CN107941989A - 一种猕猴桃抗寒性鉴定与评价的方法 - Google Patents
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Abstract
一种猕猴桃抗寒性鉴定与评价的方法，包括以下步骤：1)猕猴桃枝条在不同温度的低温处理；2)进行低温处理后生理生化指标测定；3)生理指标的系统分析；4)采用隶属函数法进行综合评价，得到不同品种猕猴桃抗寒的平均隶属函数值Uxij，平均隶属函数值Uxij值越大，品种抗寒性越强。本发明的有益效果是：该方法建立了多指标的综合评价函数，与现有的用单一指标或极少数指标评价猕猴桃抗寒性的方法相比，更加准确可靠，适用于不同种、不同品种猕猴桃抗寒性鉴定与评价的技术体系。
Description
技术领域
本发明涉及抗寒性鉴定与评价领域，具体涉及一种适用于不同种和品种猕猴桃抗寒性鉴定与评价的技术体系。
背景技术
猕猴桃以其独特的风味，富含维生素C、多种矿物营养和清肠健胃等功效而得到广泛青睐，成为重要的水果之一。我国是绝大多数猕猴桃属(Actinidia Lindl.)种质资源的发源地，我国猕猴桃的栽培面积居世界第一，栽培品种以中华猕猴桃和美味猕猴桃为主。然而，该品种的抗寒性较差，加之近几年极端低温天气时有发生，全国每年都有猕猴桃园遭遇冻害危害，轻者造成当年减产，重者导致绝收或死树毁园。因此对已有品种进行抗寒性评价，能够合理的建园减少经济损失，同时有助于抗性品种的筛选。
目前栽培品种的抗寒性品种的筛选仅仅是基于生产实践，在不同地区不同品种猕猴桃，以及在相同地区同种猕猴桃在冬季不同时间阶段所能抵御的最低温度未知，而这些对于猕猴桃生产来说至关重要。目前，我国关于猕猴桃抗寒性的研究没有统一的抗寒资源鉴定标准，通常的做法是采用一个指标进行衡量；而抗寒性是由多基因控制的数量性状，采用一个指标进行衡量具有局限性。
因此，亟需建立一套适用于猕猴桃抗寒种质资源的筛选与鉴定方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中用单一指标评价猕猴桃抗寒性的方法，提供一种多指标评价猕猴桃抗寒性的方法，能够准确鉴定不同猕猴桃品种在冬季不同低温环境下的抗寒性，为猕猴桃新品种选育以及品种的适地栽培提供理论依据和参考。
本发明公开了一种一种猕猴桃抗寒性鉴定与评价的方法，包括以下步骤：
(1)样品处理：将猕猴桃枝条进行低温处理；
(2)分析低温处理后的相对电导率和生理生化指标，生化指标包括：半致死温度，丙二醛含量、脯氨酸含量、过氧化氢酶含量、超氧化物歧化酶含量、过氧化物酶含量、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量；
(3)用隶属函数法对步骤(2)得到的相对电导率和生理生化指标进行综合抗寒性评价，得到样品的抗寒隶属函数值U(Xijk)；
(4)用每个样品的相对电导率和生理生化指标隶属度的平均值作为各样品抗寒能力综合评判标准并进行比较，隶属度的平均值越大，样品的抗寒性越强。
进一步地，样品为进入冬季休眠后的一年猕猴桃枝条。
进一步地，步骤(1)低温处理的温度梯度为-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃。
进一步地，步骤(1)中的样品进行低温处理前，用保鲜膜裹好；每个温度处理时间为8h。
进一步地，步骤(2)中相对电导率和低温半致死温度LT50的测定方法包括：将不同温度处理后的样品在室温下解冻，用去离子水冲洗枝条，避开芽眼剪成厚度为1mm-2mm的薄片，混合均匀，准确称取0.20g放入50ml刻度离心管中，加入10ml去离子水，放入摇床上，以200r/min的转速振摇浸提2h，每个处理重复3次，用电导仪测定其初电导率值R1，再将试管置于水浴锅中，沸水浴30min，之后放入摇床振摇30min，使试管内温度降至室温，再测定其终电导率值R2，计算相对电导率R1/R2；以相对电导率拟合Logistic回归方程y＝K/(1+ae-bx)，其中y为相对电导率，x为处理温度，k为当x趋于无穷大时的值，a、b为方程参数；若相关系数r接近1时，再计算低温半致死温度LT50。
进一步地，将步骤(2)中不同温度处理后的样品，进行丙二醛含量、脯氨酸含量、过氧化氢酶含量、超氧化物歧化酶含量、过氧化物酶含量、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量测定的方法包括：
避开芽眼剪碎，用液氮冻过之后，在磨样机磨成粉末，每个测定管称取0.20g粉末；
采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛的含量；
采用羟胺法测定超氧化物歧化酶的含量；
采用紫外吸收法测定过氧化氢酶的含量；
采用愈创木酚法测定过氧化物酶的含量；
采用茚三酮比色法测定脯氨酸含量；
采用蒽酮比色法测定可溶性糖的含量；
采用BCA蛋白浓度检测法测定可溶性蛋白的含量；每个处理重复3次。
