CN115088621B - 一种利用抽真空处理促进杨树外植体大量、快速分化成芽的方法 - Google Patents

一种利用抽真空处理促进杨树外植体大量、快速分化成芽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用抽真空处理促进杨树外植体大量、快速分化成芽的方法，属于植物组织培养技术领域。本发明包括：选取杨树幼苗叶片，去除叶片的边缘部分，切成若干叶盘或叶柄；将叶盘或叶柄放入处理液，置于真空泵中抽真空一段时间；取出叶盘或叶柄后立即用吸水纸吸去表面液体，将叶盘背面朝下放入装有培养基的培养皿中；培养叶盘或叶柄分化为丛生芽。实验表明，利用本发明，可以大幅度提高杨树叶盘和叶柄的分化率，杨树叶片及叶柄分化丛生芽数量较对照组均增加1.5倍以上，叶片及叶柄分化丛生芽鲜重较对照组分别增加3倍和5倍以上，表明本发明能有效促进杨树外植体分化，最终可以显著提高杨树外植体分化成幼苗的数量。

Description

一种利用抽真空处理促进杨树外植体大量、快速分化成芽的 方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种利用抽真空处理促进杨树外植体大量、快速分化成芽的方法。
背景技术
杨树(Populus spp.)因其成材早、产量高、易繁殖、适应性强等特性，是我国最为重要的国土绿化和工业用材树种之一。第九次全国森林资源清查数据显示，我国杨树林总面积居世界首位。中国也是世界杨树集中分布区之一，占世界杨树种类的50％以上，乡土杨树资源丰富。杨树良种组培快繁技术是可以提供大量优质种苗的繁殖技术之一，但完善、高效的组培再生体系仅限于少数杨树树种或基因型，大部分乡土树种或生产上大量推广应用的优良品种仍不具备组培再生体系。此外，由于杨树基因组较小、雌雄异株、易于遗传操作等特点，被视为木本植物遗传研究的模式树种。建立高效快速的组织培养技术是良种扩繁的基础，同时也可以为植物的遗传转化提供大量的基础材料，为建立植物遗传转化体系提供有力支撑。
现有杨树组培体系大多以叶盘离体再生为基础，但存在叶盘分化率低、耗时长、丛生芽数量少等缺点，不足以满足市场对良种的需求，需要提供更有效地杨树离体快繁方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种利用抽真空处理促进杨树外植体大量、快速分化成芽的方法，解决目前杨树组培过程中分化成芽的效率低的问题。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种利用抽真空处理促进杨树外植体大量、快速分化成芽的方法，包括：将杨树外植体放入处理液中进行抽真空处理，然后在分化培养基上形成丛生芽。
优选地，具体步骤包括：
(1)选取杨树组培苗叶片，去除叶片的边缘部分，切成若干叶盘或叶柄；
(2)将叶盘或叶柄放入处理液，置于真空泵中进行抽真空处理；
(3)取出叶盘或叶柄后立即用吸水纸吸去表面液体，将叶片背面朝下置于装有分化培养基的培养皿中，在一定条件下培养叶盘和叶柄，使其分化成芽；
(4)所有外植体材料在分化培养基培养30天后，更换一次新配制的分化培养基继续培养30天；然后将所有材料转移至芽伸长培养基上培养。
优选地，所述的利用抽真空处理促进杨树外植体大量、快速分化成芽的方法中，所述抽真空的压力值为0.08Mpa。
优选地，步骤(2)所述抽真空具体时间为3-15min。
优选地，步骤(2)所述抽真空具体时间为12min。
优选地，步骤(2)中所述处理液为1/2MS。
优选地，步骤(3)中所述分化培养基为：MS+蔗糖30g/L+Phytagel 2.5g/L(或琼脂8g/L)+6-BA 0.4mg/L+TDZ 0.01mg/L+NAA 0.1mg/L。
