CN103305614B - 一种紫薇属植物染色体的原位杂交方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种紫薇属植物染色体的原位杂交方法，包括制片、制备探针、杂交前预处理、制备杂交液、探针变性与染色体变性、杂交和检测七个步骤。以紫薇属植物中期染色体作为靶DNA，以玉米45S？rDNA为探针，将玉米45S？rDNA探针清晰的定位在紫薇属植物染色体上。本发明所述的杂交方法能有效消除背景干扰，提高检测灵敏度和准确性，可以较好的应用于紫薇属等小染色体植物的染色体检测，为紫薇属植物染色体的深入研究，提供了新的途径和方法。

Description

一种紫薇属植物染色体的原位杂交方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及紫薇属植物染色体的原位杂交方法。

背景技术

分子原位杂交（Insituhybridization，简称ISH）是把用生物素等标记物质标记的DNA片段作为探针（probe），与染色体DNA进行分子杂交，在显微镜下直接检测与探针互补的DNA片段的存在部位。通过荧光原位杂交技术将rDNA在染色体上进行物理定位，不仅可以为核型分析提供一个稳定有效的细胞学可识别的染色体标记，而且可以研究植物种属间的进化关系，阐明染色体的结构变异等重要的遗传学问题。目前，rDNA已在重要的模式作物和经济作物的基因组中进行了广泛的物理定位，为这些物种的染色体识别，基因组结构分析，物理图谱构建，以及物种亲缘关系的研究提供了直接的信息。

紫薇（Lagerstroemiaindica）隶属于千屈菜科（Lythraceae）紫薇属，是我国夏季重要的观赏花木。目前，全世界紫薇属植物共有约55种，我国原产18种。该属植物多为中小染色体，且不易染色，经典的细胞学手段难于识别其染色体，限制了深入理解紫薇分子细胞遗传学机制的研究。迄今为止，关于原位杂交技术在紫薇属植物中的应用未见报道，对其基因组的结构，分子细胞遗传学领域的研究至今还是空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测紫薇属植物染色体的原位杂交方法以应用于紫薇属植物染色体的深入研究。

为了实现本发明的目的，本发明提供一种紫薇属植物染色体的原位杂交方法，所述方法以紫薇属植物中期染色体作为靶DNA，以玉米45SrDNA为探针进行染色体荧光原位杂交。

具体地，所述方法包括以下步骤：

（1）染色体玻片标本的制备；

（2）探针标记；

（3）杂交前预处理；

（4）制备杂交液；

（5）探针变性与染色体变性；

（6）杂交与杂交后洗脱；

（7）信号检测。

其中，所述步骤1）以紫薇属植物茎尖为材料，采用去壁低渗火焰干燥法制备。

其中，所述步骤2）将40-60ng/μl玉米45SrDNA质粒8-10份、DIG-Nicktranslationmix或Biotin-Nicktranslationmix4份和ddH2O6-8份按体积比混合，15℃避光反应90min，加入EDTA1份，得探针标记混合液。

优选地，玉米45SrDNA质粒为10份，ddH2O为6份。

其中，所述步骤3）将步骤1）制得的染色体玻片标本干燥，经RNaseA、胃蛋白酶K处理，乙醇脱水。

其中，所述步骤4）制备杂交液的成分按体积比百分含量为50%的去离子甲酰胺，20%的50%DS溶液，20%的10mg/ml鲑鱼精溶液和探针混合液，10%的20×SSC溶液；其中，10mg/ml鲑鱼精溶液和探针混合液为探针标记混合液2-4份和10mg/ml鲑鱼精溶液4份按体积比混合60-65℃烘箱避光烘烤。

优选地，10mg/ml鲑鱼精溶液和探针混合液为探针标记混合液4份和10mg/ml鲑鱼精溶液4份按体积比混合60-65℃烘箱避光烘烤。

其中，步骤5）中所述探针变性为将步骤4）中得到的杂交液在94℃-96℃金属浴避光变性10min，转入冰水中处理10min，得变性探针。

优选地，95℃金属浴避光变性10min。

其中，步骤5）中所述染色体变性为制备变性液：按体积比百分含量为70%去离子甲酰胺，20%ddH2O，10%的20×SSC溶液；把变性液加到染色体制片玻片上，盖上盖玻片，83℃-85℃烘箱内避光变性3-4min，然后迅速甩掉盖玻片，-20℃下依次用70%、95%、100%乙醇脱水，每级5min，晾干。

