JP5362748B2 - 遺伝子組換え植物の栽培方法 - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子組換え植物の栽培方法に関し、詳しくは、所望の目的タンパク質を高発現するように形質転換された遺伝子組換え植物の栽培方法および所望の目的タンパク質を含む種子を生産する方法に関する。
植物の品種改良法として、遺伝子組換え技術が応用され、すでに、除草剤耐性や害虫耐性などの機能が付加された大豆、トウモロコシ、ナタネ、ワタ、ジャガイモ等の遺伝子組換え農作物が開発され実用化されている。さらに近年では、医薬または検査薬等の機能性タンパク質やペプチドを生産する手段として、有用な外来遺伝子を植物の染色体上に導入し、遺伝子組換え植物を作出する研究開発も進められている。なお、遺伝子組換え植物を用いて生産する機能性成分には、導入した遺伝子の産物であるタンパク質やペプチドだけでなく、例えば導入した酵素タンパク質の反応による生成物等も含まれる。植物での機能性成分生産には多くの利点があり、特に、動物トランスジェニック系に比べてコストが削減されること、市場規模に応じた生産規模の調節が容易なこと、ウイルスおよびプリオンなどの動物由来病原体が混入する恐れがないことがある。
機能性成分を効率的に植物で生産する技術に関しては、例えば、機能性成分の発現の時期、発現の場所、発現量を制御するために、機能性成分を蓄積する組織に特異的なプロモーターを遺伝子組換えに利用する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
しかしながら、機能性成分を植物体内に高蓄積させる技術を開発する場合、上記の特許文献１では、機能性成分を高発現させるプロモーターを遺伝子組換えに利用する技術に留まり、機能性成分の生産性という観点からは未だ改良の余地がある。
上記のような状況に鑑み、本発明は、所望の機能性成分を発現するように形質転換された遺伝子組換え植物を用いて、所望の機能性成分をより収量性を高く生産できる方法を提供することを目的とする。なお、本明細書において、遺伝子組換え植物に高発現させることを所望する任意のタンパク質やペプチドのことを「目的タンパク質」という場合がある。
本発明者らは、鋭意研究を進めたところ、所定の高窒素栽培条件下で発現量が増えるＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質を検出することに成功した。さらに、本発明者らは、この検出方法により得られたＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の発現を調節するプロモーターを単離し、このプロモーターとその下流に所望の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入した遺伝子組換え植物の作製に成功すると共に、このような遺伝子組換え植物を所定の高窒素栽培条件下で栽培することにより、目的タンパク質を収量性高く生産させることに成功した。本発明は、下記遺伝子組換え植物の栽培方法および種子の生産方法を提供するものである。なお、本明細書において「植物の栽培」の用語は、「植物の生産」と置き換え得る。
〔１〕下記式（１）：
Ｖ／Ｗ＞１．０ ・・・（１）
（但し、式（１）において、Ｖは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地にて所定の植物を栽培した場合における該植物の種子に含まれるＲＮＡ量である。Ｗは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、窒素０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地にて該植物を栽培した場合における該植物の種子に含まれるＲＮＡ量である。）
を満たす種子で発現するＲＮＡの発現を調節するプロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む発現ベクターが導入されて形質転換された遺伝子組換え植物を、該遺伝子組換え植物の開花予定日の３０日前から開花日まで間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるよう調整した培地にて栽培することを含む、遺伝子組換え植物の栽培方法。
〔２〕下記式（２）：
Ｘ／Ｙ＞１．０ ・・・（２）
（但し、式（２）において、Ｘは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地にて所定の植物を栽培した場合における該植物の種子に含まれる種子貯蔵タンパク質の含有量である。Ｙは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、窒素０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地にて該植物を栽培した場合における該植物の種子に含まれる該種子貯蔵タンパク質の含有量である。）
を満たす種子貯蔵タンパク質の発現を調節するプロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む発現ベクターが導入されて形質転換された遺伝子組換え植物を、該遺伝子組換え植物の開花予定日の３０日前から開花日まで間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるよう調整した培地にて栽培することを含む、遺伝子組換え植物の栽培方法。
〔３〕前記所定の植物と前記遺伝子組換え植物とが、同種の植物種である、上記〔１〕および〔２〕に記載の遺伝子組換え植物の栽培方法。
〔４〕前記所定の植物がイネ科の植物であり、前記遺伝子組換え植物がイネ科の植物である、上記〔３〕に記載の遺伝子組換え植物の栽培方法。
〔５〕前記プロモーターが、グルテリン、グロブリン、およびプロラミンからなる群より選ばれる種子貯蔵タンパク質の発現を調節するプロモーターである、上記〔４〕に記載の遺伝子組換え植物の栽培方法。
〔６〕前記遺伝子組換え植物の栽培を、水耕栽培によって行う、上記〔１〕から〔５〕のいずれか一項に記載の遺伝子組換え植物の栽培方法。
〔７〕上記〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載の遺伝子組換え植物を栽培し、種子を採集することを含む、種子の生産方法。
〔８〕前記植物がイネであり、前記種子が米である、上記〔７〕に記載の種子の生産方法。
Ｖ／Ｗ＞１．０ ・・・（１）
（但し、式（１）において、Ｖは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地にて所定の植物を栽培した場合における該植物の種子に含まれるＲＮＡ量である。Ｗは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、窒素０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地にて該植物を栽培した場合における該植物の種子に含まれるＲＮＡ量である。）
を満たす種子で発現するＲＮＡの発現を調節するプロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む発現ベクターが導入されて形質転換された遺伝子組換え植物を、該遺伝子組換え植物の開花予定日の３０日前から開花日まで間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるよう調整した培地にて栽培することを含む、遺伝子組換え植物の栽培方法。
〔２〕下記式（２）：
Ｘ／Ｙ＞１．０ ・・・（２）
（但し、式（２）において、Ｘは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地にて所定の植物を栽培した場合における該植物の種子に含まれる種子貯蔵タンパク質の含有量である。Ｙは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、窒素０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地にて該植物を栽培した場合における該植物の種子に含まれる該種子貯蔵タンパク質の含有量である。）
を満たす種子貯蔵タンパク質の発現を調節するプロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む発現ベクターが導入されて形質転換された遺伝子組換え植物を、該遺伝子組換え植物の開花予定日の３０日前から開花日まで間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるよう調整した培地にて栽培することを含む、遺伝子組換え植物の栽培方法。
〔３〕前記所定の植物と前記遺伝子組換え植物とが、同種の植物種である、上記〔１〕および〔２〕に記載の遺伝子組換え植物の栽培方法。
〔４〕前記所定の植物がイネ科の植物であり、前記遺伝子組換え植物がイネ科の植物である、上記〔３〕に記載の遺伝子組換え植物の栽培方法。
〔５〕前記プロモーターが、グルテリン、グロブリン、およびプロラミンからなる群より選ばれる種子貯蔵タンパク質の発現を調節するプロモーターである、上記〔４〕に記載の遺伝子組換え植物の栽培方法。
〔６〕前記遺伝子組換え植物の栽培を、水耕栽培によって行う、上記〔１〕から〔５〕のいずれか一項に記載の遺伝子組換え植物の栽培方法。
〔７〕上記〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載の遺伝子組換え植物を栽培し、種子を採集することを含む、種子の生産方法。
〔８〕前記植物がイネであり、前記種子が米である、上記〔７〕に記載の種子の生産方法。
本発明によれば、所望の目的タンパク質をより収量性高く生産することができる。
本発明の遺伝子組換え植物の栽培方法は、所定の特徴を備える遺伝子組換え植物を所定の条件下で栽培するものである。そこで、以下、本発明の実施形態について、下記の順を追って詳説することとする。
１．遺伝子組換え植物の作製方法
２．遺伝子組換え植物の栽培方法および種子の生産方法
１．遺伝子組換え植物の作製方法
２．遺伝子組換え植物の栽培方法および種子の生産方法
１．遺伝子組換え植物の作製方法
本発明において用いられる遺伝子組換え植物を作製する方法は、概要として次の工程Ａと工程Ｂの２つの工程に分けることができる。工程Ａは、所定の植物において、高窒素栽培条件下で高発現するＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質を検出する工程である。工程Ｂは、高窒素栽培条件下で高発現するＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の発現を調節するプロモーターを単離し、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを調製し、その発現ベクターを宿主植物細胞に導入して遺伝子組換え植物を作製する工程である。
本発明において用いられる遺伝子組換え植物を作製する方法は、概要として次の工程Ａと工程Ｂの２つの工程に分けることができる。工程Ａは、所定の植物において、高窒素栽培条件下で高発現するＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質を検出する工程である。工程Ｂは、高窒素栽培条件下で高発現するＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の発現を調節するプロモーターを単離し、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを調製し、その発現ベクターを宿主植物細胞に導入して遺伝子組換え植物を作製する工程である。
＜工程Ａ：ＲＮＡの検出＞
工程ＡのＲＮＡの検出においては、少なくとも２つの異なる窒素条件下で植物を栽培し、ＲＮＡの含有量の違いを指標として、ある植物種において所定の高窒素栽培条件下で高発現するＲＮＡを検出するものである。
工程ＡのＲＮＡの検出方法の実施形態としては、下記式（１）を満たすＲＮＡを検出する。
Ｖ／Ｗ＞１．０ ・・・（１）
（但し、式（１）において、Ｖは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地にて所定の植物を栽培した場合における該植物の種子に含まれるＲＮＡ量である。Ｗは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、窒素０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地にて該植物を栽培した場合における該植物の種子に含まれるＲＮＡ量である。）
