CN103525840B - 一种水稻的甜菜碱醛脱氢酶2香味基因、分子标记的引物及筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了能够使稻米呈现出淡香型特性的新的甜菜碱醛脱氢酶2基因，与非香水稻“日本晴”比较，其突变位点不位于编码链上，是属于编码链上游突变类型的甜菜碱醛脱氢酶2基因。在编码链起始密码子的第一个核苷酸上游-81位点处缺失了3个核苷酸，同时在-1314处插入了8个核苷酸。将这个基因通过杂交转入非香水稻并获得纯合后代即可培育出新的淡香型的水稻新品种。本发明还公开了筛选具有这种淡香型特性基因水稻的方法及分子标记引物。本发明为培育淡香型水稻提供了新的基因，也可辅助选择含有淡香味基因的植株，有利于提高选择效果，还能对育种过程后期形成的自交后代淡香味基因是否呈纯合状态进行鉴定，从而快速有效地实现育种目标。

Description

一种水稻的甜菜碱醛脱氢酶2香味基因、分子标记的引物及筛选方法

技术领域

本发明涉及分子遗传学和植物育种领域，具体为一个新的水稻香型等位基因，以及利用这个新的等位基因，采用分子标记筛选方法辅助常规育种快速选育新的淡香型水稻。

背景技术

香型稻米价格总体上都比非香型稻米高出许多，使其在国际稻米贸易中占有特别重要的地位。随着人们生活水平的提高，目前市场对香米需求量日益增加，由此也促进了香型水稻的遗传和育种研究。

香米在蒸煮中会产生特别的香气因而受到大多消费者的青睐。然而，对于香米具有的香味程度，不同人的接受度并不相同。有人喜欢浓香型稻米，也有人喜爱淡香型稻米。目前市场提供的香米商品主要是浓香类型的。对于淡香型香米商品可以通过分别取一定量的浓香型香米和非香米混合配制获得。

有报道显示，水稻香味与一种香味物质2-乙酰-1-吡咯啉（简称2-AP）密切相关（Buttery等，JAgricFoodChem，1983，31:823-826；Widjaja等，JournaloftheScienceofFoodandAgriculture，1996,70(2):151-161）。在稻米中，2-AP含量高，稻米香味就浓郁，2-AP含量相对较低，稻米香味就淡些。

尽管过去人们对于稻米香味遗传研究结果存在分歧，但多数学者认为稻米香味是由隐性主基因控制的（闵绍揩，申宗坦，熊振民，等.水稻育种学.北京:中国农业出版社,1996.322-353），并位于第8号染色体上（Aha等，TheorApplGenet,1992,84:825-828；Garland等，TheorApplGenet,2000,101:364-71；Jin等，PlantSci,2003,165:359-64；Cordeiro等，MolBreeding，2002,9(4):245-250；Chen等，PlantSci，2006,171:505-14）。

Bradbury等(Bradbury等，PlantBiotechnologyJournal,2005,3(3):363-370)最先报道，甜菜碱醛脱氢酶2基因(Badh2)与水稻香味直接相关，该基因位于水稻8号染色体上，包含了15个外显子和14个内含子，其第七外显子8个碱基的缺失和3个核苷酸的多态性（badh2-E7）导致BADH2原有的功能丧失，使其具有香味的作用底物2-AP的代谢途径中断，2-AP不断积累使水稻变香。这个设想通过Badh2基因的互补试验（Chen等，Plantcell，2008,20(7):1850-1861）和Badh2基因RNAi试验（Niu等，BMCPlantBiol,2008;8:1-10.）得到了验证。

继badh2-E7报道之后，人们对发现新的甜菜碱醛脱氢酶2基因的等位基因投入了很大的关注，并陆续发表了相关报道。Shi等(Shi等，MolBreed,2008,22(2):l85-192)发现甜菜碱醛脱氢酶2基因的等位基因是在第二外显子上有7个连续核苷酸的缺失（badh2-E2）。AmarawathiY等（AmarawathiY等，MolBreed,2008,21(1):49-65）发现在第七外显子上与badh2-E7突变一致以外，还在第八外显子存在7个核苷酸的插入。Kovach等(Kovach等，PNAS,2009,106:14444–14449)报道了在甜菜碱醛脱氢酶2基因其它外显子上存在的插入突变或缺失突变或单核苷酸多态性（SNP，Single-nucleotidepolymorphism）变化的8个等位基因。Shao等（Shao等，PlantBreeding,2011,130:172-176）发现了一种新的甜菜碱醛脱氢酶2基因缺失突变，在第4和第5外显子之间出现803bp的缺失。

新的甜菜碱醛脱氢酶2基因等位基因的发现能够为香稻育种提供重要的基因资源。虽然目前人们已发现甜菜碱醛脱氢酶2基因有突变的等位基因有12个，但分析它们的突变位点都是存在于编码链上，因此都属于编码链突变类型。

Lee等（Lee等，Cropsci,1989,29:1067-1071）报道认为，玉米不同单交种之间的RFLP遗传距离与F1杂种优势表现存在极显著正相关。张培江等（张培江等，杂交水稻，2001，16（5）：50-54）的研究结果显示，当两个亲本遗传距离较远时，其杂交水稻后代能够表现出更大的杂交优势。也就是说，亲本之间基因差异大，杂交产生的后代的优势也会较强。因此，从水稻杂种优势角度分析，需要发现更多甜菜碱醛脱氢酶2基因突变位点具有与现已报道不同的等位基因类型。

