CN104745695A - 一种海甘蓝种间杂种基因组原位杂交的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物分子育种技术领域，具体涉及一种海甘蓝种间杂种基因组原位杂交的方法，本发明步骤包括制备探针标记、制片、原位杂交和信号检测等。在制片过程中通过采用合适的酶解条件及醋酸延展火焰干燥法可以得到形态好、分散性好的海甘蓝减数分裂期的染色体制片。在探针和染色体变性时选择合适的温度和时间，并确定了合适的封阻DNA和探针浓度比，获得了信号清晰的荧光原位杂交图片，能够清楚的鉴定海甘蓝杂种中来自于不同种间的染色体，使得基因组原位杂交可以较好的应用于具有染色体数目多、形态小等特点的海甘蓝物种的细胞学检测，为海甘蓝染色体鉴定和结构研究、海甘蓝的进化研究等提供了新的技术和途径。

Description

一种海甘蓝种间杂种基因组原位杂交的方法

技术领域

本发明属于作物分子育种技术领域，具体涉及一种海甘蓝种间杂种基因组原位杂交的方法，与作物育种领域有关。

背景技术

基因组原位杂交技术(Genomic in situ hybridization,GISH)是在20世纪80年代末发展起来的分子细胞遗传技术。它采用来自一个物种的总基因组DNA作为标记探针，用另一物种的总基因组DNA以适当的浓度进行封阻，在靶染色体上进行原位杂交。在封阻DNA和标记DNA探针之间，封阻DNA优先与一般序列杂交，剩下的特异性序列主要被标记探针所杂交。

在生物的原位杂交技术方面已检索到相关的文献，例如文献-1，公开号为CN104099416A公开了“一种芝麻染色体荧光原位杂交方法”，其要点是，采用涂片技术制作芝麻中期染色体标本，采用荧光素标记BAC标本进行芝麻BAC的染色体原位杂交，探针杂交染色体后，检测荧光信号，从而确定目的DNA片段在染色体上的拷贝数量及位置，其缺点是：该专利申请与本发明相比不属于同一个反应体系，且物种的基因型也是不相同的。

文献-2即公开号为CN102605051A公开了“一种EAAT2基因cRNA原位杂交探针及其设计方法”，其要点是，根据EAAT2基因的序列设计引物，扩增适当长度的该基因的片段作为该基因的探针质粒，以该探针质粒转化细菌后进行测序，制备得到该基因的cRNA杂交探针，进一步检测该基因片段cRNA探针的原位杂交信号。该专利申请的的目的是应用于细菌方面，与本发明有本质的区别。

文献-3，即公开号为CN103320505A公开了“一种HSD11B1基因的原位杂交的探针制定及检测方法“，采用了与文献-2相同的方法，区别在于合成了HSD11B1基因的mRNA原位杂交探针序列，并在其探针标记上标记了“地高辛”，主要用于该HSD11B1基因原位杂交检测，属于生物病理领域，与本发明有本质的差异。

文献-4即公开号为CN103451287A公开了“一种改良共变性荧光原位杂交方法”，其步骤包括：制备玻片标本、探针与染色体共变性和杂交，杂交后洗涤并做染色和信号检测，该发明的探针为商购探针，作用对象是羊水、绒毛或血液，属于临床医学领域，与本发明的领域有本质的区别。

本发明涉及的作物是海甘蓝(Crambe)属于十字花科海甘蓝属植物，种子合油量为34.48％，其中芥酸含量为55％-62.50％。海甘蓝的种子油通常在工业上有广泛的应用。可以通过远缘杂交技术将其培育成为新型工业油料作物。

迄今为止尚未见到有关海甘蓝种间杂种基因组原位杂交方法的应用及报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种检测海甘蓝种间杂种的染色体原位杂交方法以应用于海甘蓝种间杂种鉴定以及基因组亲缘关系研究，以便为作物育种特别是为作物的分子育种提供技术基础。