工程ＡのＲＮＡの検出においては、少なくとも２つの異なる窒素条件下で植物を栽培し、ＲＮＡの含有量の違いを指標として、ある植物種において所定の高窒素栽培条件下で高発現するＲＮＡを検出するものである。
工程ＡのＲＮＡの検出方法の実施形態としては、下記式（１）を満たすＲＮＡを検出する。
Ｖ／Ｗ＞１．０ ・・・（１）
（但し、式（１）において、Ｖは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地にて所定の植物を栽培した場合における該植物の種子に含まれるＲＮＡ量である。Ｗは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、窒素０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地にて該植物を栽培した場合における該植物の種子に含まれるＲＮＡ量である。）
上記式（１）を満たすＲＮＡは、高窒素栽培条件下で高発現するＲＮＡである。このようにして検出されたＲＮＡの情報から高窒素栽培条件下でＲＮＡの発現を促進するプロモーターなどの発現調節領域を採集することができる。
＜工程Ａ：種子貯蔵タンパク質の検出＞
工程Ａの種子貯蔵タンパク質の検出においては、少なくとも２つの異なる窒素条件下で植物を栽培し、種子貯蔵タンパク質の蓄積量の違いを指標として、ある植物種において所定の高窒素栽培条件下で高発現する種子貯蔵タンパク質を検出するものである。
工程Ａの種子貯蔵タンパク質の検出方法の実施形態としては、下記式（２）を満たす種子貯蔵タンパク質を検出する。
Ｘ／Ｙ＞１．０ ・・・（２）
（但し、式（２）において、Ｘは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地で植物を栽培したときの該植物の種子貯蔵タンパク質含有量である。Ｙは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、窒素０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地で植物を栽培したときの該植物の種子貯蔵タンパク質含有量である。）
＜工程Ａ：種子貯蔵タンパク質の検出＞
工程Ａの種子貯蔵タンパク質の検出においては、少なくとも２つの異なる窒素条件下で植物を栽培し、種子貯蔵タンパク質の蓄積量の違いを指標として、ある植物種において所定の高窒素栽培条件下で高発現する種子貯蔵タンパク質を検出するものである。
工程Ａの種子貯蔵タンパク質の検出方法の実施形態としては、下記式（２）を満たす種子貯蔵タンパク質を検出する。
Ｘ／Ｙ＞１．０ ・・・（２）
（但し、式（２）において、Ｘは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地で植物を栽培したときの該植物の種子貯蔵タンパク質含有量である。Ｙは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、窒素０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地で植物を栽培したときの該植物の種子貯蔵タンパク質含有量である。）
上記式（２）を満たす種子貯蔵タンパク質は、高窒素栽培条件下で高発現する種子貯蔵タンパク質である。このようにして検出された種子貯蔵タンパク質の情報から高窒素栽培条件下で種子貯蔵タンパク質の発現を促進するプロモーターなどの発現調節領域を採集することができる。
＜被検対象の植物＞
工程Ａにおける「所定の植物」とは、被検対象とする植物のことを意味する。工程Ａにおいて被検対象とする植物は、ＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の発現を促進するプロモーターを探索する対象とする植物であり、後に作製する遺伝子組換え植物の種類等の条件も参酌しつつ、適宜選択してよい。ＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の検出対象となる植物としては、種子が形成されるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、双子葉植物としては、タバコ、ナタネ、ダイズ等を、単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ等の穀類や、アスパラガス等を、代表的なものとして挙げることができる。これらのうちでもイネは、種子中へのタンパク質の蓄積能力が高く、種子の保存性が良好という点で好適な植物である。
工程Ａにおける「所定の植物」とは、被検対象とする植物のことを意味する。工程Ａにおいて被検対象とする植物は、ＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の発現を促進するプロモーターを探索する対象とする植物であり、後に作製する遺伝子組換え植物の種類等の条件も参酌しつつ、適宜選択してよい。ＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の検出対象となる植物としては、種子が形成されるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、双子葉植物としては、タバコ、ナタネ、ダイズ等を、単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ等の穀類や、アスパラガス等を、代表的なものとして挙げることができる。これらのうちでもイネは、種子中へのタンパク質の蓄積能力が高く、種子の保存性が良好という点で好適な植物である。
＜栽培条件＞
被検対象となる植物は、少なくとも２つの異なる窒素条件下で栽培される。好ましい実施形態としては、第１の栽培条件および第２の栽培条件で栽培を行う。第１の栽培条件下は、供給される窒素濃度が高い条件下である。他方、第２の栽培条件は、第１の栽培条件より相対的に窒素濃度の低い条件下である。具体的には、次のような条件が例示される。
被検対象となる植物は、少なくとも２つの異なる窒素条件下で栽培される。好ましい実施形態としては、第１の栽培条件および第２の栽培条件で栽培を行う。第１の栽培条件下は、供給される窒素濃度が高い条件下である。他方、第２の栽培条件は、第１の栽培条件より相対的に窒素濃度の低い条件下である。具体的には、次のような条件が例示される。
第１の栽培条件：開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間に、硝酸態窒素が５０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が５０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるよう調整した培地で栽培する。
第２の栽培条件：開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間に、窒素０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌとなるよう調整した培地で栽培する。
培地中の窒素条件は、開花予定日の３０日前の時点から開始する。開花予定日は植物ごとに異なるが、栽培作物類でのどの時点かは各植物ごとに研究がなされている。例えば、イネの場合であれば、開花予定日の３０日前は、幼穂分化期に該当する。
培地中の窒素条件は、開花予定日の３０日前から開花日の間の一定期間において調整する。この期間中に少なくとも一度高窒素条件に植物を曝し、一定の生理的刺激を与えることが重要である。すなわち、ここでいう「一定期間」とは、植物に対し一定の生理的刺激を与えるに足る期間でよい。高窒素条件にする期間は、植物の生育状態や植物の種類などの条件によって適宜調整してよい。植物の生育状態や植物の種類などの条件によっても異なるが、好ましくは１週間程度、より好ましくは２週間程度、高窒素栽培条件下で栽培することが好ましい。また、開花予定日の３０日前を経過した直後および／または開花の直前の一定期間に高窒素栽培条件下に植物をおくことが好ましい。イネの場合、開花予定日の３０日前から開花日までの全期間に渡って高窒素栽培条件下に置いてもよい。
植物の栽培においては、植物による養分の吸収や、培地の肥料を保持する能力等に起因して、培地中の窒素濃度は容易に変動する。上記第１および第２の栽培条件では、培地中の窒素濃度を常に一定に保つ必要は必ずしもなく、上記の濃度範囲の間に収まるように施肥管理を行えばよい。培地中の窒素濃度を上記のように管理する限りにおいて、施肥のタイミング、回数、肥料の濃度などは適宜調整してよい。
また、培地中の窒素濃度の測定は、培地の種類などに応じて、硝酸イオンメーターやアンモニア態窒素メーター、また、農林水産省が定める肥料分析法などの、一般的な、土壌分析法、肥料分析法に基づき行うことができる。
硝酸態窒素とは、硝酸イオンのように酸化窒素の形態で存在する窒素成分のことである。通常はＮＯ３ −の形の硝酸イオンに金属が結合した硝酸塩の形で存在している。
また、アンモニウム態窒素とは、窒素成分のうちアンモニウム塩の形態で存在する窒素成分のことである。
また、アンモニウム態窒素とは、窒素成分のうちアンモニウム塩の形態で存在する窒素成分のことである。
培地中の窒素源の調整は、培地中の硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、培地中のアンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるように行う。すなわち、硝酸態窒素とアンモニウム態窒素の両方を窒素源として用い、それらの濃度をそれぞれ調整してもよいし、いずれか一方のみを窒素源として用い、その濃度を調整してもよい。好ましくは、両者を窒素源として用いる。硝酸態窒素とアンモニウム態窒素の含有量の比率は、例えば、７５０：０〜０：７５０、好ましくは１００：１〜１：１００であり、より好ましくは３０：１〜１：３０であり、より好ましくは１０：１〜１：１０であり、さらに好ましくは、３：１〜１：３程度である。
第１の栽培条件における硝酸態窒素の含有量は、７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌであり、好ましくは１００ｍｇ／Ｌ〜７００ｍｇ／Ｌであり、より好ましくは１５０ｍｇ／Ｌ〜７００ｍｇ／Ｌである。硝酸態窒素の含有量を７０ｍｇ／Ｌ以下に調整した場合、種子貯蔵タンパク質含有量が減少し、第２の栽培条件の場合と比較する適切な指標を得にくくなりやすい。他方、硝酸態窒素の含有量を７５０ｍｇ／Ｌ以上に調整した場合、根腐れを起こし生育不良となりやすい。
第１の栽培条件におけるアンモニウム態窒素の含有量は、７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌであり、好ましくは１００ｍｇ／Ｌ〜７００ｍｇ／Ｌであり、より好ましくは１５０ｍｇ／Ｌ〜７００ｍｇ／Ｌである。アンモニウム態窒素の含有量を７０ｍｇ／Ｌ以下に調整した場合、種子の貯蔵タンパク質含有量が減少し、第２の栽培条件の場合と比較する適切な指標を得にくくなりやすい。他方、アンモニウム態窒素の含有量を７５０ｍｇ／Ｌ以上に調整した場合、根腐れを起こし生育不良となりやすい。
上記のように、異なる所定の窒素条件下とする以外の点については、栽培する植物の種類などに応じ、適宜その植物に適した施肥管理を行ってよい。培地に含まれる他の成分としては、リン、カリウム、マンガン、ホウ素、鉄、カルシウム、銅、亜鉛、マグネシウム等が挙げられる。
植物の栽培は、水耕栽培または土耕栽培が挙げられる。土耕栽培では、土中に肥料成分が吸着されるため、肥料成分の急激な変動を抑制できるという利点があるが、その反面、植物が利用できる肥料成分が減少してしまう。他方、水耕栽培では、培地中の肥料成分はすべて植物が利用できる状態である。本発明の植物の選抜方法では、窒素を所定の条件に整えるように施肥管理を行う必要があるため、水耕栽培の方が培地中の肥料成分を調整しやすいという点においては、より好ましい。
＜種子に含まれるＲＮＡの測定およびＲＮＡの決定＞
上記第１および第２の栽培条件下でそれぞれ栽培された植物から得られた種子に含まれるＲＮＡを測定する。第１の栽培条件下で栽培された植物の種子に含まれるＲＮＡ量をＶ、第２の栽培条件下で栽培された植物の種子含まれるＲＮＡ量をＷとする。