优选地，85℃烘箱内避光变性3.5min。

其中，所述步骤6）中所述杂交为将含有探针的杂交液变性后加在染色体制片玻片上，盖上盖玻片，37℃恒温箱内黑暗培养16-18h；所述杂交后洗脱为将杂交后的染色体玻片标本依次放入2×SSC溶液，洗2×5min，放入2×SSC溶液，42℃恒温水浴10min，放入1×PBS溶液，洗5min，然后加与标记的荧光素匹配的抗体衬染。

其中，所述步骤7）为加2mg/mlDAPI荧光染液于步骤6）得到的染色体玻片标本上，染色时间5-8min，进行检测。

优选地，染色时间5min。

本发明的有益效果：

本发明清楚显示了紫薇属植物染色体45SrDNA位点，杂交特异性高，确定了合适的变性温度、变性时间、杂交时间等，使得原位杂交技术可以较好的应用于紫薇等小染色体植物的染色体检测，为紫薇属植物染色体的深入研究，提供了新的途径和方法，有利于其他基因在染色体上的物理定位，并为紫薇属植物染色体基因组原位杂交技术的开展奠定了良好基础。

附图说明

图1为玉米45SrDNA在紫薇属尾叶紫薇中信号位点分布图像，其中箭头所指为信号位点；

图2为玉米45SrDNA在紫薇属屋久岛紫薇中信号位点分布图像，其中箭头所指为信号位点。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明所用试剂：

20×SSC溶液（柠檬酸钠缓冲液）：175.3gNaCl、88.2gNa₂C₆H₅O₇·2H₂O和1000mlddH₂O的混合液；

10×PBS溶液（磷酸缓冲液）：80gNaCl、32.3gNa₂HPO₄·12H₂O、4.5gNaH₂PO₄·2H₂O和1000mlddH₂OpH=7.4的混合液。

2×SSC溶液：ddH₂O与20×SSC溶液体积比为9:1的混合液。

4×SSC溶液：ddH₂O与20×SSC溶液体积比为4:1的混合液。

1×PBS溶液：ddH₂O与10×PBS溶液体积比为9:1的混合液。

10mg/ml鲑鱼精溶液：将10mg鲑鱼精粉末溶于1ml蒸馏水中，沸水溶解5min后分装，-20℃保存。

50%DS溶液：0.5g硫酸葡聚糖粉末溶于1ml水中，68℃水浴溶解3h后分装，-20℃保存。

2μg/mlAnti-Dig-Rhodamin溶液：将200μgAnti-Dig-Rhodamin粉末溶于1mlddH₂O中，4℃保存。使用时，用5%BSA溶液进行稀释，即1μl200μg/mlAnti-Dig-Rhodamin溶液溶于99μl5%BSA溶液。