优选地，步骤(4)中所述芽伸长培养基为：MS+蔗糖30g/L+Phytagel 2.5g/L(或琼脂8g/L)+6-BA 0.4mg/L+NAA 0.1mg/L。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供了以山新杨组培苗叶片与叶柄为材料，进行抽真空处理的组织培养技术，可以明显提高杨树叶盘和叶柄的分化率，杨树叶片分化丛生芽数量较对照组增加1.5倍以上，叶片分化丛生芽鲜重较对照组增加3倍以上；叶柄分化丛生芽数量较对照组增加1.5倍以上，叶柄分化苗鲜重较对照组增加5倍以上；表明本发明能有效促进杨树外植体分化，最终可以显著提高杨树外植体分化成幼苗的数量，可以在杨树的组培快繁中进行大力推广使用，促进杨树组培快繁技术的发展。
附图说明
图1为抽真空组(1-5组)和与空白对照(0组)培养60天时山新杨叶盘分化情况照片图；
图2为抽真空组(1-5组)和与空白对照(0组)培养60天时山新杨叶盘分化率统计分析结果图；
图3为抽真空组(1-5组)和与空白对照(0组)培养60天时山新杨叶盘丛生芽鲜重统计分析结果图；
图4为抽真空12min组与空白对照组在不同培养时期山新杨叶盘分化芽数目统计分析结果图，注：H代表丛生芽高度；
图5为抽真空组(1-5组)和与空白对照(0组)培养60天时山新杨叶柄分化情况照片图；
图6为抽真空组(1-5组)和与空白对照(0组)培养60天时山新杨叶柄分化率统计分析结果图；
图7为抽真空组(1-5组)和与空白对照(0组)培养60天时山新杨叶柄丛生芽鲜重统计分析结果图；
图8为抽真空12min组与空白对照组在不同培养时期山新杨叶柄分化芽数目统计分析结果图，注：H代表丛生芽高度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可通过商业途径购买。
实施例1：
1、培养基配制
分化培养基为：MS+蔗糖30g/L+Phytagel 2.5g/L(或琼脂8g/L)+6-BA 0.4mg/L+TDZ 0.01mg/L+NAA 0.1mg/L，调整pH值为5.80-5.85。
抽真空处理液：1/2MS处理液，调整pH值为5.80-5.85。
将以上培养基121℃灭菌20min，待培养基冷却至60℃时倒入直径9cm、高2cm的圆形玻璃培养皿中，每皿25mL，待培养基完全凝固后备用。
2、采用生长良好、苗龄为1.5个月左右的山新杨(Populus davidiana×P.bolleana)组培幼苗为实验材料，选取顶芽以下第3-4片完全展开叶，在超净工作台上用手术剪剪断叶柄远轴端(即叶柄与叶片交界部位)；将选取的叶片置于无菌大玻璃皿上，利用手术刀将叶片边缘去除，再将其切成2.25cm2左右的叶盘。
3、用镊子将一部分切好的叶盘直接放入分化培养基，每皿5个叶盘，10个叶盘为一组，标记为0组，3次重复；另外一部分叶盘放入盛有150mL 1/2MS处理液的三角瓶中，设置5个组别，标记为1、2、3、4、5组，每组10个叶盘，3次重复。0组为空白对照，不进行抽真空处理；1-4组依次置于真空泵(美国GEST真空泵ROA-P201)中抽真空处理3min、6min、9min、12min、15min，压力值为0.08Mpa。
4、每一组抽真空处理完成后，立即用镊子将叶盘从三角瓶中取出，并放入无菌吸水纸上去除表面液体；然后将叶盘背面朝下置于分化培养基中，每皿5个；使用Parafilm封口膜封口，并标记好日期与组别。
5、待所有处理完成后，将各组培养皿放在组织培养室进行培养，培养条件为：16h光照/8h黑暗，光通量为100μmol·m-2·s-1、湿度55％、温度23℃。
6、培养30天时，0-5组所有材料更换一次新配制的分化培养基；培养60天时，拍照记录叶盘分化情况，统计叶盘分化率，叶盘分化率＝长出丛生芽的叶盘数/用于丛生芽分化的叶盘数×100％。
7、培养60天时，0-5组每一组随机选取5个带有丛生芽的叶盘，用万分之一天平逐一称取鲜重，重复3次，记录数据并进行统计分析。