上記第１および第２の栽培条件下でそれぞれ栽培された植物から得られた種子に含まれるＲＮＡを測定する。第１の栽培条件下で栽培された植物の種子に含まれるＲＮＡ量をＶ、第２の栽培条件下で栽培された植物の種子含まれるＲＮＡ量をＷとする。
上記ＲＮＡ含有量ＶおよびＷは、様々な公知のＲＮＡ検出方法を利用し得る。一実施形態としては、例えば、次のようにマイクロアレイを利用して、ＲＮＡ量を測定することができる。まず、種子からＲＮＡを抽出し、蛍光標識をしたｃＤＮＡを合成した後に、マイクロアレイ上のＤＮＡ断片とハイブリダイズさせる。スキャナーを用いてマイクロアレイ画像を取り込んだ後、解析ソフトを用いて各スポットの蛍光強度を算出する。算出されたスポット強度からＲＮＡ量を求めることができる。ＲＮＡを抽出する種子としては、ＲＮＡが盛んに合成されている開花後１５日から開花後２５日までの種子が望ましい。
測定対象とするＲＮＡは、種子に含まれるＲＮＡであればよい。Ｖ／Ｗ値を求めるためのＲＮＡとしては、例えば、イネの場合であれば、例えば、ＡＫ１０１４９７、ＡＫ１２０８２６、ＡＪ００２８９３、Ｏｓ０５ｇ０３２９２００、ＡＫ１０７２７１（グルテリンＡ−３）、ＡＫ１０２１９４、ＡＫ１２０６９７、ＡＫ０６７１４１、ＡＫ０６５００９、ＡＦ０１７３６０、ＡＫ０７１２０５、ＡＫ０５９１６４、ＡＫ１０７２３８、ＡＢ０１６５０５、ＡＫ０９９０８６、ＡＹ１６６４５８、ＡＹ９８７３９０（グルテリンＢ−２）、ＡＫ１０７３１４、Ｘ１５８３３、ＡＹ１９６９２３（グルテリンＢ−５）、ＡＫ０６１８９４、ＡＫ１０７３４３（グルテリンＢ−１）、ＡＫ０６３９９５、Ｊ１０００４１Ｃ２３、Ｊ０９０００９Ｉ０７、ＡＫ０６５４５６、ＡＫ１０７３１４、ＡＫ１０７６３３、Ｕ４３５３０、ＡＫ０６４３１０、ＡＫ０６４４８５、ＡＫ１０１３０９、ＡＫ１０７９８３、ＡＫ０９９９１８、ＡＫ１００３０６、Ｘ８３４３４、ＡＫ０７０４１４、ＡＫ１０３２２０、ＡＫ１２１８５６、ＡＫ０６２７５８、ＡＫ１０３３０６、ＡＫ０６１２０７、ＡＫ０６８２６６、Ｏｓ０６ｇ０５９８５００、ＡＫ１１９９００、Ｌ１９５９８、ＡＫ０７０８５１、Ｏｓ０１ｇ０８４０３００、ＡＫ０５９８０５、ＡＫ１０６２４４、ＡＫ１０８１２７、ＡＫ１０８２３０、ＡＫ０６１２３７、ＡＫ０６２５１７、ＡＫ０６５２５９、ＡＫ０６５６０４、ＡＫ１０６９６４、ＡＫ０６０９８３、Ｊ０７５０７４Ｇ０８、ＡＫ０９９７１９（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．）、グルテリン、グロブリン、プロラミンなどが挙げられる。
ＲＮＡ含有量ＶおよびＷに基づき、下記式（１）：
Ｖ／Ｗ＞１．０ ・・・（１）
を満たすＲＮＡを選抜する。式（１）を満たすということは、所定の高窒素栽培条件下において発現量が多くなるＲＮＡである蓋然性が高い。また、このようなＲＮＡをコードするＤＮＡのプロモーターは、高窒素栽培条件下でタンパク質の発現をより促進する蓋然性が高い。Ｖ／Ｗの値は、好ましくは１．２５以上であり、より好ましくは１．５以上であり、さらに好ましくは２．０以上である。他方、Ｖ／Ｗの値が１以下の場合、培地中の窒素量を増やしても、所望の目的タンパク質を高生産させる効果は期待できない。
Ｖ／Ｗ＞１．０ ・・・（１）
を満たすＲＮＡを選抜する。式（１）を満たすということは、所定の高窒素栽培条件下において発現量が多くなるＲＮＡである蓋然性が高い。また、このようなＲＮＡをコードするＤＮＡのプロモーターは、高窒素栽培条件下でタンパク質の発現をより促進する蓋然性が高い。Ｖ／Ｗの値は、好ましくは１．２５以上であり、より好ましくは１．５以上であり、さらに好ましくは２．０以上である。他方、Ｖ／Ｗの値が１以下の場合、培地中の窒素量を増やしても、所望の目的タンパク質を高生産させる効果は期待できない。
＜種子貯蔵タンパク質含有量の測定および種子貯蔵タンパク質の決定＞
上記第１および第２の栽培条件下でそれぞれ栽培された植物から得られた種子に貯蔵されるタンパク質を測定する。第１の栽培条件下で栽培された植物の種子貯蔵タンパク質含有量をＸ、第２の栽培条件下で栽培された植物の種子貯蔵タンパク質含有量をＹとする。
上記第１および第２の栽培条件下でそれぞれ栽培された植物から得られた種子に貯蔵されるタンパク質を測定する。第１の栽培条件下で栽培された植物の種子貯蔵タンパク質含有量をＸ、第２の栽培条件下で栽培された植物の種子貯蔵タンパク質含有量をＹとする。
上記種子貯蔵タンパク質含有量ＸおよびＹは、様々な公知のタンパク質検出方法を利用し得る。一実施形態としては、例えば、次のように電気泳動法を利用して、タンパク質含有量を測定することができる。まず、二次元ゲル電気泳動法により各種子貯蔵タンパク質をゲル上で単一のスポットに分離する。次に、ゲルの情報をスキャナーで画像ファイルに変換した後、画像解析ソフトを用いて、各スポットの蛍光強度として算出する。算出されたスポット強度からタンパク質含有量を求めることができる。タンパク質を抽出する種子としては、種子貯蔵タンパク質が十分に蓄積される開花後３０日以降、好ましくは開花後４５日以降の種子が望ましい。
測定対象とするタンパク質は、種子貯蔵タンパクであればよい。Ｘ／Ｙ値を求めるための種子貯蔵タンパク質としては、例えば、イネの場合であれば、例えば、グルテリン、グロブリン、プロラミンタンパク質などが挙げられ、より具体的には、グルテリンＢ−１、グルテリンＢ−２、グルテリンＢ−５、グルテリンＡ−３、グロブリン、１３ＫＤａプロラミンなどが挙げられる。
種子貯蔵タンパク質含有量ＸおよびＹに基づき、下記式（２）：
Ｘ／Ｙ＞１．０ ・・・（２）
を満たす種子貯蔵タンパク質を選抜する。式（２）を満たすということは、所定の高窒素栽培条件下において発現量が多くなる種子貯蔵タンパク質である蓋然性が高い。また、このような種子貯蔵タンパク質のプロモーターは、高窒素栽培条件下でタンパク質の発現をより促進する蓋然性が高い。Ｘ／Ｙの値は、好ましくは１．５以上であり、より好ましくは２．０以上である。他方、Ｘ／Ｙの値が１以下の場合、培地中の窒素量を増やしても、所望の目的タンパク質を高生産させる効果は期待できない。
Ｘ／Ｙ＞１．０ ・・・（２）
を満たす種子貯蔵タンパク質を選抜する。式（２）を満たすということは、所定の高窒素栽培条件下において発現量が多くなる種子貯蔵タンパク質である蓋然性が高い。また、このような種子貯蔵タンパク質のプロモーターは、高窒素栽培条件下でタンパク質の発現をより促進する蓋然性が高い。Ｘ／Ｙの値は、好ましくは１．５以上であり、より好ましくは２．０以上である。他方、Ｘ／Ｙの値が１以下の場合、培地中の窒素量を増やしても、所望の目的タンパク質を高生産させる効果は期待できない。
以上のようにして、所定の高窒素栽培条件下において発現量が多くなるＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質を選抜し得る。また、選抜されたＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質のプロモーターは、高窒素栽培条件下でタンパク質の発現をより促進する。このようなプロモーターは以下に説明する遺伝子組換え植物に導入することにより、所定の高窒素栽培条件下で所望の目的タンパク質を高発現する遺伝子組換え植物の材料となり得る。
＜工程Ｂ：形質転換体の作製＞
工程Ｂでは、まず高窒素栽培条件下で高発現するＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の発現を調節するプロモーターを単離する。このようなプロモーターは、例えば、上記工程Ａで被検対象とされ、高窒素栽培条件下で高発現するＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質が検出された植物から単離することができる。プロモーターは、ＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質をコードする核酸の上流に位置する発現調節領域から単離し得る。
工程Ｂでは、まず高窒素栽培条件下で高発現するＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の発現を調節するプロモーターを単離する。このようなプロモーターは、例えば、上記工程Ａで被検対象とされ、高窒素栽培条件下で高発現するＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質が検出された植物から単離することができる。プロモーターは、ＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質をコードする核酸の上流に位置する発現調節領域から単離し得る。
ＲＮＡ並びに種子貯蔵タンパク質およびそれをコードする核酸配列については既知のデータベースなどにより様々なものが知られている。ＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の発現を調節するプロモーターの位置および配列もまた公知となっている場合がある。本発明においては、公知の配列を利用してプロモーターを特定してもよいし、工程Ａで選抜されたＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質をコードする核酸配列を探索し、その上流の核酸配列をプロモーターとして利用してもよい。プロモーターの特定は、例えば、転写領域の上流部にあるＴＡＴＡボックス、ＣＣＡＡＴボックス、ＧＣリッチな配列などのプロモーターに共通的に観察される配列を手がかりに特定してもよいし、既知のタンパク質をコードする核酸とプロモーターと推察される核酸配列を連結し、既知のタンパク質の発現量を測定して特定してもよい。
＜発現ベクターの構築＞
目的タンパク質を発現させるための発現ベクターを構築する。発現ベクターは、少なくとも上記のようにして特定されたプロモーターと目的タンパク質をコードする核酸とを含む。発現ベクターにはその他にもターミネーター、公知の発現促進配列、マーカー配列などを挿入してもよい。
目的タンパク質を発現させるための発現ベクターを構築する。発現ベクターは、少なくとも上記のようにして特定されたプロモーターと目的タンパク質をコードする核酸とを含む。発現ベクターにはその他にもターミネーター、公知の発現促進配列、マーカー配列などを挿入してもよい。
上記のようにして特定されたプロモーターは、ベクターに組み込めるように調製する。プロモーターは、選抜された植物の細胞から単離してもよいし、また配列を特定し、合成してもよい。ベクターは植物細胞への導入に適したものが好ましい。またベクターは公知または市販のものを利用し得る。
目的タンパク質は、種子中に高発現させることを予定する任意のタンパク質やペプチドでよい。好ましい一実施形態としては、所謂機能性タンパク質などが挙げられる。機能性タンパク質とは、抗菌成分、酵素等の人類にとって有用なタンパク質を意味する。目的タンパク質をコードする核酸は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのクローニングなどの手法によって得ることができる。また、予めそのＤＮＡ配列が明らかにされているものであれば、これらを化学合成して得てもよい。さらに、ＤＮＡ配列が明らかでなくとも、アミノ酸配列が明らかであれば、アミノ酸配列から推定されるＤＮＡ配列を化学合成し得る。
プロモーターの下流に目的タンパク質をコードする核酸を配置し、これをベクター内に挿入し、発現ベクターを作製できる。核酸断片を所定の位置で切断、結合させる方法は、公知の制限酵素等を利用することにより可能である。
ベクターの構築に関する一実施形態を図３を参照しつつ、説明する。
まず、ステップ（Ｓ１）として、工程Ａで選抜された植物の細胞に含まれる染色体Ｇに含まれるプロモーター（ｐｍｒ１）を単離する。プロモーター（ｐｍｒ１）は、ターミネーター（ｔｍｒ１）と共にタンパク質（ｐｔｎ１）の発現を調整する領域を構成している。この染色体からＰＣＲなどの手法により、プロモーター（ｐｍｒ１）とターミネーター（ｔｍｒ１）を増幅する。ＰＣＲプライマーは、染色体Ｇにおいてプロモーター（ｐｍｒ１）およびターミネーター（ｔｍｒ１）をそれぞれ挟む前後の配列に基づいて適宜設計できる。
まず、ステップ（Ｓ１）として、工程Ａで選抜された植物の細胞に含まれる染色体Ｇに含まれるプロモーター（ｐｍｒ１）を単離する。プロモーター（ｐｍｒ１）は、ターミネーター（ｔｍｒ１）と共にタンパク質（ｐｔｎ１）の発現を調整する領域を構成している。この染色体からＰＣＲなどの手法により、プロモーター（ｐｍｒ１）とターミネーター（ｔｍｒ１）を増幅する。ＰＣＲプライマーは、染色体Ｇにおいてプロモーター（ｐｍｒ１）およびターミネーター（ｔｍｒ１）をそれぞれ挟む前後の配列に基づいて適宜設計できる。