进一步地，步骤(3)与抗寒性呈正相关的值用公式a)U(Xijk)＝(Xijk-Xmin)/(Xmax-Xmin)计算，与抗寒性呈负相关的相对电导率用公式b)U(Xijk)＝1-(Xijk-Xmin)/(Xmax-Xmin)计算；公式a)、b)中，U(Xijk)为第i个品种第j个温度梯度第k项指标的隶属度，且U(Xijk)∈[0,1]；Xijk表示第i个品种第j个温度梯度第k个指标测定值；Xmax、Xmin为所有参试品种中第k项指标的最大值和最小值；其中，与抗寒性呈正相关的值包括脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量、过氧化氢酶含量、超氧化物歧化酶含量、过氧化物酶含量。
进一步地，步骤(2)-(4)中，数据统计利用Excel分析，隶属函数分析利用SPSS软件分析。
本发明公开了一种猕猴桃抗寒性鉴定方法，通过该方法对已收集保存的猕猴桃种质资源进行了系统的抗寒性评价，系统了解目前猕猴桃品种的抗寒性，有利于猕猴桃的栽培与抗性选种，以加快猕猴桃抗性育种并促进猕猴桃产业健康发展。
本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明提供了一种猕猴桃抗寒性鉴定与评价的方法，该方法建立了多指标的综合评价函数，与现有的用单一指标或极少数指标评价猕猴桃抗寒性的方法相比，更加准确可靠，适用于不同种、不同品种猕猴桃抗寒性鉴定与评价的技术体系。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的猕猴桃抗寒性鉴定与评价的方法使用以下材料：
选择12月下旬猕猴桃枝条为材料，所述材料包括五个种：软枣猕猴桃品种‘长江一号’、‘红宝石星’、‘浙江15-10’；紫果猕猴桃‘紫果’；对萼猕猴桃‘中砧一号’；中华猕猴桃‘黄金果’；美味猕猴桃‘布鲁诺’。选取材料时要注意保证鉴定的材料生长势基本一致，保证测定结果的准确性。
本实施例的猕猴桃抗寒性鉴定与评价的方法包括以下步骤：
(1)样品处理
剪取一年生猕猴桃枝条，剪成10cm长度，用保鲜膜包裹，放入低温培养箱中，处理温度分别为：
软枣猕猴桃：-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃；
中华猕猴桃、美味猕猴桃、对萼猕猴桃、紫果猕猴桃：-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃。
低温培养箱以1℃/min的速度降温，到达设定温度后保持8h。取出在20℃的室温下解冻1h，进行后续实验。
(2)相对电导率测定
取步骤(1)中处理后的枝条，用去离子水把枝条冲洗干净，避开芽眼剪成1mm-2mm的薄片，混合均匀，准确称取0.20g放入50ml刻度离心管中，每个处理重复3次，加入10ml去离子水，放入摇床上，以200r/min的转速振摇浸提2h。用雷磁电导率仪测定其初电导率值R1，再将试管置于水浴锅中，沸水浴30min，之后放入摇床振摇30min，使试管内温度降至20℃左右，再测定其终电导率值R2，计算相对电导率R1/R2。以相对电导率拟合Logistic回归方程y＝K/(1+ae-bx)，其中y为相对电导率，x为处理温度，k为当x趋于无穷大时的值(K＝1)，a、b为方程参数，计算低温半致死温度LT50，半致死温度的数据如表1所示。
表1猕猴桃枝条的半致死温度
(3)与抗寒性相关的指标的测定
与抗寒性相关的指标包括丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量和抗氧化酶(SOD、POD、CAT)含量。
取步骤(1)中处理后枝条，避开芽眼，剪碎，用液氮冻过之后，在磨样机磨成粉末，每个测定管称取0.20g粉末。
丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法，测定结果如表2所示；
游离脯氨酸量的测定采用茚三酮比色法，测定结果如表3所示；
可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法，测定结果如表4所示；
超氧化物歧化酶(SOD)含量的测定采用羟胺法，测定结果如表5所示；
过氧化氢酶(CAT)含量的测定采用紫外吸收法，测定结果如表6所示；
过氧化物酶(POD)含量的测定采用愈创木酚法，测定结果如表7所示；
可溶性蛋白采用BCA蛋白浓度检测法。每个处理重复3次，测定结果如表8所示。
表2低温处理后枝条丙二醛含量
表3枝条低温处理后脯氨酸含量
表4低温处理后可溶性糖含量
表5低温处理后超氧化物歧化酶(SOD)含量
表6低温处理后过氧化氢酶(CAT)活性
表7低温处理后过氧化物酶(POD)活性
表8低温处理后可溶性蛋白含量
(4)不同猕猴桃抗寒性综合评价应用隶属函数法
采用模糊数学的隶属函数法计算每个品种各抗性相关指标的隶属度。其中：
与抗寒性呈正相关的脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量和抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性用公式(1)计算：
公式(1)：U(Xijk)＝(Xijk-Xmin)/(Xmax-Xmin)。
与抗寒性呈负相关的相对电导率、MDA含量用公式(2)计算：
公式(2)：U(Xijk)＝1-(Xijk-Xmin)/(Xmax-Xmin)。
