CN111707713A - 一种柳杉抗寒性快速鉴定与评价的方法 - Google Patents

一种柳杉抗寒性快速鉴定与评价的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种柳杉抗寒性快速鉴定与评价的方法，属于作物学技术领域。该方法主要包括以下步骤：1)待测柳杉无性系的扦插繁殖；2)柳杉扦插苗的低温处理；3)测定低温胁迫柳杉叶片的细胞膜透性、半致死温度、丙二醛、SOD、可溶性蛋白含量的变化情况；4)抗寒性评价，从而确定待测柳杉抗寒性强弱；5)抗寒性验证与进一步筛选。本发明在综合评价柳杉抗寒性的模式的基础之上，发现通过‑4℃低温胁迫柳杉无性系离体侧枝，测定相对电导率可以无损伤、快速判断80％以上柳杉无性系的抗寒性，因此进一步提出了一种快速的柳杉抗寒性鉴定与评价方法，对于柳杉种质资源的利用、种植等合理地规划布局及抗寒性育种具有十分重要的意义。

Description

一种柳杉抗寒性快速鉴定与评价的方法
技术领域
本发明属于作物学技术领域，涉及一种植物耐寒性鉴定与评价的方法，具体涉及一种适用于不同柳杉型抗寒性快速鉴定与评价的方法。
背景技术
低温是影响其生长发育、生产力和生态分布的重要环境因子之一。在全球范围内，由于低温或低温伤害导致的农林生产减少，每年损失数千亿美元。目前，尚没有解决低温损伤的根本办法。因此，研究低温对植物生长的影响，提高植物对低温的耐受性具有重要意义。
柳杉是中国特有树种，产于浙江天目山、福建南屏三千八百坎及江西庐山等地海拔1100米以下地带。在江苏南部、安徽南部、河南、湖北、湖南、四川、贵州、云南、广西、广东，以及浙江、福建、江西自然分布区以外的地区均有栽培。温度，特别是低温，是限制柳杉分布的主要因子之一，因此，快速鉴定与评价柳杉抗寒性具有重要意义。
专利申请号200910216387.3竹抗寒性鉴定与评价的方法，201610830631.5一种冬油菜抗寒性鉴定与评价方法，201711172417.6基于数字模型的椰子耐寒性鉴定方法，都仅基于植物提出了评价耐寒性的模型即综合评价方法，但在实际应用中，评价体系涉及的指标众多，若想快速简单地获取植物的抗寒性高低难免有所不便。本发明在综合评价柳杉耐寒性的模型的基础之上，进一步提供一种柳杉抗寒性快速鉴定与评价的方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明在综合评价柳杉耐寒性的模型的基础之上，筛选发现某一温度处理下(-4℃)某单一指标(电导率)可快速鉴定柳杉抗寒性(80％以上柳杉无性系的抗寒性与综合评价柳杉抗寒性的结果相同)，进一步提供了一种柳杉抗寒性快速鉴定与评价的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种柳杉抗寒性快速鉴定与评价的方法，包括以下步骤：
1)待测柳杉无性系的扦插繁殖；
2)取柳杉无性系幼苗枝条进行低温胁迫处理，处理温度为4℃、0℃、-4℃、-8℃、-12℃、-16℃、-20℃，从4℃开始，以4℃/h降温，到达目标温度时处理12h；
3)测定低温胁迫处理的柳杉枝条叶片的抗寒性生理指标：细胞膜透性、半致死温度LT50、丙二醛、SOD、可溶性蛋白含量；
4)通过主成分分析、回归分析的方法，对上述抗寒性生理指标进行综合分析，通过对抗寒性生理指标进行标准数量化后，按主成分因子负荷量，采用隶属度函数法确定隶属函数的升降顺序，隶属函数值在0到1之间，隶属度值与每个指标的权重共同决定柳杉各无性系抗寒性综合指数，建立抗寒性评价体系；
5)根据抗寒性评价体系进一步筛选快速鉴定与评价柳杉抗寒性生理指标，即在-4℃低温处理12h，通过采用电导法测定相对电导率，从而判断柳杉叶片的细胞膜透性变化，并根据柳杉叶片的细胞膜透性变化的大小，判断柳杉抗寒性高低。
进一步的，步骤1)中，待测柳杉无性系进行扦插繁殖的穗条采集自无病虫害、生长良好、光照充足的母树；柳杉插穗采集后放入清水中浸泡保存，第二天用100ppm浓度的ABT6生根粉浸泡4h，然后进行扦插。
进一步的，步骤2)中，柳杉无性系幼苗枝条为柳杉无性系两年生幼苗生长一致的枝条。
