IDNO：14至18任一所示。
9.根据权利要求5或6所述的的制备方法，其特征在于：T7-gRNA-FPg引物，其序列如：
TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC所示，其中，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN是SEQIDNO：2至13任一所示的序列。
10.一种对香味代谢过程中相关基因序列剪辑后的基因，其特征在于：在NGG特异附近基因缺失几个碱基，使此基因沉默。
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