基因基本结构包括启动子、转录区和终止子。尽管决定基因功能的遗传信息储存在位于转录区的编码链中，但启动子是一段供RNA聚合酶定位用的DNA序列，通常位于基因转录区的5′端上游。而且在启动子上还存在调控基因表达的重要顺式作用元件。因此，启动子对于控制其下游包含编码链的转录区转录具有非常重要的作用。在转录区中介于转录起始位点至编码蛋白质翻译的起始密码子之间是一段5′非翻译区，即5′UTR。有报道显示，5′UTR高度结构化对mRNA的翻译起始进行调控，既具有介导内部翻译起始的功能，也含有内部核糖体进入的位点（IRES）（Cullen，MolCellBiol，2000，20:4181-4187）。因此，在基因蛋白质翻译起始密码子的上游序列对该基因的表达具有重要的调控作用。在人们对于基因功能研究中，需要通过人为诱变的方式获得编码序列有突变的突变体。同样，如果能够得到编码区上游序列，包括启动子序列和5′UTR序列有改变的突变体，对于基因表达的调控研究也是非常有价值的。目前还未见关于甜菜碱醛脱氢酶2基因在编码区上游序列有突变方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的提供一种新的能使稻米呈现淡香型的香味基因，以及提供一种鉴定该香味基因的方法。

本发明的目的还提供一种简便筛选该香味基因分子标记的引物，并使用分子标记辅助，快速进行淡香型水稻育种的方法。

这种新的淡香型香味基因是一种甜菜碱醛脱氢酶2基因，在启动子区域和5′UTR区域都发生突变，在编码链起始密码子第一个核苷酸上游-81处，即5′UTR区域有3bp缺失，在上游-1314处，即启动子区域具有8bp插入突变的水稻新的甜菜碱醛脱氢酶2基因，缺失的序列为gtc，插入的序列为5’-aaatctag-3’。

优选的，这种突变型甜菜碱醛脱氢酶2基因的启动子和5′UTR区域包含如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。更优选的，这种突变型甜菜碱醛脱氢酶2基因的启动子和5′UTR区域如SEQIDNo.1所示。（根据Genbank登录号AP004463.2中显示的信息判断，甜菜碱醛脱氢酶2基因的5′UTR区长度为147个核苷酸，再向5′上游的序列即为启动子序列。）

优选的，这种突变型甜菜碱醛脱氢酶2基因包括SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。更优选的，这种突变型甜菜碱醛脱氢酶2基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。

我们实验室曾对本校董彦君教授惠赠的“上师香2号”香型水稻

（http://cms.shnu.edu.cn/Default.aspx?tabid=10725&ctl=Details&mid=27551&ItemID=99943&SkinSrc=%5BL%5DSkins/zz1_1106/zz1_1106&language=zh-CN）的甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链进行分析，结果很意外地发现，该水稻的甜菜碱醛脱氢酶2基因的编码链与非香水稻完全相同。

进一步研究后发现，在“上师香2号”香型水稻的甜菜碱醛脱氢酶2基因中，在编码链起始密码子第一个核苷酸上游-81位点处，即5′UTR区域缺失了3个核苷酸，同时在-1314处，即启动子区域又插入了8个核苷酸。又进一步分析“上师香2号”香型水稻选育中的香型亲本“南海138”水稻（Yamashita，1999，SogoNogyonoShingijutsu12:16–20）的甜菜碱醛脱氢酶2基因，结果与“上师香2号”香型水稻完全相同。这个新的甜菜碱醛脱氢酶2基因被我们定名为badh2-p-5′UTR。

我们曾选取了第二外显子突变类型（badh2-E2）、第七外显子突变类型（badh2-E7）、编码链上游突变类型的3种香稻和非香稻，共4个水稻品种为材料，分析了它们在不同发育阶段（从开花后第3天起开始取样，随后每隔3天取一次样，一直到开花后30天）幼嫩种子中甜菜碱醛脱氢酶2基因的mRNA表达量，结果显示，非香稻甜菜碱醛脱氢酶2基因的mRNA表达量最高，2种类型编码链有突变的香稻mRNA表达量都非常低，含有新的甜菜碱醛脱氢酶2等位基因，即甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游有突变的香稻mRNA表达量介于非香稻和编码链有突变类型的香稻之间（图2）。这表明含有新的甜菜碱醛脱氢酶2等位基因的水稻稻米属于淡香型香稻。以分别含有突变发生在甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链第二外显子的香稻、突变发生在甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游的香稻、正常甜菜碱醛脱氢酶2基因的非香稻的成熟种子为材料，分析了它们各自的2-AP含量，结果也表明，含有新的甜菜碱醛脱氢酶2等位基因，即甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游有突变的香稻成熟种子2-AP含量也基本介于非香稻和编码链有突变类型的香稻之间（表1）。

表1不同水稻成熟种子2AP含量检测

通过对不同类型水稻甜菜碱醛脱氢酶2基因mRNA表达量和稻米2-AP含量检测结果分析，可以证实了本发明公开的是一个能够使稻米香味呈现出淡香类型的新型甜菜碱醛脱氢酶2基因。

