CN103207104B - 一种植物体内铁元素染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物体内铁元素染色方法。它是将植物材料分割成小块，将其浸入Perls染色液中染色，染色后的植物材料小块用去离子水漂洗，漂洗后植物材料小块置于水合氯醛试液中，直至植物材料小块完全透明为止，取出植物材料小块即得到铁元素染色好的材料。本发明将普鲁士蓝Perls铁染色法和水合氯醛透明法有机的结合起来，在尽量保持植物材料完整的情况下，在整体上显示其植物体内铁的分布，其具有周期短：切片法一般需要一周的时间才能得到结果，而本方法可以在一天内得到结果；操作简单，不需要昂贵设备的优点。
Description
技术领域：
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种植物体内铁元素染色方法。
背景技术：
普鲁士蓝（Perls)染色法是一种古老而又敏感的显示铁的染色方法。反应原理是组织内的高价铁与亚铁氰化钾反应生成不可溶的蓝色沉淀（普鲁士蓝）。因为它操作简单，成本低，特异性好，现为实验室最常用的显示生物体内铁分布的方法(Meguro,Asanoetal.2007)。目前，在植物铁代谢的研究中，显示铁分布的方法是在切片的基础上再加上Perls染色(GreenandRogers2004,Roschzttardtz,Conejeroetal.2009,Zhang,Xuetal.2012)。这种方法不但不能从整体上显示植物体内的铁的分布，而且试验周期长（大约一周），费时，费力。
水合氯醛试液，为常用优良的化学透明剂，它能迅速渗透入组织，还可以使干燥收缩的细胞迅速复原，并能溶解大多数细胞内含物，使细胞清晰透明。水合氯醛透明剂能否用在Perls铁染色中，来替代费时费力的切片，还没有研究报道。
发明内容：
本发明的目的是弥补传统的切片+Perls铁染色方法的不足，提供一种简单、快速、成本低的从整体上显示植物体内铁分布的植物体内铁元素染色方法。
本发明的植物体内铁元素染色方法，其特征在于，包括以下步骤：
将植物材料分割成小块，将其浸入Perls染色液中染色，染色后的植物材料小块用去离子水漂洗，漂洗后植物材料小块置于水合氯醛试液中，直至植物材料小块完全透明为止，取出植物材料小块即得到铁元素染色好的材料。
铁元素染色好的材料就可以置于载玻片上，也可以直接用水合氯醛试液+铁元素染色好的材料制成临时装片，在显微镜下观察，含铁的组织被染成蓝色（普鲁士蓝）。
所述的水合氯醛试液属于本领域技术人员常用的化学透明剂，其配制方法为：取水合氯醛50g，加水15ml和甘油10ml，溶解即为水合氯醛试液，备用。
所述的Perls染色液属于本领域技术人员常用的染色液，其配方为：
（A）4%盐酸：取2ml浓盐酸溶于50ml去离子水中；
（B）4%亚铁氰化钾：2g亚铁氰化钾溶于50ml去离子水中。
每次染色前，将A液和B液等量混合，成熟15分钟后，方可用于染色。
所述的小块，优选为2×2×2mm3的小块，染色时长为30min，去离子水漂洗的次数为3次。
漂洗后植物材料小块置于水合氯醛试液中，直至植物材料小块完全透明为止，在此过程中，可以更换一次水合氯醛试液。
上述植物体内铁元素染色方法的步骤中，1．所用的试剂最好用分析纯，所使用的水是超纯水或去离子水，所使用容器必须要纯净，操作全程最好配戴手套并避免与反应液体接触，不要接触金属，这样可以保证结果的可靠性；2．最好选用已知的阳性染色作为对照染色；3．Perls染色液一定要现用现配，超过l小时或溶液呈现微谈绿色，说明该溶液失效了；4．Perls染色液中染色时注意观察，可根据染色的深浅延长或缩短时间，这属于本领域的常规知识。
本发明将普鲁士蓝Perls铁染色法和水合氯醛透明法有机的结合起来，在尽量保持植物材料完整的情况下，在整体上显示其植物体内铁的分布，其具有周期短：切片法一般需要一周的时间才能得到结果，而本方法可以在一天内得到结果；操作简单，不需要昂贵设备的优点。附图说明：
图1是实施例1的拟南芥种子经本发明方法染色后的染色图；
图2是实施例1的拟南芥种子经本发明方法染色后的胚的染色图；
图3是实施例2的水稻胚经本发明方法染色后的染色图；
图4是实施例3的拟南芥的成熟种子经Perls-DAB染色法染色后横切面的染色图；
图5是实施例3的拟南芥的成熟种子经Perls-DAB染色法染色后纵切面的染色图；
图6是实施例4的拟南芥花蕾经本发明方法染色后的染色图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
水合氯醛试液，其配制方法为：取水合氯醛50g，加水15ml和甘油10ml，溶解即为水合氯醛试液，备用。
Perls染色液，其配方为：
（A）4%盐酸：取2ml浓盐酸溶于50ml去离子水中；
（B）4%亚铁氰化钾：2g亚铁氰化钾溶于50ml去离子水中。
每次染色前，将A液和B液等量混合，成熟15分钟后，方可用于染色。
实施例1：拟南芥种子中铁染色及显微镜观察
