CN105941164A - 一种吴屯杨微繁的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种植物微繁方法，具体为一种吴屯杨微繁的方法，该方法主要包括如下步骤：外植体的选取、外植体的消毒处理、外植体芽诱导、芽分化与增殖培养、抽茎生根培养、炼苗与移栽，所述的芽分化与增殖培养中使用的培养基配方如下：以MS为基础培养基：添加6‑BA(6‑苄氨基嘌呤)0.4‑0.6mg/L、NAA(萘乙酸)0.1‑0.3mg/L、琼脂7‑10g/L、蔗糖30‑50g/L,pH为5.80‑5.84，在光照下培养12‑17天，得到丛生芽。本发明以茎段为外植体，通过激素诱导腋芽萌发，将幼芽进行增殖培养，可获得大量无性繁殖幼苗，可使吴屯杨组培苗的繁殖系数可提高10倍。

Description

一种吴屯杨微繁的方法
技术领域
本发明属于植物微繁生产技术领域，本发明涉及一种吴屯杨微繁的方法。
背景技术
我国为世界盐碱地大国之一,近1/5耕地发生盐碱化，随着国民经济和社会的迅速发展,人口增长与耕地减少的矛盾日益突出,各类盐碱土地成为重要的土地后备资源。通过培育耐盐的植物新品种,提高土地利用率、降低盐碱灾害影响,是提高生态效益和经济效益的有效途径。近年来,国内外相继推出一批速生、抗旱、耐盐碱、抗病虫害的杨树杂交,吴屯杨具有速生、抗旱、耐盐碱、抗病虫害等特性，并其遗传稳定性好。
吴屯杨是杨树天然杂交种选育而来，来源于新民市大柳屯镇吴屯村。具有根系发达，适应性强、生长快、成材早、生长周期长；枝条细密防风性能好、抗盐碱能力强等特点，是一种很好的绿化树种，已在三北地区进行试验推广。目前吴屯杨的扩繁推广主要是利用通过扦插繁育，繁殖效率较低，扦插繁殖周期长，受季节等诸多因素限制了其大规模繁殖，组织培养的方法可解决其扦插繁殖过程中的一些问题并可在短时期内获得大量组培苗，但是常规的组织培养耗时耗力，难以实现规模化生产。因此开发一种新的吴屯杨微繁技术克服原有的培养方式缺点，确保吴屯杨幼苗产业的进一步发展。
发明内容
本发明针对上述存在的问题，本发明提供了一种吴屯杨微繁的方法，不仅能缩短吴屯杨育苗周期，提高增殖效率，还能够提高育苗成活率。
本发明的技术方案如下：一种吴屯杨微繁的方法，该方法包括如下步骤：
(1)外植体的选取
选择吴屯杨茎段为外植体；
(2)外植体的消毒处理
将上述茎段每隔1-2个芽进行切段，将切下后的茎段用水冲洗30min，然后将茎段放入无菌超净台，用75vt％的酒精浸泡30s，再使用无菌水冲洗3次，再用0.1wt％的升汞浸泡5min，用无菌水冲洗5次；
(3)外植体芽诱导
将步骤(2)处理得到的外植体插入芽诱导培养基当中，进行芽诱导，得到丛生芽；
(4)芽分化与增殖培养
将经过步骤(3)诱导的丛生芽切下，插入分化培养基进行培养；所述的分化培养基配方：以MS为基础培养基：添加6-BA(6-苄氨基嘌呤)0.4-0.6mg/L、NAA(萘乙酸)0.1-0.3mg/L、琼脂7-10g/L、蔗糖30-50g/L,pH为5.80-5.84，在光照下培养12-17天，得到丛生芽；
(5)抽茎生根培养
将步骤(4)分化的丛生芽切下进行抽茎培养；
