CN117730781B - 以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法 - Google Patents
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明涉及植物组织培养技术领域，公开了一种以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，包括以下步骤：将经过消毒处理的无芒雀麦种子接种于萌发培养基上至长出具有胚轴的幼苗，在超净台中，取所得幼苗的小段下胚轴依次进行愈伤组织的诱导、愈伤组织的芽分化、愈伤组织的生根诱导即可炼苗移栽；其中，所述萌发培养基为：以MS 4～5g/L为基础培养基，附加包括蔗糖30～35g/L和植物凝胶3～4g/L，pH值为5.7～5.8。本发明建立无芒雀再生体系的各个培养基经过科学有效的配比，极大提高了愈伤组织的诱导率，产生胚性愈伤组织所需时间短、分化时间短、出苗时间短，缩短了获得再生苗的周期，为后续无芒雀麦遗传转化、组培扩繁和脱毒种质研究提供了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种用于以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法。
背景技术
无芒雀麦是禾本科雀麦属多年生草本植物，广布于我国各省区。无芒雀麦是优良牧草，具有抗旱、耐寒、耐盐碱、适应性强、叶量丰富、草质柔软、营养价值高、产量大等优点，是建立人工草场的主要草种，同时其根系发达、地下茎强壮、蔓延能力强，是防风固沙、退化土地修复的优势草种。
随着我国饲草需求的不断增长，对优质饲草无芒雀麦的需求也日益激增，传统的育种方法周期长，性状不稳定，不能满足日益激增的需求，而无性繁殖和生物育种技术则可以避免这些缺陷，且可加速育种进程。目前，基因工程较为成熟，通过转基因技术在牧草中引入抗逆或抗病虫害基因，将目的基因通过遗传转化技术整合到植物基因组中，可以成功提高牧草的抗性。稳定高效的植物再生体系是遗传转化成功及获得转基因植株的关键，无论是建立稳定高效的再生体系还是遗传转化体系，均受多种因素影响，研究难度大。
目前国内对无芒雀麦再生体系建立的研究还较少，公告号为CN104137774B、名称为无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法的发明专利中公开了通过不同激素的配比建立无芒雀麦成熟种子组织培养再生体系的方法，其以无芒雀麦成熟种子作为外植体经过分化培养基、诱导培养基、第一继代培养基、第二继代培养基和生根培养基的培养，并具体公开了分化培养基、诱导培养基、第一继代培养基、第二继代培养基和生根培养基的配比，第一，该建立无芒雀麦成熟种子组织培养再生体系的方法以无芒雀麦成熟种子作为外植体，还需要经过继代培养才能获得再生苗，诱导率低，建立再生体系的效率低，第二，该建立无芒雀麦成熟种子组织培养再生体系的方法中公开的各种培养基的配比产生胚性愈伤组织所需的时间长、分化时间长，出苗时间长，获得无芒雀麦再生苗的周期长。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其以下胚轴为外植体建立的无芒雀麦再生体系，诱导率高、分化率高、易于生根、无需经过继代培养即可获得再生苗，极大地提高了建立无芒雀麦再生体系的效率，本申请中建立无芒雀再生体系的各个培养基经过科学有效的配比，极大提高了愈伤组织的诱导率，产生胚性愈伤组织所需时间短、分化时间短、出苗时间短，缩短了获得再生苗的周期。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，包括以下步骤：将经过预处理的无芒雀麦种子接种于萌发培养基上至长出具有胚轴的幼苗，在超净台中，取所得幼苗的小段下胚轴依次进行愈伤组织的诱导、愈伤组织的芽分化、愈伤组织的生根诱导即可炼苗移栽；其中，所述萌发培养基为：以MS 4～5g/L为基础培养基，附加包括蔗糖30～35g/L和植物凝胶3～4g/L，pH值为5.7～5.8。
