CN104419763B - 黄瓜单拷贝基因的染色体物理定位方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黄瓜单拷贝基因在染色体上物理定位的方法，它是通过PCR扩增获得黄瓜单拷贝基因，然后对产物进行凝胶电泳回收纯化，以纯化产物为模板进行第二次PCR扩增，然后将第二次PCR产物标备探针。分别取黄瓜根尖和盛花期植株上的花蕾进行酶解，涂片法制片，挑选分散度高的片子，并进一步进行胃蛋白酶处理后，备用。最后将标好的探针杂交到处理好的载玻片上，在荧光显微镜下观察信号。本发明采用PCR扩增后切胶回收，之后再进行二次PCR扩增的方法，不仅可以去除基因组DNA的干扰，而且解决了切胶回收率低的问题；另外涂片法结合胃蛋白酶处理制作背景清晰且分散度高的片子可以提高信号的分辨率；通过此方法，可在染色体上直接检测到的最短长度为2kb的单拷贝基因，为黄瓜的细胞遗传学研究提供了可靠的保证。

Description

黄瓜单拷贝基因的染色体物理定位方法

一、技术领域

本发明公开了利用荧光原位杂交技术直接将黄瓜单拷贝基因在染色体上进行物理定位的方法，有利于开展黄瓜的细胞遗传学研究，属于植物生物技术领域。

二、技术背景

黄瓜(Cucumis sativus L.，2n＝14)是世界上最重要的蔬菜作物之一。黄瓜具有一些特殊的性状，如性别表型多样化、线粒体的父性遗传性等；同时黄瓜的基因组相对较小(约370Mb)，染色体数目少，仅为14条，使得黄瓜成为近年来分子细胞遗传学研究的模式物种之一。

细胞遗传图谱是指遗传上标记的探针在染色体上的位置，涉及了细胞学上的标志，例如着丝粒、端粒、异染色质区和核仁组织区等。伴随着基因组研究的进步，细胞遗传图谱不仅对于整合遗传、分子和细胞学的信息具有重要的价值，并且能为染色体水平上观察基因组结构提供一种独特的研究思路。

基因或特定序列的染色体物理定位是细胞遗传相关研究的重要内容之一。传统的FISH技术对目标片段长度有一定的要求，一般片段至少在10kb以上才能检测到可见的信号。目前基因染色体物理定位的主要方法是利用包含该基因的大片段克隆进行染色体荧光原位杂交，从而进行相应基因的物理定位，这些大片段克隆主要有BAC、Fosmid等。该方法依赖于大片段文库的构建、以及利用相应的分子标记筛选获得特写的克隆，才能用于基因的物理定位。

构建细胞遗传图谱最直接、最有效的方式是通过FISH直接将单拷贝基因定位到染色体上，多数基因的长度在10kb以下，这对FISH的检测精度提出了新的挑战。在植物染色体上，短片段序列的检测更为很难，主要是由于植物细胞壁碎片和浓厚的细胞质不易去除，背景较高，同时阻止了靶DNA的顺利进入，最终导致了相对低的信噪比。迄今，单拷贝基因的FISH检测仅来自于少数几个实验室的报道。例如Fransz等人(1996年)在矮牵牛的有丝分裂中期染色体上用1.4kb大小的探针定位了查耳酮合酶基因A；Ohmido等人(1998年)在水稻有丝分裂中期染色体上定位了一个1.29kb大小的序列；Wang(2006)等在玉米粗线期染色体上能检测到3kb的基因信号。然而，由于技术上的难度，单拷贝基因的染色体物理定位在植物中仍未见广泛的应用。

目前，单拷贝基因在黄瓜中期和粗线期染色体上的定位仍未见报道，我们通过改进制片技术，并利用纯化的单拷贝基因进行FISH检测，能在染色体上看到明显的单拷贝基因的信号，最小能检测到2Kb的基因片段，从而实现了单拷贝基因在染色体上的直接物理定位。

三、发明内容

技术问题

本发明黄瓜单拷贝基因在染色体上的物理定位方法的目的，是针对以往黄瓜单拷贝基因无法在黄瓜染色体上进行直接定位等缺陷，发明能通过FISH在黄瓜中期和粗线期染色体上检测到小至2kb长度的单拷贝基因的信号，为制作高分辨率的黄瓜染色体的物理图谱奠定了基础，加快了黄瓜的细胞遗传学研究进展。

技术方案

本发明所提供的黄瓜单拷贝基因在染色体上的物理定位，其特征在于：在黄瓜中期和粗线期染色体上观察到了清晰明显的且片段小至2kb的单拷贝基因探针的信号。

上述黄瓜单拷贝基因能够定位在染色体上，是通过以下方法获得的：

取黄瓜植株根尖以及盛花前期和盛花期大小的花蕾，分别用固定液固定备用。

取出固定好的根尖和花蕾，处理之后酶解，然后用涂片法制片，镜检，进一步用胃蛋白酶进行细胞质的去除，然后用乙醇梯度干燥，备用。

根据黄瓜基因组数据库，随机选择黄瓜单拷贝基因，利用Primer5.0设计引物，利用长片段Taq酶进行PCR扩增，扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，然后进行切胶回收。

