CN103070141B

CN103070141B - 家蚕胚胎发育进程的测定方法

Info

Publication number: CN103070141B
Application number: CN201310059955.XA
Authority: CN
Inventors: 李兵; 方艺璇; 王彬彬; 顾芝亚; 沈卫德; 洪法水
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2013-02-26
Filing date: 2013-02-26
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2033-02-26
Also published as: CN103070141A

Abstract

本发明公开了一种家蚕胚胎发育进程的测定方法，具体包括以下步骤：（1）构建待检测品种的家蚕胚胎的一型乙酰胆碱酯酶(ace1)相对转录表达量和胚胎发育进程的关联关系的模型；（2）在待测定家蚕胚胎中取一个以上作为样本,测定样本的ace1相对表达量然后对照步骤(1)所得模型,根据待测样本的ace1的相对转录表达量确定出家蚕胚胎的发育进程。该方法可以通过对少量蚕卵胚胎的发育进程进行测定而精确定量蚕卵整体的发育阶段，减少人为操作带来的误差，简化了测定流程，为家蚕胚胎的分子生物学研究提供发育进程的鉴定方法。

Description

家蚕胚胎发育进程的测定方法

技术领域

本发明涉及一种家蚕胚胎发育进程的测定方法，具体涉及一种基于基因相对转录表达量的家蚕胚胎发育进程的精确检测方法。

背景技术

家蚕（Bombyx moriL.）在我国已经被人工驯养5700多年，属鳞翅目蚕蛾科完全变态昆虫，世代包括卵、幼虫、蛹和成虫（蛾）四个虫态。家蚕卵从活化到孵化约需要13~14天，人们为了实现桑蚕卵孵化整齐，蚁蚕强健以及适时孵化的目的，在13~14天内要根据胚胎的发育进行进程对环境条件进行调整，这一操作过程称之为催青。

为了便于识别蚕卵不同的发育时期，对不同发育阶段的家蚕胚胎进行编号（甲：滞育后期、乙1：滞育期后、乙2：伸展期、丙1：最长期前、丙2：最长期、丁1：肥厚期、丁2：突起发生期、戊1：突起发达前期、戊2：突起发达后期、戊3：缩短期、己1反转期、己2：反转终了期、己3：气管形成期、己4：眼点期、己5：转青期），其中丙2、戊3、己4是三个重要的时期，分别为加温的起点时期、升温时期和确定发种时期。

催青的条件控制方法有很多种，但目前生产上普遍采用的是简化催青法，即把已经活化的桑蚕卵在温度为10~15℃，湿度75~80%的环境下进行中间感温7~10天，胚胎发育到丙2时期进行升温，用22℃，湿度80~85%催青到戊3，再用25℃，湿度85~90%催青至孵化。为了鉴定胚胎不同的发育时期，在生产上需要对催青过程中的桑蚕卵进行每天解剖，对胚胎的形态特征进行鉴别，确定发育进程。由于桑蚕卵很小，早期的胚胎上还附着大量的卵黄，影响对胚胎特征的识别；另外，解剖桑蚕卵只能是逐粒进行鉴定，由于桑蚕卵的孵化控制是一个批量控制的行为，所以传统的解剖也存在一定的误差，即个体特征不能反应整批发育进程。

家蚕不仅是重要的经济昆虫，也是模式昆虫，家蚕胚胎在发育生物学、遗传学以及基因工程等领域被广泛应用，客观上需要提供一种对家蚕胚胎的发育进程的精确定量方法。同时，具有相同遗传特征的同一品种家蚕不同批次在制种和感温处理过程中存在发育进程差异，而使用常规检测方法对不同批次进行全部解剖需要花费大量劳力，所以建立相应的省力化检测胚胎发育进程的方法很有必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种家蚕胚胎发育进程的测定方法，以简便、精确地确定家蚕胚胎的发育进程。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种家蚕胚胎发育进程的测定方法，包括以下步骤：

（1）构建待检测品种的家蚕胚胎的乙酰胆碱酯酶一型相对转录表达量和胚胎发育进程的关联关系的模型；

（2）在待测定家蚕胚胎中取一个以上作为样本, 测定样本的乙酰胆碱酯酶一型相对表达量然后对照步骤(1)所得模型,根据待测样本的乙酰胆碱酯酶一型的相对转录表达量确定出家蚕胚胎的发育进程；

步骤(1)具体包括如下步骤:取待检测品种的家蚕胚胎，在催青环境条件下进行催青，根据常规方法确定家蚕胚胎的发育阶段；然后提取总RNA，经DNA酶处理后，反转录制备cDNA；以肌动蛋白基因3为内参基因，乙酰胆碱酯酶一型为目的基因分别设定引物，然后进行定量聚合酶链式反应扩增，以乙酰胆碱酯酶一型的表达量除以肌动蛋白基因3的表达量记为乙酰胆碱酯酶一型相对转录表达量，然后建立不同发育阶段乙酰胆碱酯酶一型相对转录表达量和胚胎发育进程的指数方程；