通过合成两对引物，分两段PCR扩增，进行该香味基因的鉴定。具体鉴定的方法为，第一对上、下游引物序列分别为：5’-GATGTATAATATCGGTCG-3’和5’–GGGAGTAGTATAGCCAAC-3’。这两个引物分别与该香味基因编码链起始密码子第一个核苷酸上游-1442处和-511处同源配对；第二对上、下游引物序列分别为：5’AAGATAAATGAGGAGAGAGA3’和5’AGCAAACTTAAAACTAGAGCA3’。这两个引物分别与该香味基因编码链起始密码子第一个核苷酸上游-792处和编码链起始密码子第一个核苷酸下游+495处同源配对。两个PCR扩增产物之间搭接281bp。通过PCR扩增获得产物，利用DNAMAN软件将两段PCR扩增产物测序结果进行拼接，得到的序列再与非香水稻进行比对，即可发现在这个新的甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链起始密码子第一个核苷酸上游-81处，即5′UTR区域具有3bp的缺失突变，以及在-1314处，即启动子区域具有8bp插入突变。

鉴定该香味基因的方法，具体操作包括以下步骤：

（1）提取“上师香2号”水稻总DNA作为模板（可采用CTAB法或SDS法），加入5’-GATGTATAATATCGGTCG-3’（SEQIDNo.5）和5’-GGGAGTAGTATAGCCAAC-3’（SEQIDNo.6）两种引物进行第一段PCR扩增；同样取“上师香2号”水稻总DNA作为模板，加入5’AAGATAAATGAGGAGAGAGA3’（SEQIDNo.7）和5’AGCAAACTTAAAACTAGAGCA3’（SEQIDNo.8）两种引物进行第二段PCR扩增；

（2）取PCR产物至生物公司进行测序分析。

第一段PCR扩增的方法为：93℃～95℃预变性2分钟；93℃～95℃变性15秒，50℃退火30秒，67℃～69℃延伸1秒，共32～35个循环；67℃～69℃延伸1分钟。

第二段PCR扩增的方法为：93℃～95℃预变性2分钟；93℃～95℃变性15秒，49℃退火40秒，67℃～69℃延伸1分钟，共32～35个循环；

将PCR扩增测序结果利用DNAMAN软件进行拼接，拼接结果与非香水稻进行比对，即可在新的甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链起始密码子第一个核苷酸上游-81位点处，即5′UTR区域以及-1314位点处，即启动子区域发现分别具有3bp的缺失突变和8bp的插入突变。

所述的香味基因为编码链起始密码子第一个核苷酸上游-81位点，即5′UTR区域具有3bp的缺失突变，以及在-1314位点处，即启动子区域具8bp插入突变的新的甜菜碱醛脱氢酶2基因。

通过杂交将这个新的甜菜碱醛脱氢酶2基因转入非香水稻，并获得纯合后代即可培育出新的淡香型的水稻新品种。

本发明还提供了一种快速筛选上述香味基因的方法，以及分子标记物的引物。

一组筛选含有该香味基因（即突变的新型甜菜碱醛脱氢酶2基因）水稻分子标记的引物，在分子标记辅助育种中用于快速鉴定该香味基因，包括以下两个序列的引物（SEQIDNo.3和No.4）：

（1）与甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链起始密码子第一个核苷酸上游-1314处位点的上游设计同源配对关系的正义引物序列：含有如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；优选的，其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示：

5’-ATAATATCGGTCGAAACATTTTTATT-3’；

（2）与甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链起始密码子第一个核苷酸上游-1314位点处下游设计同源配对关系的的反义引物序列：含有如SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；优选的，其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示：

5’-GAGAAGCTTTTACACTTTATGCACATC-3’；

在分子标记辅助选育新型淡香型水稻中，一种用于鉴定该新型香味基因简便筛选的方法，包括以下步骤：

（1）提取水稻总DNA作为模板（可采用CTAB法或SDS法），加入前述的引物（5’-ATAATATCGGTCGAAACATTTTTATT-3’和5’-GAGAAGCTTTTACACTTTATGCACATC-3’）进行PCR扩增；

PCR扩增的方法为：93℃～95℃预变性5分钟；93℃～95℃变性45秒，52℃退火45秒，71℃～73℃延伸30秒，共32～35个循环；最后71℃～73℃延伸8～12分钟。

（2）取PCR产物进行凝胶电泳检测，可使用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶，优选用6%非变性的聚丙烯酰胺凝胶或4%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

如模板总DNA由纯合非香型水稻提取，扩增产物只有198bp条带。

如模板总DNA由纯合香型水稻提取，扩增产物只有约206bp条带。

如模板总DNA由香型与非香型水稻杂交后代的杂合子水稻提取，同时具有198bp条带和206bp条带扩增产物。

如模板总DNA由香型水稻与非香型水稻杂交后又与非香型水稻回交的后代水稻提取，只有198bp条带的为无香味基因纯合植株；同时具有198bp和206bp条带的为香味基因杂合类型植株。

如模板总DNA由香型水稻与非香型水稻杂交后的自交后代水稻提取，只有206bp条带的为香味基因纯合植株；只有198bp条带的为非香味基因纯合植株；同时具有206bp和198bp条带的为香味基因杂合类型植株。