抽茎生根培养基配方：以MS为基础培养基：添加6-BA(6-苄氨基嘌呤)1.8-2.1mg/L、NAA(萘乙酸)0.1-0.3mg/L、琼脂7-10g/L、蔗糖30-50g/L，pH为5.80-5.84，在光照下培养12-17天，得到吴屯杨组培苗；
(6)炼苗与移栽
选取根系发达及健壮的吴屯杨组培苗，取出后洗净根部培养基，在沙床上驯化10天后，即可作为移栽幼苗。
进一步的，步骤(2)所述的茎段为2-3cm。
进一步的，所述的芽诱导培养基配方：MS培养基，调整pH为5.80-5.84，在25-28℃光照培养8-15天，得到丛生芽。
进一步的，所述的沙床的温度为25-30℃，湿度为70-80％。
进一步的，所述的沙床在驯化前使用0.1-0.2wt％高锰酸钾消毒。
本发明的有益效果如下：
1.本发明在分化培养期间，适当的调整6-苄氨基嘌呤和萘乙酸的比例，最终筛选得到最适宜的不定芽分化培养基，显著的提高了吴屯杨不定芽的分化率，最终提高杨树幼苗的成苗棵数。
2.本发明在育苗培养期间，适当的调整6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、生长素的比例，筛选出最适宜的抽茎生根培养基配方，确保培养基能够提高苗的质量，使苗生长健壮，根细长，有韧性，进一步提高移栽后成活率，保证苗的成苗率(见表1、2)。
3.本发明在育苗时，将现有技术中的抽经、生根步骤合二为一，并对抽茎生根培养基做出研究，提出了本发明的抽茎生根培养基的配方，可直接进行抽茎生根培养，这样的设计大大减少了育苗所需时间，具有极大的推广价值；而且在工业化生产过程中减少生产占用面积，减少资金投入，提高工业化利润。
4.吴屯杨组织培养处于起步阶段，本发明以茎段为外植体，通过激素诱导腋芽萌发，将幼芽进行增殖培养，可获得大量无性繁殖幼芽(增值倍数9.73倍)，可使吴屯杨组培苗的繁殖系数可提高近10倍。
5.本发明采用微繁技术对吴屯杨进行试验，相比组织培养的步骤要简化许多，将抽茎与生根步骤合二为一既降低了成本又缩短了培育时间。
附图说明
图1为本发明的吴屯杨芽诱导生长10天示意图；
图2为本发明的吴屯杨不定芽增殖培养15天示意图1；
图3为本发明的吴屯杨不定芽增殖培养15天示意图2。
具体实施方式
下面通能具体的实施例进一步说明本发明，以使本发明的特征与优点更易于被理解，应该理解的是，本发明的实施例仅适用于本发明，而不是对本发明的限制。
对比例1
(1)外植体的选取
选取生长健壮，无病虫害吴屯杨茎段为外植体；
(2)外植体的消毒处理
将上述茎段每隔1-2个芽进行切段处理(大约每段在2-3cm)，将切下后的茎段用水冲洗30min，将茎段放入无菌超净台，用75vt％的酒精浸泡30s，在使用无菌水冲洗3次，再用0.1wt％的升汞浸泡5min,用无菌水冲洗5次；
(3)外植体芽诱导
将上述待用的外植体插入诱导培养基当中，进行芽诱导。
诱导培养基配方：MS培养基，pH为5.80，在25℃光照培养8天，得到丛生芽；
(4)芽分化与增殖培养
将步骤(3)得到的丛生芽切下，插入分化培养基进行培养。
分化培养基配方：以MS培养基为基础培养基，添加琼脂8.5g/L、蔗糖32g/L，pH为5.80，在光照下培养12天，进行芽增殖培养；
(5)抽茎生根培养
将步骤(4)分化的丛生芽切下进行抽茎生根培养
