CN104137774A - 无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法，其以无芒雀麦成熟种子作为外植体，先进行表面灭菌，再将经过灭菌处理的无芒雀麦种子转入愈伤组织诱导培养基中培养；诱导产生的愈伤组织转入第一继代培养基中进行首次继代，然后转入分化培养基中培养；将分化培养得到的不定芽接入第二继代培养基中进行二次继代，分化出苗后接入生根培养基中诱导生根。本方法以无芒雀麦成熟种子作为外植体，通过加入不同浓度生长素与细胞分裂素的培养基来诱导愈伤组织及分化、生根，从而建立其完整组培再生体系，为无芒雀麦通过基因工程进行遗传改良提供基础。

Description

无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，尤其是一种无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法。
背景技术
无芒雀麦(Bromus  inermis)是禾本科(Gramineae)雀麦属(Bromus)的多年生草本植物。具有适应性强、营养价值高、产量大、利用季节长、再生性强等特征，是优良的牧草。其野生种广泛分布于我国各省区，为1000～3500m山地草甸草场优势草种。因其具有发达的地下根茎，具有很强的抗旱能力，也是建立人工草场和环保固沙的先锋植物。
近年来，随着产业结构的调整和环境治理的需求，我国无芒雀麦的人工种植面积不断扩大，对无芒雀麦种子的需求呈上升趋势，对其进行品质改良已迫在眉睫。随着生物技术的发展，利用基因工程进行植物品质改良已成为普遍和实用的手段，而成功进行基因转化的前提就是建立高效、快速的植物组织培养再生体系。国内通过组织培养建立草本植物再生体系更多的集中于苜蓿等豆科牧草，而禾本科牧草组织培养再生体系的建立由于而相对较难，其相关技术的探索还较薄弱,而以成熟种子作为外植体进行组织培养再生体系的建立更为鲜见。目前国内对无芒雀麦离体组培再生体系建立的研究还处于起步阶段，仅有研究通过低能离子束注入的方式对其愈伤组织的诱导培养进行探索，而通过不同激素的合理有效配比来建立无芒雀麦成熟种子组织培养再生体系的研究还未见报道，对其再生过程中诱导、分化、生根等关键步骤建立方法的研究还属于空白。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种建立完整组培再生体系的无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：其以无芒雀麦成熟种子作为外植体，先进行表面灭菌，再将经过灭菌处理的无芒雀麦种子转入愈伤组织诱导培养基中培养；诱导产生的愈伤组织转入第一继代培养基中进行首次继代，然后转入分化培养基中培养；将分化培养得到的不定芽接入第二继代培养基中进行二次继代，分化出苗后接入生根培养基中诱导生根。
本发明所述诱导培养基为：附加2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）0.5～1mg/L、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）0.5～1mg/L、蔗糖25g/L和琼脂7g/L的MS培养基，pH值为5.8～6。
本发明所述第一继代培养基为：附加2,4-二氯苯氧乙酸1～2mg/L、6-苄基氨基嘌呤0.5～1mg/L、蔗糖25g/L和琼脂7g/L的MS培养基，pH值为5.8～6。
所述愈伤组织在诱导培养基和第一继代培养基中的培养条件均为：温度25～27℃，光照时间12～14h/d，光照强度1000～2000Lux，诱导时间30～35d。
本发明所述分化培养基为：附加萘乙酸（NAA）1.5～2mg/L、6-苄基氨基嘌呤0.5～1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L的MS培养基，pH值为5.8～6。所述愈伤组织在分化培养基中的培养条件为：温度25～27℃，光照时间14～16h/d，光照强度1000～2000Lux，培养时间30～35d。
本发明所述第二继代培养基为：附加萘乙酸1～1.5mg/L、6-苄基氨基嘌呤0.5～1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L的MS培养基，pH值为5.8～6。所述不定芽在第二继代培养基中的培养条件为：温度25～27℃，光照时间14～16h/d，光照强度1000～2000Lux，培养时间35～40d。
本发明所述生根培养基为：附加蔗糖25g/L和琼脂7.5g/L的1/2 MS培养基。所述生根培养基中的培养条件为：温度25～27℃，光照时间16～18h/d，光照强度1000～2000Lux，培养时间35～40d。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：1、以往禾本科牧草需要长时间暗培养才可诱导出愈伤组织，在之后的分化、生根培养过程再调整为光培养，步骤较繁琐；本发明从诱导到生根只需光培养即可成功得到再生植株，省去繁琐的暗培养控制过程，节省人力物力。2、与其他禾本科牧草组培不同，本发明在分化后又进行二次继代，得到的植株数量更多，生活力更强。3、本发明在整个培养过程中只用到3种激素，较以往更节约成本。4.在分化过程中，特意将光照培养时间加长，使之与植株本身正常生长节律相匹配，得到的植株较以往更易适应外界环境响应。5、生根培养过程中，特意加大了琼脂份量，提高了培养基本身的硬度，得到的植株根部较以往更粗壮，移栽更容易成活。