所述的香型水稻为甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链起始密码子第一个核苷酸上游-1314位点处具有8bp插入突变，以及在-81位点处具有3bp的缺失突变的香型水稻。

198bp条带对应非香味等位基因的PCR产物，206bp条带对应香味等位基因PCR产物。

上述方法可用于快速筛选由含有这个新的甜菜碱醛脱氢酶2基因的香型水稻与非香型水稻杂交后代、含有这个新的甜菜碱醛脱氢酶2基因的香型水稻与非香型水稻杂交后的自交后代，或者含有这个新的甜菜碱醛脱氢酶2基因香型水稻与非香型水稻杂交后又与非香型水稻回交的后代。

本发明的引物是根据香型水稻与非香型水稻香味基因本身的序列差异设计的，该组引物可从明确功能的DNA序列上扩增获得PCR产物，不同于一般的连锁性分子标记。

本发明克服了香味基因，即甜菜碱醛脱氢酶2基因，在目前研究中只发现在编码链存在突变，对该基因的研究还不够全面这样一种局面。为科学家们在涉及甜菜碱醛脱氢酶2基因由编码链上游突变调控该基因表达研究提供了新基因资源；本发明为香型杂交水稻优势利用提供了与目前不同类型的香味基因；本发明还为直接培育淡香型水稻提供了一个非常有用的新的香味基因，从而可满足一些喜爱淡香型香稻类型的消费者的需求。

本发明提供的采用分子标记检测操作，用于快速培育淡香型水稻方法，克服了香稻育种中使用品尝方法或与香味基因连锁标记筛选可能存在的选择失误和偏差，或通过嗅出KOH处理后稻米是否有香味时可能对人的嗅觉造成伤害，或利用设备检测会需要昂贵的设备购置及检测费用，从而实现了对含有香味基因筛选的简便、快速和有效性，同时还能够对育种过程的后期形成的自交后代香味基因是否呈纯合状态进行鉴定。

本发明能够为培育淡香型水稻提供了一个新的基因，也可辅助选择含有淡香味基因的植株，有利于提高选择效果，同时还能够对育种过程的后期形成的自交后代淡香味基因是否呈纯合状态进行鉴定，从而快速有效地实现育种目标。

附图说明

图1为“日本晴”和“上师香2号”两种水稻甜菜碱醛脱氢酶2基因分别包含-1314bp处8bp插入突变（A）和-81处3bp缺失突变（B）的序列比较图。其中“日本晴”为非香型水稻，“上师香2号”为香型水稻。阴影表示两种甜菜碱醛脱氢酶2基因主要的差异位点，数字表示该核苷酸在甜菜碱醛脱氢酶2基因中的位置，起始密码子的第一个核苷酸定为+1bp。

图2为实施例1“日本晴”非香稻及3种不同类型香味基因的香稻甜菜碱醛脱氢酶2基因mRNA在种子不同发育阶段的表达量比较。DAF表示开花后天数；各样品相对转录水平以2-ΔCT数值表示。

图3为实施例1采用westernblot检测“日本晴”非香稻及3种不同类型香味基因的香稻种子不同发育阶段甜菜碱醛脱氢酶2基因的蛋白质。M是表示标准分子量蛋白质；a和A是分别表示含有正常甜菜碱醛脱氢酶2基因的非香水稻在开花后12天和20天的种子中检测出的甜菜碱醛脱氢酶2蛋白质；b和B是分别表示含有甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游有突变的香型水稻在开花后12天和20天的种子中检测出的甜菜碱醛脱氢酶2蛋白质；c和C是分别表示含有甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链第七外显子有突变的香型水稻在开花后12天和20天的种子中甜菜碱醛脱氢酶2蛋白质的检测结果；d和D是分别表示含有甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链第二外显子有突变的香型水稻在开花后12天和20天的种子中甜菜碱醛脱氢酶2蛋白质的检测结果。

图4为实施例2含有甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游有突变的香型水稻和非香水稻以及两种水稻杂交F1植株香味基因使用6%非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测的鉴定图。其中第1泳道为非香稻植株PCR扩增产物，分子量198bp；第2泳道为含有甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游有突变的香型水稻与非香水稻杂交F1植株PCR扩增产物，分子量分别为198bp和206bp；泳道3为含有甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游有突变的香型水稻植株PCR扩增产物，分子量206bp。

具体实施方式

实施例1编码链上游有突变的甜菜碱醛脱氢酶2基因起始密码子上游序列克隆以及与非香型水稻相应序列比较分析；含有甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游有突变的香型水稻甜菜碱醛脱氢酶2基因表达、酶活性检测以及香味物质分析

首先采用分子生物学常规方法，以“上师香2号”水稻为例，克隆了甜菜碱醛脱氢酶2基因在编码链上游序列，并进行了测序分析。

通过合成两对引物，分两段PCR扩增，进行该香味基因的鉴定。第一对上下游引物序列分别为：5’-GATGTATAATATCGGTCG-3’和5’–GGGAGTAGTATAGCCAAC-3’（SEQIDNo.5和SEQIDNo.6）。这两个引物与该香味基因编码链起始密码子第一个核苷酸上游-1442处和-511处同源配对；

