CN101263782A - 一种小麦-黑麦t2bl.1rs新易位系种质的选育方法 - Google Patents
一种小麦-黑麦t2bl.1rs新易位系种质的选育方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出一种小麦－黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征包括：选择普通小麦品种小偃6号为母本，以近缘植物黑麦品种德国白粒为父本进行远缘杂交；经过幼胚拯救培养，秋水仙素半浸根法染色体加倍获得种子，再经抗病性鉴定、细胞学鉴定、并以原亲本小偃6号作父本回交，获得回交种子；再经抗病性鉴定、细胞学鉴定，定向选择综合性状优良的单株自交，如此连续自交选育6代，最终获得的单株经采用连续的总基因组原位杂交技术和三个探针的多色荧光原位杂交技术鉴定，确认为小麦－黑麦T2BL.1RS易位系。它高抗条锈病当前流行菌系和白粉病的重要毒株，丰产性状优异，为培育突破性的抗病、高产小麦新品种奠定了优异的种质基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，创制抗病、丰产性状优异的种质资源，属于农业生物技术育种研究领域。
背景技术
小麦育种的突破取决于优异种质基因资源的发掘和利用。但是随着现代农业耕作制度的改进，栽培小麦种内的遗传变异急剧减少，优异种质资源日益匮乏。众多的研究表明，小麦近缘植物蕴藏着许多丰富的、有价值的基因资源。通过远缘杂交，向栽培小麦种内导入外源优良基因，拓宽小麦的遗传基础，既可创造新物种，又可选育出具有某种优良特性的新类型。因此，发掘和利用近缘植物中的优异基因，创制优异种质材料，就成为解决小麦育种种质资源匮乏的最佳途径。
小麦近缘植物黑麦是改良小麦产量、品质和抗性的重要基因源。它具有大穗、多小穗、籽粒蛋白质和赖氨酸含量高等特点，而且具有抗条锈、杆锈、叶锈和白粉的基因以及染色体相互作用所产生的优良性状等(参考文献Schlegel R，Melz G，Korzun V(1998).Genes，markers andlinkage data of rye(Secale cereale L.)：5th updated inventory.Euphytica 101，32-67.；McIntosh RA，Yamazaki Y，Devos KM，Dubcovsky J，Rogers WJ，Appels R(2003).Catalogue of gene symbols for wheat.In：Pogna NE，RomanòM，Pogna EA，Galterio G，eds.Proceedings of the 10thInternational Wheat Genetics Symposium.Paestum，Italy.pp.1-6.)。通过种间特定的染色体易位和替换，目前在育成的小麦品种中，小麦-黑麦T1BL.1RS易位系占推广品种的10～70％，在我国则达到50～70％，它们主要是黑麦品种Pekus的T1BL.1RS易位系。
但是，近十多年来，随着新的条锈病和白粉病病原小种(或菌系)的出现和优势小种(或菌系)的发展，黑麦品种1RS上的抗条锈病基因Yr9，抗白粉病基因Pm8已经失效，抗叶锈基因Lr26的抗性也表现不稳定，致使生产上主栽的原有小麦-黑麦T1BL.1RS易位系的品种陆续丧失了对当前病害流行菌系的抗性，急需发掘和利用黑麦新的抗病优异种质资源，以培育多抗、高产的小麦优良新品种。
发明内容