本发明总体技术方案包括探针的标记、原位杂交制片、原位杂交和信号检测等四个步骤。

本发明建立的杂交方法，光信号强，易于检测。杂交获得的染色体形态完好，能够有效的用于海甘蓝染色体的鉴定和结构的研究。

本发明的具体技术方案如下所述：

1、探针标记的制备

探针标记的制备：提取海甘蓝Crambe kraliiki(母本)基因组DNA进行探针标记，标记方法为将所得的海甘蓝基因组DNA(提取海甘蓝基因组的方法为常规CTAB法)采用切口平移法，用Bio-11-dUTP标记(一种分子试剂，购自上海生工生物工程有限公司)，其标记体系为：

在200μl的离心管中依次加入下面的各组分，充分混匀并离心，然后将其置于15℃中水浴2.5h，标记反应结束后用1％的琼脂糖凝胶检测片段大小，如片段大小为200-500bp时，则应加入5μl EDTA(0.5M)终止反应，置于-20℃保存备用。

封阻DNA制备：将海甘蓝Crambe abysscinica(父本)的基因组DNA在沸水中处理40min分钟左右，使片段与探针长度相似，长度约为为300－500bp，用作封阻。

2、原位杂交制片

(1)载玻片的准备 

将新的玻片放入80％浓硫酸配制的铬酸溶液中，室温下放置10h以上，捞出后用自来水洗掉铬酸，带上手套仔细清洗每张玻片；然后将清洗好的片子放置于流水中冲洗至少10min，再用蒸馏水冲洗一次，用100％乙醇浸泡备用。

(2)酶解花药

将固定好的海甘蓝花药放入柠檬酸缓冲液(0.1M柠檬酸,pH＝6)中，置摇床上摇动20min，放入酶的混合液(酶的成分和浓度为0.6％纤维素酶，0.2％的果胶酶和0.1％的蜗牛酶，其他分为双蒸水或蒸馏水)中，于37℃下水浴50min左右。

(3)制片

将酶解好的海甘蓝花药用吸管轻轻移入柠檬酸缓冲液中漂洗20min(室温放置即可，无需摇动)。用吸管将材料移到预先晾干的载玻片上，并加一滴柠檬酸缓冲液(0.1M柠檬酸,pH＝6)，在解剖境下仔细解剖海甘蓝的花药，去掉杂质，在滴液干之前加5-10μl的45％乙酸。放置1min后，用移液器滴加一至数滴的冷的卡诺固定液(按无水乙醇：醋酸的体积比＝3:1配制)展片。滴加卡诺固定液时可将移液器适当抬高，以提高展片的效果。待固定液干后在相差显微镜下检查制片的质量。选择质量好的制片于-20℃下保存备用。

3、原位杂交 

将准备原位杂交的制片在37℃的烘箱中烘至12h即可。

(1)蛋白酶的处理 

准备一个能够同时放置几张玻片的塑料盒子，底部放一张滤纸，用20×SSC(3M氯化钠和0.3M的柠檬酸钠配制的混合溶液)润湿，置于37℃烘箱中预热。每片加蛋白酶K(用0.01M盐酸稀释，8μg/mL)150μl。盖上耐高温的塑料软膜，将载玻片平稳的置于湿盒内，盖好盖子于37℃烘箱中温育30min。

(2)RNA酶处理

将载玻片从湿盒中拿出，放入盛有70ml的2×SSC的玻片缸中，待软膜飘起后将其捞出，将玻片缸置于平板摇床上轻摇5min(以下的漂洗步骤，均在摇床上进行)。每片加150μl的RNA酶液(购自上海生工生物工程有限公司，100μg/ml，使用前用2×SSC稀释)，盖膜，在湿盒中37℃温育1h。

(3)多聚甲醛的处理

在RNA酶处理的同时，配制4％的多聚甲醛溶液。在通风橱内称取2.8克的多聚甲醛粉末置于三角瓶中，加入42ml的蒸馏水，60℃水浴30min。加入14ml的0.1M的NaOH溶液，摇动三角瓶直到溶液变澄清，补充蒸馏水至70ml，摇匀冷却后倒入玻片缸中，置通风橱中备用；将经过RNA酶处理好的制片放入玻片缸中用2×SSC在摇床上漂洗三次，每次4min；放入多聚甲醛溶液中，摇床上摇动15min；再用2×SSC漂洗三次；制片分别在70％、100％的乙醇中脱水5min；空气中干燥。