优选的是，所述愈伤组织的诱导过程为：在超净台中，取小段下胚轴置于诱导培养基上，并于23～27℃的黑暗培养箱中培养30～35d，其中，所述诱导培养基为：以MS 4～5g/L为基础培养基，附加包括2,4-D1.0～3.0mg/L、6-BA0.1～1.0mg/L、蔗糖30～35g/L和植物凝胶3～4g/L，pH值为5.7～5.8。
优选的是，所述愈伤组织的芽分化过程为：在超净台中，取诱导后的愈伤组织置于芽分化培养基上培养15～20d，其中，所述芽分化培养基为：以MS 4～5g/L为基础培养基，附加包括NAA0.5～2.0mg/L、6-BA0.5～2.0mg/L、肌醇50～100mg/L、水解酪蛋白200～500mg/L、蔗糖30～35g/L和植物凝胶3～4g/L，pH值为5.7～5.8。
优选的是，所述愈伤组织的生根诱导过程为：在超净台中，取芽分化后的愈伤组织置于生根培养基上培养30～35d，其中，所述生根培养基为：以MS 4～5g/L为基础培养基，附加包括蔗糖30～35g/L和植物凝胶3～4g/L，pH值为5.7～5.8。
优选的是，所述萌发培养基为以MS4.44g/L为基础培养基，附加包括蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8；所述诱导培养基为：以MS4.44g/L为基础培养基，附加包括2,4-D2.0mg/L、6-BA1.0mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8；所述芽分化培养基为：以MS4.44g/L为基础培养基，附加包括NAA 2.0mg/L、6-BA1.0mg/L、肌醇75mg/L、水解酪蛋白350mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8；所述生根培养基为：以MS4.44g/L为基础培养基，附加包括蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8。
优选的是，无芒雀麦种子预处理过程包括：剥掉无芒雀麦种子稃皮后置于三角瓶中，依次进行以下操作：使用体积分数为75％乙醇消毒1～2min、无菌水冲洗、体积分数20％次氯酸钠灭菌10～15min、无菌水冲洗、无菌水浸泡10～12h。
优选的是，小段下胚轴的长度为0.5～1cm。
优选的是，愈伤组织的芽分化过程中所用诱导后的愈伤组织为筛选的淡黄色颗粒状胚型愈伤组织。
优选的是，愈伤组织的生根过程所用芽分化后的愈伤组织为已经分化成芽的愈伤组织。
优选的是，所述炼苗移栽过程包括：待愈伤组织生根至形成具有发达根系的组培苗，取出组培苗，洗净后采用基质土移栽，在室温下培养至新生叶片复壮后，移至室外培养。
本发明至少包括以下有益效果：本发明提供的无芒雀麦再生方法采用下胚轴为外植体，消毒操作简单、易于实施、无需使用升汞等有毒试剂、安全环保，且外植体活力强，有利于提高诱导率；本发明提供的无芒雀麦再生方法所获得的愈伤组织大部分呈黄色、紧密、颗粒状，其分化率高，且易于生根，极大地提高了胚性愈伤组织的获得率以及建立再生体系的效率；本发明进一步公开了无芒雀麦再生方法中各培养的科学配比，极大提高了愈伤组织的诱导率，产生胚性愈伤组织所需时间短、分化时间短、出苗时间短，极大地缩短了获得再生苗的周期；本发明提供的无芒雀麦再生方法操作简单，无需经过壮苗和继代培养即可获得再生苗，再生效率高；本发明提供的无芒雀麦再生方法通过使用少量的植物激素就可以高效地达到繁育无芒雀麦的目的，为工厂化育苗提供技术支撑，同时也降低了因激素价格高而带来的高成本；本发明提供的无芒雀麦再生方法通过加入肌醇和水解酪蛋白，一方面可以提供植物新生芽萌发与增殖对营养物质的需求，另一方面还可以有效预防愈伤褐化带来的组织死亡。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明一个技术方案中所述无芒雀麦再生方法的流程图。
图2为本发明实施例1利用下胚轴诱导的胚性愈伤组织；
图3为本发明实施例1愈伤组织分化的结果；
图4为本发明实施例1丛生芽生根的结果；
