JPH07308137A - ヤマナラシ節に属する植物の植物体生産方法 - Google Patents
ヤマナラシ節に属する植物の植物体生産方法Info
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- JPH07308137A JPH07308137A JP6103749A JP10374994A JPH07308137A JP H07308137 A JPH07308137 A JP H07308137A JP 6103749 A JP6103749 A JP 6103749A JP 10374994 A JP10374994 A JP 10374994A JP H07308137 A JPH07308137 A JP H07308137A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 培地中の窒素源の濃度が、アンモニア態窒素
濃度１〜１５ｍＭかつ硝酸態窒素濃度１５〜５０ｍＭで
ある培地を用いて、ハコヤナギ属（Populus ）ヤマナラ
シ節（Leuce ）に属する植物の組織を培養し、そこから
不定芽を分化させて、植物体を再生する。 【効果】ハコヤナギ属のうち、わが国においてパルプ用
広葉樹材としての植林に適する、ヤマナラシ節に属する
植物の組織から直接に、あるいはカルスのわずかな増殖
を経ただけで、効率良く不定芽を分化させ、これから植
物体を再生することにより、遺伝的構成の等しい植物体
を短期間で大量に生産することを可能とする。
濃度１〜１５ｍＭかつ硝酸態窒素濃度１５〜５０ｍＭで
ある培地を用いて、ハコヤナギ属（Populus ）ヤマナラ
シ節（Leuce ）に属する植物の組織を培養し、そこから
不定芽を分化させて、植物体を再生する。 【効果】ハコヤナギ属のうち、わが国においてパルプ用
広葉樹材としての植林に適する、ヤマナラシ節に属する
植物の組織から直接に、あるいはカルスのわずかな増殖
を経ただけで、効率良く不定芽を分化させ、これから植
物体を再生することにより、遺伝的構成の等しい植物体
を短期間で大量に生産することを可能とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ハコヤナギ属（ポプル
ス： Populus ）ヤマナラシ節（Leuce ）に属する植物
の組織を培養することにより、不定芽を経由して植物体
を再生することを特徴とする植物体の生産方法に関する
ものである。
ス： Populus ）ヤマナラシ節（Leuce ）に属する植物
の組織を培養することにより、不定芽を経由して植物体
を再生することを特徴とする植物体の生産方法に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】ハコヤナギ属は、成長が早く緑化樹、パ
ルプ材等に広く利用される有用な樹種であるため、北半
球温帯を中心に多くの種が栽培されている。通常、これ
らの種の増殖には、插し木法を用いた無性繁殖が行われ
ているが、わが国においてパルプ用広葉樹材としての植
林に適するとされる、ヤマナラシ節に属する種は、插し
木での発根率が低いため、根伏せ等の方法により繁殖が
行われている。しかし、この方法による大量増殖には長
期間を要し、またそのためのより広い圃場も必要とされ
るので、これらの問題を解決するため、組織培養の手法
を用いた大量増殖について、多くの研究が進められてい
る。
ルプ材等に広く利用される有用な樹種であるため、北半
球温帯を中心に多くの種が栽培されている。通常、これ
らの種の増殖には、插し木法を用いた無性繁殖が行われ
ているが、わが国においてパルプ用広葉樹材としての植
林に適するとされる、ヤマナラシ節に属する種は、插し
木での発根率が低いため、根伏せ等の方法により繁殖が
行われている。しかし、この方法による大量増殖には長
期間を要し、またそのためのより広い圃場も必要とされ
るので、これらの問題を解決するため、組織培養の手法
を用いた大量増殖について、多くの研究が進められてい
る。
【０００３】組織培養とは、植物体の一部を適当な条件
下で無菌的に培養し、増殖・生育させる技術であり、こ
の技術を応用することにより、植物体の組織の一部を用
いて極めて短期間で植物体を再生することが可能である
ため、種苗の大量増殖への応用等が期待されており、ヤ
マナラシ節に属する種でも、葯や茎を材料として培養
し、不定形組織であるカルスを誘導・増殖させて、これ
から茎葉等を分化させ、植物体を再生する方法は既に知
られている（木本植物の増殖と育種 農業図書1989）。
しかし、カルスはその増殖中に遺伝子突然変異を起こし
やすいことが知られており、この方法を用いた場合で
も、カルスの増殖段階で変異体を生ずるおそれが大き
く、これは特に、遺伝的構成の等しい、いわゆるクロー
ン苗の増殖を目的とする場合には問題となる。またこの
方法では、根伏せ法等によるよりは増殖期間を短縮でき
るものの、その培養は、葯や茎等の外植片からのカルス
の誘導、そしてその増殖、さらにそこからの茎葉等の分
化、という過程を経るため、外植片の培養を始めてから
茎葉の分化までになお数ヶ月を要する。そのため、商業
目的に苗等を大量に生産する場合や、育種を目的として
優良個体の選抜・増殖を繰り返す場合等には、この期間
の短縮を図ることも重要な課題となる。従って、外来遺
伝子を導入した交雑ヤマナラシ（ポプルス・シーボルデ
ィ×ポプルス・グランディデンタータ： Populus Siebo
ldii×Populus grandidentata ）形質転換体の作出にこ
の方法を用いた報告もあるが（松永ら、1992 第２回樹
木分子生物学シンポジウム講演要旨集 72-77 ）、上記
の理由により、目的とする遺伝子の導入されたクローン
苗が効率的に得られないこと、また植物体の再生までに
時間がかかること等、実用上の問題を有している。
下で無菌的に培養し、増殖・生育させる技術であり、こ
の技術を応用することにより、植物体の組織の一部を用
いて極めて短期間で植物体を再生することが可能である
ため、種苗の大量増殖への応用等が期待されており、ヤ
マナラシ節に属する種でも、葯や茎を材料として培養
し、不定形組織であるカルスを誘導・増殖させて、これ
から茎葉等を分化させ、植物体を再生する方法は既に知
られている（木本植物の増殖と育種 農業図書1989）。
しかし、カルスはその増殖中に遺伝子突然変異を起こし
やすいことが知られており、この方法を用いた場合で
も、カルスの増殖段階で変異体を生ずるおそれが大き
く、これは特に、遺伝的構成の等しい、いわゆるクロー
ン苗の増殖を目的とする場合には問題となる。またこの
方法では、根伏せ法等によるよりは増殖期間を短縮でき
るものの、その培養は、葯や茎等の外植片からのカルス
の誘導、そしてその増殖、さらにそこからの茎葉等の分
化、という過程を経るため、外植片の培養を始めてから
茎葉の分化までになお数ヶ月を要する。そのため、商業
目的に苗等を大量に生産する場合や、育種を目的として
優良個体の選抜・増殖を繰り返す場合等には、この期間
の短縮を図ることも重要な課題となる。従って、外来遺
伝子を導入した交雑ヤマナラシ（ポプルス・シーボルデ
ィ×ポプルス・グランディデンタータ： Populus Siebo
ldii×Populus grandidentata ）形質転換体の作出にこ
の方法を用いた報告もあるが（松永ら、1992 第２回樹
木分子生物学シンポジウム講演要旨集 72-77 ）、上記
の理由により、目的とする遺伝子の導入されたクローン
苗が効率的に得られないこと、また植物体の再生までに
時間がかかること等、実用上の問題を有している。
【０００４】かかる問題を解決するため、植物体の組織
から、カルスの誘導・増殖のための操作を行うことなく
不定芽等を分化させて、植物体を再生する組織培養方法