进一步的，步骤2)中，零上温度处理后直接进行抗寒性生理指标的测定，零下温度处理结束后放入4℃中解冻12h后进行抗寒性生理指标的测定。
进一步的，步骤3)中，细胞膜透性采用电导法测定测定相对电导率，拟合logistic方程计算半致死温度LT50，丙二醛采用硫代巴比妥酸法测定，SOD采用氮蓝四唑比色法测定，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定。
进一步的，细胞膜透性采用电导法测定测定相对电导率，称取蒸馏水清洗干净的针叶于带塞试管中，按照1g∶100mL的比例加入蒸馏水，盖上瓶塞，常温浸提12h，直至针叶沉入管底后用电导仪测其电导值为E1，测蒸馏水电导值为E0，再将试管放入沸水浴20min，冷却至室温，测其电导值为E2，相对电导率＝(E1-E0)/(E2-E0)×100％。
进一步的，步骤4)中，同一抗寒性生理指标内，隶属函数值越高，抗寒性越强。
进一步的，步骤5)中，综合各指标隶属函数值的结果，再结合细胞膜透性、半致死温度LT50、丙二醛、SOD、可溶性蛋白含量每一个单指标，发现-4℃低温胁迫柳杉无性系离体侧枝12h，相对电导率越低，抗寒性越强。
有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：
本发明在综合评价柳杉抗寒性的基础之上，发现通过-4℃低温胁迫柳杉无性系离体侧枝12h，并测定相对电导率可以无损伤、快速判断80％以上柳杉无性系的抗寒性(80％以上柳杉无性系的抗寒性与综合评价体系中抗寒性相同)，因此进一步提出了一种快速的柳杉抗寒性鉴定与评价方法。本申请通过单一温度处理、单一指标，简单迅速地判断柳杉无性系抗寒性的高低。对于柳杉种质资源的利用、种植等合理地规划布局及抗寒性育种具有十分重要的意义。
附图说明
图1是不同低温处理下柳杉无性系相对电导率的变化图；
图2是不同低温处理下柳杉无性系MDA的变化图；
图3是不同低温处理下柳杉无性系SOD的变化图；
图4是不同低温处理下柳杉无性系可溶性蛋白的变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。以下实施例中如无特殊说明，所用实验方法均为常规方法。
实施例1
选择福建杨梅岭林场(118°31′54.56″E、25°22′24.09″N)生长状态良好的无病虫害的11个柳杉无性系(#3、#25、#32、#57、#74、#42、#54、#66、#68、#011、#X1)。2014年6月，用修枝剪剪取当年生半木质化、生长健壮、无病虫害、枝条节间短、带有2～3个侧芽的枝条制作插穗。扦插时插条上切口平切，位置距上芽1-1.5cm；下切口斜切，约45°斜面，斜面与上芽方向相反；上下剪口均要求平滑，并防止劈裂，保留上芽，插穗长12-15cm左右。插穗剪切好后尽量保持湿润，及时用水浸泡，浸泡时间一般12h以上。0.1％多菌灵消毒2h。扦插前用100ppm浓度的ABT6生根粉浸泡4h，然后进行扦插。扦插时用小棒引洞，将柳杉的穗条2/3插入基质中，在扦插完成后用土降柳杉周围穗条压实，在扦插完成之后统一浇一次透水。每3d喷灌一次。
2016年5月采样，取11个柳杉无性系两年生幼苗生长一致的枝条，将每个无性系的枝条分为7组，放入海尔程控冰箱中进行低温处理，处理温度为4℃、0℃、-4℃、-8℃、-12℃、-16℃、-20℃，从4℃开始，以4℃/h降温，到达目标温度时处理12h，零上温度处理后直接进行生理指标的测定，零下温度处理结束后放入4℃中解冻12h后进行测定，每个处理设置3个重复。
(1)测定低温胁迫柳杉叶片的细胞膜透性、半致死温度、丙二醛、SOD、可溶性蛋白的变化，如下：
I、细胞膜透性及半致死温度的测定
细胞膜透性采用电导法测定，称取蒸馏水清洗干净的针叶0.2g于带塞试管中，加入20mL蒸馏水，盖上瓶塞，常温浸提12h，直至针叶沉入管底后用DDS-307电导仪测其电导值为E1，测蒸馏水电导值为E0，再将样品放入沸水浴20min，冷却至室温，测其电导值为E2。计算公式：相对电导率(％)＝(E1-E0)/(E2-E0)*100％，结果如图1所示。随着温度的降低，柳杉各个无性系相对电导率总体呈现先上升后基本不变的趋势。其中，在4℃～-8℃的降温过程中，相对电导率上升得比较显著，-8℃～-20℃时，相对电导率的变化不显著。大多数柳杉无性系的相对电导率在-8℃是达到了最大值。不同无性系也各有其特点，#74增幅最大，说明#74更易受到低温的伤害，#32与#54在整个过程中相对电导率相对于其他无性系较低，受低温影响相对小。