(4)杂交混合液的制备

在1.5ml的离心管中按每张制片的量依次加入以下试剂或组分：

将杂交混合液混匀，离心，70℃水浴变性10min，冰上冷却5min，每片加50μl杂交混合液，盖膜，在原位PCR仪上80℃下共变性处理5min，于37℃湿盒中温育过夜。

(5)杂交后的洗脱 

1)用0.1×SSC配制20％的甲酰胺溶液，42℃水浴预热，同时预热两份2×SSC溶液；

2)将玻片放入盛有2×SSC的玻片缸中，待塑料膜飘起后捞出；

3)将玻片转入预热的甲酰胺中，42℃水浴10min；

4)转入预热的2×SSC中两次，每次5min；

5)在室温下，用2×SSC漂洗玻片一次，5min。

(6)生物素检测 

1)用1×磷酸盐缓冲液即PBS漂洗玻片一次，5min；

2)5％的牛血清白蛋白(BSA)100μl/每片，室温放置5min,揭膜；

3)用％牛血清白蛋白与荧光素Cy3按1：40的体积比配制Cy3溶液，然后每一玻片上加50ul上述配制好的Cy3溶液，最后后盖膜；

4)在湿盒中37℃温育30min；

5)用1×PBS洗三次，每次5min。

(7)DAPI负染与封片 

1)5μg/ml的DAPI每片100μl；

2)盖膜后在室温下放置15min；

3)将玻片放入1×PBS中待膜飘起后拿出；

4)每片加抗荧光猝灭剂一滴(购自Vector公司)；

5)4℃下避光保存。

4、杂交信号检测

4、杂交信号检测

利用德国莱卡(Leica)显微镜进行荧光观察，然后利用SPOT Cooled CCD装置(ORCAR2)俘获图像并摄影，最后后再利用Adobe Photoshop(8.0)软件进行图象的合成，得到如图1所述的图像。

本发明的有益效果：

本发明在制片过程中通过采用合适的酶解条件及醋酸延展火焰干燥法可以得到形态好、分散性好的海甘蓝减数分裂期的染色体制片。在探针和染色体变性时选择合适的温度和时间，并且确定了合适的封阻DNA和探针浓度比，获得了信号清晰的荧光原位杂交图片，能够清楚的鉴定海甘蓝杂种中来自于不同种间的染色体，使得基因组原位杂交可以较好的应用于具有染色体数目多、形态小等特点的海甘蓝物种的细胞学检测，为海甘蓝染色体鉴定和结构研究以及海甘蓝的进化研究等提供了新的技术和途径。

附图说明

图1：是本发明海甘蓝(Crambe abyssinica)和(Crambe kralikii)的杂种基因组原位杂交的检测图谱。附图标记说明：图中：蓝色荧光为DNA的DAPI负染，红色荧光为以Bio-11-dUTP标记的Crambe kralikii基因组DNA作探针杂交后的原位杂交位点。图中：A1、B1图分别为杂种后代减数分裂终变期时DAPI负染的图像；A2、B2图为杂种后代减数分裂终变期时DAPI和CY3信号合成后的图像(A1图和B1图示为同一个细胞分裂时期的图像)。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不是用来限制本发明的保护范围。

实施例1

1、染色体玻片标本的制备：

在晴好天气上午11点在田间取以海甘蓝(Crambe kralikii)为母本(该材料来源于美国农业部(参见网址：http://plants.usda.gov/core/profile？symbol＝CRAB5)、海甘蓝(Crambe abyssinica，该材料来源于美国农业部(参见网址：http://plants.usda.gov/core/profile？symbol＝CRAB5)为父本制备杂种(杂交所时所用的父母本的原始材料的来源及杂种制备过程参见文献：Du XZ,Huang BL,Guan H and Huang BQ.Production and genetic characterization of interspecific hybrids among Crambe abyssinica,Crambe hispanica and Crambe kralikii.Genet and Mol Res.13(3):6995-7005)的开花初期幼嫩花蕾，直接放入卡诺固定液(配方：按无水乙醇：冰醋酸的体积比为3:1配制)中室温固定24h，将固定好的花药放入1M盐酸中，于60℃水浴1-2min，将材料取出置于清水中，然后压片观察，将具有好的分裂相的花药放入柠檬酸缓冲液中，置摇床上摇动20min，放入酶的混合液(酶的成分和浓度为0.6％纤维素酶，0.2％的果胶酶和0.1％的蜗牛酶)中，37℃下水浴45-50min。然后将酶解好的材料用吸管轻轻移入柠檬酸缓冲液中漂洗20min(室温放置即可，无需摇动)。用吸管将材料移到预先晾干的载玻片上，并加一滴柠檬 酸缓冲液，在解剖境下仔细解剖花药，去掉杂质，在滴液干之前加5－10μl的45％浓度的乙酸。放置1min后，用移液器滴加一至数滴的冷的卡诺固定液展片。添加卡诺固定液可将移液器适当抬高，以提高展片的效果。待固定液干后在相差显微镜下检查制片的质量。选择质量好的制片于-20℃下保存备用。