图5为本发明实施例1炼苗移栽的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明实例所用的MS培养基，购自Phytotech公司；植物凝胶、蔗糖、水解酪蛋白购自于Sigma公司；肌醇、6-BA、2,4-D、NAA购自于索莱宝公司(北京)。
无芒雀麦诱导培养基的筛选
无芒雀麦幼苗的培养：选取饱满结实的无芒雀麦种子，剥掉种子稃皮，因为种子稃皮带菌多，易发生污染；随后置于三角瓶中，依次进行以下操作：使用体积分数为75％乙醇消毒2min、无菌水冲洗、体积分数20％次氯酸钠灭菌10min、无菌水冲洗、无菌水浸泡10h，接种于以MS4.44g/L为基础培养基，附加包括蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8的萌发培养基上培养，获得无芒雀麦无菌幼苗。
无芒雀麦诱导培养基的筛选：在超净台下，选取生长一致的无芒雀麦无菌幼苗，取无菌幼苗的小段下胚轴置于不同组成的诱导培养基上，放于25℃的黑暗培养箱中培养30d，对愈伤组织诱导培养基激素种类、浓度配比进行筛选，每组试验重复三次，筛选出最佳的诱导配比。通过以下公式计算愈伤组织诱导率：愈伤组织诱导率＝(产生愈伤组织的外植体数)/(接入外植体总数)×100％。不同激素组成及诱导结果如表1所示：
表1不同激素组成对愈伤组织诱导的影响
由表1数据可以看出，下胚轴在不同激素组成(种类和浓度的不同)下愈伤组织的诱导能力不同，由Y1组数据可以看出，诱导培养基中不加入激素时，其愈伤组织诱导率最低，这说明本申请筛选的诱导激素有利于促进愈伤组织的诱导；由Y2～Y5、Y9、Y13组数据可以看出，单独添加6-BA或者2,4-D激素对愈伤组织进行诱导时，愈伤组织诱导率最高为32.00％(Y3组)，而添加双激素对愈伤组织进行诱导时，愈伤组织诱导率最低为33.00％(Y18组)，因此，单激素对愈伤组织诱导率远远低于采用两种激素组合对愈伤组织进行诱导的诱导率，这是因为6-BA和2,4-D激素协同诱导愈伤组织具有更高的诱导率，从表1的数据可以看出，随着2,4-D激素浓度的增加，愈伤组织的诱导率先增加达到一个峰值后又降低，随着6-BA激素浓度的增加，愈伤组织的诱导率也呈现先增加后减少的规律，综合表1来看，当2，4-D浓度为2mg/L，6-BA浓度为1mg/L，愈伤组织诱导率最高，可达为75.56％(这个数值是远远高于单激素对愈伤组织诱导率的最大值之和的，两种单激素对愈伤组织诱导率的最大值分别为32.00％和21.11％)。愈伤组织的最优诱导培养基为：以MS4.44g/L为基础培养基，附加包括2,4-D2mg/L、6-BA1mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8。
无芒雀麦再生外植体的筛选
无芒雀麦幼苗的培养：选取饱满结实的无芒雀麦种子，剥掉种子稃皮，因为种子稃皮带菌多，易发生污染；随后置于三角瓶中，依次进行以下操作：使用体积分数为75％乙醇消毒2min、无菌水冲洗、体积分数20％次氯酸钠灭菌10min、无菌水冲洗、无菌水浸泡10h，接种于以MS4.44g/L为基础培养基，附加包括蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8的萌发培养基上培养，获得无芒雀麦无菌幼苗。
无芒雀麦再生外植体的筛选：在超净台下，选取生长一致的无芒雀麦无菌幼苗，分别取无菌幼苗的小段下胚轴和叶片为外植体，同时选取预处理过的无芒雀麦种子为外植体(预处理过程为选取饱满结实的无芒雀麦种子，剥掉种子稃皮，因为种子稃皮带菌多，易发生污染；随后置于三角瓶中，依次进行以下操作：使用体积分数为75％乙醇消毒2min、无菌水冲洗、体积分数20％次氯酸钠灭菌10min、无菌水冲洗、无菌水浸泡10h)，将以上外植体置于诱导培养基上，放于25℃的黑暗培养箱中培养30d，每组试验重复三次，筛选出无芒雀麦最优外植体。所述诱导培养基为：以MS4.44g/L为基础培养基，附加包括2,4-D2mg/L、6-BA1mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8。不同外植体的愈伤组织的诱导率结果如表2所示。
表2不同外植体的愈伤组织诱导率