も行われる。ここで不定芽とは、そもそも芽となるべき
ではない組織から何らかの方法で誘導された芽のことを
いい、カルスから茎葉等を分化させた場合と同様に、適
当な条件下でこれを培養することにより、植物体を再生
することができる。不定芽は、茎や葉等の組織から直接
誘導することも、またカルスから誘導することもできる
が、この方法では、カルスは全く誘導されないか、誘導
されても殆ど増殖しない条件下で不定芽の分化を誘導す
ることにより、材料とした茎や葉等の組織から直接に、
あるいはわずかに増殖しただけのカルスから、不定芽を
分化させる。従って、この方法は、培養中に遺伝子突然
変異を起こすおそれも少なく、また、カルスの誘導・増
殖・カルスからの再分化という過程を必ず経る再分化方
法と比べて、植物体の再生に要する期間も短いため、上
記した商業目的・育種目的に有用と考えられ、特に最近
では、アグロバクテリウム法等により遺伝子を導入した
形質転換植物体を効率良く得るための手段として、使用
される場合が多くなっている。
から、カルスの誘導・増殖のための操作を行うことなく
不定芽等を分化させて、植物体を再生する組織培養方法
も行われる。ここで不定芽とは、そもそも芽となるべき
ではない組織から何らかの方法で誘導された芽のことを
いい、カルスから茎葉等を分化させた場合と同様に、適
当な条件下でこれを培養することにより、植物体を再生
することができる。不定芽は、茎や葉等の組織から直接
誘導することも、またカルスから誘導することもできる
が、この方法では、カルスは全く誘導されないか、誘導
されても殆ど増殖しない条件下で不定芽の分化を誘導す
ることにより、材料とした茎や葉等の組織から直接に、
あるいはわずかに増殖しただけのカルスから、不定芽を
分化させる。従って、この方法は、培養中に遺伝子突然
変異を起こすおそれも少なく、また、カルスの誘導・増
殖・カルスからの再分化という過程を必ず経る再分化方
法と比べて、植物体の再生に要する期間も短いため、上
記した商業目的・育種目的に有用と考えられ、特に最近
では、アグロバクテリウム法等により遺伝子を導入した
形質転換植物体を効率良く得るための手段として、使用
される場合が多くなっている。
【０００５】ところで、組織培養の手法を用いる場合に
は、培養の目的とするところにより、培養すべき植物の
組織や培養に用いる培地の組成、温度・光等の条件を適
宜選択する必要がある。しかし、これらの条件の組み合
わせとそれにより得られる結果との間には、必ずしも一
定の傾向を見出だすことはできず、材料とする植物の種
のみならず品種が相違するだけでも、同一結果は得られ
ないのがむしろ普通である。例えば、不定芽分化に対す
る培地の植物ホルモン組成および品種（遺伝子型：geno
type）の影響を詳細に調査した報告では、不定芽分化率
は、同一の基本培地に同一種類・同一量の植物ホルモン
を添加して用いた場合でも、品種の違いにより０〜１０
０％の範囲で異なる値を示した（コールマンら：Colema
n et.al、1989 プラント・セル・レポート：Plant Cel
l Reports 9 165-167 ）。従って、研究者は、材料
とする植物と培養の目的によって、そのつど最も適した
条件を検索する必要があり、これが植物の組織培養の手
法を用いる場合に、解決すべき最も重要な課題となる。
しかし、木本植物の分野においては、野菜、花卉等の草
本植物と比べ、組織培養による増殖等の研究が進んでい
ないことから、不定芽分化を目的とする場合でも、現段
階では、草本植物であるタバコの不定芽分化等に用いら
れる条件を、培地中の植物ホルモン組成を変更しただけ
でそのまま用い、かかる条件下で比較的容易に不定芽分
化が起こる品種を材料として、モデル的な研究を行なう
にとどまっている。例えばハコヤナギ属においては、葉
からの不定芽分化による植物体の再生が報告されている
（フィラッティら：Fillatti et.al、1987 モレキュラ
・ジェネラル・ジェネティックス：Molecular GeneralG
enetics 206 192-199 ）が、実際に有用な樹種に関
して効率的な不定芽分化を起こさせるための、培地等の
培養条件について検討がなされている例は、極めて少な
い。
は、培養の目的とするところにより、培養すべき植物の
組織や培養に用いる培地の組成、温度・光等の条件を適
宜選択する必要がある。しかし、これらの条件の組み合
わせとそれにより得られる結果との間には、必ずしも一
定の傾向を見出だすことはできず、材料とする植物の種
のみならず品種が相違するだけでも、同一結果は得られ
ないのがむしろ普通である。例えば、不定芽分化に対す
る培地の植物ホルモン組成および品種（遺伝子型：geno
type）の影響を詳細に調査した報告では、不定芽分化率
は、同一の基本培地に同一種類・同一量の植物ホルモン
を添加して用いた場合でも、品種の違いにより０〜１０
０％の範囲で異なる値を示した（コールマンら：Colema
n et.al、1989 プラント・セル・レポート：Plant Cel
l Reports 9 165-167 ）。従って、研究者は、材料
とする植物と培養の目的によって、そのつど最も適した
条件を検索する必要があり、これが植物の組織培養の手
法を用いる場合に、解決すべき最も重要な課題となる。
しかし、木本植物の分野においては、野菜、花卉等の草
本植物と比べ、組織培養による増殖等の研究が進んでい
ないことから、不定芽分化を目的とする場合でも、現段
階では、草本植物であるタバコの不定芽分化等に用いら
れる条件を、培地中の植物ホルモン組成を変更しただけ
でそのまま用い、かかる条件下で比較的容易に不定芽分
化が起こる品種を材料として、モデル的な研究を行なう
にとどまっている。例えばハコヤナギ属においては、葉
からの不定芽分化による植物体の再生が報告されている
（フィラッティら：Fillatti et.al、1987 モレキュラ
・ジェネラル・ジェネティックス：Molecular GeneralG
enetics 206 192-199 ）が、実際に有用な樹種に関
して効率的な不定芽分化を起こさせるための、培地等の
培養条件について検討がなされている例は、極めて少な
い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ハコヤナギ
属のうち、わが国においてパルプ用広葉樹材としての植
林に適するとされる、ヤマナラシ節に属する植物の組織
より直接に、あるいはその組織からわずかに増殖したカ
ルスより、効率良く不定芽を分化させ、これから植物体
を再生することにより、遺伝的構成の等しい植物体を短
期間で大量に生産する方法を提供しようとするものであ
る。
属のうち、わが国においてパルプ用広葉樹材としての植
林に適するとされる、ヤマナラシ節に属する植物の組織
より直接に、あるいはその組織からわずかに増殖したカ
ルスより、効率良く不定芽を分化させ、これから植物体
を再生することにより、遺伝的構成の等しい植物体を短
期間で大量に生産する方法を提供しようとするものであ
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意検討を行なった結果、ヤマナラシ節に
属する植物においては、窒素源を特定の組成とした培地
を用いて、その組織を培養することにより、カルス増殖
を殆ど起こすことなく、その組織から効率良く不定芽の
分化を誘導することができることを見出だした。
を解決すべく鋭意検討を行なった結果、ヤマナラシ節に
属する植物においては、窒素源を特定の組成とした培地
を用いて、その組織を培養することにより、カルス増殖
を殆ど起こすことなく、その組織から効率良く不定芽の
分化を誘導することができることを見出だした。
【０００８】すなわち、本発明においては、不定芽分化
のための培地として、培地中の窒素源の濃度を、アンモ