半致死温度运用spss 22结合logistic方程y＝k/((1+ae^(-bx))进行拟合(其中，y为叶片的电解质外渗率，x为处理温度，k为极限电解质外渗率，a、b为方程参数)。令y’＝In[(k-y)/y]，y’＝lna-bx，转换为直线方程进行直线回归，其中半致死温度为方程的拐点y＝lna/b，电导率与温度的回归方程及半致死温度如表1所示。
表1电导率与温度的回归方程及半致死温度
Figure BDA0002563705040000041
Figure BDA0002563705040000051
II、丙二醛的测定
采用硫代巴比妥酸法测定，剪取针叶0.5g，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，加入5ml 10％的三氯乙酸(TCA)，充分混匀，随后将匀浆转入10mL离心管，4000r/min离心20min，上清液即为样品提取液。吸取提取液2mL，对照加2mL蒸馏水，分别向两个离心管中加入2mL0.6％的硫代巴比妥酸(TBA)，混匀后放入沸水浴中反应20min，随后放入冷水中迅速冷却，3000r/min离心10min。取上清液，用紫外分光光度计测定上清液在600nm、532nm、450nm波长下的吸光值。
MDA含量的计算公式：MDA的浓度C(imol/L)＝(6.45D532-D600)-0.56D450；MDA的含量(imol/g)＝CVTV1/1000V2W
式中：C为MDA浓度，imol/L；VT为样品提取液的总体积，mL；V1为样品提取液和TBA溶液总反应液体积，mL；V2为与TBA反应的样品提取液体积，mL；W为样品质量，g；1000为将mL换算成L的系数。
结果如图2所示：虽然柳杉各个无性系在不同温度时MDA的变化不太一致，在一定温度范围内呈现波动的趋势，但总体来说呈现先下降后上升的趋势。在-4℃时出现急剧下降，随后在-12℃时逐渐上升，并且多个无性系的MDA含量在-16℃时达到峰值。在整个低温处理过程中，66号无性系的MDA值偏低，说明膜的受伤程度比较小，74号无性系的MDA偏高，膜的受伤程度比较大。
III、SOD的测定
SOD的测定采用氮蓝四唑比色法。称取针叶0.5g，液氮研磨，磨碎后，加入2mL预冷的pH＝7.8的0.05mol·L-1磷酸缓冲液在研砵中研磨，转入离心管定容至10mL转入离心管中。提取液于4℃10000r/min离心20min。上清液用于SOD测定。
SOD活性测定：(1)0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)1.5mL，空白为1.6mL；(2)0.1mol/L EDTA-Na2 0.3mL；(3)0.13mol/L MET 0.3mL；(4)0.02mol/L核黄素0.3mL；(5)0.75mol/LNBT 0.3mL；(6)提取液0.05mL，空白不加酶液。反应总体积3mL。两个对照管一个用黑布遮光，40001x照光10min，置560nm处测定光密度。
按以下公式计算SOD活性：SOD总活性(ì/g)＝(ACK-AE)VT/0.5ACKWVs
式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示；活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；ACK为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；VT为样品液体总体积，mL；Vs为测定样品时用量，mL；W为样品质量，g；蛋白质含量单位为mg/g。