本发明的目的在于针对目前生产上主栽的T1BL.1RS易位系品种因病原新小种(菌系)的出现而陆续丧失抗性的问题，为了克服抗病品种的单一化，增加抗源的多样性，提供一个抗病、高产小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法。
本发明要解决的技术问题是通过如下技术方案实现的：这种小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征包括以下步骤：
a、亲本选择：选择普通小麦品种小偃6号为母本，以近缘植物黑麦品种德国白粒为父本进行远缘杂交；
b、远缘杂交：在母本小偃6号抽穗后第二天人工去雄，后套袋隔离；母本开花后第二天上午9～11点，下午3～4点用父本授粉，连续重复3次；授粉后继续套袋，在授粉16～18天后采集幼穗于4℃冰箱中保存48～72小时；
c、幼胚拯救培养：剥离步骤b中获得的幼穗，将杂种F0的幼胚于MS培养基上培养成苗，并在生根壮苗培养基上生根壮苗，4℃越夏，经营养钵育苗后于当年的十月初移栽大田，获得根尖细胞染色体数目为2n＝28的F1幼胚再生植株；
d、秋水仙素半浸根法染色体加倍：将步骤c中获得的幼胚再生植株的部分根系，浸入0.05％的秋水仙素溶液中，进行染色体加倍，获得F1种子；
e、鉴定、回交：种植步骤d的F1种子，获得根尖细胞染色体数目加倍2n＝56的F1植株；对F1植株进行条锈病和白粉病的抗病性鉴定，保留抗病的植株，并以步骤a中的原母本小偃6号作父本回交，获得回交种子；
f、鉴定、自交：种植步骤e获得的回交种子，对回交后代植株进行细胞学鉴定，抗病性鉴定和农艺性状调查，定向选择综合性状优良的单株自交，如此连续自交选育6代；采用连续的总基因组原位杂交技术和三个探针的多色荧光原位杂交技术，对自交最终获得的根尖细胞染色体数目为2n＝42＝21″W单株鉴定，黑麦的一对1RS染色体臂代换了小麦的一对2BS染色体臂，确认为T2BL.1RS易位的小麦-黑麦新种质。
所述小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征在于：步骤c所述的幼胚拯救培养的生根壮苗培养基是如下重量比例的：MS培养基50％、蔗糖2％、烯效唑0.025％、水余量。
所述小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征在于：步骤d所述的秋水仙素半浸根法染色体加倍是在次年春季3月中旬，在步骤c中移栽到大田的F1幼胚再生植株一侧，挖一直径10cm左右的小坑，露出1/2～2/3的根系，抖净泥土，其余根系仍留在土中，将10ml小烧杯倾斜放入小坑内，把露出的根系分蘖节轻轻塞入小烧杯内，然后用吸移管注入营养液浸没分蘖节，再在杯口处塞上浸过药液的棉花，在坑口盖一块塑料膜，用土覆盖以减少药液蒸发，每天早、中、晚三次向烧杯内添加营养液至浸没分蘖节，处理四天后，去掉烧杯，将根系至分蘖节轻轻重新埋入土中，植株成熟收获时按单株考查结实情况，获得F1种子。
所述小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征在于：所述的营养液是如下重量比例的秋水仙素0.05％、二甲基亚砜1.5％、MS培养基5％、水余量。
所述的小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征在于：步骤e所述的抗病性鉴定包括人工接种鉴定对条锈病的抗性鉴定：以小麦品种铭贤169作感病对照，操作步骤为在每年春季3月上旬，在麦苗的第一、二片心叶上去掉腊质后，用毛笔将条锈菌的病孢子涂抹在第一、二片心叶上，并喷水保湿，两周后等感病对照铭贤169充分发病时调查抗病性，用反应型表示：0--免疫，0；--近免疫，1--高抗，2--中抗，3--中感，4--高感。