抽茎生根培养基配方：以MS培养基为基础培养基，添加琼脂8.5g/L、蔗糖32g/L，pH为5.80，在光照下培养12天，得到吴屯杨组培苗：
(6)炼苗与移栽
沙床使用0.1wt％的高锰酸钾消毒；
选取根系发达及健壮的吴屯杨组培苗，取出后洗净根部培养基，在沙床上驯化10天后，即可作为移栽幼苗，见图1。
实施例2
(1)外植体的选取
选取生长健壮，无病虫害吴屯杨茎段为外植体；
(2)外植体的消毒处理
将上述茎段每隔1-2个芽进行切段处理(大约每段在2-3cm)，将切下后的茎段用水冲洗30min，将茎段放入无菌超净台，用75vt％的酒精浸泡30s，使用无菌水冲洗3次，再用0.1wt％的升汞浸泡5min,用无菌水冲洗5次；
(3)外植体芽诱导
将上述待用的外植体插入诱导培养基当中，进行芽诱导。
诱导培养基配方：MS培养基，pH为5.80，在25℃光照培养8天，得到丛生芽；
(4)芽分化与增殖培养
将步骤(3)得到的丛生芽切下，插入分化培养基进行培养。
分化培养基配方：以MS培养基为基础培养基，添加6-BA(6-苄氨基嘌呤)0.1mg/L、NAA(萘乙酸)0.1mg/L、琼脂7g/L、蔗糖30g/L，pH为5.80，在光照下培养12天，进行芽增殖培养；
(5)抽茎生根培养
将步骤(4)分化的丛生芽切下进行抽茎生根培养
抽茎生根培养基配方：以MS培养基为基础培养基，添加6-BA(6-苄氨基嘌呤)1.5mg/L、NAA(萘乙酸)0.1mg/L、琼脂7g/L、蔗糖30g/L，pH为5.80，在光照下培养12-17天，得到吴屯杨组培苗；
(6)炼苗与移栽
沙床使用0.1wt％的高锰酸钾消毒；
选取根系发达及健壮的吴屯杨组培苗，取出后洗净根部培养基，在沙床上驯化15天后，即可作为移栽幼苗，见图3。
实施例3
(1)外植体的选取
选取生长健壮，无病虫害吴屯杨茎段为外植体；
(2)外植体的消毒处理
将上述茎段每隔1-2个芽进行切去(大约每段在2-3cm)，将切下后的茎段用水冲洗30min，然后将茎段放入无菌超净台，用75vt％的酒精浸泡30s，在使用无菌水冲洗3次，再用0.1wt％的升汞浸泡5min,用无菌水冲洗5次；
(3)外植体芽诱导
将上述待用的外植体插入培养基当中，进行芽诱导。
芽诱导培养基配方：MS培养基，pH为5.84，在28℃光照培养15天，得到丛生芽；
(4)芽分化与增殖培养
将所述诱导的芽切下，插入分化培养基进行培养。
芽分化培养基配方：以MS培养基为基础培养基，添加6-BA(6-苄氨基嘌呤)1.0mg/L、NAA(萘乙酸)0.2mg/L、琼脂8.5g/L、蔗糖32g/L，pH为5.84，在光照下培养15天，进行芽增殖培养；
(5)抽茎生根陪养
将上述的分化的丛生芽切下进行抽茎生根培养
抽茎生根培养培养基配方：以MS培养基为基础培养基，添加6-BA(6-苄氨基嘌呤)1.8mg/L、NAA(萘乙酸)0.15mg/L、IAA(生长素)0.5mg/L、琼脂8.5g/L、蔗糖32g/L，pH为5.82，在光照下培养14天，得到吴屯杨组培苗；
(6)炼苗与移栽
沙床使用0.1wt％的高锰酸钾消毒；
选取根系发达及健壮的吴屯杨幼苗，取出后洗净根部培养基，在沙床上驯化15天后，即可作为移栽幼苗，见图2。
实施例4
(1)外植体的选取
选取生长健壮，无病虫害吴屯杨茎段为外植体；
(2)外植体的消毒处理