本发明以无芒雀麦成熟种子作为外植体，从诱导到生根只需对光培养时间进行小幅度调整即可成功得到再生植株，通过加入不同浓度生长素与细胞分裂素的培养基来诱导愈伤组织及分化、生根，从而建立其完整组培再生体系，具有培养工艺简单、成本低，得到的植株数量多、活力强、更容易成活的特点。
附图说明
图1是本发明的工艺流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：图1所示，本无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法采用下述具体的工艺步骤。
（1）外植体灭菌处理：选择饱满的无芒雀麦种子，去壳后置于50ml三角瓶中。在超净工作台上用体积百分比为75%的乙醇表面消毒1min，无菌水冲洗1遍；再用体积百分比为0.1%的氯化汞进一步消毒15min，其间不停振荡，最后用无菌水冲洗5次，在室温下用无菌水浸泡12h，让种子充分吸胀。
（2）愈伤组织的诱导：将已灭菌的无芒雀麦种子接种于愈伤组织诱导培养基上进行培养。培养条件为：温度26℃，光照时间12h/d，光照强度1500Lux；诱导培养基为：在MS培养基中加入1mg/L的2,4-D、0.5mg/L的6-BA、25g/L的蔗糖和7g/L的琼脂，pH值5.8，诱导时间30d。 
（3）将愈伤组织转入继代培养基1中进行培养：种子诱导得到愈伤组织后，将其转移到继代培养基1中进行培养。培养条件为：温度26℃，光照时间12h/d，光照强度1500Lux；继代培养基1为：MS＋1mg/L 2,4-D ＋1mg/L 6-BA ＋25g/L蔗糖＋7g/L琼脂，pH值5.8，培养时间30d。
（4）将愈伤组织转入分化培养基中进行分化培养：挑选生长状态佳的愈伤组织转入分化培养基培养。培养条件为：温度26℃，光照时间14h/d，光照强度1500Lux；分化培养基为：MS＋2mg/L NAA ＋1mg/L 6-BA ＋30g/L蔗糖＋7g/L琼脂，pH值5.8，培养时间30d。
（5）将分化培养得到的不定芽接入继代培养基2中继续进行继代：分化培养基培养得到的不定芽转入继代培养基2中进行继代直至出苗。培养条件为：温度26℃，光照时间14h/d，光照强度1500Lux；继代培养基2为：MS＋1mg/L NAA ＋1mg/L 6-BA ＋30g/L蔗糖＋7g/L琼脂，pH值5.8，培养时间35d。
（6）分化出苗后接入生根培养基中诱导生根：待再生小苗长至3～4cm时转入生根培养基中培养；培养条件为：温度26℃，光照时间16h/d，光照强度1500Lux；生根培养基为：1/2 MS＋25g/L蔗糖＋7.5g/L琼脂，pH值5.8，培养时间35d。
上述培养基中各附加成分（2,4-D、6-BA、蔗糖、琼脂、萘乙酸等）的加入量以各培养基总量为基准计算得出。
经分析、检测，本实施例的诱导率为68%，分化率为83%，生根率在90%以上。
实施例2：本无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法采用下述具体的工艺步骤。
（1）外植体灭菌处理：同实施例1。
（2）愈伤组织的诱导：培养条件为：温度25℃，光照时间13h/d，光照强度2000Lux；诱导培养基为：MS＋0.8mg/L 2,4-D ＋1mg/L 6-BA ＋25g/L蔗糖＋7g/L琼脂，pH值6.0，诱导时间35d；
（3）将愈伤组织转入继代培养基1中进行培养：培养条件为：温度27℃，光照时间13h/d，光照强度2000Lux；继代培养基1为：MS＋1.5mg/L 2,4-D ＋0.5mg/L 6-BA ＋25g/L蔗糖＋7g/L琼脂，pH值5.9，培养时间35d。
（4）将愈伤组织转入分化培养基中进行分化培养：培养条件为：温度25℃，光照时间15h/d，光照强度2000Lux；分化培养基为：MS＋1.5mg/L NAA ＋0.8mg/L 6-BA ＋30g/L蔗糖＋7g/L琼脂，pH值6.0，培养时间32d。
（5）将分化培养得到的不定芽接入继代培养基2中继续进行继代：培养条件为：温度25℃，光照时间16h/d，光照强度2000Lux；继代培养基2为：MS＋1.2mg/L NAA ＋0.5mg/L 6-BA ＋30g/L蔗糖＋7g/L琼脂，pH值5.9，培养时间40d。
（6）分化出苗后接入生根培养基中诱导生根：培养条件为：温度25℃，光照时间18h/d，光照强度2000Lux；生根培养基为：1/2 MS＋25g/L蔗糖＋7.5g/L琼脂，pH值5.8，培养时间38d。
经分析、检测，本实施例的诱导率为65%，分化率为85%，生根率在90%以上。
实施例3：本无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法采用下述具体的工艺步骤。
（1）外植体灭菌处理：同实施例1。