从表2中可以看出，不同的外植体对无芒雀麦愈伤组织的诱导效果产生影响，以下胚轴为外植体的愈伤组织，其愈伤组织诱导率明显优于以种子和叶片作为外植体的愈伤组织，无芒雀麦再生的最优外植体为下胚轴。
无芒雀麦芽分化培养基的筛选
选取诱导状态良好的愈伤组织，该状态指的是颜色淡黄，颗粒明显，质地较坚硬，生长速度快的胚性愈伤组织，转移到不同激素组成的分化培养基中，芽分化培养基以MS4.44g/L为基础培养基，附加包括NAA、6-BA、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8，激素选取0～4mg/L的NAA和0～2mg/L的6-BA进行配比培养，每个处理重复三次，培养条件均为室温25℃，16h光照培养，8h暗培养，培养20～30d。通过下面公式计算愈伤组织的芽分化率，愈伤组织的芽分化率＝(分化的愈伤数目/接入的愈伤总数)×100％，其结果如表3所示。
表3不同激素组成对愈伤组织芽分化的影响
由表3数据可以看出，愈伤组织在不同激素组成(种类和浓度的不同)下愈伤组织的芽分化能力不同，由F1组数据可以看出，芽分化培养基中不加入激素时，其愈伤组织芽分化率最低，这说明本申请筛选的芽分化激素有利于促进愈伤组织的芽分化；由F2～F6、F11、F16组数据可以看出，单独添加6-BA或者NAA激素对愈伤组织进行芽分化培养时，愈伤组织芽分化率低于其他采用两种激素组合对愈伤组织进行芽分化培养的芽分化率，这是因为6-BA和NAA激素协同培养愈伤组织具有更高的芽分化率，当NAA浓度为2mg/L，6-BA浓度为1mg/L，愈伤组织诱导率最高，可达为85.56％，远远大于单个激素对愈伤组织芽分化率最高值的和(单个激素对愈伤组织芽分化率最高值分别为51.00％和31.11％)，从表3的数据可以看出，随着NAA激素浓度的增加，愈伤组织的诱导率先增加达到一个峰值后又降低，随着6-BA激素浓度的增加，愈伤组织的诱导率也呈现先增加后减少的规律，综合表3来看，当NAA浓度为2mg/L，6-BA浓度为1mg/L，愈伤组织诱导率最高，可达为85.56％。同时，6-BA和NAA激素的添加有利于缩小愈伤组织开始分化需要的时间，表3的数据可以看出，单个激素的添加，愈伤组织开始分化需要的最短时间为9天，而双激素的协同作用后，愈伤组织开始分化需要的最短时间为7天，综上，6-BA和NAA激素协同培养愈伤组织可以有效增加愈伤组织的芽分化率，同时也能有效缩短愈伤组织开始芽分化所需要的时间。
在最优激素的基础上进一步考察肌醇和水解酪蛋白对愈伤组织芽分化的影响，在最优激素组合的基础上添加不同浓度的肌醇和水解酪蛋白，每试验重复三次，其结果如表4所示。
表4不同有机物的添加对愈伤组织芽分化的影响
由表4可以看出，在添加不同有机物(包括种类和数量)的芽分化培养基培养，愈伤组织的芽分化能力不同，由F1组数据可以看出，芽分化培养基中不加入有机物时，其愈伤组织芽分化率最低，愈伤组织芽开始分化所需要的时间最长，这说明本申请筛选的有机物有利于促进愈伤组织的芽分化率和开始芽分化的速度；由F2～F5、F9、F13组数据可以看出，单独添加肌醇或者水解酪蛋白对愈伤组织进行芽分化培养时，愈伤组织芽分化率远远低于其他采用两种有机物组合对愈伤组织进行芽分化培养的芽分化率，单独添加肌醇或者水解酪蛋白对愈伤组织进行芽分化培养，愈伤组织的芽分化率最高为88.89％和90.56％，同时，采用两种有机物组合对愈伤组织进行芽分化培养时，愈伤组织开始分化所需的时间少于单独添加肌醇或者水解酪蛋白对愈伤组织进行芽分化培养的愈伤组织，其中，单独添加肌醇或者水解酪蛋白对愈伤组织进行芽分化培养，愈伤组织开始分化所需的时间最短为6.5天，而肌醇和水解酪蛋白协同对愈伤组织进行芽分化培养时，愈伤组织开始分化所需的时间最长为6天，这表明，肌醇或者水解酪蛋白协同培养愈伤组织既有利于愈伤组织的芽分化率，也有利于愈伤组织的芽分化速度，表4的数据可以看出，随着肌醇浓度的增加，愈伤组织的诱导率先增加达到一个峰值后又降低，随着水解酪蛋白浓度的增加，愈伤组织的诱导率也呈现先增加后减少的规律，综合表4来看，当肌醇75mg/L、水解酪蛋白350mg/L，愈伤组织诱导率最高，分化率达98.89％，且在3.5天就开始分化，更有助于组培苗的健壮生长。