将上述茎段每隔1-2个芽进行切段处理(大约每段在2-3cm)，将切下后的茎段用水冲洗30min，将茎段放入无菌超净台，用75vt％的酒精浸泡30s，在使用无菌水冲洗3次，再用0.1wt％的升汞浸泡5min,用无菌水冲洗5次；
(3)外植体芽诱导
将上述待用的外植体插入诱导培养基当中，进行芽诱导。
诱导培养基配方：MS培养基，调pH为5.80，在25℃光照培养8天，得到丛生芽；
(4)芽分化与增殖培养
将步骤(3)得到的丛生芽切下，插入分化培养基进行培养。
分化培养基配方：以MS培养基为基础培养基，添加6-BA(6-苄氨基嘌呤)2.0mg/L、NAA(萘乙酸)0.3mg/L、琼脂10g/L、蔗糖50g/L，pH为5.84，在光照下培养17天，进行芽增殖培养；
(5)抽茎生根培养
将步骤(4)分化的丛生芽切下进行抽茎生根培养；
抽茎生根培养基配方：以MS培养基为基础培养基，添加6-BA(6-苄氨基嘌呤)2.1mg/L、NAA(萘乙酸)0.3mg/L、IAA(生长素)0.5mg/L、琼脂10g/L、蔗糖50g/L，pH为5.84，在光照下培养17天，得到吴屯杨组培苗；
(6)炼苗与移栽
沙床使用0.2wt％的高锰酸钾消毒；
选取根系发达及健壮的吴屯杨组培苗，取出后洗净根部培养基，在沙床上驯化10天后，即可作为移栽幼苗。
实施例5
(1)外植体的选取
选取生长健壮，无病虫害吴屯杨茎段为外植体；
(2)外植体的消毒处理
将上述茎段每隔1-2个芽进行切段处理(大约每段在2-3cm)，将切下后的茎段用水冲洗30min，将茎段放入无菌超净台，用75vt％的酒精浸泡30s，使用无菌水冲洗3次，再用0.1wt％的升汞浸泡5min,用无菌水冲洗5次；
(3)外植体芽诱导
将上述待用的外植体插入诱导培养基当中，进行芽诱导。
诱导培养基配方：MS培养基，pH为5.80，在25℃光照培养8天，得到丛生芽；
(4)芽分化与增殖培养
将步骤(3)得到的丛生芽切下，插入分化培养基进行培养。
分化培养基配方：以MS培养基为基础培养基，添加6-BA(6-苄氨基嘌呤)0.1mg/L、NAA(萘乙酸)0.1mg/L、琼脂7g/L、蔗糖30g/L，pH为5.80，在光照下培养12天，进行芽增殖培养；
(5)抽茎生根培养
将步骤(4)分化的丛生芽切下进行抽茎生根培养
抽茎生根培养基配方：以MS培养基为基础培养基，添加6-BA(6-苄氨基嘌呤)1.5mg/L、NAA(萘乙酸)0.1mg/L、IAA(生长素)0.5mg/L、琼脂7g/L、蔗糖30g/L，pH为5.80，在光照下培养12-17天，得到吴屯杨组培苗；
(6)炼苗与移栽
沙床使用0.1wt％的高锰酸钾消毒；
选取根系发达及健壮的吴屯杨组培苗，取出后洗净根部培养基，在沙床上驯化15天后，即可作为移栽幼苗。
实施例6
本发明通过以下培养基配方对芽分化培养的激素组合对比研究，具体如下：
分化培养基配方1为MS+6-BA(6-苄氨基嘌呤)0mg/L+NAA(萘乙酸)0mg/L+琼脂8.5g/L+蔗糖32g/L；
分化培养基配方2为MS+6-BA(6-苄氨基嘌呤)0.5mg/L+NAA(萘乙酸)0.2mg/L+琼脂8.5g/L+蔗糖32g/L；
分化培养基配方3为MS+6-BA(6-苄氨基嘌呤)1.0mg/L+NAA(萘乙酸)0.2mg/L+琼脂8.5g/L+蔗糖32g/L；