所述的小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征在于：步骤e所述的抗病性鉴定包括自然诱发鉴定对白粉病的抗性：操作步骤为在每年春季4月初，在自然菌源充足的病圃，在拔节期到灌浆期45天内浇水3～4次以保持高湿环境，即可充分诱发白粉病，3～4周后当感病对照铭贤169充分发病时调查抗病性，采用0～9级分级法：0--免疫，1～2级--高抗，3～4级--中抗，5～6级--中感，7～9级--高感。
本发明选育鉴定的小麦(小偃6号)-黑麦(德国白粒)T2BL.1RS新易位系种质，不同于生产上一般常见的小麦-黑麦T1BL.1RS易位系，它高抗条锈病当前流行菌系和白粉病的重要毒株，丰产性状优异，为培育突破性的抗病、高产小麦新品种奠定了优异的种质基础。
附图说明
图1为连续GISH(A)和FISH(B)鉴定小麦-黑麦T2BL.1RS易位系的图谱
图2为连续GISH(A)和FISH(B)鉴定小麦-黑麦T2BL.1RS易位系的图谱
图3显示的为小麦-黑麦T2BL.1RS易位系抗条锈病的鉴定结果
图4显示的为小麦-黑麦T2BL.1RS易位系抗白粉病的鉴定结果
图5显示的为小麦-黑麦T2BL.1RS易位系的农艺性状
图6显示的为小麦-黑麦T2BL.1RS易位系的穗子和籽粒
图中：
图1A、图2A分别显示的是以digoxigenin-11-dUTP标记的黑麦基因组DNA为探针，中国春DNA为封组的GISH图谱，其中小麦染色体显示红色，黑麦染色体表现绿色，表明黑麦的一对染色体臂导入了小麦，取代了小麦的一对染色体臂，形成了小麦-黑麦易位系。
图1B、图2B分别显示的是在图1A、图2A同一个细胞上(GISH)，继续采用一组pHvG38(绿色)/pSc119.2(红色)探针(图1B)和另外一组pAs1(绿色)/pSc119.2(红色)探针(图2B)的FISH鉴定结果。图1B、图2B表明导入小麦的一对黑麦染色体臂是黑麦1R染色体的短臂，即1RS染色体，与其对应的小麦染色体为2B染色体的长臂，即2BL染色体。三个探针相结合鉴定全部染色体的FISH结果表明该小麦-黑麦易位系为一个小麦-黑麦T2BL.1RS易位系。
图3显示的是小麦-黑麦T2BL.1RS易位系抗条锈病的鉴定结果。其中a为黑麦品种德国白粒，对条锈病表现0级(免疫)；b为T2BL.1RS易位系，表现1级(高抗)；c为对照小麦品种石4185，表现4级(高感)。
图4显示的是小麦-黑麦T2BL.1RS易位系抗白粉病的鉴定结果。其中a为对照品种石4185，对白粉病表现7级(高感)；b为黑麦品种德国白粒，表现0级(免疫)；c为T2BL.1RS易位系，表现2级(高抗)。
图5显示的是小麦-黑麦T2BL.1RS易位系的农艺性状。其中图5A为成熟的单株；图5B为大田未成熟时的表现。
图6显示的是小麦-黑麦T2BL.1RS易位系的穗子(正面和侧面)和籽粒。
具体实施方式
1、小麦(小偃6号)-黑麦(德国白粒)T2BL.1RS新易位系种质的选育方法：
a、亲本选择：小麦品种小偃6号(Triticum aestivum L.，2n＝42，AABBDD)，是由李振声院士等利用长穗偃麦草和普通小麦远缘杂交选育出的一个冬小麦品种，具有优质、早熟、抗逆性强，适应性广的特点，被誉为我国小麦远缘杂交育种中表现最突出的品种，是我国小麦育种重要的骨干亲本之一，但由于品种----菌群互动，目前已丧失了对条锈病和白粉病的抗性。
黑麦为小麦的一个近缘种，是改良小麦产量、品质和抗性的重要基因源，具有抗条锈、杆锈、叶锈，白粉、叶斑病和抗蚜虫的特性。黑麦作为异交植物，不同品种之间甚至品种内部都具有较高的遗传多样性。选择对条锈病当前流行菌系和白粉病毒株免疫的黑麦品种德国白粒(Secale cereale L.；cv.German White，2n＝14，RR)为亲本，以期将黑麦的抗病性导入遗传背景优良的骨干亲本小偃6号中，创制优异种质资源。