2、探针标记的制备

探针标记的制备：提取海甘蓝Crambe kraliiki(母本)基因组DNA进行探针标记，标记方法为，将所得的海甘蓝基因组DNA(提取海甘蓝基因组的方法为常规CTAB法)采用切口平移法，用Bio-11-dUTP标记(一种分子试剂，购自上海生工生物工程有限公司)做探针，其

在200μl的离心管中依次加入上述的各组分并充分混匀离心，然后将上述探针标记体系置于15℃水浴中水浴2.5h，标记反应结束后用1％的琼脂糖凝胶检测片段大小，如片段为200－500bp，则应加5μl的EDTA(0.5M)终止反应，并置于－20℃保存备用。

封阻DNA制备：将来源于海甘蓝父本(Crambe abysscinica)的基因组DNA在沸水中处理40min左右，使片段与探针长度相似，约为300－500bp。

染色体制片材料：海甘蓝Crambe abysscinica和Crambe kraliiki的杂种后代的花药。

3、原位杂交的制片

(1)载玻片的准备 

将新的玻片放入80％浓硫酸配制的铬酸溶液中，室温下放置10h以上，捞出后用自来水洗掉铬酸，带上手套仔细清洗每张玻片；然后将清洗好的片子放置于流水中冲洗至少10min，再用蒸馏水冲洗一次，用100％浓度的乙醇浸泡备用。

(2)酶解花药

将固定好的海甘蓝花药放入柠檬酸缓冲液中，置摇床上摇动20min，放入酶的混合液(0.6％纤维素酶，0.2％的果胶酶和0.1％的蜗牛酶)中(具体时间视花药大小而定，花药大处理时间可长些，花药小处理时间可短些))，于37℃下水浴50min左右。

(3)制片

将上步酶解好的材料样品用吸管轻轻移入柠檬酸缓冲液中漂洗20min(室温放置即可， 无需摇动)。用吸管将材料移到预先晾干的载玻片上，并加一滴缓冲液(是柠檬酸缓冲液还是PBS)，在解剖境下仔细的解剖海甘蓝的花药和子房，去掉杂质，在滴液干之前加5-10μl的45％浓度的乙酸。放置1min后，用移液器滴加一至数滴的冷的卡诺固定液展片,添加卡诺固定液时可将移液器适当抬高，以提高展片的效果。待固定液干后在相差显微镜下检查制片的质量。选择质量好的制片于－20℃下保存备用。

4、原位杂交 

将准备原位杂交的制片在37℃的烘箱中烘干至12h。

(1)蛋白酶的制备 

准备一个能够同时放置几张玻片的塑料盒子，底部放一张滤纸，用20×SSC润湿，置于37℃烘箱中预热。每玻片加蛋白酶K(用0.01M盐酸稀释，8μg/mL，购自上海生工生物工程有限公司)150μl；盖上耐高温的塑料软膜，将载玻片平稳的置于湿盒内，盖好盖子于37℃烘箱中温育至30min。

(2)RNA酶制备

将载玻片从湿盒中拿出，放入盛有70ml 2×SSC的玻片缸中，待软膜飘起后将其捞出，将玻片缸置于平板摇床上轻摇5min(以下的漂洗步骤，均在摇床上进行)。每一玻片(以下或称制片)加150μl的RNA酶液(来源同前，100μg/ml，使用前述的2×SSC稀释)，盖膜，湿盒中37℃温育1h。