分化培养基配方4为MS+6-BA(6-苄氨基嘌呤)2.0mg/L+NAA(萘乙酸)0mg/L+琼脂8.5g/L+蔗糖32g/L。
取涨势相同的芽360个，均分为4组，分别用上述4个配方进行培养15天后，记录芽分化情况。
采用配方1-4的条件下进行组培，对各配方的外植体数、培养阶段的情况变化和芽诱导率的统计情况见表1。
表1丛生芽增殖情况表
由表1可知，接种的外植体为茎段的腋芽，接种在培养基中4天后，配方1的培养基中无明显变化，配方2的培养基中观察到小面积的淡黄色的愈伤组织，配方3中观察到小面积的淡黄色的愈伤组织，配方4中观察到小面积的淡黄色的愈伤组织；接种后8天，配方一的培养基中观察到部分腋芽出现增高，部分叶片出现叶尖发黑现象；配方2的培养基中观察到淡黄色的愈伤组织面积扩大腋芽无明显增高，叶片颜色正常，芽的增殖倍数高达9.73倍，因此采用配方2可是吴屯杨组培苗繁殖系数提高近10倍；配方3中观察到腋芽出现明显增高，部分腋芽基部出现较短的根系，叶片颜色正常；配方4中观察到腋芽明显增高，腋芽基部均出现生根现象，叶片颜色正常；接种12天后，配方1的培养基中，少量腋芽出现明显增高，部分叶尖发黑现象出现蔓延；配方2中观察到腋芽出现少量增高，愈伤组织撑破包埋的培养基，愈伤组织上长出较小的叶片，出现生成丛生芽的趋势，叶片颜色为嫩绿色；配方3中观察到腋芽增高，出现大量长根现象，叶色正常；配方4中观察到腋芽增高，出现大量根系，叶色正常；接种15天后，配方1中仅有少量的腋芽存活，大多数腋芽叶片发黑死亡，没有出现任何生长；配方2中观察到出现大量的丛生芽，叶片颜色为嫩绿色，将丛生芽转接到抽茎生根培养基中能达到组培苗全部成活；配方3中观察到腋芽形成茎高3-4cm的生有根系的叶色正常的植株；配方4观察到腋芽形成茎高4-5cm的生有根系的叶色正常的植株。
实施例7
本发明通过以下培养基配方对抽茎生根培养的激素组合进行对比研究，具体如下：
抽茎生根培养基配方1：MS+6-BA(6-苄氨基嘌呤)0mg/L+NAA(萘乙酸)0mg/L+GA(赤霉素)0mg/L+琼脂8.5g/L+蔗糖32g/L；
抽茎生根培养基配方2：MS+6-BA(6-苄氨基嘌呤)2.0mg/L+NAA(萘乙酸)0.2mg/L+琼脂8.5g/L+蔗糖32g/L；
抽茎生根培养基配方3：MS+6-BA(6-苄氨基嘌呤)1.0mg/L+NAA(萘乙酸)0.15mg/L+IAA(生长素)0.5mg/L+琼脂8.5g/L+蔗糖32g/L；
抽茎生根培养基配方4：MS+6-BA(6-苄氨基嘌呤)1.0mg/L+NAA(萘乙酸)0.15mg/L+GA(赤霉素)2.0mg/L+琼脂8.5g/L+蔗糖32g/L。
取分化后的芽360个，均分为4组，按上述的配方进行抽茎培养，培养15天，记录芽抽茎情况。
表2芽抽茎生根情况表
从表2可以看出，不同的激素种类、不同的激素浓度对芽的抽茎生根作用效果差异较大，其中配方2的效果最好。改变激素及适当的调节激素浓度可以控制苗的生长，保证健壮幼苗的比例。
由表2可知，接种的外植体为丛生芽，接种在培养基中4天后，配方1的培养基中无明显变化，配方2的培养基中观察到小面积的淡黄色的愈伤组织，配方3中观察到小面积的淡黄色的愈伤组织，配方4中观察到小面积的淡黄色的愈伤组织；