步骤(2)具体包括如下步骤:提取待测定家蚕胚胎样本的总RNA，经DNA酶处理后，反转录制备cDNA，以肌动蛋白基因3为内参基因，乙酰胆碱酯酶一型为目的基因分别设定引物，然后进行定量聚合酶链式反应扩增，测得待测样本的乙酰胆碱酯酶一型的相对转录表达量，然后对照步骤(1)所得模型确定出待测定家蚕胚胎的发育进程。

上述技术方案中，所述步骤（1）中的发育阶段包括甲、乙1、乙、丙1、丙2、丁1、丁2、戊1、戊2、戊3、己1、己2、己3、己4、己5共15个时期。

上述技术方案中，步骤（1）中每个发育阶段用于提取总RNA的家蚕胚胎的总质量大于50mg。

上述技术方案中，所述家蚕胚胎发育进程的检测方法适用于所有品种。

上述技术方案中，步骤(1) 中，催青环境条件的控制方法为常规方法，并且所述催青环境与步骤(2) 中待检测的家蚕胚胎所在的催青环境相同；在确定胚胎的各个发育阶段时采用的是常规的解剖方法，为了避免因个体的不同而导致误差，每一处理需要同时重复识别10个以上的胚胎。

优选的技术方案中，建立家蚕胚胎的乙酰胆碱酯酶一型相对转录表达量和胚胎发育进程的关联关系的模型时，以胚胎发育阶段的时间为横坐标，以胚胎的乙酰胆碱酯酶一型相对转录表达量为纵坐标，得到一标准曲线。

本发明中，总RNA的提取、DNA酶处理和反转录合成cDNA处理根据分子克隆实验指南（第三版）进行。

家蚕卵从活化到孵化是胚胎由小到大的逐渐成长的连续的过程，在这个胚胎逐步发育的过程中，卵内的大量基因的转录表达水平呈现规律性的变化。乙酰胆碱酯酶的作用是在神经传递过程中水解乙酰胆碱，随着家蚕胚胎的不断发育，家蚕的神经系统逐渐成熟，乙酰胆碱酯酶基因的相对转录表达量也呈现上升的规律。家蚕的乙酰胆碱酯酶基因具有两种类型，由于乙酰胆碱酯酶一型（ace1）的表达量高于乙酰胆碱酯酶二型（ace2），选定ace1作为标志基因，通过测定其相对表达量精确测定家蚕胚胎发育进程是可行的。

本发明根据家蚕ace1的开放阅读框碱基的序列以及定量聚合酶链式反应（PCR）引物设计的规则，设计跨内含子ace1引物一对，为ace1-P1：5′ - CNCCANTTCNGTNGNTCNNG -3′以及ace1-P2：5′ - ACNGTNCTNTGCNTGNANGN -3′，其中N为A、T、C、G其中之一；同样设计肌动蛋白基因3（Actin3）引物，为Actin3-P1：5′ -CGGCTACTCGTTCACTACC -3′以及Actin3-P2：5′ -CCGTCGGGAAGTTCGTAAG -3′。

本发明中取样存放于液N中保存，避免RNA降解，并且应在所有样品取样完成后，尽快进行总RNA提取以及后面的步骤，存放时间不宜超过30天。

本发明中定量PCR的原理及数据分析方法已经被J.H. Schefe公开（J.H. Schefe, K.E. Lehmann, I.R. Buschmann, T. Unger, H. Funke-Kaiser, Quantitative real-time RT-PCR data analysis: current concepts and the novel ‘‘gene expression’s CT difference’’ formula, Journal of Molecular Medicine 2006 (84)： 901–910），本领域技术人员可以参考。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点:

1．本发明提供了一种家蚕胚胎发育进程的测定方法，其只需采用少量蚕卵为样本即可以实现对蚕卵整体的发育阶段进行准确的测定，较传统方法更具有代表性，这对于以家蚕卵为对象的生命科学研究具有重要意义；

2．本发明的测定方法是对蚕卵发育的综合评价，避免传统方法的判断误差，具有结果准确、操作方便、实用性强的特点，适合推广应用。

附图说明

图1为实施例中ace1相对转录表达量和胚胎发育进程的相对关系曲线图。

图2为是实例中的胚胎解剖图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述:

实施例一：一种家蚕胚胎发育进程的测定方法

⑴材料及设备：

家蚕卵采用苏州大学育成的品种（苏秀×春丰），催青控制箱为广东省韶关鑫腾科普仪器有限公司生产的250D人工气候箱，天平为日本岛津公司生产的万分之一克精度的电子天平，定量PCR仪为ABI7300。