综上所述，愈伤组织的最优芽分化培养基为：所述芽分化培养基为：以MS4.44g/L为基础培养基，附加包括NAA 2.0mg/L、6-BA1mg/L、肌醇75mg/L、水解酪蛋白350mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8。
无芒雀麦生根培养基的筛选
待组培苗不定芽生长至5～6cm长时，移到生根培养基上培养，所述生根培养基分别选取MS和1/2MS为基础培养基，附加包括蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8，记录生根情况，其结果如表5所示。
表5不同培养基对无菌苗生根的影响
由表5可知，无菌苗转到生根培养基2周即可长出2-3mm的幼根，随后逐渐伸长形成根系。不同的培养基类型对组培苗的影响不同，MS培养基更有利于无芒雀麦的生根，生根率达到96.00％。
实施例1
无芒雀麦再生过程如图1所示，包括无芒雀麦种子的预处理、萌发培养、诱导培养、芽分化培养、生根诱导和炼苗移栽。
无芒雀麦种子的预处理：剥掉无芒雀麦种子稃皮后置于三角瓶中，依次进行以下操作：使用体积分数为75％乙醇消毒2min、无菌水冲洗、体积分数20％次氯酸钠灭菌10min、无菌水冲洗、无菌水浸泡10h；
萌发培养：在超净台下，将预处理的无芒雀麦种子接种于萌发培养基上至长出具有胚轴的幼苗；其中，所述萌发培养基为以MS4.44 g/L为基础培养基，附加包括蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8；
诱导培养：所述愈伤组织的诱导过程为：在超净台下，取小段下胚轴置于诱导培养基上，并于25℃的黑暗培养箱中培养30d，其中，所述诱导培养基为：以MS4.44g/L为基础培养基，附加包括2,4-D 2.0mg/L、6-BA 1.0mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8；诱导出来的愈伤组织如图2所示，颜色淡黄，颗粒明显，为胚型愈伤组织。
愈伤组织的芽分化培养：在超净台下，取诱导后的愈伤组织置于芽分化培养基上培养15d，其中，所述芽分化培养基为：以MS4.44g/L为基础培养基，附加包括NAA 2.0mg/L、6-BA1.0mg/L、肌醇75mg/L、水解酪蛋白350mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8；芽分化后的愈伤组织如图3所示。
愈伤组织的生根诱导：在超净台下，取芽分化后的愈伤组织置于生根培养基上培养30d，其中，所述生根培养基为：以MS4.44g/L为基础培养基，附加包括蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8；生根诱导后的愈伤组织如图4所示；
炼苗移栽：待愈伤组织生根至形成具有发达根系的组培苗，取出组培苗，洗净后采用基质土移栽，在室温下培养至新生叶片复壮后，移至室外培养，所述基质土为蛭石：珍珠岩＝1：1。图5所示即为再生苗炼苗移栽结果。
对比例1(诱导培养基采用CN104137774B发明专利公开的诱导率高的培养基)
无芒雀麦种子的预处理：同实施例1；
萌发培养：同实施例1；
诱导培养：所述愈伤组织的诱导过程为：在超净台中，取小段下胚轴置于诱导培养基上，并于25℃的黑暗培养箱中培养30d，其中，所述诱导培养基为：附加2,4-D 0.5mg/L、6-BA0.7mg/L、蔗糖25g/L和琼脂7g/L的MS培养基，pH值为5.8～6；
愈伤组织的芽分化培养：同实施例1；
愈伤组织的生根诱导：同实施例1。
炼苗移栽：同实施例1。
对比例2(芽分化采用CN104137774B发明专利公开的芽分化率高的培养基)
无芒雀麦种子的预处理：同实施例1；
萌发培养：同实施例1；
诱导培养：同实施例1；
愈伤组织的芽分化培养：取诱导后的愈伤组织置于分化培养基上培养15d，所述芽分化培养基为：附加NAA1.5mg/L、6-BA0.8mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L的MS培养基，pH值为5.8～6；
愈伤组织的生根诱导：同实施例1。
炼苗移栽：同实施例1。