（1）为了利于Perls染色液的渗透，用锋利的刀片，将拟南芥的种皮切掉一部分。
（2）将步骤（1）中处理的种子浸入新鲜配制Perls染色液中，染色30分钟；
Perls染色液的配制：4%亚铁氰化钾和4%盐酸等量混合，成熟15分钟后备用；
（3）去离子水漂洗3次；
（4）将漂洗后的种子置于水合氯醛试液中，透明8个小时以上，或者过夜，至种子完全透明为止；
水合氯醛试液的配制：水合氯醛50g，水15ml和甘油10ml，溶解即得；
（5）吸取适量的水合氯醛试液透明剂连同步骤（4）处理后的种子滴在载玻片上，盖上盖玻片，不要压。
将采用上述方法得到的片子在普通显微镜下观察，照相。含铁的组织被染成蓝色（普鲁士蓝），结果如图1所示。稍微用力压片，将胚从种皮中释放出来，重新观察照相，结果如图2所示。本实施例能在整体上显示拟南芥种子中铁的分布，具有周期短、操作简单、不需要昂贵设备的优点。
实施例2：水稻胚中铁染色及显微镜观察
（1）用锋利的刀片和解剖针，将胚从水稻种子中解剖出来
（2）将解剖出来的胚浸入新鲜配制的Perls染色液中，染色30分钟；
Perls染色液的配制：4%亚铁氰化钾和4%盐酸等量混合，成熟15分钟后备用；
（3）去离子水漂洗3次；
（4）将漂洗后的胚置于水合氯醛试液中，透明8个小时以上，或者过夜，直至胚完全透明；
水合氯醛试液的配制：水合氯醛50g，水15ml和甘油10ml，溶解即得；
（5）将步骤（4）处理后的胚置于载玻片上，用锋利的刀片把胚一切为2，盖上盖玻片，稍微用力压一下。将采用上述方法得到的片子在普通显微镜下观察，照相。含铁的组织被染成蓝色（普鲁士蓝），结果如图3所示。本实施例能在整体上显示水稻胚中铁的分布，具有周期短、操作简单、不需要昂贵设备的优点。
实施例3：对比试验
选取若干拟南芥的成熟种子，随机分为两份，一份经本发明的植物体内铁元素染色方法进行染色，具体步骤见实施例1。
一份经切片加Perls-DAB染色法，具体步骤如下：（1）将拟南芥种子，放入10%中性福尔马林中（0.01MPBS，PH=7.4）固定10h以上，用0.01MPBS漂洗3次，每次30分钟；（2）系列酒精脱水，每级1-2h；（3）TO透明剂透明3次，每次2h；（4）透蜡，碎蜡和TO透明剂1:1，40度过夜，60度，换两次纯蜡，每次4h；（5）石蜡包埋，美国AO切片机切片，厚6-8um,40度烘片过夜；（6）脱蜡和复水：TO透明剂2次，TO透明剂和无水乙醇1:1,每次5分钟，100%,100%,95%,85%,70%,50%,30%,15%,ddH2O系列酒精复水，每级5分钟；（7）将切片浸入新鲜配制的Perls染色液中（4%亚铁氰化钾和4%盐酸等量混合，成熟15分钟）孵育30分钟；（8）去离子水漂洗3次；（9）DAB染液（武汉，博士德），染30分钟。封片观察照相。结果如图4和图5所示，由图4和图5可见，用Perls-DAB染色法铁元素显色的位置与实施例1中按照本发明的方法进行铁元素染色后的结果一致（图1），由此说明，本发明的方法是可靠，可行的。
表1：两种方法的指标对比
| 项目 | 周期 | 整体性 | 所需仪器 |
| 本发明的方法 | 10小时 | 好 | 显微照相 |
| 旧方法 | 70个小时以上 | 差 | 烘箱、切片机、显微照相 |
两种方法的对比如表1所示，由表1可见，本发明的植物体内铁元素染色方法能在整体上显示植物体内铁的分布，具有周期短、操作简单、不需要昂贵设备的优点。
实施例4：拟南芥花蕾中铁染色及显微镜观察
（1）用锋利的刀片将拟南芥的花蕾切下来；
（2）将新鲜的花蕾浸入新鲜配制的Perls染色液中，染色30分钟；
Perls染色液的配制：4%亚铁氰化钾和4%盐酸等量混合，成熟15分钟后备用；
（3）去离子水漂洗3次；
（4）将漂洗后的花蕾置于水合氯醛试液中，透明8个小时以上，或者过夜，期间换一次透明剂，直至花蕾完全透明为止；
水合氯醛试液的配制：水合氯醛50g，水15ml和甘油10ml，溶解即得；
（5）将步骤（4）处理后的花蕾置于载玻片上，盖上盖玻片，稍微用力压一下。
将采用上述方法得到的片子在普通显微镜下观察，照相。含铁的组织被染成蓝色（普鲁士蓝），结果如图6所示。本实施例能在整体上显示花蕾体内铁的分布，具有周期短、操作简单、不需要昂贵设备的优点。
Claims (3)
1.一种植物体内铁元素染色方法，其特征在于，包括以下步骤：将植物材料分割成小块，将其浸入Perls染色液中染色，染色后的植物材料小块用去离子水漂洗，漂洗后植物材料小块置于水合氯醛试液中，直至植物材料小块完全透明为止，取出植物材料小块即得到铁元素染色好的材料。
2.根据权利要求1所述的植物体内铁元素染色方法，其特征在于，所述的小块为2×2×2mm3的小块，染色时长为30min，去离子水漂洗的次数为3次。
3.根据权利要求1所述的植物体内铁元素染色方法，其特征在于，漂洗后植物材料小块置于水合氯醛试液中，直至植物材料小块完全透明为止，在此过程中，更换一次水合氯醛试液。
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