ニア態窒素濃度１〜１５ｍＭかつ硝酸態窒素濃度１５〜
５０ｍＭ、好ましくはアンモニア態窒素濃度５〜１０ｍ
Ｍかつ硝酸態窒素濃度３０〜４０ｍＭとしたものを用い
る。アンモニア態窒素濃度、硝酸態窒素濃度のいずれが
この範囲を外れても、不定芽の分化には悪影響を与え
る。また、このアンモニア態窒素と硝酸態窒素の割合
は、モル濃度比にして１：２〜１：５、特に１：３であ
ることが、高効率で不定芽の分化を誘導する上から望ま
しい。
のための培地として、培地中の窒素源の濃度を、アンモ
ニア態窒素濃度１〜１５ｍＭかつ硝酸態窒素濃度１５〜
５０ｍＭ、好ましくはアンモニア態窒素濃度５〜１０ｍ
Ｍかつ硝酸態窒素濃度３０〜４０ｍＭとしたものを用い
る。アンモニア態窒素濃度、硝酸態窒素濃度のいずれが
この範囲を外れても、不定芽の分化には悪影響を与え
る。また、このアンモニア態窒素と硝酸態窒素の割合
は、モル濃度比にして１：２〜１：５、特に１：３であ
ることが、高効率で不定芽の分化を誘導する上から望ま
しい。
【０００９】なお、培地の他の成分については、ＭＳ
（ムラシゲ・スク−グ）培地、ＬＳ（リンスマイヤ−・
スク−グ）培地、ＷＰ（ウッディプラント）培地等とし
て知られているものの組成をそのまま用いることができ
る。さらに、不定芽の分化、および分化した芽の生長を
促進するため、これらの培地には植物ホルモンとして、
ベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチン、２
−イソペンテニルアデニン、チジアズロン等のサイトカ
イニンを単独もしくは併用して加えることが望ましい。
その添加量は、用いるサイトカイニンの活性に応じて適
宜定めることができるが、通常は０．０５〜５ｍｇ／ｌ
の範囲から選択される。一方、オ−キシン類については
特に加える必要はないが、茎葉の再分化を抑制しない範
囲で加えることができる。なお、培養温度は１５〜３０
℃、また少なくとも１日１０時間は５００ルクス以上で
培養することが、やはり不定芽の分化・生長等の上から
望ましい。
（ムラシゲ・スク−グ）培地、ＬＳ（リンスマイヤ−・
スク−グ）培地、ＷＰ（ウッディプラント）培地等とし
て知られているものの組成をそのまま用いることができ
る。さらに、不定芽の分化、および分化した芽の生長を
促進するため、これらの培地には植物ホルモンとして、
ベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチン、２
−イソペンテニルアデニン、チジアズロン等のサイトカ
イニンを単独もしくは併用して加えることが望ましい。
その添加量は、用いるサイトカイニンの活性に応じて適
宜定めることができるが、通常は０．０５〜５ｍｇ／ｌ
の範囲から選択される。一方、オ−キシン類については
特に加える必要はないが、茎葉の再分化を抑制しない範
囲で加えることができる。なお、培養温度は１５〜３０
℃、また少なくとも１日１０時間は５００ルクス以上で
培養することが、やはり不定芽の分化・生長等の上から
望ましい。
【００１０】本発明の不定芽分化培地は、上記のように
ハコヤナギ属のうちヤマナラシ節に属する植物に対して
適用することができるが、その中でも特に、ヤマナラシ
（ポプルス・シーボルディ： Populus Sieboldii）とオ
オバヤマナラシ（ポプルス・グランディデンタータ： P
opulus grandidentata）の雑種である交雑ヤマナラシの
不定芽分化に優れた効果を有する。交雑ヤマナラシは、
岩手県岩手郡玉山村の山地に自生していたヤマナラシか
ら選抜した５本の雌株の切枝を、水ざし法によって開花
させたものに、カナダ産オオバヤマナラシ雄株の１選抜
木からの花粉を交配させて得られた種子約30,000粒よ
り、1,200 本の健全実生苗を得て、伸長生長が特に旺盛
なＦ１個体の選抜を行った結果、得られたものである
（秋田十條化成（株）内実験林にて栽培）。その伸長成
長はヤマナラシ節に属する他の種、あるいはそれらの種
間雑種の中でも特に優れており、雑種強勢が顕著に発現
されていることが報告されている（高山、1968 日林誌
50(9) 267-273 ）。
ハコヤナギ属のうちヤマナラシ節に属する植物に対して
適用することができるが、その中でも特に、ヤマナラシ
（ポプルス・シーボルディ： Populus Sieboldii）とオ
オバヤマナラシ（ポプルス・グランディデンタータ： P
opulus grandidentata）の雑種である交雑ヤマナラシの
不定芽分化に優れた効果を有する。交雑ヤマナラシは、
岩手県岩手郡玉山村の山地に自生していたヤマナラシか
ら選抜した５本の雌株の切枝を、水ざし法によって開花
させたものに、カナダ産オオバヤマナラシ雄株の１選抜
木からの花粉を交配させて得られた種子約30,000粒よ
り、1,200 本の健全実生苗を得て、伸長生長が特に旺盛
なＦ１個体の選抜を行った結果、得られたものである
（秋田十條化成（株）内実験林にて栽培）。その伸長成
長はヤマナラシ節に属する他の種、あるいはそれらの種
間雑種の中でも特に優れており、雑種強勢が顕著に発現
されていることが報告されている（高山、1968 日林誌
50(9) 267-273 ）。
【００１１】また、本発明においては、培養すべき組織
として、植物体の茎、頂芽、側芽、茎頂、および葉柄の
組織のうち、いずれでも使用することができる。ここ
で、頂芽とは茎の先端に生じる芽、側芽とは茎の側面に
生じる芽のことであり、茎頂とはこれらの芽の先端部
等、茎の端部に存在する分裂組織を含む部分をいう。こ
れらの組織は植物体より切り出し、常法により殺菌を行
って無菌条件下に移し、滅菌水による洗浄等の後、直ち
に、あるいは適当な前培養を経て、上記の不定芽分化培
地にて培養することにより、そこから不定芽を分化させ
ることができる。ただし、フラスコ内等で無菌的に生育
させた植物体を材料として用いる場合には、殺菌操作は
必要としない。前培養を行う場合、用いる培地について
の制限はないが、その培養中にカルスの増殖が認められ
るときは、前培養期間は短くすることが望ましい。
として、植物体の茎、頂芽、側芽、茎頂、および葉柄の
組織のうち、いずれでも使用することができる。ここ
で、頂芽とは茎の先端に生じる芽、側芽とは茎の側面に
生じる芽のことであり、茎頂とはこれらの芽の先端部
等、茎の端部に存在する分裂組織を含む部分をいう。こ
れらの組織は植物体より切り出し、常法により殺菌を行
って無菌条件下に移し、滅菌水による洗浄等の後、直ち
に、あるいは適当な前培養を経て、上記の不定芽分化培
地にて培養することにより、そこから不定芽を分化させ
ることができる。ただし、フラスコ内等で無菌的に生育
させた植物体を材料として用いる場合には、殺菌操作は
必要としない。前培養を行う場合、用いる培地について
の制限はないが、その培養中にカルスの増殖が認められ
るときは、前培養期間は短くすることが望ましい。
【００１２】分化してきた不定芽は、１〜３ｃｍ程度に
伸張したものを培養組織より切断し、これを発根のため
の培地に移植して発根させることにより、完全な植物体
を再生することができる。発根培地としては、上記のＭ
Ｓ、ＬＳ、ＷＰ培地等、通常知られている培地をそのま
ま、あるいは１／３程度まで稀釈して用いることができ
る。また、窒素源を本発明の組成としたものを用いても
よい。植物ホルモンについては、全く添加しないか、あ
るいはオーキシン類を単独で０．５ｍｇ／ｌまでの濃度
で加えるのが望ましく、これよりも濃度が高くなると、
移植した組織のカルス化を誘導する傾向を強く示すよう
になる。この場合、特に、ＩＢＡ（インドール酪酸）を
単独で０．０１〜０．２ｍｇ／ｌ加えるのが望ましい。
なお、サイトカイニン類は発根を抑制する傾向があるた
め使用を控える必要があるが、オーキシン類の濃度の１
／１０以下であれば加えることもできる。