对比例3(生根采用CN104137774B发明专利公开的生根率高的培养基)
无芒雀麦种子的预处理：同实施例1；
萌发培养：同实施例1；
诱导培养：同实施例1；
愈伤组织的芽分化培养：同实施例1；
愈伤组织的生根诱导：取芽分化后的愈伤组织置于生生根培养基上培养30d，其中，所述生根培养基为：附加蔗糖25g/L和琼脂7.5g/L的1/2MS培养基。
炼苗移栽：同实施例1。
对比例4
采用CN104137774B发明专利公开的无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法培养。
炼苗移栽：同实施例1。
对实施例1、对比例1～4的诱导阶段、芽分化阶段以及生根阶段进行观察，并记录愈伤组织的诱导率、芽分化率和生根率，每组试验均做三次，其结果如表6所示。
表6实施例1、对比例1～4芽分化培养后计算愈伤组织培养结果
表6中可以看出，采用本发明所提供的无芒雀麦再生方法中诱导培养基的实施例1所得愈伤组织的诱导率远远大于对比例1(CN104137774B发明专利公开的诱导培养基)和对比例4所得愈伤组织的诱导率(非下胚轴作为外植体以及采用CN104137774B发明专利公开的诱导培养基)，采用本发明所提供的无芒雀麦再生方法中芽分化培养基的实施例1所得愈伤组织的芽分化率明显优于对比例1、对比例2(CN104137774B发明专利公开的芽分化培养基)和对比例4(非下胚轴作为外植体以及采用CN104137774B发明专利公开的芽分化培养基)，采用本发明所提供的无芒雀麦再生方法中生根培养基的实施例1所得愈伤组织生根率明显优于对比例1～4，由此可知，不同诱导培养基、芽分化培养基和生根培养基的组合对愈伤组织的诱导率、芽分化率和生根率具有明显的影响，实施例1公开的诱导培养基、芽分化培养基和生根培养基具有协同效果，由此组成的无芒雀麦再生体系稳定，能够提高愈伤组织的诱导率、芽分化率和生根率，即使将本申请的最优诱导培养基与其他芽分化培养基和生根培养基组合，也不能得到实施例1最终的生根率，同理，即使将本申请的最优芽培养基与其他诱导培养基和生根培养基组合，也不能得到实施例1最终的生根率，即使将本申请的最优生根培养基与其他芽分化培养基和诱导培养基组合，也不能得到实施例1最终的生根率。
实施例2
无芒雀麦再生过程如图1所示，包括无芒雀麦种子的预处理、萌发培养、诱导培养、芽分化培养、生根诱导和炼苗移栽。
无芒雀麦种子的预处理：剥掉无芒雀麦种子稃皮后置于三角瓶中，依次进行以下操作：使用体积分数为75％乙醇消毒1min、无菌水冲洗、体积分数20％次氯酸钠灭菌15min、无菌水冲洗、无菌水浸泡12h；
萌发培养：在超净台下，将预处理的无芒雀麦种子接种于萌发培养基上至长出具有胚轴的幼苗；其中，所述萌发培养基为以MS4g/L为基础培养基，附加包括蔗糖35g/L和植物凝胶4g/L，pH值为5.7～5.8；
诱导培养：所述愈伤组织的诱导过程为：在超净台下，取小段下胚轴置于诱导培养基上，并于23℃的黑暗培养箱中培养35d，其中，所述诱导培养基为：以MS4g/L为基础培养基，附加包括2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.1mg/L、蔗糖35g/L和植物凝胶4g/L，pH值为5.7～5.8；
愈伤组织的芽分化培养：在超净台下，取诱导后的愈伤组织置于芽分化培养基上培养15d，其中，所述芽分化培养基为：以MS4g/L为基础培养基，附加包括NAA0.5mg/L、6-BA0.5mg/L、肌醇50mg/L、水解酪蛋白200mg/L、蔗糖35g/L和植物凝胶4g/L，pH值为5.7～5.8；
愈伤组织的生根诱导：在超净台下，取芽分化后的愈伤组织置于生根培养基上培养35d，其中，所述生根培养基为：以MS4g/L为基础培养基，附加包括蔗糖35g/L和植物凝胶4g/L，pH值为5.7～5.8；
炼苗移栽：待愈伤组织生根至形成具有发达根系的组培苗，取出组培苗，洗净后采用基质土移栽，在室温下培养至新生叶片复壮后，移至室外培养，所述基质土为蛭石：珍珠岩＝1：1，所得愈伤组织的生根率大于95％。
实施例3
无芒雀麦再生过程如图1所示，包括无芒雀麦种子的预处理、萌发培养、诱导培养、芽分化培养、生根诱导和炼苗移栽。