次にステップ（Ｓ２）として、増幅して得られたプロモーター（ｐｍｒ１）とターミネーター（ｔｍｒ１）の間に、目的タンパク質をコードする核酸（ｐｔｎ２）を挟む核酸断片（Ｆ２）を構築する。
さらにステップ（Ｓ３）として、ステップ（Ｓ２）で得られた核酸断片（Ｆ２）をプラスミドベクター（ｖｃｔ）に組み込む。このようにして、発現ベクターを構築できる。
＜宿主とする植物＞
上記のようにして作製されたベクターが導入される宿主としては、遺伝子組換え植物として目的タンパク質を生産する植物の細胞が用いられる。宿主とする植物の種類は、上記のプロモーターが認識され、目的タンパク質を発現し得るものであればよく、その他の点について限定されるものではない。宿主とする植物は、栽培管理の容易さ、栽培地の環境、成育期間、収穫の容易性、並びに、種子の性質、大きさ及び収量などの条件を考慮し、目的タンパクの生産面から好適なものを適宜選択してよい。また、上記にて取得したＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の発現を促進するプロモーターの由来と同じ種類の植物を宿主とすることにより、遺伝子発現システム上の弊害は避けやすい。そのため、好ましい一実施形態としては、プロモーターの由来と同じ植物種を宿主として選択する形態が挙げられる。
上記のようにして作製されたベクターが導入される宿主としては、遺伝子組換え植物として目的タンパク質を生産する植物の細胞が用いられる。宿主とする植物の種類は、上記のプロモーターが認識され、目的タンパク質を発現し得るものであればよく、その他の点について限定されるものではない。宿主とする植物は、栽培管理の容易さ、栽培地の環境、成育期間、収穫の容易性、並びに、種子の性質、大きさ及び収量などの条件を考慮し、目的タンパクの生産面から好適なものを適宜選択してよい。また、上記にて取得したＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の発現を促進するプロモーターの由来と同じ種類の植物を宿主とすることにより、遺伝子発現システム上の弊害は避けやすい。そのため、好ましい一実施形態としては、プロモーターの由来と同じ植物種を宿主として選択する形態が挙げられる。
宿主とする植物、すなわち、遺伝子組換え植物として栽培が予定される植物としては、例えば、タバコ、ナタネ、ダイズ等の双子葉植物や、イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ等の穀類や、アスパラガス等の単子葉植物などを挙げることができる。これらのうちでもイネは、種子中へのタンパク質の蓄積能力が高く、種子の保存性が良好という点で好適な植物である。
＜構築した発現ベクターの植物細胞への導入＞
次に、構築した発現ベクターを用いて植物の形質転換細胞を作製する。形質転換される植物細胞は、工程の簡略化という観点からは、ホストとなる植物細胞は、これをそのまま再生し、遺伝子組換え植物として大量に栽培し得る植物であることが好ましい。
次に、構築した発現ベクターを用いて植物の形質転換細胞を作製する。形質転換される植物細胞は、工程の簡略化という観点からは、ホストとなる植物細胞は、これをそのまま再生し、遺伝子組換え植物として大量に栽培し得る植物であることが好ましい。
構築した発現ベクターを植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、融合法、高速バリスティックベネトレーション法等の物理的・化学的手法を、植物または動物細胞への直接導入法として使用することができる（Ｉ．Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４２：２０５、１９９１）。また、植物細胞に対しては、植物に感染するウイルスや細菌を介して行う、間接導入法も使用することができる（Ｉ．Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４２：２０５、１９９１）。この場合、ウイルスとしては、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルス、タバコモザイクウイルス、ブロムモザイクウイルス等が使用でき、細菌としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・リゾジェネス等が使用できる。
＜形質転換体の再分化＞
次に、上記の方法で外来遺伝子を導入した植物細胞から、組換え組織または組換え個体を培養する。遺伝子導入処理を行った細胞を、適宜、目的遺伝子や選抜マーカー遺伝子による特定形質の発現、遺伝子の欠失等による特定形質の消失などを指標として選抜を行いつつ、定法によって増殖させ、再分化させ、組換え組織または組換え個体を培養することができる。再分化して得られた植物から種子を採取し、得られた種子を利用して、遺伝子組換え体を繁殖させることができる。
次に、上記の方法で外来遺伝子を導入した植物細胞から、組換え組織または組換え個体を培養する。遺伝子導入処理を行った細胞を、適宜、目的遺伝子や選抜マーカー遺伝子による特定形質の発現、遺伝子の欠失等による特定形質の消失などを指標として選抜を行いつつ、定法によって増殖させ、再分化させ、組換え組織または組換え個体を培養することができる。再分化して得られた植物から種子を採取し、得られた種子を利用して、遺伝子組換え体を繁殖させることができる。
必ずしも明確ではないが、本発明により所望の目的タンパク質の生産性が向上する一つの理由としては、次のように推測される。開花期前の生殖成長期にアミノ酸生成の原料となる窒素分を過剰に与えることにより、アミノ酸の合成に関与する遺伝子を活性化できると推察される。開花期後の種子の登熟期に入ると、植物体中に蓄積したアミノ酸と、活性化したアミノ酸の合成に関与する遺伝子の影響で種子のタンパク質合成遺伝子が活性化すると推察される。さらに、他のタンパク質合成遺伝子と比較して、より活性化されるタンパク質合成遺伝子のプロモーター領域を利用することで、より効率よく目的タンパク質が生産されると考えられる。
２．遺伝子組換え植物の栽培方法および種子の生産方法
本発明の遺伝子組換え植物の栽培方法は、上記「１．遺伝子組換え植物の作製方法」のようにして準備し得る遺伝子組換え植物を所定の条件下で栽培するものである。なお、具体的な実施形態については下記にて後述するが、上記「１．遺伝子組換え植物の作製方法」のようにして一旦、高窒素栽培条件下で目的タンパク質を高発現するように形質転換された遺伝子組換え植物を得た後は、上記のような工程Ａ：ＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の検出や、工程Ｂ：形質転換の作製を、必ずしもそれぞれ繰り返す必要はない。すなわち、一旦高窒素栽培条件下で目的タンパク質を高発現するように形質転換された遺伝子組換え植物を得た後は、その遺伝子組換え植物をその植物種の通常の繁殖方法にしたがって系統維持し、その植物を繰り返し栽培してもよい。
本発明の遺伝子組換え植物の栽培方法は、上記「１．遺伝子組換え植物の作製方法」のようにして準備し得る遺伝子組換え植物を所定の条件下で栽培するものである。なお、具体的な実施形態については下記にて後述するが、上記「１．遺伝子組換え植物の作製方法」のようにして一旦、高窒素栽培条件下で目的タンパク質を高発現するように形質転換された遺伝子組換え植物を得た後は、上記のような工程Ａ：ＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の検出や、工程Ｂ：形質転換の作製を、必ずしもそれぞれ繰り返す必要はない。すなわち、一旦高窒素栽培条件下で目的タンパク質を高発現するように形質転換された遺伝子組換え植物を得た後は、その遺伝子組換え植物をその植物種の通常の繁殖方法にしたがって系統維持し、その植物を繰り返し栽培してもよい。
＜工程Ｃ：遺伝子組換え植物の栽培＞
上記「１．遺伝子組換え植物の作製方法」により作製された遺伝子組換え植物を、該植物の開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるよう調整した培地で栽培する。
上記「１．遺伝子組換え植物の作製方法」により作製された遺伝子組換え植物を、該植物の開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるよう調整した培地で栽培する。
工程Ｃは、遺伝子組換え植物を所定の高窒素栽培条件下で栽培する工程である。工程Ｃにおける栽培条件の実施形態は、上記「１．遺伝子組換え植物の作製方法」における「第２の栽培条件」（すなわち低窒素条件とする場合）にのみ関する部分を除き、同様に適用し得る。言い換えると、工程Ｃにおける栽培条件の実施形態としては、栽培の窒素条件に関しては上記「１．遺伝子組換え植物の作製方法」における「第１の栽培条件」としての窒素条件が同様に適用され、その他の栽培に関する諸条件：所定の窒素条件とする開始時期およびその一定期間の形態、培地中の窒素濃度を制御するための形態、培地中の窒素濃度の測定の形態、培地中の窒素源の調整の形態、施肥管理の形態、並びに、水耕栽培または土耕栽培の形態などは、上記「１．遺伝子組換え植物の作製方法」の＜栽培条件＞に記載の実施形態と同様に適用し得る。また、窒素条件以外の具体的な栽培条件は、遺伝子組換え植物についての植物の種類に応じて適宜調整してよい。
＜種子の生産方法＞
本発明で栽培された遺伝子組換え植物は、そのまま、あるいは導入された目的タンパク質を分離・精製した形で摂取して、利用することができる。
遺伝子組換え植物が種子植物である場合、本発明の遺伝子組換え植物の栽培方法は、種子の生産方法でもある。種子タンパク質の貯蔵性が高いことから、種子物としては、イネ科の植物、より好ましくはイネが挙げられる。
本発明で栽培された遺伝子組換え植物は、そのまま、あるいは導入された目的タンパク質を分離・精製した形で摂取して、利用することができる。
遺伝子組換え植物が種子植物である場合、本発明の遺伝子組換え植物の栽培方法は、種子の生産方法でもある。種子タンパク質の貯蔵性が高いことから、種子物としては、イネ科の植物、より好ましくはイネが挙げられる。
種子の生産の場合、種子が形成され、所定の成熟度に達したら採取する。ここでいう採取とは、農業、園芸などの分野でいう収穫と同義である。したがって、種子そのものを単離することのみならず、栽培地から種子を含む植物体を回収することを広く含む。
本発明の種子植物の生産方法で生産された種子には、目的タンパク質が高発現している。種子からその目的タンパク質を精製してもよいし、或いは、その種子自体をそのまま利用してもよい。目的タンパク質が、ヒトが摂取可能な機能性タンパク質である場合、種子をそのまま或いは調理して簡便に摂取することができる。
高窒素条件下で高発現を促進するプロモーターを発見し、これを組み込んだ遺伝子組換え体を作製した種（または品種）を保存することにより、以後は、ＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の検出やそれに基づく遺伝子組換え植物の作製を、毎度繰り返す必要はない。例えば、ある植物種について高窒素栽培条件下で高発現し得るＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の発現を調節するプロモーターが一旦特定されれば、上記工程ＡのＲＮＡおよび種子貯蔵タンパク質の検出を毎度行う必要はなく、その知見に基づいて遺伝子組換え植物を作製し得る。
