CN112816426A - 一种咖啡抗寒性的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物种质资源鉴定技术领域，公开了一种咖啡抗寒性的鉴定方法。本发明所述鉴定方法采用低温处理后的咖啡叶片，用隶属函数法对得到的叶片的电导率、过氧化氢酶含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量进行综合抗寒性评价，得到不同咖啡种质资源的抗寒隶属函数值Uij；通过得到的抗寒隶属函数值Uij来判断咖啡资源的抗寒性。本发明依据隶属函数法建立了一种多指标的综合评价体系，能在早期有效鉴定咖啡的抗寒性。本发明鉴定方法适用于自然降温过程田间不同咖啡资源早期抗寒性鉴定与评价的技术体系，与咖啡植区冬季田间抗寒鉴定结果相吻合，该方法对于咖啡不同种质资源的利用，种植地点的合理规划布局和抗寒育种均具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物种质资源鉴定技术领域，具体涉及一种咖啡抗寒性的鉴定方法。
背景技术
咖啡是世界三大饮料作物之首，原产于热带地区，适宜生长在平均温度18～25℃气候环境下。中国咖啡主产区为海南、云南，海南以中粒种咖啡为主，云南以小粒种咖啡为主。全国咖啡种植面积约210万亩，产量为15万吨，总产值约为21亿元。因我国热区地处热带北缘，冬季常有低温危害，通常限制了咖啡的开花、座果、引起咖啡颗粒过小、不饱满、缺陷豆比例上升，影响咖啡的产量和品质，严重的可导致植株的死亡。因此提高咖啡抗寒性，使咖啡安全越冬至关重要。
其中，选育抗寒良种，利用咖啡自身的遗传因素来抵御低温胁迫是最根本的途径。而抗寒良种选育的关键则是种质资源抗寒性的早期鉴定。目前，鉴定咖啡抗寒性强弱最可靠的方法是直接鉴定法。即当试验地遭遇严寒时，实地进行观测和比较鉴定。但直接鉴定成本较高，受自然环境限制较大。因此，如何对咖啡种质资源进行苗期抗寒性准确、快速鉴定，成为生产中亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种咖啡种质资源苗期抗寒性的鉴定方法，使得所述鉴定方法通过多指标的综合评价体系，在早期有效鉴定与评价咖啡的抗寒性。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种咖啡抗寒性的鉴定方法，包括：
步骤1、获得咖啡幼苗的第二至第四片完全展开成熟叶片；分为低温处理组和对照组；
步骤2、将步骤1获得的叶片进行相对电导率、过氧化氢酶含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量四个指标的检测；
步骤3、相对电导率按照反隶属函数Uij＝1–(Xij–Xjmin)/(Xjmax–Xjmin)计算抗寒隶属函数值，过氧化氢酶含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量按照正隶属函数Uij＝(Xij–Xjmin)/(Xjmax–Xjmin)计算抗寒隶属函数值，最后统计平均抗寒隶属函数值作为平均隶属度鉴定咖啡品种的抗寒性，所述平均隶属度越高，咖啡品种的抗寒性越高；
其中，Uij表示i品种j指标的抗寒隶属函数值；Xij表示i品种j指标的测定值；Xjmin表示两个组中所有品种j指标的最小值；Xjmax表示两个组中所有品种j指标的最大值；i表示某个品种；j表示某项指标。
作为优选，所述低温为0-10℃；更优选地，所述低温为0-8℃；在本发明具体实施方式中，所述低温为8℃。优选地，低温处理的时间为2-3d。
咖啡幼苗的第一片叶片较为幼嫩，而第四以下的叶太老，为了鉴定结果的误差较小，本发明第采用第二至第四片属于成熟稳定的叶片。对于本领域技术人员来讲其能够理解咖啡幼苗的第二至第四片完全展开成熟叶片的含义，但本发明为了能够更加形象的描述叶片顺序，本发明提供了图1所示的示意图来展示。在本发明具体实施方式中，本发明选择5-7月龄的咖啡幼苗，更具体地是6月龄咖啡幼苗。
在本发明中，所述咖啡幼苗的种植方法如下：
采集咖啡果实，将咖啡果实脱皮后用水浸泡，然后脱胶、水洗晾干；晾干后的种子以砂和椰糠为基质播种，当咖啡苗长至两叶一心时进行装袋移栽。
作为优选，本发明所述相对电导率采用简易浸泡或常规抽气方式测定，具体可参照文献《植物叶片相对电导率测定方法比较研究》(陈爱葵等，广东教育学院学报，2010)。在本发明具体实施方式中，所述相对电导率的检测方法如下：
洗净所取的叶片，蒸馏水漂洗后，去离子水冲洗，滤纸吸干，避开叶脉将叶剪成2mm长宽的碎片，称取0.2g，添加20mL去离子水，抽真空，倒入三角瓶中并盖上封口膜，在室温下振荡8～10h，振荡频率80～100r/h，然后测定电导率R1；之后将原样液封口后放入沸水浴中煮沸30～35min后，冷却至室温，在同样振荡条件下测定煮沸电导率R2，3次重复，计算相对电导率。相对电导率R(％)＝(R1/R2)×100％。