无芒雀麦种子的预处理：剥掉无芒雀麦种子稃皮后置于三角瓶中，依次进行以下操作：使用体积分数为75％乙醇消毒1.5min、无菌水冲洗、体积分数20％次氯酸钠灭菌13min、无菌水冲洗、无菌水浸泡11h；
萌发培养：在超净台下，将预处理的无芒雀麦种子接种于萌发培养基上至长出具有胚轴的幼苗；其中，所述萌发培养基为以MS5g/L为基础培养基，附加包括蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8；
诱导培养：所述愈伤组织的诱导过程为：在超净台下，取小段下胚轴置于诱导培养基上，并于27℃的黑暗培养箱中培养32d，其中，所述诱导培养基为：以MS4.44g/L为基础培养基，附加包括2,4-D3.0mg/L、6-BA0.8mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8；
愈伤组织的芽分化培养：在超净台下，取诱导后的愈伤组织置于芽分化培养基上培养15d，其中，所述芽分化培养基为：以MS5g/L为基础培养基，附加包括NAA 1.5mg/L、6-BA2mg/L、肌醇100mg/L、水解酪蛋白500mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8；愈伤组织的生根诱导：在超净台下，取芽分化后的愈伤组织置于生生根培养基上培养30d，其中，所述生根培养基为：以MS4.44g/L为基础培养基，附加包括蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8；
愈伤组织的生根诱导：在超净台下，取芽分化后的愈伤组织置于生根培养基上培养35d，其中，所述生根培养基为：以MS 5g/L为基础培养基，附加包括蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7～5.8；
炼苗移栽：待愈伤组织生根至形成具有发达根系的组培苗，取出组培苗，洗净后采用基质土移栽，在室温下培养至新生叶片复壮后，移至室外培养，所述基质土为蛭石：珍珠岩＝1：1；所得愈伤组织的生根率大于95％。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
如上所述，根据本发明，本发明至少包括以下有益效果：本发明提供的无芒雀麦再生方法采用下胚轴为外植体，消毒操作简单、易于实施、无需使用升汞等有毒试剂、安全环保，且外植体活力强，有利于提高诱导率；本发明提供的无芒雀麦再生方法所获得的愈伤组织大部分呈黄色、紧密、颗粒状，其分化率高，且易于生根，极大地提高了胚性愈伤组织的获得率以及建立再生体系的效率；本发明进一步公开了无芒雀麦再生方法中各培养的科学配比，极大提高了愈伤组织的诱导率，产生胚性愈伤组织所需时间短、分化时间短、出苗时间短，极大地缩短了获得再生苗的周期；本发明提供的无芒雀麦再生方法操作简单，无需经过壮苗和继代培养即可获得再生苗，再生效率高；本发明提供的无芒雀麦再生方法通过使用少量的植物激素就可以高效地达到繁育无芒雀麦的目的，为工厂化育苗提供技术支撑，同时也降低了因激素价格高而带来的高成本；本发明提供的无芒雀麦再生方法通过加入肌醇和水解酪蛋白，一方面可以提供植物新生芽萌发与增殖对营养物质的需求，另一方面还可以有效促进组培苗健壮生长。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (8)
1.以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，包括以下步骤：将经过预处理的无芒雀麦种子接种于萌发培养基上至长出具有胚轴的幼苗，在超净台中，取所得幼苗的小段下胚轴依次进行愈伤组织的诱导、愈伤组织的芽分化、愈伤组织的生根诱导即可炼苗移栽；其中，所述萌发培养基为：以MS 4~5g/L为基础培养基，附加蔗糖30~35g/L和植物凝胶3~4g/L，pH值为5.7~5.8；所述愈伤组织的诱导过程为：在超净台中，取小段下胚轴置于诱导培养基上，并于23~27℃的黑暗培养箱中培养30~35d，其中，所述诱导培养基为：以MS4~5g/L为基础培养基，附加2,4-D、6-BA、蔗糖30~35g/L和植物凝胶3~4g/L，pH值为5.7~5.8，其中，6-BA为0.5mg/L时，2,4-D 