伸張したものを培養組織より切断し、これを発根のため
の培地に移植して発根させることにより、完全な植物体
を再生することができる。発根培地としては、上記のＭ
Ｓ、ＬＳ、ＷＰ培地等、通常知られている培地をそのま
ま、あるいは１／３程度まで稀釈して用いることができ
る。また、窒素源を本発明の組成としたものを用いても
よい。植物ホルモンについては、全く添加しないか、あ
るいはオーキシン類を単独で０．５ｍｇ／ｌまでの濃度
で加えるのが望ましく、これよりも濃度が高くなると、
移植した組織のカルス化を誘導する傾向を強く示すよう
になる。この場合、特に、ＩＢＡ（インドール酪酸）を
単独で０．０１〜０．２ｍｇ／ｌ加えるのが望ましい。
なお、サイトカイニン類は発根を抑制する傾向があるた
め使用を控える必要があるが、オーキシン類の濃度の１
／１０以下であれば加えることもできる。
【００１３】本発明において培養の方式は、液体培養で
あると固体培養であるとを問わないが、より健全な不定
芽の生長、および根の分化と生長の点から、固体培養が
望ましい。固体培養を行う場合には、培養の目的によっ
ても異なるが、一般には、培地固形剤として寒天、ゲラ
ンガム等を用い、培地の体積に対して、寒天培地の場合
には寒天を０．７〜１．０ｗ／ｖ％、ゲランガム培地の
場合にはゲランガムを０．２〜０．３ｗ／ｖ％となるよ
うに培地中に加え、常法に従い溶解・固化させたものを
用いる。
あると固体培養であるとを問わないが、より健全な不定
芽の生長、および根の分化と生長の点から、固体培養が
望ましい。固体培養を行う場合には、培養の目的によっ
ても異なるが、一般には、培地固形剤として寒天、ゲラ
ンガム等を用い、培地の体積に対して、寒天培地の場合
には寒天を０．７〜１．０ｗ／ｖ％、ゲランガム培地の
場合にはゲランガムを０．２〜０．３ｗ／ｖ％となるよ
うに培地中に加え、常法に従い溶解・固化させたものを
用いる。
【００１４】
【作用】本発明は、ハコヤナギ属ヤマナラシ節に属する
植物においては、木本植物の組織培養に用いられている
既知の培地中、その窒素源の濃度のみをアンモニア態窒
素濃度１〜１５ｍＭかつ硝酸態窒素濃度１５〜５０ｍＭ
としたものを用いて培養を行うことにより、カルス増殖
を殆ど起こすことなく、その組織から効率良く不定芽の
分化が誘導される、との知見に基づきなされたものであ
る。
植物においては、木本植物の組織培養に用いられている
既知の培地中、その窒素源の濃度のみをアンモニア態窒
素濃度１〜１５ｍＭかつ硝酸態窒素濃度１５〜５０ｍＭ
としたものを用いて培養を行うことにより、カルス増殖
を殆ど起こすことなく、その組織から効率良く不定芽の
分化が誘導される、との知見に基づきなされたものであ
る。
【００１５】かかる分化が誘導される機構について、詳
細は明らかでない。しかし、植物細胞はそもそも分化全
能性、すなわち１個の体細胞から１個の植物体を再生す
ることのできる能力をあらかじめ備えていることが知ら
れている。従って、植物細胞はある適当な条件下に置か
れることにより、その生理状態が変化し、その変化した
状態に応じて種々の組織を分化させるが、本発明の対象
であるヤマナラシ節に属する植物においては、その栄養
源の中、アンモニア態窒素と硝酸態窒素の２種の窒素源
の濃度が両者とも、不定芽の分化を誘導するような生理
状態を引き起こす過程に深く関わっており、そのため、
その組織を培養する培地中の窒素源の組成を上記のもの
とすることにより、その細胞の生理状態が変化して不定
芽の分化が起こるものと考えられる。
細は明らかでない。しかし、植物細胞はそもそも分化全
能性、すなわち１個の体細胞から１個の植物体を再生す
ることのできる能力をあらかじめ備えていることが知ら
れている。従って、植物細胞はある適当な条件下に置か
れることにより、その生理状態が変化し、その変化した
状態に応じて種々の組織を分化させるが、本発明の対象
であるヤマナラシ節に属する植物においては、その栄養
源の中、アンモニア態窒素と硝酸態窒素の２種の窒素源
の濃度が両者とも、不定芽の分化を誘導するような生理
状態を引き起こす過程に深く関わっており、そのため、
その組織を培養する培地中の窒素源の組成を上記のもの
とすることにより、その細胞の生理状態が変化して不定
芽の分化が起こるものと考えられる。
【００１６】
【実施例】以下に、本発明を実施例に基づいて説明す
る。
る。
【００１７】［実施例１］無菌条件下、交雑ヤマナラシ
Ｙ６３（秋田十條化成（株）内実験林より採取）の無菌
フラスコ苗の茎を、節を含まないように５ｍｍ長さに切
断し、これをさらに縦に二つ割りにして、窒素源の組成
を、アンモニア態窒素濃度１０ｍＭ、硝酸態窒素濃度３
０ｍＭに変更したＭＳ寒天固体培地（シュークロース２
ｗ／ｖ％、ゼアチン０．５ｍｇ／ｌ、寒天０．８ｗ／ｖ
％）に置床し、温度２５℃、照度３０００ルクス（終
日）で１か月間培養したところ、置床した組織２４個中
２３個で不定芽の分化が認められた。これらをさらに約
１か月間、同様の条件下で培養し、この芽から伸長して
生じた茎葉が２〜３ｃｍになった頃に、やはり無菌条件
下、その茎の部分から切り取り、これを発根のため、ゼ
アチンに替えてＩＢＡ０．０５ｍｇ／ｌとした以外は上
記のものと同様の組成の培地に移植して、さらに培養を
続けて発根させたところ、移植後１か月後には６１個の
幼植物体を得ることができた。
Ｙ６３（秋田十條化成（株）内実験林より採取）の無菌
フラスコ苗の茎を、節を含まないように５ｍｍ長さに切
断し、これをさらに縦に二つ割りにして、窒素源の組成
を、アンモニア態窒素濃度１０ｍＭ、硝酸態窒素濃度３
０ｍＭに変更したＭＳ寒天固体培地（シュークロース２
ｗ／ｖ％、ゼアチン０．５ｍｇ／ｌ、寒天０．８ｗ／ｖ
％）に置床し、温度２５℃、照度３０００ルクス（終
日）で１か月間培養したところ、置床した組織２４個中
２３個で不定芽の分化が認められた。これらをさらに約
１か月間、同様の条件下で培養し、この芽から伸長して
生じた茎葉が２〜３ｃｍになった頃に、やはり無菌条件
下、その茎の部分から切り取り、これを発根のため、ゼ
アチンに替えてＩＢＡ０．０５ｍｇ／ｌとした以外は上
記のものと同様の組成の培地に移植して、さらに培養を
続けて発根させたところ、移植後１か月後には６１個の
幼植物体を得ることができた。
【００１８】［比較例１］不定芽分化のための培地とし
て通常のＭＳ培地を用いた以外は、実施例１と全く同様
にして、交雑ヤマナラシＹ６３の無菌フラスコ苗の茎を
培養したところ、置床した組織２４個中２個で不定芽の
分化が認められ、得られた幼植物体数は２個体であっ
た。
て通常のＭＳ培地を用いた以外は、実施例１と全く同様
にして、交雑ヤマナラシＹ６３の無菌フラスコ苗の茎を
培養したところ、置床した組織２４個中２個で不定芽の
分化が認められ、得られた幼植物体数は２個体であっ
た。
【００１９】［実施例２］不定芽分化のための培地とし
て、窒素源の組成を、アンモニア態窒素濃度５ｍＭ，硝
酸態窒素濃度２０ｍＭとした以外は、実施例１と全く同
様にして、交雑ヤマナラシＹ６３の無菌フラスコ苗の茎
を培養したところ、置床した組織２４個中１２個で不定
芽の分化が認められ、得られた幼植物体数は１６個体で
あった。
て、窒素源の組成を、アンモニア態窒素濃度５ｍＭ，硝
酸態窒素濃度２０ｍＭとした以外は、実施例１と全く同
様にして、交雑ヤマナラシＹ６３の無菌フラスコ苗の茎
を培養したところ、置床した組織２４個中１２個で不定
芽の分化が認められ、得られた幼植物体数は１６個体で
あった。
【００２０】［実施例３］不定芽分化のための培地とし
て、窒素源の組成を、アンモニア態窒素濃度１０ｍＭ，
硝酸態窒素濃度４０ｍＭとした以外は、実施例１と全く
同様にして、交雑ヤマナラシＹ６３の無菌フラスコ苗の
茎を培養したところ、置床した組織２４個中１５個で不
定芽の分化が認められ、得られた幼植物体数は４１個体