5%BSA溶液：5g小牛血清蛋白粉末，溶于100ml4×SSC溶液。

DAPI荧光染液：2mgDAPI粉末溶于1mlddH₂O中，分装后4℃保存。

0.1mg/ml胃蛋白酶K溶液：将10mg粉末溶于1mlddH₂O中配成原液，使用时将原液与ddH₂O按照1:99的配比进行稀释使用。

0.1mg/mlRNaseA溶液：将10mg粉末溶于1mlddH₂O配成原液，使用时将原液与ddH₂O按1:99的配比进行稀释使用。

DIG-Nicktranslationmix、Biontin-Nicktranslationmix购自Roche，Germany。

供试材料：紫薇属尾叶紫薇、屋久岛紫薇采自国家花卉中心(北京小汤山)种质资源圃。

供试质粒：玉米45SrDNA探针质粒由中国农业大学玉米改良中心金危危教授实验室馈赠。

实施例1

1、染色体玻片标本的制备：

于早上9:00取尾叶紫薇一年生枝条茎尖生长点最内侧长度为0.5cm的茎尖部分。直接放入固定液（按体积比，无水乙醇:冰醋酸（分析纯）:三氯甲烷（分析纯）=5:3:2）中于-20℃冰箱中固定18h。于蒸馏水中润洗洗净固定液，转移至0.075mol/LKCl溶液中前低渗30min；将前低渗处理后的茎尖生长点用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，放入混合酶液中于37℃水浴酶解4h，混合酶液为2.5%纤维素酶：2.5%的果胶酶：0.01%蛋白酶K按体积比2:1:3配制而成。火焰干燥法制片，在光学显微镜下进行镜检，选择图像清晰、染色体分散程度高的中期分裂相标本放在-20℃冰箱中保存备用。

2、探针标记

玉米45SrDNA质粒采用碱裂解法试剂盒（购自Biomiga）提取，质粒浓度47.5ng/μl。以玉米45SrDNA质粒为探针，DIG-Nicktranslationmix为标记物，用德国罗氏公司生产的地高辛缺口转移试剂盒标记（Roche，Germany）。20μl探针标记混合液中包含：玉米45SrDNA探针10μl，DIG-Nicktranslationmix4μl，加ddH₂O6μl至终体积20μl，15℃避光反应90min，加入1μl50mMEDTA（购自Fermentas）终止反应。

3、杂交前预处理。

65℃烘箱内染色体玻片干燥1h，加100μl0.1mg/mlRNA酶溶液于染色体玻片标本上，盖上封口膜，放入底部有水的湿盒中37℃温育1h。揭掉封口膜，将染色体玻片放入盛有2×SSC溶液的染缸内，100rpm摇洗2×5min后取出。无需晾干，加20μl0.1mg/ml胃蛋白酶K溶液于染色体制片标本上，盖上封口膜，放入底部有水的湿盒中37℃温育10min。揭开封口膜，将染色体玻片放入盛有1×PBS溶液的染缸内，100rpm摇洗2×5min后取出。然后-20℃下依次用70%、95%、100%乙醇脱水，每级5min，气干。

4、制备杂交液。

按照每张染色体玻片加入4μl探针的量配制杂交液。标记20μl探针杂交液：取4μl10mg/ml鲑鱼精溶液放入离心管中，在管壁上画线记住刻度，加入4μl探针标记混合液，把离心管放于65℃烘箱内开盖烘烤至4μl刻度处；加入去离子甲酰胺10μl、20×SSC溶液2μl、50%DS溶液4μl，短暂离心。

5、探针变性与染色体变性。

探针变性：把上一步骤制得的含有探针的杂交液在95℃金属浴避光变性10min，转入冰水中处理10min，得变性探针。

染色体变性：配制染色体变性液，每张片子加入100μl变性液，按体积比百分含量为70%去离子甲酰胺，20%ddH₂O，10%的20×SSC溶液配制。把变性液加到染色体制片玻片上，盖上盖玻片，85℃烘箱内避光变性3.5min，然后迅速甩掉盖玻片，-20℃下依次用70%、95%、100%乙醇脱水，每级5min，气干。

6、杂交与杂交后洗脱。

将含有探针的杂交液变性后加在染色体制片玻片上，盖上盖玻片，37℃恒温箱内黑暗培养16-18h，进行杂交。将杂交后的染色体玻片标本依次放入盛有2×SSC溶液的染缸中，100rpm摇洗2×5min；放入盛有2×SSC溶液的染缸中，42℃恒温水浴10min；放入盛有1×PBS溶液的染缸中，100rpm摇洗5min。无需晾干，加100μl2μg/mlAnti-Dig-Rhodamin溶液于玻片上，盖上封口膜，放入底部有水的湿盒中37℃温育1h。揭开封口膜，将染色体玻片放入盛有1×PBS溶液的染缸中，100rpm摇洗2×5min，转入盛有无菌水的染缸中，100rpm摇洗2×2min，气干，以上步骤皆在避光处进行。