第二对上、下游引物序列（SEQIDNo.7和SEQIDNo.8）分别为：

5’-AAGATAAATGAGGAGAGAGA-3’和5’-AGCAAACTTAAAACTAGAGCA-3’。这两个引物与该香味基因编码链起始密码子第一个核苷酸上游-792处和编码链起始密码子第一个核苷酸下游+495处同源配对。两个PCR扩增产物之间搭接281bp。

提取“上师香2号”香型水稻的总DNA，用上述两组引物通过PCR扩增获得产物，第一段PCR扩增的方法为：93℃～95℃预变性2分钟；93℃～95℃变性15秒，50℃退火30秒，67℃～69℃延伸1秒，共32～35个循环；67℃～69℃延伸1分钟。第二段PCR扩增的方法为：93℃～95℃预变性2分钟；93℃～95℃变性15秒，49℃退火40秒，67℃～69℃延伸1分钟，共32～35个循环。

利用DNAMAN软件将两段PCR扩增产物测序结果进行拼接，得到的序列再与非香水稻“日本晴”进行比对，即可发现在“上师香2号”水稻中的这个新的甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链起始密码子第一个核苷酸上游-81处，即5′UTR区域具有3bp的缺失突变，以及在-1314处，即启动子区域具有8bp插入突变。这种突变型甜菜碱醛脱氢酶2基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，其启动子和5′UTR区域核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。进一步分析“上师香2号”水稻选育中用到的香型亲本“南海138”水稻的甜菜碱醛脱氢酶2基因，结果与“上师香2号”水稻完全相同，在编码链起始密码子第一个核苷酸上游-81处，即5′UTR区域具有3bp的缺失突变，以及在-1314处，即启动子区域具有8bp插入突变。

与非香水稻“日本晴”比较，该新的甜菜碱醛脱氢酶2基因的突变位点不同于以往已报道的甜菜碱醛脱氢酶2基因的突变都位于编码链上，而是属于编码链上游突变类型的甜菜碱醛脱氢酶2基因。

比较“上师香2号”香型水稻与非香型水稻“日本晴”的甜菜碱醛脱氢酶2基因序列，“上师香2号”香型水稻与非香型水稻之间最主要差异有两个区段，第一个是位于编码链起始密码子第一个核苷酸上游-81位点处，即5′UTR区域中连续缺少了3个核苷酸，另一个是位于编码链起始密码子第一个核苷酸上游-1314位点处，即启动子区域中连续多了8个核苷酸，结果如图1。

以非香型水稻、分别在编码链第七和第二外显子有突变的香型水稻、以及突变发生在编码链上游的香型水稻为材料，分析不同发育阶段种子中甜菜碱醛脱氢酶2基因mRAN表达水平。结果显示，突变发生在编码链上游的香型水稻的mRAN表达水平介于非香型水稻和两种编码链有突变的香型水稻之间，结果如图2。

对于水稻的甜菜碱醛脱氢酶2基因，即便是非香水稻具有正常的甜菜碱醛脱氢酶2基因，其控制合成的蛋白质，也有正常长度（55KD）和异常的截短蛋白质两种形式。只有正常长度（55KD）的蛋白质才是有生物学功能的（Chen等,ThePlantCellOnline,2008,20,1850-1861）。同样以非香型水稻、分别在编码链第七和第二外显子有突变的香型水稻、以及突变发生在编码链上游的香型水稻为材料，利用westernblot分析了4种水稻在两个种子发育阶段甜菜碱醛脱氢酶2基因控制合成的甜菜碱醛脱氢酶2蛋白质。结果显示，在两种编码链有突变的香型水稻种子中，都没有正常分子量为55KD的蛋白质。突变发生在编码链上游的香型水稻种子在两个发育阶段都有正常分子量为55KD的蛋白质。我们使用图像处理软件对非香水稻和突变发生在编码链上游的香型水稻电泳泳道中的条带进行了含量扫描，并计算55KD正常蛋白质与22KD异常蛋白质之间的比值。结果显示，从开花12天的种子发育至开花20天的种子，在非香水稻种子中，正常分子量蛋白质所占的比例有所增加，而突变发生在编码链上游的香型水稻情况正相反（表2）。

表2非香水稻和突变发生在编码链上游的香型水稻两个发育阶段种子中正常分子量甜菜碱醛脱氢酶2蛋白质和异常分子量蛋白质相对含量比较

同样以非香型水稻和两种编码链有突变的香型水稻为对照，进一步分析突变发生在编码链上游的香型水稻甜菜碱醛脱氢酶2基因控制合成出的甜菜碱醛脱氢酶2蛋白质的活性。结果发现，两种甜菜碱醛脱氢酶2基因编码序列有突变的水稻，甜菜碱醛脱氢酶2蛋白质已完全丧失活性，这与westernblot检测无正常分子量蛋白质的结果完全对应。突变发生在编码链上游的香型水稻种子在两个发育阶段，甜菜碱醛脱氢酶2蛋白质的活性都几乎介于非香型水稻和两种编码链有突变的香型水稻之间（表3）。