であった。
て、窒素源の組成を、アンモニア態窒素濃度１０ｍＭ，
硝酸態窒素濃度４０ｍＭとした以外は、実施例１と全く
同様にして、交雑ヤマナラシＹ６３の無菌フラスコ苗の
茎を培養したところ、置床した組織２４個中１５個で不
定芽の分化が認められ、得られた幼植物体数は４１個体
であった。
【００２１】［比較例２］不定芽分化のための培地とし
て、窒素源の組成を、アンモニア態窒素濃度５ｍＭ，硝
酸態窒素濃度１０ｍＭとした以外は、実施例１と全く同
様にして、交雑ヤマナラシＹ６３の無菌フラスコ苗の茎
を培養したところ、置床した組織２４個中５個で不定芽
の分化が認められ、得られた幼植物体数は７個体であっ
た。
て、窒素源の組成を、アンモニア態窒素濃度５ｍＭ，硝
酸態窒素濃度１０ｍＭとした以外は、実施例１と全く同
様にして、交雑ヤマナラシＹ６３の無菌フラスコ苗の茎
を培養したところ、置床した組織２４個中５個で不定芽
の分化が認められ、得られた幼植物体数は７個体であっ
た。
【００２２】［比較例３］不定芽分化のための培地とし
て、窒素源の組成を、アンモニア態窒素濃度２０ｍＭ，
硝酸態窒素濃度２０ｍＭとした以外は、実施例１と全く
同様にして、交雑ヤマナラシＹ６３の無菌フラスコ苗の
茎を培養したところ、置床した組織２４個中３個で不定
芽の分化が認められ、得られた幼植物体数は５個体であ
った。
て、窒素源の組成を、アンモニア態窒素濃度２０ｍＭ，
硝酸態窒素濃度２０ｍＭとした以外は、実施例１と全く
同様にして、交雑ヤマナラシＹ６３の無菌フラスコ苗の
茎を培養したところ、置床した組織２４個中３個で不定
芽の分化が認められ、得られた幼植物体数は５個体であ
った。
【００２３】［実施例４］温度２５℃、照度３０００ル
クス（終日）の恒温室内で生育している交雑ヤマナラシ
Ｙ７８（秋田十條化成（株）内実験林より採取）の茎
を、節を含まないように切り出し、有効塩素量１％の次
亜塩素酸ソーダ溶液中に浸漬して撹拌しつつ１０分間殺
菌を行った。これを無菌条件下に移し、滅菌水で洗浄し
た後、５ｍｍ長さに切断し、さらに縦に二つ割りにし
て、窒素源の組成を、アンモニア態窒素濃度１０ｍＭ、
硝酸態窒素濃度３０ｍＭに変更したＷＰ寒天固体培地
（シュークロース２ｗ／ｖ％、ゼアチン０．５ｍｇ／
ｌ、寒天０．８ｗ／ｖ％）に置床し、実施例１と同様に
して培養したところ、置床した組織１０個中８個で不定
芽の分化が認められ、幼植物体１６個体を得ることがで
きた。
クス（終日）の恒温室内で生育している交雑ヤマナラシ
Ｙ７８（秋田十條化成（株）内実験林より採取）の茎
を、節を含まないように切り出し、有効塩素量１％の次
亜塩素酸ソーダ溶液中に浸漬して撹拌しつつ１０分間殺
菌を行った。これを無菌条件下に移し、滅菌水で洗浄し
た後、５ｍｍ長さに切断し、さらに縦に二つ割りにし
て、窒素源の組成を、アンモニア態窒素濃度１０ｍＭ、
硝酸態窒素濃度３０ｍＭに変更したＷＰ寒天固体培地
（シュークロース２ｗ／ｖ％、ゼアチン０．５ｍｇ／
ｌ、寒天０．８ｗ／ｖ％）に置床し、実施例１と同様に
して培養したところ、置床した組織１０個中８個で不定
芽の分化が認められ、幼植物体１６個体を得ることがで
きた。
【００２４】［比較例４］不定芽分化のための培地とし
て通常のＷＰ培地を用いた以外は、実施例４と全く同様
にして、交雑ヤマナラシＹ７８の茎を培養したところ、
置床した組織１０個中２個で不定芽の分化が認められ、
得られた幼植物体数は３個体であった。
て通常のＷＰ培地を用いた以外は、実施例４と全く同様
にして、交雑ヤマナラシＹ７８の茎を培養したところ、
置床した組織１０個中２個で不定芽の分化が認められ、
得られた幼植物体数は３個体であった。
【００２５】［実施例５］野外で生育している交雑ヤマ
ナラシＹ７９（秋田十條化成（株）内実験林より採取）
の萌芽前の枝を、よく洗浄した後、温度２５℃、照度３
０００ルクス（終日）の恒温室内で水ざしにして、萌芽
させた。そこから側芽を含む節の部分を切り出し、これ
を、有効塩素量１％の次亜塩素酸ソーダ溶液中に浸漬し
て撹拌しつつ１０分間殺菌を行い、無菌条件下に移し
て、滅菌水で洗浄後、実施例１と同様の不定芽分化培地
および条件で培養したところ不定芽の分化が認められ、
２か月後には置床した組織１個あたり、１〜５個の茎葉
が伸長してきた。次に、やはり無菌条件下、これらの茎
葉を切り取り、発根のため、２／３稀釈ＭＳゲランガム
固体培地（シュークロース２ｗ／ｖ％、ＩＢＡ０．５ｍ
ｇ／ｌ、ゲランガム０．３ｗ／ｖ％）に移植して、さら
に培養を続けて発根させ、幼植物体を得た。
ナラシＹ７９（秋田十條化成（株）内実験林より採取）
の萌芽前の枝を、よく洗浄した後、温度２５℃、照度３
０００ルクス（終日）の恒温室内で水ざしにして、萌芽
させた。そこから側芽を含む節の部分を切り出し、これ
を、有効塩素量１％の次亜塩素酸ソーダ溶液中に浸漬し
て撹拌しつつ１０分間殺菌を行い、無菌条件下に移し
て、滅菌水で洗浄後、実施例１と同様の不定芽分化培地
および条件で培養したところ不定芽の分化が認められ、
２か月後には置床した組織１個あたり、１〜５個の茎葉
が伸長してきた。次に、やはり無菌条件下、これらの茎
葉を切り取り、発根のため、２／３稀釈ＭＳゲランガム
固体培地（シュークロース２ｗ／ｖ％、ＩＢＡ０．５ｍ
ｇ／ｌ、ゲランガム０．３ｗ／ｖ％）に移植して、さら
に培養を続けて発根させ、幼植物体を得た。
【００２６】ここで得られた幼植物体は、フラスコ内で
無菌的に培養されたものであるが、これを外部環境に移
すため、約５ｃｍに成長した幼植物体の根を水洗し、オ
−トクレ−ブ殺菌したメトロミックス３５０（Ｗ．Ｒ．
グレ−ス社製）を入れたポリポットに移植し、ビニ−ル
袋で覆って温度２５℃、照度３０００ルクスの条件で栽
培することにより、馴化を行った。２週間後に覆いを取
り外し、そのまま栽培を続けたところ、幼植物体は馴化
後３ケ月で約３０ｃｍに成長した。
無菌的に培養されたものであるが、これを外部環境に移
すため、約５ｃｍに成長した幼植物体の根を水洗し、オ
−トクレ−ブ殺菌したメトロミックス３５０（Ｗ．Ｒ．
グレ−ス社製）を入れたポリポットに移植し、ビニ−ル
袋で覆って温度２５℃、照度３０００ルクスの条件で栽
培することにより、馴化を行った。２週間後に覆いを取
り外し、そのまま栽培を続けたところ、幼植物体は馴化
後３ケ月で約３０ｃｍに成長した。
【００２７】以上の結果を表１に示す。なお、ここで基
本培地として用いたＭＳおよびＷＰ培地の組成は、表２
に示す。
本培地として用いたＭＳおよびＷＰ培地の組成は、表２
に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】培地中の窒素濃度が、アンモニア態窒素１
〜１５ｍＭかつ硝酸態窒素１５〜５０ｍＭの範囲にある
場合には、基本培地の種類を問わず、不定芽分化率はす
べて５０％以上を示し、この２種の窒素源のうちのいず
れが上記の濃度範囲を外れても、不定芽分化率は急激に
低下した。また、アンモニア態窒素と硝酸態窒素の割合
は、そのモル濃度比が１：３のときに、特に高い不定芽
分化率を示した。一方、これらの不定芽から再生して得
られた幼植物体の個体数は、発根、馴化等の不定芽分化
後の生育状況によっても結果が左右されるものである
が、それでも、アンモニア態窒素濃度と硝酸態窒素濃度
が上記の範囲にある不定芽分化培地を用いることによ
り、得られる幼植物体の個体数は明らかに増加した。
〜１５ｍＭかつ硝酸態窒素１５〜５０ｍＭの範囲にある
場合には、基本培地の種類を問わず、不定芽分化率はす
べて５０％以上を示し、この２種の窒素源のうちのいず
れが上記の濃度範囲を外れても、不定芽分化率は急激に
低下した。また、アンモニア態窒素と硝酸態窒素の割合
は、そのモル濃度比が１：３のときに、特に高い不定芽
分化率を示した。一方、これらの不定芽から再生して得
られた幼植物体の個体数は、発根、馴化等の不定芽分化