7、信号检测。

加20μl2mg/mlDAPI荧光染液于染色体玻片标本上，盖上封口膜，染色时间5min后，揭开封口膜，加20μl抗荧光淬灭封片液，盖上盖玻片，荧光显微镜下镜检观察。

用OlympusBX-51荧光显微镜观察杂交信号，Cytovision软件进行拍照，Photoshop软件进行图像处理。图一是玉米45SrDNA在紫薇属尾页紫薇中信号位点分布图像，信号在彩色照片中显示为红色，在本说明书附图中由箭头标记。

实施例2

与实施例1所不同处是材料为屋久岛紫薇。其步骤及信号观察均同实施例1。

结果表明，从图1和图2中可见，用Dig标记的玉米45SrDNA探针与紫薇属植物染色体制片杂交具有2个信号点（由箭头标记）。背景干扰弱，灵敏度和准确性高，使得原位杂交技术可以较好的应用于紫薇等小染色体植物的染色体检测，为紫薇属植物染色体的深入研究，提供了新的途径和方法。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种紫薇属植物染色体的原位杂交方法，其特征在于以紫薇属植物中期染色体作为靶DNA，以玉米45SrDNA为探针进行染色体荧光原位杂交；

具体包括以下步骤：

1)染色体玻片标本的制备；

2)探针标记：将40-60ng/μl玉米45SrDNA质粒10份、DIG-Nicktranslationmix或Biotin-Nicktranslationmix4份和ddH₂O6份按体积比混合，15℃避光反应90min，加入EDTA1份，得探针标记混合液；

3)杂交前预处理；

4)制备杂交液；

5)探针变性与染色体变性；

6)杂交与杂交后洗脱；

7)信号检测；

其中：所述步骤1)以紫薇属植物茎尖为材料，采用去壁低渗火焰干燥法制备；放入固定液中于-20℃冰箱中固定18h；于蒸馏水中润洗洗净固定液，转移至0.075mol/LKCl溶液中前低渗30min；将前低渗处理后的茎尖生长点用蒸馏水润洗，吸水纸吸干，放入混合酶液中于37℃水浴酶解4h；所述混合酶液为2.5％纤维素酶：2.5％的果胶酶：0.01％蛋白酶K按体积比2:1:3配制而成；所述固定液为无水乙醇:冰醋酸:三氯甲烷按体积比5:3:2配制而成；

所述步骤3)将步骤1)制得的染色体玻片标本干燥，经RNaseA、胃蛋白酶K处理，乙醇脱水；

所述步骤4)制备杂交液的成分按体积比百分含量为50％的去离子甲酰胺，20％的50％DS溶液，20％的10mg/ml鲑鱼精溶液和探针混合液，10％的20×SSC溶液；其中，10mg/ml鲑鱼精溶液和探针混合液为探针标记混合液4份和10mg/ml鲑鱼精溶液4份按体积比混合60-65℃烘箱避光烘烤；

步骤5)中所述探针变性为将步骤4)中得到的杂交液在95℃金属浴避光变性10min，转入冰水中处理10min，得变性探针；

步骤5)中所述染色体变性为制备变性液：按体积比百分含量为70％去离子甲酰胺，20％ddH2O，10％的20×SSC溶液；把变性液加到染色体制片玻片上，盖上盖玻片，85℃烘箱内避光变性3.5min，然后迅速甩掉盖玻片，-20℃下依次用70％、95％、100％乙醇脱水，每级5min，晾干；

步骤6)中所述杂交为将含有探针的杂交液变性后加在染色体制片玻片上，盖上盖玻片，37℃恒温箱内黑暗培养16-18h；所述杂交后洗脱为将杂交后的染色体玻片标本依次放入2×SSC溶液，洗2×5min，放入2×SSC溶液，42℃恒温水浴10min，放入1×PBS溶液，洗5min，然后加与标记的荧光素匹配的抗体衬染；

所述步骤7)为加2mg/mlDAPI荧光染液于步骤6)得到的染色体玻片标本上，染色时间5min，进行检测。