在本发明具体实施方式中，过氧化氢酶测定采用(钼酸铵法)试剂盒、可溶性糖含量测定采用(蒽酮比色法)试剂盒、可溶性蛋白含量测定采用(分光光度法)试剂盒。
本发明以P4、P3、卡杜拉、热研4号、热研1号、24-11、大韩、大7为实验材料，涵盖了小粒种咖啡、中粒种咖啡以及大粒种咖啡种质资源，通过本发明的鉴定方法鉴定出上述几种种质资源抗寒性大小依次为P4＞卡杜拉＞P3＞大韩＞24-11＞大7＞热研4号＞热研1号，整体表现为小粒种咖啡抗寒性强于大粒种和中粒种咖啡，与咖啡植区冬季田间抗寒表型鉴定结果相吻合。
由以上技术方案可知，本发明以咖啡苗期叶片的电导率、过氧化氢酶、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量为指标，依据隶属函数法建立了一种多指标的综合评价体系，能在早期有效鉴定与评价咖啡的抗寒性。本发明咖啡抗寒性鉴定方法适用于自然降温过程田间不同咖啡资源早期抗寒性鉴定与评价的技术体系，与咖啡植区冬季田间抗寒鉴定结果相吻合，该方法对于咖啡不同品种(种质)资源的利用，种植地点的合理规划布局和抗寒育种均具有重要的意义。
附图说明
图1所示咖啡幼苗叶片顺序示意图；
图2所示为大粒种咖啡叶片、中粒种咖啡叶片以及小粒种咖啡叶片的低温胁迫对比试验。
具体实施方式
本发明公开了一种咖啡抗寒性的鉴定方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述鉴定方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述鉴定方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，所述咖啡幼苗按照如下具体方式栽培：
采集咖啡果实，将咖啡果实脱皮后浸泡24h，浮在水面的咖啡种子捞出淘汰，然后将剩余种子进行脱胶，水洗晾干；晾干后的种子摊放于砂畦上并盖以椰糠，每天浇水，当咖啡苗长至两叶一心时进行装袋。当咖啡生长至6月龄，选取生长正常，无病虫害和机械损伤的苗木放入人工培养箱中进行8℃低温胁迫处理。
所述的砂畦首先铺砂15-20厘米，砂上均匀平铺咖啡种子，咖啡种子上面盖一层1厘米厚的细砂，砂上盖椰糠。砂畦上搭盖荫棚。
本发明发现叶片的质膜相对透性反应了叶片细胞膜受破坏的程度，通过电导率能够反映出质膜相对透性；而过氧化氢酶是咖啡叶片抗氧化酶，酶活性越高，代表抵抗寒害的能力越强；可溶性糖和可溶性蛋白是咖啡叶片重要的渗透调节物质，其含量越高，咖啡的抗寒性越强。因此，本发明选择该四个指标作为本发明鉴定方法的标准。
以下就本发明所提供的一种咖啡抗寒性的鉴定方法做进一步说明。
实施例1：本发明鉴定方法
1、咖啡幼苗的培养及胁迫处理
采集咖啡果实，将咖啡果实脱皮后浸泡24h，浮在水面的咖啡种子捞出淘汰，然后将剩余种子进行脱胶，水洗晾干；晾干后的种子摊放于砂畦上并盖以椰糠，每天浇水，当咖啡苗长至两叶一心时进行装袋。当咖啡生长至6月龄，选取生长正常，无病虫害和机械损伤的苗木放入人工培养箱中进行8℃低温胁迫处理2～3d，以未处理的为对照。
2、咖啡叶片生理生化指标的测定
采集咖啡第二至第四片完全展开成熟叶片2-3片，分别对应编号；测定叶片的电导率、过氧化氢酶含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量；每个样品设置3次重复。
3、实验数据处理
用隶属函数法对步骤2得到的叶片电导率、过氧化氢酶、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量进行综合抗寒性评价，得到咖啡不同品种的抗寒隶属函数值Uij：
与抗寒性呈正相关指标(过氧化氢酶、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量)是用正隶属函数Uij＝(Xij–Xjmin)/(Xjmax–Xjmin)计算，与抗寒性呈负相关指标(相对电导率)是用反隶属函数Uij＝1–(Xij–Xjmin)/(Xjmax–Xjmin)计算。
式中，Uij表示i品种j指标的抗寒隶属函数值；Xij表示i品种j指标的测定值；Xjmin表示两个组中所有品种j指标的最小值；Xjmax表示两个组中所有品种j指标的最大值；i表示某个品种；j表示某项指标。
通过计算得到的各指标的抗寒隶属函数值Uij，然后统计平均抗寒隶属函数值，称为平均隶属度，从而判断咖啡的抗寒性，平均隶属度越大，品种抗寒性越强。
其中，电导率的测定：洗净所取的叶片，蒸馏水漂洗后，去离子水冲洗，滤纸吸干，避开叶脉将叶剪成2mm长宽的碎片，称取0.2g，添加20mL去离子水，抽真空，倒入三角瓶中并盖上封口膜，在室温下振荡8～10h，振荡频率80～100r/h，然后测定电导率R1；之后将原样液封口后放入沸水浴中煮沸30～35min后，冷却至室温，在同样振荡条件下测定煮沸电导率R2，3次重复，计算相对电导率。相对电导率R(％)＝(R1/R2)×100％。