後の生育状況によっても結果が左右されるものである
が、それでも、アンモニア態窒素濃度と硝酸態窒素濃度
が上記の範囲にある不定芽分化培地を用いることによ
り、得られる幼植物体の個体数は明らかに増加した。
【００３１】
【効果】本発明により、ハコヤナギ属のうち、ヤマナラ
シ節に属する植物の組織から直接に、あるいはカルスの
わずかな増殖を経ただけで、効率良く不定芽を分化さ
せ、これから植物体を再生することが可能となり、これ
により、遺伝的構成の等しい植物体を短期間で大量に生
産することが容易に行えるようになった。
シ節に属する植物の組織から直接に、あるいはカルスの
わずかな増殖を経ただけで、効率良く不定芽を分化さ
せ、これから植物体を再生することが可能となり、これ
により、遺伝的構成の等しい植物体を短期間で大量に生
産することが容易に行えるようになった。
【００３２】しかも、本発明においては、窒素源の濃度
として、アンモニア態窒素と硝酸態窒素をそれぞれ一定
の濃度範囲に設定するだけで、既知の木本植物の培地を
用いることができる。
として、アンモニア態窒素と硝酸態窒素をそれぞれ一定
の濃度範囲に設定するだけで、既知の木本植物の培地を
用いることができる。
【００３３】以上の本発明によりもたらされる効果は、
ヤマナラシ節に属する植物において、組織培養の手法に
より、商業目的のための種苗の大量生産の他、優れた形
質を有する個体の選抜のための、あるいは選抜された個
体の大量増殖、さらには有用遺伝子が導入された個体の
大量増殖を、短期間で効率良く行うことを可能とするも
のである。
ヤマナラシ節に属する植物において、組織培養の手法に
より、商業目的のための種苗の大量生産の他、優れた形
質を有する個体の選抜のための、あるいは選抜された個
体の大量増殖、さらには有用遺伝子が導入された個体の
大量増殖を、短期間で効率良く行うことを可能とするも
のである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年８月１６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００４】かかる問題を解決するため、植物体の組織
から、カルスの誘導・増殖のための操作を行うことなく
不定芽等を分化させて、植物体を再生する組織培養方法
も行われる。ここで不定芽とは、そもそも芽となるべき
ではない組織から何らかの方法で誘導された芽のことを
いい、カルスから茎葉等を分化させた場合と同様に、適
当な条件下でこれを培養することにより、植物体を再生
することができる。不定芽は、茎や葉等の組織から直接
誘導することも、またカルスから誘導することもできる
が、この方法では、カルスは全く誘導されないか、誘導
されても殆ど増殖しない条件下で不定芽の分化を誘導す
ることにより、材料とした茎や葉等の組織から直接に、
あるいはわずかに増殖しただけのカルスから、不定芽を
分化させる。従って、この方法は、培養中に遺伝子突然
変異を起こすおそれも少なく、また、カルスの誘導・増
殖・カルスからの再分化という過程を必ず経る再分化方
法と比べて、植物体の再生に要する期間も短いため、上
記した商業目的・育種目的に有用と考えられ、特に最近
では、アグロバクテリウム法等により遺伝子を導入した
形質転換植物体を効率良く作出し増殖するための手段と
して、使用される場合が多くなっている。
から、カルスの誘導・増殖のための操作を行うことなく
不定芽等を分化させて、植物体を再生する組織培養方法
も行われる。ここで不定芽とは、そもそも芽となるべき
ではない組織から何らかの方法で誘導された芽のことを
いい、カルスから茎葉等を分化させた場合と同様に、適
当な条件下でこれを培養することにより、植物体を再生
することができる。不定芽は、茎や葉等の組織から直接
誘導することも、またカルスから誘導することもできる
が、この方法では、カルスは全く誘導されないか、誘導
されても殆ど増殖しない条件下で不定芽の分化を誘導す
ることにより、材料とした茎や葉等の組織から直接に、
あるいはわずかに増殖しただけのカルスから、不定芽を
分化させる。従って、この方法は、培養中に遺伝子突然
変異を起こすおそれも少なく、また、カルスの誘導・増
殖・カルスからの再分化という過程を必ず経る再分化方
法と比べて、植物体の再生に要する期間も短いため、上
記した商業目的・育種目的に有用と考えられ、特に最近
では、アグロバクテリウム法等により遺伝子を導入した
形質転換植物体を効率良く作出し増殖するための手段と
して、使用される場合が多くなっている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】ところで、組織培養の手法を用いる場合に
は、培養の目的とするところにより、培養すべき植物の
組織や培養に用いる培地の組成、温度・光等の条件を適
宜選択する必要がある。しかし、これらの条件の組み合
わせとそれにより得られる結果との間には、必ずしも一
定の傾向を見出だすことはできず、材料とする植物の種
のみならず品種が相違するだけでも、同一結果は得られ
ないのがむしろ普通である。例えば、不定芽分化に対す
る培地の植物ホルモン組成および品種（遺伝子型：geno
type）の影響を詳細に調査した報告では、不定芽分化率
は、同一の基本培地に同一種類・同一量の植物ホルモン
を添加して用いた場合でも、品種の違いにより０〜１０
０％の範囲で異なる値を示した（コールマンら：Colema
n et.al、1989 プラント・セル・レポート：Plant Cel
l Reports 8 459-462 ）。従って、研究者は、材料
とする植物と培養の目的によって、そのつど最も適した
条件を検索する必要があり、これが植物の組織培養の手
法を用いる場合に、解決すべき最も重要な課題となる。
しかし、木本植物の分野においては、野菜、花卉等の草
本植物と比べ、組織培養による増殖等の研究が進んでい
ないことから、不定芽分化を目的とする場合でも、現段
階では、草本植物であるタバコの不定芽分化等に用いら
れる条件を、培地中の植物ホルモン組成を変更しただけ
でそのまま用い、かかる条件下で比較的容易に不定芽分
化が起こる品種を材料として、モデル的な研究を行なう
にとどまっている。例えばハコヤナギ属においては、葉
からの不定芽分化による植物体の再生が報告されている
（フィラッティら：Fillatti et.al、1987 モレキュラ
・ジェネラル・ジェネティックス：Molecular GeneralG
enetics 206 192-199 ）が、実際に有用な樹種に関
して効率的な不定芽分化を起こさせるための、培地等の
培養条件について検討がなされている例は、極めて少な
い。
は、培養の目的とするところにより、培養すべき植物の
組織や培養に用いる培地の組成、温度・光等の条件を適
宜選択する必要がある。しかし、これらの条件の組み合
わせとそれにより得られる結果との間には、必ずしも一
定の傾向を見出だすことはできず、材料とする植物の種
のみならず品種が相違するだけでも、同一結果は得られ
ないのがむしろ普通である。例えば、不定芽分化に対す
る培地の植物ホルモン組成および品種（遺伝子型：geno
type）の影響を詳細に調査した報告では、不定芽分化率
は、同一の基本培地に同一種類・同一量の植物ホルモン
を添加して用いた場合でも、品種の違いにより０〜１０
０％の範囲で異なる値を示した（コールマンら：Colema
n et.al、1989 プラント・セル・レポート：Plant Cel
l Reports 8 459-462 ）。従って、研究者は、材料
とする植物と培養の目的によって、そのつど最も適した
条件を検索する必要があり、これが植物の組織培養の手
法を用いる場合に、解決すべき最も重要な課題となる。
しかし、木本植物の分野においては、野菜、花卉等の草
本植物と比べ、組織培養による増殖等の研究が進んでい