结果如图3所示：柳杉各无性系的SOD在4℃降到0℃时由于植株对低温不适应呈现下降的趋势，随后植株经过短暂的抗寒锻炼，抗寒能力逐渐增强，出现短暂的上升，-8℃以后SOD值逐渐下降，说明植株自身抗氧化系统受到破坏，抗寒能力减弱。整个低温处理过程中68号无性系SOD值偏高，而且波动较小，42号无性系的SOD值下降比较快，说明在低温处理过程中，42号无性系的超氧化物歧化酶受温度影响比较大。
IV、可溶性蛋白的测定
蛋白质标准溶液(100ìg/mL)：用天秤称取0.1g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解，并定容至1000mL，放入4℃中保存。考马斯亮蓝G250试剂的配制：称取考0.1g考马斯亮蓝G250，加入50mL 90％乙醇，再加入85％H3PO4 100mL，最后用蒸馏水定容至1000mL，常温下放置备用。蛋白质标准曲线(蛋白质含量为0-100ìg/mL)的制作：取6支试管(编号分别为空白、1、2、3、4、5)，分别按表配制0-100ìg/mL的牛血清白蛋白质液各1mL，在每支试管中加入5mL考马斯亮蓝G250试剂，盖塞，摇匀，放置2min后，用1cm口径比色杯在595nm下比色，以空白调零，记录光密度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，如表2所示配制蛋白质标准曲线系列溶液。样品提取：称取鲜样0.5g，用10mL磷酸缓冲液研磨提取，然后在4000r/min下离心15min。
表2蛋白质标准曲线系列溶液的配制
Figure BDA0002563705040000071
蛋白质浓度测定：吸取样品离心液0.5mL加入具塞试管，再加5mL考马斯亮蓝G250溶液，充分混合，放置2min在595nm下比色，记录吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量。结果计算：样品蛋白质含量(mg/gFW)＝(C*VT)/(V1*FW*1000)，式中：C为查得标准曲线值，ìg；VT为提取液总体积，mL；FW为样品鲜重，g；V1为测定时加样量，mL。
结果如图4所示：在整个低温处理过程中，柳杉无性系可溶性蛋白呈现出先下降后上升的趋势，在-8℃时达到最低，而后随着温度的降低可溶性蛋白的含量逐渐增大。其中X1号无性系的可溶性蛋白值相对于其他无性系较低，说明其细胞的保水能力比较差，54号无性系的可溶性蛋白值较高，细胞的保水能力比较强。
(2)抗寒指标隶属度值及主成分分析，主要包括以下步骤：
I、鉴于抗寒时，各生理指标的单位、性质各不相同，但各指标的变化具有连续性，因此对指标进行标准数量化后，按主成分因子负荷量，采用隶属度函数法确定隶属函数的升降顺序，隶属函数值在0到1之间，隶属度值与每个指标的权重共同决定植株的抗寒评分。同一指标内，隶属函数值越高，抗寒评分越高。将不同柳杉无性系胁迫处理的生理指标转化为隶属度值的结果见表3。
由表3可知，#57、#32无性系在电导率方面，评分为0.528，为11个无性系中最高，说明在电导率这个指标上，#57、#32无性系表现出较强的抗寒性；而半致死温度方面，#42无性系得分为0，说明其在半致死温度上体现出抗寒性较差。
表3柳杉各无性系抗寒性指标隶属度值
Figure BDA0002563705040000072
Figure BDA0002563705040000081
II、主成分分析
主成分分析能有效地简化数据，分析各指标间的关系，起到了浓缩数据的作用。在分析半致死温度时，由表1可以发现，11个无性系柳杉的半致死温度集中在-4到-8℃之间，而-4℃是一个关键的转折温度，因此以-4℃下各指标的值用来作主成分分析，结果如表4。由表4可知，第一与第二主成分(第一主成分特征值2.489，第二主成分特征值1.628)的特征值均大于1，涵盖了大部分的信息，因此用这两个主成分进行抗寒性分析。运用前两个主成分对五个生理指标进行负荷量分析，计算结果如表5所示。由表5可以看出，各指标对柳杉抗寒性影响由强到弱分别是，SOD、电导率、MDA、可溶性蛋白、半致死温度。