例えば、イネからプロモーターを単離する場合であれば、単離するプロモーターとして好ましくは、ＡＫ１０１４９７、ＡＫ１２０８２６、ＡＪ００２８９３、Ｏｓ０５ｇ０３２９２００、ＡＫ１０７２７１（グルテリンＡ−３）、ＡＫ１０２１９４、ＡＫ１２０６９７、ＡＫ０６７１４１、ＡＫ０６５００９、ＡＦ０１７３６０、ＡＫ０７１２０５、ＡＫ０５９１６４、ＡＫ１０７２３８、ＡＢ０１６５０５、ＡＫ０９９０８６、ＡＹ１６６４５８、ＡＹ９８７３９０（グルテリンＢ−２）、ＡＫ１０７３１４、Ｘ１５８３３、ＡＹ１９６９２３（グルテリンＢ−５）、ＡＫ０６１８９４、ＡＫ１０７３４３（グルテリンＢ−１）、ＡＫ０６３９９５、Ｊ１０００４１Ｃ２３、Ｊ０９０００９Ｉ０７、ＡＫ０６５４５６、ＡＫ１０７３１４、ＡＫ１０７６３３、Ｕ４３５３０、ＡＫ０６４３１０、ＡＫ０６４４８５、ＡＫ１０１３０９、ＡＫ１０７９８３、ＡＫ０９９９１８、ＡＫ１００３０６、Ｘ８３４３４、ＡＫ０７０４１４、ＡＫ１０３２２０、ＡＫ１２１８５６、ＡＫ０６２７５８、ＡＫ１０３３０６、ＡＫ０６１２０７、ＡＫ０６８２６６、Ｏｓ０６ｇ０５９８５００、ＡＫ１１９９００、Ｌ１９５９８、ＡＫ０７０８５１、Ｏｓ０１ｇ０８４０３００、ＡＫ０５９８０５、ＡＫ１０６２４４、ＡＫ１０８１２７、ＡＫ１０８２３０、ＡＫ０６１２３７、ＡＫ０６２５１７、ＡＫ０６５２５９、ＡＫ０６５６０４、ＡＫ１０６９６４、ＡＫ０６０９８３、Ｊ０７５０７４Ｇ０８、ＡＫ０９９７１９（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．）、グルテリン、グロブリン、プロラミンなどのプロモーターが挙げられ、より好ましくは、グルテリンＢ−１、グルテリンＢ−２、グルテリンＢ−５、グルテリンＡ−３、グロブリン、または、１３ＫＤａプロラミンなどのプロモーターが挙げられ、さらに好ましくはグルテリンＢ−１、グルテリンＢ−５のプロモーターが挙げられる。これらのプロモーターは、高窒素栽培条件下でその下流にある構造遺伝子の発現を促進させ得る。これらのプロモーターを用いる場合、形質転換される宿主となる植物としてはイネが好適である。すなわち、本発明の遺伝子組換え植物の栽培方法の他の実施形態としては、Ｖ／Ｗ＞１．０となる種子に含有されるＲＮＡをコードするＤＮＡの発現を調節するプロモーターおよび、グルテリン、グロブリン、およびプロラミンなどから選ばれる種子貯蔵タンパク質の発現を調節するプロモーターと、高発現させることを予定している目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む発現ベクターを導入することにより形質転換された遺伝子組換え植物を、該植物の開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるよう調整した培地で栽培する形態も挙げられる。
さらに、一旦上記のような遺伝子組換え植物が作製されれば、その植物種の通常の繁殖方法に従って、その遺伝子組換え植物の系統を維持し、これを上記工程Ｃに従って栽培してもよい。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は係る実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、更に詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、分子生物学的手法についてはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．，１９８９）または、製造業者の取り扱い説明書に従い行われた。
［実施例１］
１．植物の栽培
下記のように第１の栽培条件および第２の栽培条件で、イネを栽培した。栽培のスケジュールの概要を図１に示す。また、用いた栽培液Ａおよび栽培液Ｂの組成を表１に示す。
１．植物の栽培
下記のように第１の栽培条件および第２の栽培条件で、イネを栽培した。栽培のスケジュールの概要を図１に示す。また、用いた栽培液Ａおよび栽培液Ｂの組成を表１に示す。
＜ＲＮＡ含有量Ｖおよび種子貯蔵タンパク質Ｘを測定するための第１の栽培条件＞
イネの一品種である日本晴の種子を次亜塩素酸とエタノールで殺菌後、滅菌水が入ったシャーレに均等に広げ、遮光した後、２８度で５日間培養した。
イネの一品種である日本晴の種子を次亜塩素酸とエタノールで殺菌後、滅菌水が入ったシャーレに均等に広げ、遮光した後、２８度で５日間培養した。
人工太陽光室の室内にて、育苗箱の中に水を含ませたウレタンマットを敷き、出芽した種子を播種した。明条件：気温２８度、湿度５０％、１１時間、暗条件：気温２３度、湿度５０％、１３時間で１５日間苗を培養した。
湛液方式の栽培ベッド（Ｍ式水耕研究所製）に１００Ｌの栽培液Ａ（表１参照）を充填し、得られた苗を１本ずつ７７株植え付け、明条件：気温２８度、湿度５０％、１１時間、暗条件：気温２３度、湿度５０％、１３時間で４５日間培養した。
栽培液Ｂ（表１参照）の成分になるよう追肥を行い、明条件：気温２８度、湿度５０％、１１時間、暗条件：気温２３度、湿度５０％、１３時間で４５日間培養後、種子を得た。
上記のように水耕栽培を行ったので、栽培ベッド内の水分の窒素濃度を制御することにより、培地中の窒素濃度を制御した。硝酸態窒素濃度は、硝酸イオン複合電極(東亜ディーケーケー社製)を用いて測定した。またアンモニウム態窒素濃度は、アンモニア複合電極(東亜ディーケーケー社製)を用いて測定した。
＜ＲＮＡ含有量Ｗおよび種子貯蔵タンパク質Ｙを測定するための第２の栽培条件＞
日本晴の種子を次亜塩素酸とエタノールで殺菌後、滅菌水が入ったシャーレに均等に広げ、遮光した後、２８度で５日間培養した。
日本晴の種子を次亜塩素酸とエタノールで殺菌後、滅菌水が入ったシャーレに均等に広げ、遮光した後、２８度で５日間培養した。
人工太陽光室の室内にて、育苗箱の中に水を含ませたウレタンマットを敷き、出芽した種子を播種した。明条件：気温２８度、湿度５０％、１１時間、暗条件：気温２３度、湿度５０％、１３時間で１５日間培養した。
栽培ポットに窒素を５０ｍｇ／Ｌ含有する土壌を５Ｌ充填し、得られた苗を１本植え付け、明条件：気温２８度、湿度５０％、１１時間、暗条件：気温２３度、湿度５０％、１３時間で４５日間培養した。
土壌中の窒素が５０ｍｇ／Ｌとなるように追肥を行い、明条件：気温２８度、湿度５０％、１１時間、暗条件：気温２３度、湿度５０％、１３時間で４５日間培養後、種子を得た。
２．ＲＮＡの解析
＜マイクロアレイ用試料の調整＞
上記条件で栽培して得た開花後２０日目の各々の種子を、液体窒素で凍結後、乳鉢で破砕し、Ｆｒｕｉｔ−ｍａｔｅ ｆｏｒ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（タカラバイオ社より購入）で処理後、ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ社より購入）で抽出した。その後Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮａｓｅ Ｉ（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ）（タカラバイオ社より購入）で処理し、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｆｒｏｍ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）（タカラバイオ社より購入）で精製して、ＲＮＡ溶液を得た。
＜マイクロアレイ用試料の調整＞
上記条件で栽培して得た開花後２０日目の各々の種子を、液体窒素で凍結後、乳鉢で破砕し、Ｆｒｕｉｔ−ｍａｔｅ ｆｏｒ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（タカラバイオ社より購入）で処理後、ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ社より購入）で抽出した。その後Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮａｓｅ Ｉ（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ）（タカラバイオ社より購入）で処理し、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｆｒｏｍ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）（タカラバイオ社より購入）で精製して、ＲＮＡ溶液を得た。
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを８００ｎｇ／１サンプルとなるように調整し、シアニン ３−ＣＴＰ色素ラベル用４００ｎｇ、シアニン ５−ＣＴＰ色素ラベル用４００ｎｇとなるようにそれぞれチューブに分注した。Ｌｏｗ ＲＮＡ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＰＬＵＳ， ２カラー用（アジレント・テクノロジー株式会社より購入）を用いて、シアニンラベル化 ｃＲＮＡを生成し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社より購入）を用いて、精製した。
＜ハイブリダイゼーション＞
シアニン ３−ＣＴＰ色素ラベルしたｃＤＮＡ８２５ｎｇとシアニン ５−ＣＴＰ色素ラベルしたｃＤＮＡ８２５ｎｇをそれぞれチューブに分注し、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー株式会社より購入）で処理後、イネ オリゴＤＮＡマイクロアレイ ４ ｘ ４４Ｋ ＲＡＰ−ＤＢ（アジレント・テクノロジー株式会社より購入）へ充填し、ハイブリダイゼーションさせた。
シアニン ３−ＣＴＰ色素ラベルしたｃＤＮＡ８２５ｎｇとシアニン ５−ＣＴＰ色素ラベルしたｃＤＮＡ８２５ｎｇをそれぞれチューブに分注し、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー株式会社より購入）で処理後、イネ オリゴＤＮＡマイクロアレイ ４ ｘ ４４Ｋ ＲＡＰ−ＤＢ（アジレント・テクノロジー株式会社より購入）へ充填し、ハイブリダイゼーションさせた。
＜画像解析＞
ＤＮＡ マイクロアレイスキャナ（アジレント・テクノロジー株式会社製）で画像をスキャンし、スポットを数値化した。さらに、画像解析ソフトＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（アジレント・テクノロジー株式会社製）を用いて、Ｖ／Ｗ＞１．０となるＲＮＡを検出した。スポット強度の値を表２に示す。
ＤＮＡ マイクロアレイスキャナ（アジレント・テクノロジー株式会社製）で画像をスキャンし、スポットを数値化した。さらに、画像解析ソフトＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（アジレント・テクノロジー株式会社製）を用いて、Ｖ／Ｗ＞１．０となるＲＮＡを検出した。スポット強度の値を表２に示す。
３．タンパク質の解析
＜２次元ゲル用試料の調製＞
上記第１および第２の栽培条件下で栽培して得た開花後４５日目の各々の種子を、胚盤を取り除いた後に、マルチビーズショッカー（安井器械社製）で破砕し、８Ｍ尿素、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２０％（ｗ／ｖ）グリセロール、５０ｍＭリン酸バッファーを含有する抽出溶液中にホモジナイズして、タンパク質溶液を得た。得られたタンパク質溶液をＲｅａｄｙＰｒｅ ２−Ｄ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社（以下、ＢＩＯ−ＲＡＤ社と略称する）より購入）で精製し、ＲｅａｄｙＳｔｒｉｐ ７-１０ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）を添加した。ＲＣ ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）を用いて全タンパク質濃度を決定した。
＜２次元ゲル用試料の調製＞
上記第１および第２の栽培条件下で栽培して得た開花後４５日目の各々の種子を、胚盤を取り除いた後に、マルチビーズショッカー（安井器械社製）で破砕し、８Ｍ尿素、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２０％（ｗ／ｖ）グリセロール、５０ｍＭリン酸バッファーを含有する抽出溶液中にホモジナイズして、タンパク質溶液を得た。得られたタンパク質溶液をＲｅａｄｙＰｒｅ ２−Ｄ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社（以下、ＢＩＯ−ＲＡＤ社と略称する）より購入）で精製し、ＲｅａｄｙＳｔｒｉｐ ７-１０ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）を添加した。ＲＣ ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）を用いて全タンパク質濃度を決定した。
＜２次元ゲル電気泳動＞