ないことから、不定芽分化を目的とする場合でも、現段
階では、草本植物であるタバコの不定芽分化等に用いら
れる条件を、培地中の植物ホルモン組成を変更しただけ
でそのまま用い、かかる条件下で比較的容易に不定芽分
化が起こる品種を材料として、モデル的な研究を行なう
にとどまっている。例えばハコヤナギ属においては、葉
からの不定芽分化による植物体の再生が報告されている
（フィラッティら：Fillatti et.al、1987 モレキュラ
・ジェネラル・ジェネティックス：Molecular GeneralG
enetics 206 192-199 ）が、実際に有用な樹種に関
して効率的な不定芽分化を起こさせるための、培地等の
培養条件について検討がなされている例は、極めて少な
い。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】［実施例１］無菌条件下、交雑ヤマナラシ
Ｙ６３（秋田十條化成（株）内実験林より採取）の無菌
フラスコ苗の茎を、節を含まないように長さ５ｍｍに切
断し、これをさらに縦に二つ割りにして、窒素源の組成
を、アンモニア態窒素濃度１０ｍＭ、硝酸態窒素濃度３
０ｍＭに変更したＭＳ寒天固体培地（シュークロース２
ｗ／ｖ％、ゼアチン０．５ｍｇ／ｌ、寒天０．８ｗ／ｖ
％）に置床し、温度２５℃、照度３０００ルクス（終
日）で１か月間培養したところ、置床した組織２４個中
２３個で不定芽の分化が認められた。これらをさらに約
１か月間、同様の条件下で培養し、この芽から伸長して
生じた茎葉が２〜３ｃｍになった頃に、やはり無菌条件
下、その茎の部分から切り取り、これを発根のため、ゼ
アチンに替えてＩＢＡ０．０５ｍｇ／ｌとした以外は上
記のものと同様の組成の培地に移植して、さらに培養を
続けて発根させたところ、移植後１か月後には６１個の
幼植物体を得ることができた。
Ｙ６３（秋田十條化成（株）内実験林より採取）の無菌
フラスコ苗の茎を、節を含まないように長さ５ｍｍに切
断し、これをさらに縦に二つ割りにして、窒素源の組成
を、アンモニア態窒素濃度１０ｍＭ、硝酸態窒素濃度３
０ｍＭに変更したＭＳ寒天固体培地（シュークロース２
ｗ／ｖ％、ゼアチン０．５ｍｇ／ｌ、寒天０．８ｗ／ｖ
％）に置床し、温度２５℃、照度３０００ルクス（終
日）で１か月間培養したところ、置床した組織２４個中
２３個で不定芽の分化が認められた。これらをさらに約
１か月間、同様の条件下で培養し、この芽から伸長して
生じた茎葉が２〜３ｃｍになった頃に、やはり無菌条件
下、その茎の部分から切り取り、これを発根のため、ゼ
アチンに替えてＩＢＡ０．０５ｍｇ／ｌとした以外は上
記のものと同様の組成の培地に移植して、さらに培養を
続けて発根させたところ、移植後１か月後には６１個の
幼植物体を得ることができた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】［実施例５］野外で生育している交雑ヤマ
ナラシＹ７９（秋田十條化成（株）内実験林より採取）
の萌芽前の枝を、よく洗浄した後、温度２５℃、照度３
０００ルクス（終日）の恒温室内で水ざしにして、萌芽
させた。そこから側芽を含む節の部分を切り出し、これ
を、有効塩素量１％の次亜塩素酸ソーダ溶液中に浸漬し
て撹拌しつつ１０分間殺菌を行い、無菌条件下に移し
て、滅菌水で洗浄後、実施例１と同様の不定芽分化培地
および条件で培養したところ不定芽の分化が認められ、
２か月後には置床した組織１個あたり、１〜５個の茎葉
が伸長してきた。次に、やはり無菌条件下、これらの茎
葉を切り取り、発根のため、２／３稀釈ＭＳゲランガム
固体培地（シュークロース２ｗ／ｖ％、ＩＢＡ０．０５
ｍｇ／ｌ、ゲランガム０．３ｗ／ｖ％）に移植して、さ
らに培養を続けて発根させ、幼植物体を得た。
ナラシＹ７９（秋田十條化成（株）内実験林より採取）
の萌芽前の枝を、よく洗浄した後、温度２５℃、照度３
０００ルクス（終日）の恒温室内で水ざしにして、萌芽
させた。そこから側芽を含む節の部分を切り出し、これ
を、有効塩素量１％の次亜塩素酸ソーダ溶液中に浸漬し
て撹拌しつつ１０分間殺菌を行い、無菌条件下に移し
て、滅菌水で洗浄後、実施例１と同様の不定芽分化培地
および条件で培養したところ不定芽の分化が認められ、
２か月後には置床した組織１個あたり、１〜５個の茎葉
が伸長してきた。次に、やはり無菌条件下、これらの茎
葉を切り取り、発根のため、２／３稀釈ＭＳゲランガム
固体培地（シュークロース２ｗ／ｖ％、ＩＢＡ０．０５
ｍｇ／ｌ、ゲランガム０．３ｗ／ｖ％）に移植して、さ
らに培養を続けて発根させ、幼植物体を得た。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】
【表２】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】しかも、本発明においては、窒素源の濃度
として、アンモニア態窒素と硝酸態窒素をそれぞれ一定
の濃度範囲に設定するだけで、既知の植物用培地を用い
ることができる。
として、アンモニア態窒素と硝酸態窒素をそれぞれ一定
の濃度範囲に設定するだけで、既知の植物用培地を用い
ることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】以上の本発明によりもたらされる効果は、
ヤマナラシ節に属する植物において、組織培養の手法に
より、商業目的のための種苗の大量生産の他、優れた形
質を有する個体の選抜のための、あるいは選抜された個
体の大量増殖、さらには有用遺伝子が導入された個体の
作出および大量増殖を、短期間で効率良く行うことを可
能とするものである。
ヤマナラシ節に属する植物において、組織培養の手法に
より、商業目的のための種苗の大量生産の他、優れた形
質を有する個体の選抜のための、あるいは選抜された個
体の大量増殖、さらには有用遺伝子が導入された個体の
作出および大量増殖を、短期間で効率良く行うことを可
能とするものである。
Claims (8)
- 【請求項１】 ハコヤナギ属（ Populus ）ヤマナラシ
節（Leuce ）に属する植物の組織を培養することによ
り、不定芽を経由して植物体を再生する方法において、
培地中の窒素源の濃度が、アンモニア態窒素濃度１ｍＭ
〜１５ｍＭかつ硝酸態窒素濃度１５〜５０ｍＭである培
地を用いて、培養組織から不定芽を分化させることを特
徴とする、植物体の生産方法。 - 【請求項２】 培養に供する植物が、交雑ヤマナラシ
（ポプルス・シーボルディ×ポプルス・グランディデン
タータ： Populus Sieboldii×Populus grandi dentata
）である、請求項１に記載の植物体の生産方法。 - 【請求項３】 培養に供する植物の組織が、植物の茎、
茎頂、頂芽、側芽および葉柄のうちいずれか一つより選
ばれたものである、請求項１または２に記載の植物体の
生産方法。 - 【請求項４】 不定芽分化のための培地として、窒素源
の濃度をアンモニア態窒素濃度１〜１５ｍＭかつ硝酸態
窒素濃度１５〜５０ｍＭに改変したムラシゲ・スクーグ
培地を用いる、請求項１、２、または３に記載の植物体
の生産方法。 - 【請求項５】 不定芽分化のための培地として、窒素源
の濃度をアンモニア態窒素濃度１〜１５ｍＭかつ硝酸態
窒素濃度１５〜５０ｍＭに改変したウッディ・プラント
培地を用いる、請求項１、２、または３に記載の植物体
の生産方法。 - 【請求項６】 不定芽分化のための培地として、窒素源
の濃度がアンモニア態窒素濃度５〜１０ｍＭかつ硝酸態
窒素濃度３０〜４０ｍＭであるものを用いる、請求項
１、２、３、４、または５に記載の植物体の生産方法。 - 【請求項７】 不定芽分化のための培地として、アンモ
ニア態窒素源と硝酸態窒素源のモル濃度比が、１：２〜
１：５の範囲にあるものを用いる、請求項１、２、３、