接种后8天，配方1的培养基中观察到部分腋芽出现增高，部分叶片出现叶尖发黑现象,总体叶色泛黄；配方2的培养基中观察到腋芽明显增高，腋芽基部出现根，叶片颜色正常；配方3中观察到腋芽出现明显增高，部分腋芽基部出现较短的根系，叶片颜色正常；配方4中观察到腋芽明显增高，叶片颜色嫩绿；
接种12天后，配方1的培养基中，少量腋芽出现明显增高，部分叶尖发黑现象出现蔓延，叶片泛黄；配方2腋芽增高，出现大量发达的根系，叶色正常；配方3中观察到腋芽增高，出现大量长根现象，叶色正常；配方4中观察到腋芽抽出较细的茎并增高，叶色泛黄；
接种15天后，配方1中不发生抽茎生根，并且出现大量死亡，叶色泛黄；配方2中观察到抽茎高为1-5cm，并生成极为发达健壮的根系，叶片颜色为绿色；配方3中观察到腋芽形成茎高3-4cm的生有根系的叶色正常的植株；配方4观察到腋芽抽茎为0.5cm粗高4-5cm的无根系生成的茎。
应当认识到采用本发明的方法可以得到大量的吴屯杨幼苗，具有极大的推广价值；而且在工业化生产过程中减少生产占用面积，减少资金投入，提高工业化生产的利润。

Claims (5)

1.一种吴屯杨微繁的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)外植体的选取
选择吴屯杨茎段为外植体；
(2)外植体的消毒处理
将上述茎段每隔1-2个芽进行切段，将切下后的茎段用水冲洗30min，然后将茎段放入无菌超净台，用75vt％的酒精浸泡30s，再使用无菌水冲洗3次，再用0.1vt％的升汞浸泡5min，用无菌水冲洗5次；
(3)外植体芽诱导
将步骤(2)处理得到的外植体插入芽诱导培养基当中，进行芽诱导，得到丛生芽；
(4)芽分化与增殖培养
将经过步骤(3)诱导的丛生芽切下，插入分化培养基进行培养；所述的分化培养基配方：以MS为基础培养基，添加6-BA 0.1-2.0mg/L、NAA 0.1-0.3mg/L、琼脂7-10g/L、蔗糖30-50g/L,pH为5.80-5.84，在光照下培养12-17天，得到丛生芽；
(5)抽茎生根培养
将步骤(4)分化的丛生芽切下进行抽茎培养；
抽茎生根培养基配方：以MS为基础培养基，添加6-BA1.5-2.1mg/L、NAA 0.1-0.3mg/L、琼脂7-10g/L、蔗糖30-50g/L，pH为5.80-5.84，在光照下培养12-17天，得到吴屯杨组培苗；
(6)炼苗与移栽
选取根系发达及健壮的吴屯杨组培苗，取出后洗净根部培养基，在沙床上驯化10天后，即可作为移栽幼苗。
2.如权利要求1所述的吴屯杨微繁的方法，其特征在于，步骤(2)所述的茎段为2-3cm。
3.如权利要求1所述的吴屯杨微繁的方法，其特征在于，所述的芽诱导培养基配方：MS培养基，调整pH为5.80-5.84，在25-28℃光照培养8-15天，得到丛生芽。
4.如权利要求书1所述吴屯杨微繁的方法，其特征在于，所述的沙床的温度为25-30℃，湿度为70-80％。
5.如权利要求书1所述吴屯杨微繁的方法，其特征在于，步骤(6)所述的沙床在驯化前使用0.1-0.2wt％高锰酸钾消毒。
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