１次元目のタンパク質分離用等電点電気泳動は、ＰＲＯＴＥＡＮ ＩＥＦ ｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）および７ｃｍ ＲｅａｄｙＳｔｒｉｐ ＩＰＧ Ｓｔｒｉｐ ３−７ＮＬ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）を用いて実施した。２次元目のタンパク質分離用電気泳動は、ＩＰＧ Ｓｔｒｉｐ をｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ Ｉ、 ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入） で平衡化し、ＰＲＯＴＥＡＮ ｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）および １０−２０％ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｇｅｌ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）を用いて実施した。画像解析の際のタンパク質スポットの分子量および等電点計算のために、試料は分子量マーカー および等電点ｐｌ較正マーカーとともに泳動した。２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの直後に、Ｇｅｌ を４０％エタノール、１０％酢酸を含有する固定液に２時間浸透し、Ｆｌａｍｉｎｇｏ Ｇｅｌｓｔａｉｎ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）で処理した。
１次元目のタンパク質分離用等電点電気泳動は、ＰＲＯＴＥＡＮ ＩＥＦ ｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）および７ｃｍ ＲｅａｄｙＳｔｒｉｐ ＩＰＧ Ｓｔｒｉｐ ３−７ＮＬ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）を用いて実施した。２次元目のタンパク質分離用電気泳動は、ＩＰＧ Ｓｔｒｉｐ をｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ Ｉ、 ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入） で平衡化し、ＰＲＯＴＥＡＮ ｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）および １０−２０％ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｇｅｌ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）を用いて実施した。画像解析の際のタンパク質スポットの分子量および等電点計算のために、試料は分子量マーカー および等電点ｐｌ較正マーカーとともに泳動した。２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの直後に、Ｇｅｌ を４０％エタノール、１０％酢酸を含有する固定液に２時間浸透し、Ｆｌａｍｉｎｇｏ Ｇｅｌｓｔａｉｎ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）で処理した。
＜２次元ゲルの画像解析＞
処理したゲルをＰｈａｒｏｓ ＦＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）を用いてデジタル化した。Ｑｕａｎｔｉｔｙ ＯｎｅおよびＰＤＱｕｅｓｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）を用いて、６種類の種子貯蔵タンパク質のスポット位置をそれぞれ特定し、スポット強度を測定した。６種類の種子貯蔵タンパク質は、グロブリン、グルテリン、グルテリンＢ−５、グルテリンＢ−１、１０ＫＤａプロラミン、および１３ＫＤａプロラミンである。２次元ゲルの画像解析図を図２に、スポット強度の値を表３に示す。
処理したゲルをＰｈａｒｏｓ ＦＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）を用いてデジタル化した。Ｑｕａｎｔｉｔｙ ＯｎｅおよびＰＤＱｕｅｓｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）を用いて、６種類の種子貯蔵タンパク質のスポット位置をそれぞれ特定し、スポット強度を測定した。６種類の種子貯蔵タンパク質は、グロブリン、グルテリン、グルテリンＢ−５、グルテリンＢ−１、１０ＫＤａプロラミン、および１３ＫＤａプロラミンである。２次元ゲルの画像解析図を図２に、スポット強度の値を表３に示す。
４．遺伝子組換え植物の作製
＜発現ベクターの作製＞
上記「２．ＲＮＡの解析」「３．タンパク質の解析」の結果、Ｖ／Ｗ＝１．４７、Ｘ／Ｙ＝２．１７であったグルテリンＢ−１をコードする核酸配列（ＧｌｕＢ−１ ｇｅｎｅ：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ５４３１４、ＡＫ１０７３４３）と、そのプロモーター配列（ＧｌｕＢ−１ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ４２７５６９）をＮＣＢＩ Ｈｏｍｅ Ｐａｇｅ, Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅより取得した。グルテリンＢ−１をコードする核酸周辺の核酸配列をＲｉｃｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｄａｔａｂａｓｅより検索し、グルテリンＢ−１をコードする核酸の下流１．０ｋｂの核酸配列をターミネーター配列として取得した。
＜発現ベクターの作製＞
上記「２．ＲＮＡの解析」「３．タンパク質の解析」の結果、Ｖ／Ｗ＝１．４７、Ｘ／Ｙ＝２．１７であったグルテリンＢ−１をコードする核酸配列（ＧｌｕＢ−１ ｇｅｎｅ：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ５４３１４、ＡＫ１０７３４３）と、そのプロモーター配列（ＧｌｕＢ−１ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ４２７５６９）をＮＣＢＩ Ｈｏｍｅ Ｐａｇｅ, Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅより取得した。グルテリンＢ−１をコードする核酸周辺の核酸配列をＲｉｃｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｄａｔａｂａｓｅより検索し、グルテリンＢ−１をコードする核酸の下流１．０ｋｂの核酸配列をターミネーター配列として取得した。
取得した核酸配列情報を基にＰＣＲプライマーを設計し、Ｎ末端にＳｓｅ８３８７Ｉサイトを付加したグルテリンＢ−１のプロモーター配列とグルテリンＢ−１のシグナルペプチド配列を含む断片（断片Ａ）（Ｐｒｉｍｅｒ１：ＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＴＧＣＴＡＣＣＡＡＣＡ（配列番号１）、Ｐｒｉｍｅｒ２：ＣＡＧＧＡＧＴＧＴＴＧＧＡＧＴＡＴＣＧＡＧＧＴＡＡＡＡＧＡＡ（配列番号２））、Ｎ末端にＳａｃＩサイト、Ｃ末端にＥｃｏＲＩサイトを付加したグルテリンＢ−１のターミネーター配列を含む断片（断片Ｂ）（Ｐｒｉｍｅｒ３：ＧＡＧＣＴＣＴＧＴＡＡＴＴＧＡＧＡＡＣＴＡＧＴＡＴＣ（配列番号３）、Ｐｒｉｍｅｒ４：ＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＡＣＴＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＴ（配列番号４））をＰＣＲにより取得した。
取得した断片Ａ，Ｂをゼロブラント ＴＯＰＯＰＣＲクローニングキット（インビトロジェン社より購入）を用いてＥ．ｃｏｌｉに導入し、増幅させた。断片Ａと７ｃｒｐ（花粉症緩和ペプチド）とＫＤＥＬ配列を連結した断片Ｃ（特開２００４−３２１０７９）とをＮｃｏＩ（タカラバイオ社より購入）で処理後、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社より購入）を用いて連結した。断片Ａと断片Ｃを連結した断片と断片ＢをＳａｃＩ（タカラバイオ社より購入）で処理後、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社より購入）を用いて連結した。得られた連結断片（Ａ，Ｂ，Ｃ）をＳｓｅ８３８７Ｉ（タカラバイオ社より購入）とＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社より購入）で処理後、プラスミドｐＴＬ７（Ｈ．Ｅｂｉｎｕｍａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ、２２：９５、２００２）のＥｃｏＲＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉ制限酵素部位間に、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社より購入）を用いて連結し、発現ベクターを構築した。なお、上記配列番号は、それぞれ配列表中におけるそれぞれに対応する。
＜アグロバクテリウムへの導入＞
アグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａ.ツメファシエンス）ＥＨＡ１０５株を、１０ｍｌのＹＥＢ液体培地（５ｇ／ｌビーフエキス、１ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌショ糖、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２２℃でのｐＨ７．２（以下、特に示さない場合、２２℃でのｐＨとする。））に接種し、ＯＤ.６３０が０．４から０．６の範囲に至るまで、２８℃で培養した後、培養液を６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心して菌体を回収した。回収した菌体は、２０ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）に懸濁して、再度６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心することにより集菌し、この菌体を２００μｌのＹＥＢ液体培地に懸濁して、プラスミド導入用菌液とした。 ０．５ｍｌチューブ内で、上記プラスミド導入用菌液５０μｌと発現ベクターとを混合し、エレクトロポレーション法（ジーンパルサーIIシステム（ＢＩＯＲＡＤ社より購入））を用いて、Ａ.ツメファシエンスＥＨＡ１０５株への発現ベクター導入処理を行った。発現ベクター導入処理後の菌体は、２００μｌのＹＥＢ液体培地を加えて２５℃で、振とうしつつ１時間培養を行ってから、５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加ＹＥＢ寒天培地（寒天１．５ｗ／ｖ％、他の組成は上記に同じ。）に播種し、２８℃、２日間培養した。次いで、生じた菌コロニーをＹＥＢ液体培地に移植して更に培養し、増殖した菌体からアルカリ法でプラスミドを抽出して、これらの菌体に発現ベクターが導入されていることを確認した。
アグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａ.ツメファシエンス）ＥＨＡ１０５株を、１０ｍｌのＹＥＢ液体培地（５ｇ／ｌビーフエキス、１ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌショ糖、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２２℃でのｐＨ７．２（以下、特に示さない場合、２２℃でのｐＨとする。））に接種し、ＯＤ.６３０が０．４から０．６の範囲に至るまで、２８℃で培養した後、培養液を６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心して菌体を回収した。回収した菌体は、２０ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）に懸濁して、再度６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心することにより集菌し、この菌体を２００μｌのＹＥＢ液体培地に懸濁して、プラスミド導入用菌液とした。 ０．５ｍｌチューブ内で、上記プラスミド導入用菌液５０μｌと発現ベクターとを混合し、エレクトロポレーション法（ジーンパルサーIIシステム（ＢＩＯＲＡＤ社より購入））を用いて、Ａ.ツメファシエンスＥＨＡ１０５株への発現ベクター導入処理を行った。発現ベクター導入処理後の菌体は、２００μｌのＹＥＢ液体培地を加えて２５℃で、振とうしつつ１時間培養を行ってから、５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加ＹＥＢ寒天培地（寒天１．５ｗ／ｖ％、他の組成は上記に同じ。）に播種し、２８℃、２日間培養した。次いで、生じた菌コロニーをＹＥＢ液体培地に移植して更に培養し、増殖した菌体からアルカリ法でプラスミドを抽出して、これらの菌体に発現ベクターが導入されていることを確認した。