（2）愈伤组织的诱导：培养条件为：温度27℃，光照时间14h/d，光照强度1000Lux；诱导培养基为：MS＋0.5mg/L 2,4-D ＋0.7mg/L 6-BA ＋25g/L蔗糖＋7g/L琼脂，pH值5.9，诱导时间33d；
（3）将愈伤组织转入继代培养基1中进行培养：培养条件为：温度25℃，光照时间14h/d，光照强度1000Lux；继代培养基1为：MS＋2mg/L 2,4-D ＋0.8mg/L 6-BA ＋25g/L蔗糖＋7g/L琼脂，pH值5.9，培养时间32d。
（4）将愈伤组织转入分化培养基中进行分化培养：培养条件为：温度27℃，光照时间16h/d，光照强度1000Lux；分化培养基为：MS＋1.8mg/L NAA ＋0.5mg/L 6-BA ＋30g/L蔗糖＋7g/L琼脂，pH值5.9，培养时间35d。
（5）将分化培养得到的不定芽接入继代培养基2中继续进行继代：培养条件为：温度27℃，光照时间15h/d，光照强度1000Lux；继代培养基2为：MS＋1.5mg/L NAA ＋0.8mg/L 6-BA ＋30g/L蔗糖＋7g/L琼脂，pH值6，培养时间38d。
（6）分化出苗后接入生根培养基中诱导生根：培养条件为：温度27℃，光照时间17h/d，光照强度1000Lux；生根培养基为：1/2 MS＋25g/L蔗糖＋7.5g/L琼脂，pH值5.8，培养时间40d。
经分析、检测，本实施例的诱导率为69%，分化率为80%，生根率在90%以上。

Claims (10)

1.一种无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法，其特征在于：其以无芒雀麦成熟种子作为外植体，先进行表面灭菌，再将经过灭菌处理的无芒雀麦种子转入愈伤组织诱导培养基中培养；诱导产生的愈伤组织转入第一继代培养基中进行首次继代，然后转入分化培养基中培养；将分化培养得到的不定芽接入第二继代培养基中进行二次继代，分化出苗后接入生根培养基中诱导生根。
2.根据权利要求１所述的无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法，其特征在于，所述诱导培养基为：附加2,4-二氯苯氧乙酸0.5～1mg/L、6-苄基氨基嘌呤0.5～1mg/L、蔗糖25g/L和琼脂7g/L的MS培养基，pH值为5.8～6。
3.根据权利要求１所述的无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法，其特征在于，所述第一继代培养基为：附加2,4-二氯苯氧乙酸1～2mg/L、6-苄基氨基嘌呤0.5～1mg/L、蔗糖25g/L和琼脂7g/L的MS培养基，pH值为5.8～6。
4.根据权利要求1、2或3所述的无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法，其特征在于，所述愈伤组织在诱导培养基和第一继代培养基中的培养条件均为：温度25～27℃，光照时间12～14h/d，光照强度1000～2000Lux，诱导时间30～35d。
5.根据权利要求１所述的无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法，其特征在于，所述分化培养基为：附加萘乙酸1.5～2mg/L、6-苄基氨基嘌呤0.5～1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L的MS培养基，pH值为5.8～6。
6.根据权利要求5所述的无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法，其特征在于，所述愈伤组织在分化培养基中的培养条件为：温度25～27℃，光照时间14～16h/d，光照强度1000～2000Lux，培养时间30～35d。
7.根据权利要求１所述的无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法，其特征在于，所述第二继代培养基为：附加萘乙酸1～1.5mg/L、6-苄基氨基嘌呤0.5～1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L的MS培养基，pH值为5.8～6。
8.根据权利要求7所述的无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法，其特征在于，所述不定芽在第二继代培养基中的培养条件为：温度25～27℃，光照时间14～16h/d，光照强度1000～2000Lux，培养时间35～40d。
9.根据权利要求１所述的无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法，其特征在于，所述生根培养基为：附加蔗糖25g/L和琼脂7.5g/L的1/2 MS培养基。
10.根据权利要求9所述的无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法，其特征在于，所述生根培养基中的培养条件为：温度25～27℃，光照时间16～18h/d，光照强度1000～2000Lux，培养时间35～40d。
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