表34种水稻两个发育阶段种子中甜菜碱醛脱氢酶2蛋白质的活性检测

以分别含有突变发生在甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链第二外显子的香稻、突变发生在甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游的香稻、正常甜菜碱醛脱氢酶2基因的非香稻的成熟种子为材料，分析了它们各自的2-AP含量，结果也表明，含有新的甜菜碱醛脱氢酶2等位基因，即甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游有突变的香稻成熟种子2-AP含量也基本介于非香稻和编码链有突变类型的香稻之间（表1）。

分别以含有第二外显子突变类型的甜菜碱醛脱氢酶2基因的香型水稻和非香水稻为对照，分析甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游有突变的香型水稻成熟种子中的2-AP含量。结果显示，甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游有突变的香型水稻成熟种子2-AP含量也基本介于非香稻和编码链有突变类型的香稻之间（如表1）。

从甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游有突变的香型水稻种子甜菜碱醛脱氢酶2蛋白westernblot检测结果表明，只是甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游发生突变，该基因还是能够合成出正常分子量的蛋白质，但在水稻种子中所占的比例会减少。从种子中甜菜碱醛脱氢酶2基因mRNA表达量、甜菜碱醛脱氢酶2蛋白质活性以及2-AP含量的分析结果都可以证实，在甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游发生突变的新甜菜碱醛脱氢酶2基因，是一个能够控制水稻稻米呈现半香型类型的特性。

实施例2鉴定该香型基因的分子标记物引物

非香型水稻“日本晴”甜菜碱醛脱氢酶2基因与新的甜菜碱醛脱氢酶2基因比较，两者在编码序列上游-1314处相差8个核苷酸。将两种甜菜碱醛脱氢酶2基因在-1314处的差异位点设计为可区别两种甜菜碱醛脱氢酶2基因的分子标记，并设计如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4序列的引物，作为鉴定两种甜菜碱醛脱氢酶2基因分子标记物的引物。

根据非香型水稻“日本晴”甜菜碱醛脱氢酶2基因编码序列上游的序列推测，采用本发明设计的一对引物：SEQIDNo.3和SEQIDNo.4序列，对非香水稻基因组提取的DNA进行扩增，预计PCR产物分子量为198bp；新型甜菜碱醛脱氢酶2基因在涉及-1314位点处比非香水稻的甜菜碱醛脱氢酶2基因多了8个核苷酸，预计PCR产物分子量为206bp；如对由非香水稻与含有新型甜菜碱醛脱氢酶2基因香型水稻杂交获得的F1植株，提取基因组DNA进行扩增，预计PCR产物会出现分子量分别为198bp和206bp条带。

检测的具体操作为：提取总DNA，并用SEQIDNo.3和No.4的核苷酸序列作为上下游引物进行PCR扩增。PCR扩增的方法为：93℃～95℃预变性5分钟；93℃～95℃变性45秒，52℃退火45秒，71℃～73℃延伸30秒，共32～35个循环；最后71℃～73℃延伸8～12分钟。

以“上师香2号”、非香水稻“C418”以及两者杂交稻F1植株总DNA为模板，采用SEQIDNo.3和SEQIDNo.4序列的引物，用上述方法进行PCR扩增，PCR扩增产物用6%非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果与预计的一致。

将含有与“上师香2号”香型水稻具有同样突变的新型甜菜碱醛脱氢酶2基因的香型水稻“南海138”、非香水稻“C418”、含有突变的新型甜菜碱醛脱氢酶2基因的香型水稻“南海138”与非香水稻“C418”杂交获得的F1植株总DNA为模板，采用本发明设计的引物（SEQIDNo.3和SEQIDNo.4序列）进行PCR扩增，PCR产物用6%非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测非香型水稻、F1植株和香型水稻（如图4），其中第1泳道为非香稻“C418”植株PCR扩增产物，分子量198bp；第2泳道为含有突变的新型甜菜碱醛脱氢酶2基因的香型水稻“南海138”与非香水稻“C418”杂交F1植株PCR扩增产物，分子量分别为198bp和206bp；泳道3为含有突变的新型甜菜碱醛脱氢酶2基因的香型水稻“南海138”植株PCR扩增产物，分子量206bp。

我们还使用本发明设计的引物（SEQIDNo.3和SEQIDNo.4序列），对“南海138”香稻、非香水稻改为“中花11”，以及由“南海138”与“中花11”杂交获得的F1植株总DNA为模板进行PCR，3种水稻电泳检测显示出的条带也完全与预计的相同。我们还采用1.7%KOH溶液对应检测了3种水稻叶片的香味。取1克新鲜的水稻叶片，剪成碎片放入试管，加入1.7%KOH溶液5ml，立即塞住试管口，在室温下保持10min，然后逐一打开试管塞迅速用鼻嗅来鉴别香味有无。为确保鉴定的准确性，由三人同时闻味。

由于香味是一种隐性性状，只有在香味基因纯合时香味才能在KOH溶液环境中显示出来，杂合状态是不能在KOH溶液中显示出香味性状，所以，预计如上3种水稻叶片在1.7%KOH溶液环境中只有“南海138”香稻能够显示具有香味的特性。检测结果与预计的完全相同。