＜アグロバクテリウムＥＨＡ１０５によるイネの形質転換＞
イネ品種「日本晴」の完熟種子を、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ４ モデル植物の実験プロトコール（ｐ９３−９８）の方法に従い殺菌した後、この完熟種子を、Ｎ６Ｃｌ２培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類（Ｃｈｕ Ｃ．Ｃ．、１９７８， Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｐｌａｎｔ ＴｉｓｓｕｅＣｕｔｕｒｅ、Ｓｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ Ｐｅｋｉｎｇ、ｐｐ．４３−５０）、３０ｇ／ｌシュークロース、２．８ｇ／ｌプロリン、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ＝５．８）に置床し、サージカルテープでシールしてから２８℃明所で培養して発芽させ、アグロバクテリウムＥＨＡ１０５による感染材料とした。ＹＥＢ寒天培地（１５ｇ／ｌバクトアガー、他の組成は上記に同じ。）にて培養した発現ベクターを導入したアグロバクテリウムＥＨＡ１０５を、ＹＥＢ液体培地に移植して、２５℃、１８０ｒｐｍで一晩培養した後、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心して集菌し、アセトシリンゴン１０ｍｇ／ｌを含むＮ６液体培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／ｌシュークロース、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、ｐＨ＝５．８）に、ＯＤ．６３０＝０．１５となるように懸濁し、感染用アグロバクテリウム懸濁液とした。調整したイネの発芽種子を５０ｍｌチューブに入れ、感染用アグロバクテリウム懸濁液を注いで１．５分間浸漬した。浸漬後、アグロバクテリウム懸濁液を捨て、発芽種子を滅菌したろ紙の上に置いて余分な水分を除去してから、この種子を、共存培養培地Ｎ６Ｃｌ２培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／ｌシュークロース、２．８ｇ／ｌプロリン、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ＝５．２）に置床し、サージカルテープでシールして２８℃暗所で３日間培養し、次いで、Ｎ６Ｃｌ２ＴＣＨ２５培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／ｌシュークロース、２．８ｇ／ｌプロリン、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、２５ｍｇ／ｌハイグロマイシン、４ｇ／ｌゲルライト）に移植して培養した。
イネ品種「日本晴」の完熟種子を、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ４ モデル植物の実験プロトコール（ｐ９３−９８）の方法に従い殺菌した後、この完熟種子を、Ｎ６Ｃｌ２培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類（Ｃｈｕ Ｃ．Ｃ．、１９７８， Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｐｌａｎｔ ＴｉｓｓｕｅＣｕｔｕｒｅ、Ｓｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ Ｐｅｋｉｎｇ、ｐｐ．４３−５０）、３０ｇ／ｌシュークロース、２．８ｇ／ｌプロリン、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ＝５．８）に置床し、サージカルテープでシールしてから２８℃明所で培養して発芽させ、アグロバクテリウムＥＨＡ１０５による感染材料とした。ＹＥＢ寒天培地（１５ｇ／ｌバクトアガー、他の組成は上記に同じ。）にて培養した発現ベクターを導入したアグロバクテリウムＥＨＡ１０５を、ＹＥＢ液体培地に移植して、２５℃、１８０ｒｐｍで一晩培養した後、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心して集菌し、アセトシリンゴン１０ｍｇ／ｌを含むＮ６液体培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／ｌシュークロース、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、ｐＨ＝５．８）に、ＯＤ．６３０＝０．１５となるように懸濁し、感染用アグロバクテリウム懸濁液とした。調整したイネの発芽種子を５０ｍｌチューブに入れ、感染用アグロバクテリウム懸濁液を注いで１．５分間浸漬した。浸漬後、アグロバクテリウム懸濁液を捨て、発芽種子を滅菌したろ紙の上に置いて余分な水分を除去してから、この種子を、共存培養培地Ｎ６Ｃｌ２培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／ｌシュークロース、２．８ｇ／ｌプロリン、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ＝５．２）に置床し、サージカルテープでシールして２８℃暗所で３日間培養し、次いで、Ｎ６Ｃｌ２ＴＣＨ２５培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／ｌシュークロース、２．８ｇ／ｌプロリン、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、２５ｍｇ／ｌハイグロマイシン、４ｇ／ｌゲルライト）に移植して培養した。
＜形質転換体の再分化＞
上記Ｎ６Ｃｌ２ＴＣＨ２５培地での培養開始から１週間後、発芽した芽を胚盤組織から除去して、残った胚盤組織を、Ｎ６Ｃｌ４ＴＣＨ２５培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／ｌシュークロース、２．８ｇ／ｌプロリン、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、４ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、２５ｍｇ／ｌハイグロマイシン、４ｇ／ｌゲルライト）で１週間培養し、更に、ＭＳＲＣ培地（ＭＳ無機塩類及びビタミン類（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ、Ｔ． ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ、Ｆ．、１９６２ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ．、１５、４７３）、３０ｇ／ｌシュークロース、３０ｇ／ｌソルビトール、２ｇ／ｌカザミノ酸、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、４ｇ／ｌゲルライト）に移植して培養することにより、芽又は幼植物体を再分化させた。
上記Ｎ６Ｃｌ２ＴＣＨ２５培地での培養開始から１週間後、発芽した芽を胚盤組織から除去して、残った胚盤組織を、Ｎ６Ｃｌ４ＴＣＨ２５培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／ｌシュークロース、２．８ｇ／ｌプロリン、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、４ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、２５ｍｇ／ｌハイグロマイシン、４ｇ／ｌゲルライト）で１週間培養し、更に、ＭＳＲＣ培地（ＭＳ無機塩類及びビタミン類（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ、Ｔ． ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ、Ｆ．、１９６２ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ．、１５、４７３）、３０ｇ／ｌシュークロース、３０ｇ／ｌソルビトール、２ｇ／ｌカザミノ酸、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、４ｇ／ｌゲルライト）に移植して培養することにより、芽又は幼植物体を再分化させた。
５．遺伝子組換え植物の栽培
上記「３．遺伝子組換え植物の作製」により得られたイネを以下の要領にて栽培した。栽培に用いた栽培液Ｃおよび栽培液Ｄの組成を表３に示す。
まず、上記「３．遺伝子組換え植物の作製」により得られた胚盤組織から再分化させた芽又は幼植物体を、発根培地に移植して背丈２０ｃｍ程度の幼苗となるまで生育させた。
上記「３．遺伝子組換え植物の作製」により得られたイネを以下の要領にて栽培した。栽培に用いた栽培液Ｃおよび栽培液Ｄの組成を表３に示す。
まず、上記「３．遺伝子組換え植物の作製」により得られた胚盤組織から再分化させた芽又は幼植物体を、発根培地に移植して背丈２０ｃｍ程度の幼苗となるまで生育させた。
湛液方式の栽培ベッド（Ｍ式水耕研究所製）に１００Ｌの栽培液Ｃ（表３参照）を充填し、得られた苗を１本ずつ７７株植え付け、明条件：気温２８度、湿度５０％、１１時間、暗条件：気温２３度、湿度５０％、１３時間で４５日間培養した。
栽培液Ｄ（表３参照）の成分になるよう追肥を行い、明条件：気温２８度、湿度５０％、１１時間、暗条件：気温２３度、湿度５０％、１３時間で４５日間培養した。
栽培液Ｄ（表３参照）の成分になるよう追肥を行い、明条件：気温２８度、湿度５０％、１１時間、暗条件：気温２３度、湿度５０％、１３時間で４５日間培養した。
６．タンパク質含有量の測定
上記「４．遺伝子組換え植物の栽培」にて得られた植物から種子を採取し、種子中のタンパク質含有量を、下記の要領にて測定した。
＜種子の総タンパク質含有量＞
杯盤を除去した種子中のタンパク質含有量を、近赤外線タンパク質解析装置ＮＩＲＦＬＥＸ Ｎ−５００（ＢＵＣＨＩ社製）で測定し、種子重量から総タンパク質含有量を算出した。
上記「４．遺伝子組換え植物の栽培」にて得られた植物から種子を採取し、種子中のタンパク質含有量を、下記の要領にて測定した。
＜種子の総タンパク質含有量＞
杯盤を除去した種子中のタンパク質含有量を、近赤外線タンパク質解析装置ＮＩＲＦＬＥＸ Ｎ−５００（ＢＵＣＨＩ社製）で測定し、種子重量から総タンパク質含有量を算出した。
＜機能性タンパク質（花粉症緩和ペプチド：７ｃｒｐ）の量＞
種子中のタンパク質と既知濃度のタンパク質マーカーをＳＤＳ−ＰＡＧＥキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）で泳動し、Ｇｅｌ を４０％エタノール、１０％酢酸を含有する固定液に２時間浸透し、Ｆｌａｍｉｎｇｏ Ｇｅｌｓｔａｉｎ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）で処理した。処理したゲルをＰｈａｒｏｓ ＦＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）を用いてデジタル化した。Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）を用いて７ｃｒｐのバンド位置を特定し、濃度既知のマーカーのバンド強度と比較して、花粉症緩和ペプチド（７ｃｒｐ）の重量を算出した。このようにして、遺伝子組換え植物から採取された種子中の総タンパク質の量と、形質転換により導入された機能性タンパク質の量とを求めた。