b、远缘杂交：以小偃6号为母本，以黑麦品种德国白粒为父本，配制杂交组合。在母本小偃6号抽穗后第二天人工去雄，后套袋隔离；母本开花后第二天上午9～11点，下午3～4点用父本授粉，连续重复3次(天)；授粉后继续套袋，在授粉16～18天后采集幼穗于4℃冰箱中保存48～72小时；
c、幼胚拯救培养：由于远缘杂交获得的F0有胚无乳，必需进行幼胚拯救培养才能生长成苗。因此，需剥离步骤b中获得的幼穗，将杂种F0的幼胚于MS培养基上培养成苗，并在成分是如下重量比例的：“MS培养基50％、蔗糖2％、烯效唑0.025％、水余量。”生根壮苗培养基上生根壮苗，4℃越夏，经营养钵育苗后于当年的十月初移栽大田，获得F1幼胚再生植株。
d、秋水仙素半浸根法染色体加倍：通过根尖细胞染色体和花粉母细胞染色体制片，在显微镜下进行观察，F1幼胚再生植株根尖细胞的染色体数目为2n＝28；花粉母细胞染色体的构型为2n＝21′W+7′R。由于F1幼胚再生植株不结实，因此必需通过染色体加倍获得后代种子。具体操作是在次年春季3月中旬，在步骤c中移栽到大田的F1幼胚再生植株一侧，挖一直径10cm左右的小坑，露出1/2～2/3的根系，抖净泥土，其余根系仍留在土中，将10ml小烧杯倾斜放入小坑内，把露出的根系分蘖节轻轻塞入小烧杯内，然后用吸移管注入是如下重量比例的：“秋水仙素0.05％、二甲基亚砜1.5％、MS培养基5％、水余量。”营养液浸没分蘖节，再在杯口处塞上浸过药液的棉花，在坑口盖一块塑料膜，用土覆盖以减少药液蒸发。每天早、中、晚三次向烧杯内添加药液至浸没分蘖节，处理四天后，去掉烧杯，将根系至分蘖节轻轻重新埋入土中。植株成熟收获时按单株考查结实情况，获得F1种子；
e、鉴定、回交：种植步骤d的F1种子，获得染色体加倍的F1植株。经细胞学鉴定，其根尖细胞的染色体数目为2n＝56。人工接种鉴定对条锈病；自然诱发鉴定对白粉病的抗性，保留抗病的植株，并以步骤a中的亲本小偃6号作父本回交，获得回交种子。
人工接种鉴定对条锈病的抗性：以小麦品种铭贤169作感病对照，操作步骤为在每年春季3月上旬，在麦苗的第一、二片心叶上去掉腊质后，用毛笔将条锈菌的病孢子涂抹在第一、二片心叶上，并喷水保湿，两周后等感病对照铭贤169充分发病时调查抗病性，用反应型表示：0--免疫，0；--近免疫，1--高抗，2--中抗，3--中感，4--高感。
自然诱发鉴定对白粉病的抗性：一般在每年春季4月初，在自然菌源充足的病圃，在拔节期到灌浆期45天内浇水3～4次以保持高湿环境，即可充分诱发白粉病。3～4周后当感病对照铭贤169充分发病时调查抗病性，采用0～9级分级法：0--免疫，1～2级--高抗，3～4级--中抗，5～6级--中感，7～9级--高感。
农艺性状的精准鉴定：通过对每一代小麦-黑麦材料进行农艺性状的详细调查，包括株高，穗数，小穗数，穗粒数，不育小穗数，粒色，籽粒饱满度、千粒重等，并以小麦区试对照品种石4185和亲本小偃6号为对照，定向选择丰产性状优良的后代材料。
f、鉴定、自交：种植步骤e获得的回交种子，对回交后代植株进行细胞学鉴定；人工接种鉴定对条锈病当前流行菌系；自然诱发鉴定对白粉病的抗性；精准鉴定综合农艺性状。定向选择形态特征趋向普通小麦，育性正常，综合农艺性状优良，高抗或免疫条锈病和白粉病的单株进行自交，如此连续自交选育6代，最终获得编号为WR04-32的小麦-黑麦材料。
2、小麦(小偃6号)-黑麦(德国白粒)T2BL.1RS新易位系种质的鉴定结果