我们又将与“上师香2号”香型水稻具有同样突变的新型甜菜碱醛脱氢酶2基因的“南海138”水稻与“中花11”水稻杂交获得的F1植株收获的种子，继续种植得到F2植株。在采用本发明设计的引物（SEQIDNo.3和SEQIDNo.4）对F2植株进行了检测，从4%琼脂糖凝胶电泳检测后的条带类型也反映出F2群体有三种不同类型植株。其中DNA分子量只有206bp一条带对应于自交后代香味基因纯合植株PCR产物，具有198bp和206bp条带对应于自交后代香味基因杂合植株PCR产物；只有198bp一条带对应于自交后代非香纯合植株PCR产物。同样我们也使用了1.7%KOH溶液对F2植株的叶片进行香味检测。同样由于香味属于隐性性状，对于出现198bp条带的纯合非香植株和同时出现198bp和206bp条带的杂合植株都没有香味，只有出现206bp条带的植株才有香味。根据遗传分离规律推测，在F2群体中，能够从叶片中检测到没有香味和具有香味的植株理论比例为3：1。我们分析了81棵F2植株，其中有23棵植株具有香味，58棵植株没有香味。而且数值及植株与采用本发明设计的引物（SEQIDNo.3和SEQIDNo.4）进行的检测结果相同及完全对应。使用χ²检测本实施例中得到的具有香味和没有香味植株分别为23棵和58棵的数据进行分析。结果显示，该数值符合没有香味和具有香味的植株比例为3：1的理论分离比。

又将与“上师香2号”香型水稻具有同样突变的新型甜菜碱醛脱氢酶2基因的“南海138”香稻与非香水稻“C418”杂交F1植株继续与非香水稻“C418”回交，所得后代植株总DNA的PCR产物用4%琼脂糖凝胶电泳检测。无香味基因的纯合植株总DNA的PCR扩增产物分子量只有198bp条带，香味基因杂合类型植株总DNA的PCR扩增产物同时具有198bp和206bp条带。采用1.7%KOH溶液对回交一代的BC1F1植株叶片进行检测，所有植株都没有香味。

在杂交F1植株、自交的F2植株以及回交一代BC1F1植株的实际检测操作中，获得了与预计分子量完全相同的电泳结果，而且与使用KOH溶液进行香味的直接检测结果相对应。这说明本发明设计的引物，SEQIDNo.3和SEQIDNo.4，完全能够扩增包含编码链上游-1314位点在内的PCR产物，作为鉴别非香水稻与含有新型甜菜碱醛脱氢酶2基因的香型水稻。

使用KOH溶液对回交后代植株叶片进行检测，所有植株都没有香味，但是通过采用PCR检测分子标记就能够从电泳后的凝胶图上区分出依然含有香味基因的杂合植株和非香植株，从这之间的差异更能够反映出使用分子标记检测在快速有效培育香型水稻新品种中的重要性和实用性。

实施例3培育抗条纹叶枯病的高产淡香型水稻

“上师香2号”水稻由“南海138”香稻与“嘉花1号”非香水稻杂交培育而成。尽管“上师香2号”水稻已经比“南海138”水稻产量超出许多，其产量与前几年上海市主栽的常规水稻“秀水128”持平。但是，“秀水128”水稻产量明显低于“秀水134”常规水稻的产量。“南海138”香稻和“嘉花1号”都不含水稻条纹叶枯病抗性基因，因此杂交培育出的“上师香2号”水稻也表现为不抗水稻条纹叶枯病。“秀水134”水稻具有条纹叶枯病抗性基因qSTV11^KAS，能够抗水稻条纹叶枯病。为此，我们将“上师香2号”水稻作为淡香型香稻亲本，与高产抗条纹叶枯病的“秀水134”水稻杂交及多代回交，培育出了产量比“上师香2号”水稻更高并且能够抗条纹叶枯病的的淡香型水稻新品种。

将非香水稻“秀水134”中的非香基因用A表示，“上师香2号”水稻中的淡香型基因用a表示。先将“秀水134”（AA）与淡香型的“上师香2号”（aa）杂交获得F1植株（Aa）。

再将杂交F1植株（Aa）继续与非香型“秀水134”水稻（AA）回交，获得回交一代种子（BC1F1）。种植回交一代种子，在水稻开花前田间观察回交一代植株（BC1F1）。为了在回交一代植株中引入更多“秀水134”水稻的遗传组成，还需要将回交一代植株中含有香味基因的杂合植株继续与“秀水134”水稻（AA）回交。

在回交一代植株（BC1F1）群体香味基因有两种基因型：AA和Aa，即纯合的非香植株和杂合植株。选取农艺性状更接近“秀水134”水稻的植株取叶片，提取BC1F1植株总DNA为模板，并用SEQIDNo.3和No.4的核苷酸序列作为上下游引物进行PCR扩增（扩增方法同实施例2）。用6%非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测BC1F1植株，同时以“上师香2号”香型水稻和“秀水134”水稻作为对照。非香型“秀水134”对照水稻PCR扩增产物的分子量198bp；香稻品种“上师香2号”水稻PCR扩增产物的分子量206bp；回交植株PCR扩增产物有两种情况，同时含有198bp和206bp条带杂合植株和只有198bp条带的纯合非香植株。从中选取同时含有198bp和206bp条带的植株继续与“秀水134”水稻（AA）回交，得到回交第二代种子（BC2F1）。