種子中のタンパク質と既知濃度のタンパク質マーカーをＳＤＳ−ＰＡＧＥキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）で泳動し、Ｇｅｌ を４０％エタノール、１０％酢酸を含有する固定液に２時間浸透し、Ｆｌａｍｉｎｇｏ Ｇｅｌｓｔａｉｎ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）で処理した。処理したゲルをＰｈａｒｏｓ ＦＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）を用いてデジタル化した。Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社より購入）を用いて７ｃｒｐのバンド位置を特定し、濃度既知のマーカーのバンド強度と比較して、花粉症緩和ペプチド（７ｃｒｐ）の重量を算出した。このようにして、遺伝子組換え植物から採取された種子中の総タンパク質の量と、形質転換により導入された機能性タンパク質の量とを求めた。
［実施例２］
培養液Ｄのアンモニウム態窒素含有量を１５０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
培養液Ｄのアンモニウム態窒素含有量を１５０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
［実施例３］
培養液Ｄの硝酸態窒素含有量を５０ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を１５０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
培養液Ｄの硝酸態窒素含有量を５０ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を１５０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
［実施例４］
培養液Ｄの硝酸態窒素含有量を６００ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を２００ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
培養液Ｄの硝酸態窒素含有量を６００ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を２００ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
［実施例５］
培養液Ｄの硝酸態窒素含有量を７０ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を７０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
培養液Ｄの硝酸態窒素含有量を７０ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を７０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
［実施例６］
培養液Ｄの硝酸態窒素含有量を７５０ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を７５０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
培養液Ｄの硝酸態窒素含有量を７５０ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を７５０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
［実施例７］
目的タンパク質の発現用プロモーターとしてグルテリンＢ−５のプロモーターを用いた以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
目的タンパク質の発現用プロモーターとしてグルテリンＢ−５のプロモーターを用いた以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
［実施例８］
Ｙの栽培条件を水耕栽培とした以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
Ｙの栽培条件を水耕栽培とした以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
［実施例９］
培養液Ｂのアンモニウム態窒素含有量を２０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
培養液Ｂのアンモニウム態窒素含有量を２０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
［実施例１０］
培養液Ｂの硝酸態窒素含有量を２０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
培養液Ｂの硝酸態窒素含有量を２０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
［比較例１］
培養液Ｄの硝酸態窒素含有量を２０ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を２０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
培養液Ｄの硝酸態窒素含有量を２０ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を２０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
［比較例２］
培養液Ｄの硝酸態窒素含有量を８００ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を８００ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
培養液Ｄの硝酸態窒素含有量を８００ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を８００ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
［比較例３］
目的タンパク質の発現用プロモーターとして１０ＫＤａプロラミンのプロモーターを用いた以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
目的タンパク質の発現用プロモーターとして１０ＫＤａプロラミンのプロモーターを用いた以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
［比較例４］
培養液Ｂの硝酸態窒素含有量を２０ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を２０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
培養液Ｂの硝酸態窒素含有量を２０ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を２０ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
［比較例５］
培養液Ｂの硝酸態窒素含有量を８００ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を８００ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
［比較例６］
培養液Ｄの硝酸態窒素含有量を２０ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を２０ｍｇ／Ｌとした以外は、比較例３と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
培養液Ｂの硝酸態窒素含有量を８００ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を８００ｍｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
［比較例６］
培養液Ｄの硝酸態窒素含有量を２０ｍｇ／Ｌとし、アンモニウム態窒素含有量を２０ｍｇ／Ｌとした以外は、比較例３と同様にして、遺伝子組換え植物の栽培、タンパク質含有量の測定を行った。
上記、実施例１〜１０および比較例１〜６の試験結果を下記表５に示す。
本発明は、生物資源生産、機能性食品生産、バイオテクノロジーおよび植物の品種改良などの分野において有用である。
Ｇ 染色体
ｐｍｒ１ プロモーター
ｐｔｎ１、ｐｔｎ２ タンパク質をコードする構造遺伝子領域
ｔｍｒ１ ターミネーター
ｖｃｔ プラスミドベクター
ｐｍｒ１ プロモーター
ｐｔｎ１、ｐｔｎ２ タンパク質をコードする構造遺伝子領域
ｔｍｒ１ ターミネーター
ｖｃｔ プラスミドベクター
配列番号１：プライマー１
配列番号２：プライマー２
配列番号３：プライマー３
配列番号４：プライマー４
配列番号２：プライマー２
配列番号３：プライマー３
配列番号４：プライマー４
Claims (8)
- 下記式（１）：
Ｖ／Ｗ＞１．０ ・・・（１）
（但し、式（１）において、Ｖは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地にて所定の植物を栽培した場合における該植物の種子に含まれるＲＮＡ量である。Ｗは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、窒素０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地にて該植物を栽培した場合における該植物の種子に含まれるＲＮＡ量である。）
を満たす種子で発現するＲＮＡの発現を調節するプロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む発現ベクターが導入されて形質転換された遺伝子組換え植物を、該遺伝子組換え植物の開花予定日の３０日前から開花日まで間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるよう調整した培地にて栽培することを含む、遺伝子組換え植物の栽培方法。 - 下記式（２）
Ｘ／Ｙ＞１．０ ・・・（２）
（但し、式（２）において、Ｘは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地にて所定の植物を栽培した場合における該植物の種子に含まれる種子貯蔵タンパク質の含有量である。Ｙは、開花予定日の３０日前から開花日までの間の一定期間、窒素０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌとなるように調整した培地にて該植物を栽培した場合における該植物の種子に含まれる該種子貯蔵タンパク質の含有量である。）
を満たす種子貯蔵タンパク質の発現を調節するプロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む発現ベクターが導入されて形質転換された遺伝子組換え植物を、該遺伝子組換え植物の開花予定日の３０日前から開花日まで間の一定期間、硝酸態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌ、および／または、アンモニウム態窒素が７０ｍｇ／Ｌ〜７５０ｍｇ／Ｌとなるよう調整した培地にて栽培することを含む、遺伝子組換え植物の栽培方法。 - 前記所定の植物と前記遺伝子組換え植物とが、同種の植物種である、請求項１または請求項２に記載の遺伝子組換え植物の栽培方法。
- 前記所定の植物がイネ科の植物であり、前記遺伝子組換え植物がイネ科の植物である、請求項３に記載の遺伝子組換え植物の栽培方法。
- 前記プロモーターが、グルテリン、グロブリン、およびプロラミンからなる群より選ばれる種子貯蔵タンパク質の発現を調節するプロモーターである、請求項４に記載の遺伝子組換え植物の栽培方法。
- 前記遺伝子組換え植物の栽培を、水耕栽培によって行う、請求項１から５のいずれか一項に記載の遺伝子組換え植物の栽培方法。
- 請求項１から６のいずれか一項に記載の遺伝子組換え植物の栽培方法によって前記遺伝子組換え植物を栽培し、種子を採集することを含む、種子の生産方法。
- 前記植物がイネであり、前記種子が米である、請求項７に記載の種子の生産方法。
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