过氧化氢酶含量采用试剂盒(钼酸铵法)测定；可溶性糖含量采用试剂盒(蒽酮比色法)测定；可溶性蛋白含量采用试剂盒(分光光度法)测定。
实施例2：本发明鉴定方法的应用
选取P4、P3、卡杜拉、热研4号、热研1号、24-11、大韩、大7为实验材料，按照实施例1方法进行鉴定，结果见表1和表2；
表1不同咖啡种质资源和不同组的指标数值
表2 8℃低温处理不同咖啡种质资源抗寒隶属函数值Uij
以P3品种为例，演示抗寒隶属函数值的计算过程：
电导率 Uij:1-(87.0916-25.1516)/(120.7086-25.1516)＝0.3518
可溶性糖 Uij:(156.9557-61.1593)/(171.2902-61.1593)＝0.8698
可溶性蛋白 Uij:(41.2959-21.8158)/(41.2959-21.8158)＝1
CAT Uij:(10.9366-2.7209)/(12.8119-2.7209)＝0.8142
平均 Uij＝(0.3518+0.8698+1+0.8142)/4＝0.7590
从表2判定8个咖啡资源的抗寒性大小依次为P4＞卡杜拉＞P3＞大韩＞24-11＞大7＞热研4号＞热研1号。整体表现为小粒种咖啡抗寒性强于大粒种和中粒种咖啡，与现有的咖啡植区冬季田间抗寒表型鉴定结果相吻合，参见现有文献《国内咖啡光合作用研究》(章传政，黎星辉，朱世桂；热带农业科技，2005)以及《咖啡高产栽培技术》(第19页，董云萍，龙宇宙，孙燕，中国农业出版社，2009)。
此外，本发明分别选取上述参试品种中的小粒种咖啡(P4)、中粒种咖啡(热研4号)和大粒种咖啡(大韩)各一种进行低温胁迫试验(叶片处理为8℃低温胁迫72h，对照为常温25-27℃)，结果见图2；
从图2表现来看，抗寒性能是小粒种咖啡(P4)＞大粒种咖啡(大韩)＞中粒种咖啡(热研4号)，这与本发明的评价方法结果一致。
本发明咖啡抗寒性鉴定与评价的方法适用于自然降温过程田间不同咖啡资源早期抗寒性鉴定与评价的技术体系，综合咖啡的电导率和酶活性等指标对冬咖啡进行抗寒性鉴定，与咖啡植区冬季田间抗寒鉴定结果相吻合，能够为咖啡植区冬季抗寒性能做出早期预测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种咖啡抗寒性的鉴定方法，其特征在于，包括：
步骤1、获得不同品种咖啡幼苗的第二至第四片完全展开成熟的叶片，分为低温处理组和对照组；
步骤2、将步骤1获得的叶片进行相对电导率、过氧化氢酶含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量四个指标的检测；
步骤3、相对电导率按照反隶属函数Uij＝1–(Xij–Xjmin)/(Xjmax–Xjmin)计算抗寒隶属函数值，过氧化氢酶含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量按照正隶属函数Uij＝(Xij–Xjmin)/(Xjmax–Xjmin)计算抗寒隶属函数值，最后统计平均抗寒隶属函数值作为平均隶属度鉴定咖啡品种的抗寒性，所述平均隶属度越高，咖啡品种的抗寒性越高；
其中，Uij表示i品种j指标的抗寒隶属函数值；Xij表示i品种j指标的测定值；Xjmin表示两个组中所有品种j指标的最小值；Xjmax表示两个组中所有品种j指标的最大值；i表示某个品种；j表示某项指标。
2.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，所述低温为0-10℃。
3.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，所述咖啡幼苗为5-7月龄咖啡幼苗。
4.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，所述咖啡幼苗的种植方法如下：
采集咖啡果实，将咖啡果实脱皮后用水浸泡，然后脱胶、水洗晾干；晾干后的种子以砂和椰糠为基质播种，当咖啡苗长至两叶一心时进行装袋移栽。
5.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，所述相对电导率的检测方法采用简易浸泡或常规抽气方式测定。
6.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，所述过氧化氢酶测定采用钼酸铵法检测。
7.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，所述可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法。
8.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，所述可溶性蛋白含量测定采用分光光度法。
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