公式(1)、(2)中：U(Xijk)为第i个品种第j个温度梯度第k项指标的隶属度，且U(Xijk)∈[0,1]；Xijk表示第i个品种第j个温度梯度第k个指标测定值；Xmax、Xmin为所有参试品种中第k项指标的最大值和最小值。
计算获得的不同猕猴桃品种的各生理指标的隶属函数值如表9所示。
(5)上述步骤(3)和步骤(4)中数据采用Microsoft excel 2007和SPSS 22进行统计与分析。统计结果见表9，用每个品种各项指标隶属度的平均值作为各品种抗寒能力综合评判标准进行比较。实施例中的七个品种猕猴桃抗寒性为：长江一号>红宝石星>浙江15-10>中砧一号>紫果猕猴桃>布鲁诺>黄金果，与文献报道和田间直接观察的结果一致。
表9不同猕猴桃品种的各生理指标的隶属函数值及平均值
Claims (8)
1.一种猕猴桃抗寒性鉴定与评价的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品处理：将猕猴桃枝条进行低温处理；
(2)分析低温处理后的相对电导率和生理生化指标，所述生化指标包括：半致死温度，丙二醛含量、脯氨酸含量、过氧化氢酶含量、超氧化物歧化酶含量、过氧化物酶含量、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量；
(3)用隶属函数法对步骤(2)得到的相对电导率和生理生化指标进行综合抗寒性评价，得到样品的抗寒隶属函数值U(Xijk)；
(4)用每个样品的相对电导率和生理生化指标隶属度的平均值作为各样品抗寒能力综合评判标准并进行比较，隶属度的平均值越大，样品的抗寒性越强。
2.根据权利要求1所述的一种猕猴桃抗寒性鉴定与评价的方法，其特征在于，所述样品为进入冬季休眠后的一年猕猴桃枝条。
3.根据权利要求2所述的一种猕猴桃抗寒性鉴定与评价的方法，其特征在于，所述步骤(1)低温处理的温度梯度为-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃。
4.根据权利要求2所述的一种猕猴桃抗寒性鉴定与评价的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的样品进行低温处理前，用保鲜膜裹好；每个温度处理时间为8h。
5.根据权利要求2所述的一种猕猴桃抗寒性鉴定与评价的方法，其特征在于，所述步骤(2)中相对电导率和低温半致死温度LT50的测定方法包括：将不同温度处理后的样品在室温下解冻，用去离子水冲洗枝条，避开芽眼剪成厚度为1mm-2mm的薄片，混合均匀，准确称取0.20g放入50ml刻度离心管中，加入10ml去离子水，放入摇床上，以200r/min的转速振摇浸提2h，每个处理重复3次，用电导仪测定其初电导率值R1，再将试管置于水浴锅中，沸水浴30min，之后放入摇床振摇30min，使试管内温度降至室温，再测定其终电导率值R2，计算相对电导率R1/R2；以相对电导率拟合Logistic回归方程y＝K/(1+ae-bx)，其中y为相对电导率，x为处理温度，k为当x趋于无穷大时的值，a、b为方程参数；若相关系数r接近1时，再计算低温半致死温度LT50。
6.根据权利要求1所述的一种猕猴桃抗寒性鉴定与评价的方法，其特征在于，将所述步骤(2)中不同温度处理后的样品，进行丙二醛含量、脯氨酸含量、过氧化氢酶含量、超氧化物歧化酶含量、过氧化物酶含量、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量测定的方法包括：
避开芽眼剪碎，用液氮冻过之后，在磨样机磨成粉末，每个测定管称取0.20g粉末；
采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛的含量；
采用羟胺法测定超氧化物歧化酶的含量；
采用紫外吸收法测定过氧化氢酶的含量；
采用愈创木酚法测定过氧化物酶的含量；
采用茚三酮比色法测定脯氨酸含量；
采用蒽酮比色法测定可溶性糖的含量；
采用BCA蛋白浓度检测法测定可溶性蛋白的含量；每个处理重复3次。
7.根据权利要求2所述的一种猕猴桃抗寒性鉴定与评价的方法，其特征在于，所述步骤(3)与抗寒性呈正相关的值用公式a)U(Xijk)＝(Xijk-Xmin)/(Xmax-Xmin)计算，与抗寒性呈负相关的相对电导率用公式b)U(Xijk)＝1-(Xijk-Xmin)/(Xmax-Xmin)计算；公式a)、b)中，U(Xijk)为第i个品种第j个温度梯度第k项指标的隶属度，且U(Xijk)∈[0,1]；Xijk表示第i个品种第j个温度梯度第k个指标测定值；Xmax、Xmin为所有参试品种中第k项指标的最大值和最小值；其中，与抗寒性呈正相关的值包括脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量、过氧化氢酶含量、超氧化物歧化酶含量、过氧化物酶含量。
8.根据权利要求1所述的一种猕猴桃抗寒性鉴定与评价的方法，其特征在于，所述步骤(2)-(4)中，数据统计利用Excel分析，隶属函数分析利用SPSS软件分析。
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