将得到的回收产物作为DNA模版，再进行二次PCR扩增。

将二次PCR产物标成探针备用，通过FISH，将探针杂交到黄瓜染色体上，在荧光显微镜下观察信号。

有益效果

本发明与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：

1)黄瓜单拷贝基因通过FISH能够在黄瓜中期和粗线期染色体检测到信号(图1和2)，且检测到的探针信号的最小片段小于2kb(图4)，与现有技术相比，充分提高了靶信号的灵敏度。

2)现有的技术在定位目标基因时，主要利用大片段文库进行FISH定位，这需要事先构建好相应的文库，需要特定的条件。同时还需要在文库中筛选获得包含目标基因的克隆，程序相当繁琐。而使用现在的方法可以直接进行基因的定位，检测到的最小探针长度为2kb，适合于绝大多数基因的定位需要。

3)在材料准备方面，制作分散度高的片子，这样可以使杂交上去的探针信号更加清晰，提高了定位的准确性，加快了实验进程。

4)将PCR扩增出来之后，进行切胶回收，这样可以去除基因组DNA的干扰，使得目标探针信号在染色体上清晰可辨。

四、附图说明

图1：利用本发明制作的单拷贝基因在黄瓜粗线期染色体上的定位，单拷贝基因的信号明显，无重复序列的干扰。

图2：单拷贝基因在黄瓜五号染色体中期染色体上的定位，中期染色体分散度高，很容易分辨出信号的定位。

图3：三个单拷贝基因在黄瓜五号染色体粗线期染色体上的定位，能清晰的分辨出目标信号在染色体上的分布。

图4：2.0kb的单拷贝基因片段在黄瓜四号中期染色体上的定位，充分显示了黄瓜靶信号灵敏度的提高。

五、具体实施方式

本发明黄瓜单拷贝基因在染色体上的定位的实施程序包括：

(1)PCR产物的切胶回收：以黄瓜DNA为模版，按照体系进行第一次PCR扩增，然后将产物全部加到琼脂糖凝胶中进行检测，针对不同的产物，分别切胶，然后根据试剂盒进行回收，回收完之后对回收后的产物进行检测，得到不同的产物不同的浓度。

(2)第二次PCR扩增及标探针：根据产物的浓度不同，调整体系混样。扩增之后对产物进行检测。挑选浓度较高的第二次PCR产物，分别标成红色和绿色的探针，备用。

(3)材料准备：在黄瓜植株上取适当的根尖以及在盛花前期和盛花期取适当大小的花蕾，分别放入体积比为3∶1的M：G(甲醇：冰醋酸)、E：G(乙醇：冰醋酸)固定液中固定至少24小时，超过一周的话可将根尖和花蕾换到70％的乙醇中，酶解好备用。

(4)制片：①取出酶解好的其中的一个花药，放入另一新的1.5ml离心管中，加入约100ul的E：G固定液，将花药捣碎，吸出约30ul的含粗线期染色体的液体，涂于载玻片上，再加上100ul的E：G固定液，在酒精灯上烧片干燥制片；②取出酶解好的其中一个根尖，放在干净的载玻片上用镊子敲碎，再加上100ul的M：G固定液，在酒精灯上烧片干燥制片。

(5)FISH：根据FISH程序，将探针加到载玻片上进行杂交过夜，第二天进行洗片，压片。然后在荧光显微镜下观察单拷贝基因的信号即可。

Claims (2)

1.一种黄瓜单拷贝基因的染色体物理定位方法，其特征在于：

通过荧光原位杂交，能在黄瓜中期和粗线期染色体上检测到最短长度为2.0kb的单拷贝基因的荧光原位杂交信号；

所述的在黄瓜中期和粗线期染色体上检测到最短长度为2kb的单拷贝基因的荧光原位杂交信号，是通过以下方法获得的：

1)黄瓜染色体上的单拷贝基因利用基因组DNA作模板，进行PCR扩增之后，1％的琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收；

2)以切胶回收的DNA为模板，再进行二次PCR扩增，利用扩增后的产物标探针；

3)取酶解好的花药或根尖，加入适量固定液制成悬浊液涂片，再利用涂片法制片，镜检，挑选染色体分散度高的制片，进一步利用胃蛋白酶消化去除细胞质后，干燥备用；

所述根尖放入体积比为3∶1的甲醇∶冰醋酸固定液中固定至少24小时；所述花药放入体积比为3∶1的乙醇∶冰醋酸固定液中固定至少24小时；所述花药和根尖的固定时间超过一周后将根尖和花药换到70％的乙醇中；

所述制片过程具体为：①取出酶解好的其中的一个花药，放入另一新的1.5ml离心管中，加入100ul的乙醇∶冰醋酸固定液，将花药捣碎，吸出30ul的含粗线期染色体的液体，涂于载玻片上，再加上100ul的乙醇∶冰醋酸固定液，在酒精灯上烧片干燥制片；②取出酶解好的其中一个根尖，放在干净的载玻片上用镊子敲碎，再加上100ul的甲醇∶冰醋酸固定液，在酒精灯上烧片干燥制片；

4)将标好的探针杂交到黄瓜染色体上，通过荧光原位杂交检测信号。

2.根据权利要求1所述的一种黄瓜单拷贝基因的染色体物理定位方法，其特征在于，在黄瓜中期和粗线期染色体上检测到最短长度为2.0kb的单拷贝基因的荧光原位杂交信号，是由于探针既没有基因组DNA的干扰，并经过第二次PCR扩增之后，浓度较高，而且经过预处理的载玻片背景较干净，易于探针杂交上去。