为1.0mg/L，6-BA为1.0mg/L时，2,4-D为 1.0~3.0 mg/L；所述愈伤组织的芽分化过程为：在超净台中，取诱导后的愈伤组织置于芽分化培养基上培养15~20d，所述芽分化培养基为：以MS4~5g/L为基础培养基，附加NAA0.5~2.0mg/L、6-BA 0.5~2.0mg/L、肌醇50~100mg/L、水解酪蛋白200~500mg/L、蔗糖30~35g/L和植物凝胶3~4g/L，pH值为5.7~5.8。
2.如权利要求1所述的以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，所述愈伤组织的生根诱导过程为：在超净台中，取芽分化后的愈伤组织置于生根培养基上培养30~35d，其中，所述生根培养基为：以MS4~5g/L为基础培养基，附加蔗糖30~35g/L和植物凝胶3~4g/L，pH值为5.7~5.8。
3.如权利要求2所述的以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，所述萌发培养基为以MS4.44g/L为基础培养基，附加蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7~5.8；所述诱导培养基为：以MS4.44g/L为基础培养基，附加2,4-D2.0mg/L、6-BA 1.0mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7~5.8；所述芽分化培养基为：以MS4.44g/L为基础培养基，附加NAA 2.0mg/L、6-BA1.0mg/L、肌醇75mg/L、水解酪蛋白350mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7~5.8；所述生根培养基为：以MS4.44g/L为基础培养基，附加蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH值为5.7~5.8。
4.如权利要求1所述的以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，无芒雀麦种子预处理过程包括：剥掉无芒雀麦种子稃皮后置于三角瓶中，依次进行以下操作：使用体积分数为75%乙醇消毒1~2min、无菌水冲洗、体积分数20%次氯酸钠灭菌10~15min、无菌水冲洗、无菌水浸泡10~12h。
5.如权利要求1所述的以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，小段下胚轴的长度为0.5~1cm。
6.如权利要求1所述的以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，愈伤组织的芽分化过程中所用诱导后的愈伤组织为筛选的淡黄色颗粒状的胚型愈伤组织。
7.如权利要求1所述的以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，愈伤组织的生根过程所用芽分化后的愈伤组织为已经分化成芽的愈伤组织。
8.如权利要求1所述的以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，所述炼苗移栽过程包括：待愈伤组织生根至形成具有发达根系的组培苗，取出组培苗，洗净后采用基质土移栽，在室温下培养至新生叶片复壮后，移至室外培养。
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| CN104137774A (zh) * | 2014-07-04 | 2014-11-12 | 中国农业科学院草原研究所 | 无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN117730781A (zh) | 2024-03-22 |
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