样本：每区取50mg卵，设3个重复，同时设5000粒平行区用于解剖鉴定发育阶段。

⑵活化、感温及催青

活化为低温自然解除，感温为15℃处理10天，催青按照简化催青技术处理。

⑶蚕卵解剖及形态鉴定

采用碱法(20% KOH)进行解剖，将存有50mL碱液的小烧杯置于酒精灯烧开后移去酒精灯，将存有50粒左右的桑蚕卵置于碱液5秒，经温水(35℃)漂洗后放于存有温水9cm的二重皿内，用胶头吸管反复冲洗，直到胚胎逸出，取出胚胎用显微镜进行形态鉴定。

⑷定量PCR分析

定量PCR引物的合成：根据家蚕ace1的开放阅读框碱基的序列和定量PCR引物设计的规则，设计跨内含子引物一对（分别为ace1-P1：5′ - CNCCANTTCNGTNGNTCNNG -3′、ace1-P2：5′ - ACNGTNCTNTGCNTGNANGN -3′）（N为A、T、C、G其中之一）；选取Actin3为内参基因，同样设计其引物（Actin3-P1：5′ -CGGCTACTCGTTCACTACC -3′和Actin3-P2：5′ -CCGTCGGGAAGTTCGTAAG -3′）。

总RNA的提取、DNA酶处理和反转录合成cDNA：总RNA的提取、DNA酶处理和反转录合成cDNA处理根据分子克隆实验指南（第三版）进行。

定量PCR检测：采用荧光染料SYBR GreenⅠ在ABI 7300上进行。PCR 反应体系：SYBR Premix Ex Taq (2×) 10 μL，上游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL，模板 2.0 μL，dH₂O 6.8 μL，总体系20 μL。PCR 程序：两步法PCR 扩增，50 ℃ 2 min；95 ℃预变性1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s，45 个循环，每个样品重复测定3 次。

⑸数据统计

分别把目标基因和内参基因进行稀释10倍、100倍和1000倍，按照J.H. Schefe公开的方法，根据测定得的Ct值制定标准曲线，ace1的标准曲线方程为Y＝-0.6869x+26.923，R²＝0.9988；Actin-3的标准曲线方程为Y＝-0.7988x+22.985，R²＝0.9987。根据各样本测定的Ct值，经三组平均后，分别求出对应的log值，再根据2 ^－△△CT法求出对应的表达量如下表。

表1 苏秀×春丰胚胎各发育特征与ace1相对转录表达量关系

注：以上数据均为3区的平均数据。

将表1数据进行统计作图，附图1为上述家蚕ace1相对转录表达量和胚胎发育进程的相对关系曲线图，从中可以看出ace1相对转录相对表达量符合指数方程的趋势，方程为。

⑹应用

采用上述相同的方法，对需要精确检测的发育进程的胚胎进行定量PCR检测，测得ace1的相对表达量Y为0.10261，根据公式，计算X＝10.38107,对照表1可以看出胚胎的发育处于戊3（数值为10）过后，已1（数值为11）不到的时期，处于戊3到已1进程中38.107%的阶段。戊3到已1的数值进程为单位1，现在计算得X＝10.38107，为经过数值10，但不到11，小数是0.38107，即得到38.107%的进程。

⑺发育进程的验证

采用步骤（3）所述的方法对上述进行胚胎发育进程精确测定的蚕卵进行解剖，显微镜观察形态如图2所示，对其胚胎的特征进行识别：已经出现了反转期的前期特征，即胚胎出现了弯曲，说明胚胎的发育已经过了最短期（戊3），证明了精确定量的数据是可靠的。

Claims

1.一种家蚕胚胎发育进程的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）在待测定家蚕胚胎中取一个以上作为样本, 测定样本的乙酰胆碱酯酶一型相对转录表达量，然后对照步骤(1)所得模型，根据待测样本的乙酰胆碱酯酶一型的相对转录表达量确定出家蚕胚胎的发育进程；

步骤(2)具体包括如下步骤:提取待测定家蚕胚胎样本的总RNA，经DNA酶处理后，反转录制备cDNA，以肌动蛋白基因3为内参基因，乙酰胆碱酯酶一型为目的基因分别设定引物，然后进行定量聚合酶链式反应扩增，得到待测样本的乙酰胆碱酯酶一型的相对转录表达量，然后对照步骤(1)所得模型确定出待测定家蚕胚胎的发育进程；

所述步骤（1）中的发育阶段包括甲、乙1、乙2、丙1、丙2、丁1、丁2、戊1、戊2、戊3、己1、己2、己3、己4、己5共15个时期。

2.根据权利要求1所述的家蚕胚胎发育进程的测定方法，其特征在于：所述步骤（1）中每个发育阶段用于提取总RNA的家蚕胚胎的总质量大于50mg。