2-1、连续基因组原位杂交(GISH、FISH)鉴定：由中科院遗传与发育生物学研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室，对步骤f中获得的细胞学稳定的小麦-黑麦材料WR04-32(2n＝42＝21″W)，采用连续的总基因组原位杂交技术(GISH)和三个探针的多色荧光原位杂交技术(FISH)相结合，准确识别鉴定全部黑麦染色体(片段)和小麦染色体(片段)的归属，确定小麦-黑麦易位系的组成。其中以黑麦基因组为探针，中国春为封组的GISH表明，小麦染色体(染色体片段)显示红色，黑麦染色体(染色体片段)表现绿色，证明步骤f中获得的材料WR04-32为一个小麦-黑麦易位系，如图1A，图2A所示。进一步在GISH的同一个细胞上，采用pHvG38(绿色)/pSc119.2(红色)和pAsl(绿色)/pSc119.2(红色)两组探针结合的FISH表明，步骤f中获得的材料WR04-32为黑麦的一对1RS染色体臂代换了小麦的一对2BS染色体臂，确认为小麦-黑麦T2BL.1RS易位系，如图1B，图2B所示。
2-2、抗病性综合鉴定：在中科院栾城国家生态系统观测台站病圃连续4年的抗病性鉴定结果表明，小麦-黑麦材料WR04-32高抗至免疫条锈病当前流行菌系(CY30、CY31、CY32和水源类型)的混合菌系。由中国农科院植保所进行的苗期分小种抗病性鉴定结果表明，WR04-32免疫至近免疫条中CY28(0-0；级)，免疫CY29；CY30和CY31(0级)，高抗CY32(1级)。条锈病成株期抗性鉴定结果表明，WR04-32免疫条中CY31(0级)，高抗CY32(1级)，高抗条锈病当前流行的混合菌系(条中29号、条中30号、条中31号、条中32号、Su-4、Su-6、Su-11、Su-12、Su-14)。对白粉病自然诱发鉴定和混合菌系的接种鉴定表现高抗(2级)。WR04-32的亲本小偃6号均高感条锈病和白粉病；黑麦品种德国白粒均免疫条锈病和白粉病。目前生产上主栽的T1BL.1RS易位系的代表性品种石4185(国家区域试验对照品种)不论对条锈病(4级)和白粉病(7级)也均表现高感，如图3、图4所示。
2-3、农艺性状的精准鉴定：最终选育出的代号为WR04-32的小麦-黑麦T2BL.1RS易位系，表现半冬性，中早熟，株高75cm左右，叶片上挺，株型紧凑，茎秆粗壮，抗倒伏性强。穗层整齐，分蘖力强，成穗率高(15个)，平均小穗数24个，穗粒数68个。穗长方型，长芒，白壳，白粒，硬质。穗大、粒多，籽粒椭圆型，饱满度好，千粒重40-42g。
作为一个种质材料，小麦/黑麦T2BL.1RS易位系突出特点是由于外源黑麦染色体的导入，其高抗条锈病(图3)、白粉病(图4)，综合抗病性强，并且株型紧凑，穗层整齐，分蘖力强，产量性状优异，如图5和图6所示。为了促进小麦/黑麦种质资源的有效利用，目前利用小麦-黑麦T2BL.1RS易位系已经配置了100多个杂交组合。
本发明列举的实施例旨在进一步地阐述小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育鉴定方法，而不对本发明的范围构成任何限制。
Claims (6)
1、一种小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征包括以下步骤：
a、亲本选择：选择普通小麦品种小偃6号为母本，以近缘植物黑麦品种德国白粒为父本进行远缘杂交；
b、远缘杂交：在母本小偃6号抽穗后第二天人工去雄，后套袋隔离；母本开花后第二天上午9～11点，下午3～4点用父本授粉，连续重复3次；授粉后继续套袋，在授粉16～18天后采集幼穗于4℃冰箱中保存48～72小时；