(3)多聚甲醛的制备

在RNA酶处理的同时，配制4％的多聚甲醛溶液：在通风橱内称取2.8克的多聚甲醛粉末置于三角瓶中，加入42ml的蒸馏水，60℃下水浴30分。加入14ml的0.1M的NaOH溶液，摇动三角瓶直到溶液变澄清，加蒸馏水至70ml，摇匀冷却后倒入玻片缸中，置通风橱中备用；将经RNA酶处理好的制片放入玻片缸中用2×SSC在摇床上漂洗三次，每次4min；放入多聚甲醛溶液中，摇床上摇动15min；再用2×SSC漂洗三次；制片分别在70％、100％的乙醇中脱水5min；空气干燥。

(4)杂交混合液的制备

在1.5ml的离心管中按每张制片的量依次加入下面的试剂或组分。

将上述杂交混合液混匀，离心，70℃水浴变性10min，冰上冷却5min。每制片加以上制备好的50μl杂交混合液，盖膜，在原位PCR仪上与80℃共变性5min，37℃湿盒温育过夜。

(5)杂交后的洗脱 

1)用0.1×SSC配制20％的甲酰胺溶液，42℃下水浴预热，同时预热两份2×SSC溶液；

2)将玻片放入盛有2×SSC的玻片缸中，待塑料膜飘起后捞出；

3)将玻片转入预热的甲酰胺中，42℃水浴10min；

4)转入预热的2×SSC中两次，每次5min；

5)在室温下用2×SSC处理一次，5min；

(6)生物素检测 

1)用1×PBS(磷酸盐缓冲液，137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH₂PO₄的混合溶液)漂洗一次，5min；

2)按100μl/每片加5％的牛血清白蛋白(BSA)，室温下放置5min,然后揭膜；

3)用5％的牛血清白蛋白与Cy3按体积比为1：40配制Cy3耦联的链亲和素，然后每一玻片上加50ul该溶液然后盖膜；

4)在湿盒中于37℃下温育30min；

5)用1×PBS洗三次，每次5min。

(6)DAPI负染与封片 

1)5μg/ml的DAPI(一种荧光标记物，购买于上海生工生物工程有限公司)，每一玻片中的DAPI的量为100μl；

2)将玻片盖膜后于室温下放置15min；

3)将玻片放入1×PBS中，待膜飘起后拿出；

4)每一玻片加抗荧光猝灭剂一滴(Vector，购买于上海生工生物工程有限公司)，

5)用干净的盖片盖好所述的玻片；

6)将所述的玻片于4℃下避光保存。

3、杂交信号的检测

利用德国莱卡(Leica)显微镜进行荧光观察，然后利用SPOT Cooled CCD装置(ORCAR2)俘获图像并摄影，最后后再利用Adobe Photoshop(8.0)软件进行图象的合成，得到如图1所述的图像。

Claims (2)

1.一种海甘蓝种间杂种基因组原位杂交的方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)探针标记体系的建立及封阻DNA制备

1)探针的标记体系

利用CTAB法提取母本海甘蓝(Crambe kralikii)叶片的基因组DNA，采用切口平移法用Bio-11-dUTP对提取的母本海甘蓝基因组DNA进行标记，所述的标记体系为：

在200μl的离心管中依次加入上述各组分，充分混匀并离心，然后将其置于15℃中水浴2.5h；标记结束后用1％的琼脂糖凝胶检测片段大小，如片段大小为200-500bp时，加入浓度为0.5M的5μl EDTA，终止反应，置于-20℃保存备用；

2)封阻DNA制备：

利用CTAB法提取父本海甘蓝(Crambe abyssinica)叶片基因组DNA用作封阻DNA，处理方式为将该基因组DNA在沸水中处理40min，使其DNA片段的长度与探针长度同为300－500bp；

(2)原位杂交制片

1)载玻片的准备

将新的玻片放入80％浓硫酸配制的铬酸溶液中，室温下放置10h以上，捞出后用自来水洗掉铬酸，仔细清洗每张玻片；然后将清洗好的片子放置于流水中冲洗至少10min，再用蒸馏水冲洗一次，用100％乙醇浸泡备用；