继续种植回交第二代种子。回交第二代植株（BC2F1）香味基因位点遗传组成同样是AA和Aa。同样田间观察回交第二代植株，选取农艺性状更接近“秀水134”水稻的植株取叶片，再利用本发明设计的鉴定分子标记的一对引物对回交第二代植株（BC2F1）进行PCR扩增，同样将含有198bp和206bp条带的香味基因的杂合子水稻再与“秀水134”非香型水稻回交获得回交第三代种子以及植株（BC3F1）。

采用如上同样的方法，获得回交第四代（BC4F1）、回交第五代（BC5F1）和回交第六代（BC6F1）植株。

从理论上推测，在回交第六代植株（BC6F1）中，“秀水134”水稻的遗传组成大于99%。同样利用本发明的一对引物鉴定香味基因分子标记的方法，从回交第六代（BC6F1）植株中筛选含有198bp和206bp条带的香味基因的杂合子植株，并通过自交收获种子（BC6F2），并种植得到BC6F2植株。利用本发明设计的一对引物对自交植株进行PCR扩增，选出香味基因位点纯合的植株，即PCR扩增产物只有206bp一条带的水稻植株。

为了在新培育的淡香型水稻中保留原先在“秀水134”水稻中的条纹叶枯病抗性基因，因此在筛选获得香味基因位点纯合的植株中，进一步使用本实验室许言福等建立鉴定qSTV11^KAS基因的方法（许言福等，上海农业学报，2013，29（5）），继续鉴定筛选出qSTV11^KAS基因也呈纯合状态的植株。

从分子标记鉴定为香味基因位点纯合的植株上收获种子（BC6F3）。取100粒种子去掉颖壳后，将糙米放入10ml试管中，加入1.7%KOH溶液并盖过糙米，迅速盖上试管盖子。约10分钟后打开离心管盖子，迅速用鼻嗅来鉴别香味情况。在采用KOH溶液检测糙米香味时，同时取非香型“秀水134”水稻和“上师香2号”以及甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上有突变的香稻一起作为对照。从KOH溶液检测结果显示，新培育的高产香型水稻稻米的香味程度与“上师香2号”相当，但介于“秀水134”非香型水稻和甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上有突变的水稻之间。

将淡香型基因和条纹叶枯病抗性基因都纯合的植株上收获的种子以一穗种一个小区的形式继续种植，在不同生长时期田间观察，选取各项农艺性状都稳定，并且产量能够与“秀水134”相当的小区，并收获种子。由此成功培育出了能够抗条纹叶枯病高产淡香型水稻新品系。

Claims (4)

1.一种水稻香味基因在培育淡香型水稻方面的应用，其特征在于，所述的水稻香味基因是甜菜碱醛脱氢酶2基因，在编码链起始密码子第一个核苷酸上游-81处有3bp缺失，在上游-1314处具有8bp插入突变的水稻新的甜菜碱醛脱氢酶2基因，缺失的序列为gtc，插入的序列为aaatctag；其编码链起始密码子第一个核苷酸上游区域为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；所述水稻香味基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。

2.一组筛选淡香型水稻分子标记的引物，其特征在于，所述引物用于鉴定筛选含有香味基因的水稻，上游和下游的引物序列分别如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示；

SEQIDNo.35’-ATAATATCGGTCGAAACATTTTTATT-3’

SEQIDNo.45’-GAGAAGCTTTTACACTTTATGCACATC-3’；

所述的水稻香味基因是甜菜碱醛脱氢酶2基因，核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；在编码链起始密码子第一个核苷酸上游-81处有3bp缺失，在上游-1314处具有8bp插入突变的水稻新的甜菜碱醛脱氢酶2基因，缺失的序列为gtc，插入的序列为aaatctag；其编码链起始密码子第一个核苷酸上游区域为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。

3.一种筛选淡香型水稻的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取水稻总DNA为模板，用权利要求2所述的引物进行扩增；

(2)将PCR产物进行凝胶电泳检测；

如模板总DNA由纯合非香型水稻提取，扩增产物只有198bp条带；

如模板总DNA由纯合香型水稻提取，扩增产物只有206bp条带；

如模板总DNA由香型与非香型水稻杂交后代的杂合子水稻提取，同时具有198bp条带和206bp条带扩增产物；

如模板总DNA由香型水稻与非香型水稻杂交后又与非香型水稻回交的后代水稻提取，只有198bp条带的为无香味基因纯合植株；同时具有198bp和206bp条带的为香味基因杂合类型植株；

如模板总DNA由香型水稻与非香型水稻杂交后的自交后代水稻提取，只有206bp条带的为香味基因纯合植株；只有198bp条带的为非香味基因纯合植株；同时具有206bp和198bp条带的为香味基因杂合类型植株；

所述的香型水稻含有水稻香味基因，所述的水稻香味基因为甜菜碱醛脱氢酶2基因，核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，在编码链起始密码子第一个核苷酸上游-81处有3bp缺失，在上游-1314处具有8bp插入突变的水稻新的甜菜碱醛脱氢酶2基因，缺失的序列为gtc，插入的序列为aaatctag；其编码链起始密码子第一个核苷酸上游区域为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。

4.权利要求3所述筛选淡香型水稻的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为：93℃～95℃预变性5分钟；93℃～95℃变性45秒，52℃退火45秒，71℃～73℃延伸30秒，共32～35个循环；最后71℃～73℃延伸8～12分钟。