c、幼胚拯救培养：剥离步骤b中获得的幼穗，将杂种F0的幼胚于MS培养基上培养成苗，并在生根壮苗培养基上生根壮苗，4℃越夏，经营养钵育苗后于当年的十月初移栽大田，获得根尖细胞染色体数目为2n＝28的F1幼胚再生植株；
d、秋水仙素半浸根法染色体加倍：将步骤c中获得的幼胚再生植株的部分根系，浸入0.05％的秋水仙素溶液中，进行染色体加倍，获得F1种子；
e、鉴定、回交：种植步骤d的F1种子，获得根尖细胞染色体数目加倍2n＝56的F1植株；对F1植株进行条锈病和白粉病的抗病性鉴定，保留抗病的植株，并以步骤a中的原母本小偃6号作父本回交，获得回交种子；
f、鉴定、自交：种植步骤e获得的回交种子，对回交后代植株进行细胞学鉴定，抗病性鉴定和农艺性状调查，定向选择综合性状优良的单株自交，如此连续自交选育6代；采用连续的总基因组原位杂交技术和三个探针的多色荧光原位杂交技术，对自交最终获得的根尖细胞染色体数目为2n＝42＝21″W单株鉴定，黑麦的一对1RS染色体臂代换了小麦的一对2BS染色体臂，确认为T2BL.1RS易位的小麦-黑麦新种质。
2、根据权利要求1所述小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征在于：步骤c所述的幼胚拯救培养的生根壮苗培养基是如下重量比例的：MS培养基50％、蔗糖2％、烯效唑0.025％、水余量。
3、根据权利要求1所述小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征在于：步骤d所述的秋水仙素半浸根法染色体加倍是在次年春季3月中旬，在步骤c中移栽到大田的F1幼胚再生植株一侧，挖一直径10cm左右的小坑，露出1/2～2/3的根系，抖净泥土，其余根系仍留在土中，将10ml小烧杯倾斜放入小坑内，把露出的根系分蘖节轻轻塞入小烧杯内，然后用吸移管注入营养液浸没分蘖节，再在杯口处塞上浸过药液的棉花，在坑口盖一块塑料膜，用土覆盖以减少药液蒸发，每天早、中、晚三次向烧杯内添加营养液至浸没分蘖节，处理四天后，去掉烧杯，将根系至分蘖节轻轻重新埋入土中，植株成熟收获时按单株考查结实情况，获得F1种子。
4、根据权利要求3所述小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征在于：所述的营养液是如下重量比例的秋水仙素0.05％、二甲基亚砜1.5％、MS培养基5％、水余量。
5、根据权利要求1所述的小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征在于：步骤e所述的抗病性鉴定包括人工接种鉴定对条锈病的抗性鉴定：以小麦品种铭贤169作感病对照，操作步骤为在每年春季3月上旬，在麦苗的第一、二片心叶上去掉腊质后，用毛笔将条锈菌的病孢子涂抹在第一、二片心叶上，并喷水保湿，两周后等感病对照铭贤169充分发病时调查抗病性，用反应型表示：0--免疫，0；--近免疫，1--高抗，2--中抗，3--中感，4--高感。
6、根据权利要求1所述的小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征在于：步骤e所述的抗病性鉴定包括自然诱发鉴定对白粉病的抗性：操作步骤为在每年春季4月初，在自然菌源充足的病圃，在拔节期到灌浆期45天内浇水3～4次以保持高湿环境，即可充分诱发白粉病，3～4周后当感病对照铭贤169充分发病时调查抗病性，采用0～9级分级法：0--免疫，1～2级--高抗，3～4级--中抗，5～6级--中感，7～9级--高感。
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