2)酶解花药

将固定好的海甘蓝花药放入柠檬酸缓冲液中，置摇床上摇动20min，放入酶的混合液中，所述酶的成分和浓度为0.6％纤维素酶，0.2％的果胶酶和0.1％的蜗牛酶；于37℃下水浴45-52min；

3)制片

将酶解好的海甘蓝花药用吸管轻轻移入柠檬酸缓冲液中漂洗20min，用吸管将所述的花药材料移到预先晾干的载玻片上，并加一滴柠檬酸缓冲液，在解剖境下仔细解剖海甘蓝的花药，去掉杂质，在滴液干之前加5-10μl的45％乙酸；放置1min后，用移液器滴加一至数滴的冷的卡诺固定液展片，待卡诺固定液干后在相差显微镜下检查制片的质量；选择质量好的制片于-20℃下保存备用；

(3)原位杂交

将准备原位杂交的制片在37℃的烘箱中烘至12h；

1)蛋白酶的处理

准备一个能够同时放置几张玻片的塑料盒子，底部放一张滤纸，用20×SSC润湿，置于37℃烘箱中预热，每片加浓度为8μg/mL的蛋白酶K150μl，盖上耐高温的塑料软膜，将载玻片平稳的置于湿盒内，盖上盖子后于37℃烘箱中温育30min；

2)RNA酶处理

将载玻片从湿盒中拿出，放入盛有70ml的2×SSC的玻片缸中，待软膜飘起后将其捞出，将玻片缸置于平板摇床上轻摇5min；每片加浓度为150μl的RNA酶液100μg/ml，使用前用2×SSC稀释，盖膜，在湿盒中37℃温育1h；

3)多聚甲醛的处理

在RNA酶处理的同时，配制4％的多聚甲醛溶液，加入14ml的0.1M的NaOH溶液，摇动三角瓶直到溶液变澄清，补充蒸馏水至70ml，摇匀冷却后倒入玻片缸中，置通风橱中备用；将经过RNA酶处理好的制片放入玻片缸中用2×SSC在摇床上漂洗三次，每次4min；放入多聚甲醛溶液中，摇床上摇动15min；再用2×SSC漂洗三次；制片分别在70％、100％的乙醇中脱水5min；空气中干燥；

4)杂交混合液的制备

在1.5ml的离心管中按每张制片的量依次加入以下试剂或组分：

混匀，离心后加入

Bio-11-dUTP探针           5μl(总量1μg)

10倍于探针量的封阻DNA     5μl(总量10μg)

总体积                    50μl

将杂交混合液混匀，离心，70℃水浴变性10min，冰上冷却5min，每片加50μl杂交混合液，盖膜，在原位PCR仪上80℃下共变性处理5min，于37℃湿盒中温育过夜；

5)杂交后的洗脱

a)用0.1×SSC配制20％的甲酰胺溶液，42℃水浴预热，同时预热两份2×SSC溶液；

b)将玻片放入盛有2×SSC的玻片缸中，待塑料膜飘起后捞出；

c)将玻片转入预热的甲酰胺中，42℃水浴10min；

d)将玻片转入预热的2×SSC中两次，每次5min；

e)在室温下，用2×SSC漂洗玻片一次，5min；

6)生物素检测

a)用1×磷酸盐缓冲液即PBS将玻片漂洗一次，5min；

b)5％的牛血清白蛋白(BSA)100μl/每片，室温放置5min,揭膜；

c)用％牛血清白蛋白与荧光素Cy3按1：40的体积比配制Cy3溶液，然后每一玻片上加50ul上述配制好的Cy3溶液，最后盖膜；

d)在湿盒中37℃温育30min；

e)用1×PBS洗三次，每次5min；

7)DAPI负染与封片

a)向每一玻片上滴加浓度为5μg/ml的DAPI 100μl；

b)将玻片盖膜后在室温下放置15min；

c)将玻片放入1×PBS中待膜飘起后拿出；

d)每一玻片加抗荧光猝灭剂一滴；

e)将上步的玻片在4℃下避光保存；

(4)对杂交信号进行检测。

2.如权利要求1所述的一种海甘蓝种间杂种基因组原位杂交的方法，其特征在于，提取海甘蓝(Crambe abyssinica)基因组DNA的材料包括花药、子房或植株幼嫩叶片。