柳杉各无性系抗寒性综合评价根据权重与隶属度值计算柳杉各无性系抗寒性综合指数，结果如表6。各个无性系的综合指数有一定的差异，综合指数在0.41～0.72之间，抗寒性最好的无性系为#57，其次分别为#32、#68，抗寒性相对较差的无性系为#011、#25以及#42，其中#42的抗寒性最弱，其余几个无性系的综合指数相对来说差距不大，在0.5～0.6之间。
然后根据柳杉各无性系抗寒性综合指数查柳杉细胞膜透性的数据，发现在-4℃低温处理12h，通过采用电导法测定柳杉叶片的细胞膜透性，根据值高低，可迅速判断80％以上柳杉无性系抗寒性高低(80％以上柳杉无性系的抗寒性与综合评价柳杉抗寒性的结果相同；相对电导率值越低，抗寒性越好)。
表4主成分分析结果
Figure BDA0002563705040000082
Figure BDA0002563705040000091
表5柳杉各无性系抗寒性的负荷量及权重
Figure BDA0002563705040000092
表6柳杉各无性系抗寒性综合指数
Figure BDA0002563705040000093

Claims (8)

1.一种柳杉抗寒性快速鉴定与评价的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)待测柳杉无性系的扦插繁殖；
2)取柳杉无性系扦插苗枝条进行低温胁迫处理，分为7组，处理温度为4℃、0℃、-4℃、-8℃、-12℃、-16℃、-20℃，从4℃开始，以4℃/h降温，到达目标温度时处理12h；
3)测定低温胁迫处理的柳杉枝条叶片的抗寒性生理指标：细胞膜透性、半致死温度LT50、丙二醛、SOD、可溶性蛋白含量；
4)通过主成分分析、回归分析的方法，对所述抗寒性生理指标进行综合分析，通过对抗寒性生理指标进行标准数量化后，按主成分因子负荷量，采用隶属度函数法确定隶属函数值的升降顺序，隶属度值与每个指标的权重共同决定柳杉各无性系抗寒性综合指数，建立抗寒性评价体系；
5)根据抗寒性评价体系进一步筛选快速鉴定与评价柳杉抗寒性生理指标，即在-4℃低温处理12h，通过采用电导法测定相对电导率，从而判断柳杉叶片的细胞膜透性变化，并根据柳杉叶片的细胞膜透性变化的大小，判断柳杉抗寒性高低。
2.根据权利要求1所述的柳杉抗寒性快速鉴定与评价的方法，其特征在于，步骤1)中，待测柳杉无性系进行扦插繁殖的穗条采集自无病虫害、生长良好、光照充足的母树；柳杉插穗采集后放入清水中浸泡保存，第二天用100ppm浓度的ABT6生根粉浸泡4h，然后进行扦插。
3.根据权利要求1所述的柳杉抗寒性快速鉴定与评价的方法，其特征在于，步骤2)中，所述柳杉无性系幼苗枝条为柳杉无性系两年生幼苗生长一致的枝条。
4.根据权利要求1所述的柳杉抗寒性快速鉴定与评价的方法，其特征在于，步骤2)中，零上温度处理后直接进行抗寒性生理指标的测定，零下温度处理结束后放入4℃中解冻12h后进行抗寒性生理指标的测定。
5.根据权利要求1所述的柳杉抗寒性快速鉴定与评价的方法，其特征在于，步骤3)中，细胞膜透性采用电导法测定测定相对电导率，拟合logistic方程计算半致死温度LT50，丙二醛采用硫代巴比妥酸法测定，SOD采用氮蓝四唑比色法测定，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定。
6.根据权利要求5所述的柳杉抗寒性快速鉴定与评价的方法，其特征在于，细胞膜透性采用电导法测定测定相对电导率，称取蒸馏水清洗干净的针叶于带塞试管中，按照1g∶100mL的比例加入蒸馏水，盖上瓶塞，常温浸提12h，直至针叶沉入管底后用电导仪测其电导值为E1，测蒸馏水电导值为E0，再将试管放入沸水浴20min，冷却至室温，测其电导值为E2，相对电导率＝(E1-E0)/(E2-E0)×100％。
7.根据权利要求1所述的柳杉抗寒性快速鉴定与评价的方法，其特征在于，步骤4)中，同一抗寒性生理指标内，隶属函数值越高，抗寒性越强。
8.根据权利要求1所述的柳杉抗寒性快速鉴定与评价的方法，其特征在于，步骤5)中，综合各指标隶属函数值的结果，结合细胞膜透性、半致死温度LT50、丙二醛、SOD、可溶性蛋白含量每一个单指标，发现-4℃低温胁迫柳杉无性系离体侧枝，相对电导率越低，抗寒性越强。
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