４、５または６に記載の植物体の生産方法。 - 【請求項８】 不定芽分化のための培地として、アンモ
ニア態窒素源と硝酸態窒素源のモル濃度比が、１：３で
あるものを用いる、請求項１、２、３、４、５、６また
は７に記載の植物体の生産方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6103749A JP2920185B2 (ja) | 1994-05-18 | 1994-05-18 | ヤマナラシ節に属する植物の植物体生産方法 |
| US08/443,161 US5654190A (en) | 1994-05-18 | 1995-05-17 | Process for producing plant belonging to the section leuce |
| CA002149705A CA2149705C (en) | 1994-05-18 | 1995-05-18 | Process for producing plant belonging to the section leuce |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6103749A JP2920185B2 (ja) | 1994-05-18 | 1994-05-18 | ヤマナラシ節に属する植物の植物体生産方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07308137A true JPH07308137A (ja) | 1995-11-28 |
| JP2920185B2 JP2920185B2 (ja) | 1999-07-19 |
Family
ID=14362233
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6103749A Expired - Fee Related JP2920185B2 (ja) | 1994-05-18 | 1994-05-18 | ヤマナラシ節に属する植物の植物体生産方法 |
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| JP (1) | JP2920185B2 (ja) |
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010087048A1 (ja) * | 2009-02-02 | 2010-08-05 | 日本製紙株式会社 | 遺伝子組換え植物の栽培方法 |
| CN103503774A (zh) * | 2013-09-30 | 2014-01-15 | 四川农业大学 | 一种响叶杨茎段组织培养获得再生植株的方法 |
| CN103636498A (zh) * | 2013-11-29 | 2014-03-19 | 黑龙江省林业科学研究所 | 山杨良种银×山1333组织培养基 |
| CN105941164A (zh) * | 2016-07-14 | 2016-09-21 | 大连民族大学 | 一种吴屯杨微繁的方法 |
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| US7049481B1 (en) * | 1999-05-21 | 2006-05-23 | Board Of Control Of Michigan Technological University | Cellulose synthase encoding polynucleotides and uses thereof |
| US7674951B1 (en) | 1999-05-21 | 2010-03-09 | Michigan Technological University | Isolated cellulose synthase promoter regions |
| JP3985474B2 (ja) * | 2001-07-24 | 2007-10-03 | 日本製紙株式会社 | 遺伝子導入効率を向上させたユーカリ属の植物への遺伝子導入方法 |
| US8129585B2 (en) * | 2005-08-03 | 2012-03-06 | Michigan Technological University | Methods for enhancing expression of secondary cell wall cellulose synthases in plants |
| CN102919128A (zh) * | 2012-11-14 | 2013-02-13 | 东北林业大学 | 欧美杂种山杨组培苗瓶外袋生根方法 |
| CN103202231B (zh) * | 2013-04-25 | 2016-03-16 | 陕西理工学院 | 灰杨组培体系的建立方法 |
| CN103875536B (zh) * | 2014-04-16 | 2015-08-12 | 河北农业大学 | 一种多氯联苯暴露条件下毛白杨基因分析材料的获取方法 |
-
1994
- 1994-05-18 JP JP6103749A patent/JP2920185B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-05-17 US US08/443,161 patent/US5654190A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-18 CA CA002149705A patent/CA2149705C/en not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| WO2010087048A1 (ja) * | 2009-02-02 | 2010-08-05 | 日本製紙株式会社 | 遺伝子組換え植物の栽培方法 |
| JP5362748B2 (ja) * | 2009-02-02 | 2013-12-11 | 日本製紙株式会社 | 遺伝子組換え植物の栽培方法 |
| US9353379B2 (en) | 2009-02-02 | 2016-05-31 | Nippon Paper Industries Co., Ltd. | Method for cultivation of genetically-modified plant |
| CN103503774A (zh) * | 2013-09-30 | 2014-01-15 | 四川农业大学 | 一种响叶杨茎段组织培养获得再生植株的方法 |
| CN103636498A (zh) * | 2013-11-29 | 2014-03-19 | 黑龙江省林业科学研究所 | 山杨良种银×山1333组织培养基 |
| CN103636498B (zh) * | 2013-11-29 | 2015-12-02 | 黑龙江省林业科学研究所 | 山杨良种银×山1333组织培养基 |
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| CN115088621A (zh) * | 2022-07-18 | 2022-09-23 | 南京林业大学 | 一种利用抽真空处理促进杨树外植体大量、快速分化成芽的方法 |
| CN115088621B (zh) * | 2022-07-18 | 2023-09-26 | 南京林业大学 | 一种利用抽真空处理促进杨树外植体大量、快速分化成芽的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| CA2149705C (en) | 2004-01-20 |
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