本实施例中，以山新杨叶盘作为离体快速繁殖的起始材料，诱导叶片细胞脱分化和再分化形成丛生芽，分别统计抽真空组(1-5组)和与空白对照(0组)叶盘分化率与丛生芽生长情况，结果表明：(1)将叶盘置于分化培养基培养之前进行抽真空处理，可以明显促进叶盘分化成芽(图1)；(2)与未进行抽真空处理的对照组相比，抽真空组(1-5组)的叶盘分化率明显提高(图2)；(3)与未进行抽真空处理的对照组相比，抽真空处理可以显著促进丛生芽的生长，反应在培养材料的鲜重上，抽真空处理显著提高培养材料的鲜重(图3)；(4)在相同的培养条件和培养时间下，抽真空12min处理(第4组)叶盘的分化率最高，达到84.42％，且第4组带芽叶盘的鲜重最高，是空白对照组的3倍以上，可见，在分化培养前对叶盘进行抽真空12min处理效果最优(图1-3)。
实施例2：
以生长良好、苗龄为1.5个月左右的山新杨组培幼苗为实验材料，实施步骤与实施例1基本相同。不同之处在于：
1、切好的叶盘仅分为2组：空白对照组和抽真空处理12min组，每组10个叶盘，3次重复；
2、空白对照组和抽真空处理12min组在分化培养60天后，所有材料转移至芽伸长培养基中；
3、芽伸长培养基为：MS+蔗糖30g/L+Phytagel 2.5g/L(或琼脂8g/L)+6-BA0.4mg/L+NAA 0.1mg/L，调整pH值为5.80-5.85。121℃灭菌20min，待培养基冷却至60℃是倒入直径5cm、高9.5cm的圆形玻璃培养瓶中，每瓶20mL，待培养基完全凝固后备用；
4、根据不定芽高度(H)分为3组(0.5cm＞H≥0.3cm、1cm＞H≥0.5cm、H≥1cm)，分别在培养80天、87天、94天、101天和108天时记录不同高度的不定芽数目，并进行统计分析。
本实施例中，以山新杨叶盘作为离体快速繁殖的起始材料，仅对叶盘进行抽真空12min处理，统计抽真空组和与空白对照组叶盘在不同培养阶段的不定芽数目，结果表明：抽真空12min处理不仅可以显著提高叶盘分化的不定芽总数，还能增加芽高度(H)在0.5cm以上不定芽的数目及其占比(图4)，抽真空12min处理有效促进了杨树外植体大量、快速分化成芽。
实施例3：
以生长良好、苗龄为1.5个月左右的山新杨组培幼苗为实验材料，实施步骤与实施例1基本相同。不同之处在于在超净工作台上，用手术剪剪断叶柄近轴端(即叶柄与茎连接的部位)，将带叶柄的叶片置于无菌大玻璃皿上，利用手术刀切下叶柄，仅保留叶柄待用；抽真空处理后，将叶柄置于分化培养基上培养，每皿5叶柄，重复3次。
本实施例中，以山新杨叶柄作为离体快速繁殖的起始材料，诱导叶柄细胞脱分化和再分化形成丛生芽，分别统计抽真空组(1-5组)和与空白对照(0组)叶柄分化率与丛生芽生长情况，结果表明：(1)将叶柄置于分化培养基培养之前进行抽真空处理，可以明显促进叶柄分化成芽，且分化情况要明显优于图1的叶盘分化(图5)；(2)与未进行抽真空处理的对照组相比，抽真空组(1-5组)的叶柄分化率明显提高(图6)；(3)与未进行抽真空处理的对照组相比，抽真空处理可以显著促进丛生芽的生长，反应在培养材料的鲜重上，抽真空处理显著提高培养材料的鲜重(图7)；(4)在相同的培养条件和培养时间下，抽真空12min处理(第4组)叶柄的分化率最高，达到97.78％，且第4组带芽叶柄的鲜重最高，是空白对照组的5倍以上，可见，在分化培养前对叶盘进行抽真空12min处理效果最优(图5-7)；(5)现有杨树组培体系大多以叶盘离体再生为基础，本实施例中，以山新杨叶柄作为离体快速繁殖的起始材料，诱导叶柄细胞脱分化和再分化形成丛生芽，拓宽了杨树离体快繁外植体选择范围。
实施例4
以生长良好、苗龄为1.5个月左右的山新杨组培幼苗为实验材料，实施步骤与实施例3基本相同。不同之处在于：
1、切好的叶柄仅分为2组：空白对照组和抽真空处理12min组，每组10个叶盘，3次重复；
2、空白对照组和抽真空处理12min组在分化培养60天后，所有材料转移至芽伸长培养基中；
3、芽伸长培养基为：MS+蔗糖30g/L+Phytagel 2.5g/L(或琼脂8g/L)+6-BA0.4mg/L+NAA 0.1mg/L，调整pH值为5.80-5.85。121℃灭菌20min，待培养基冷却至60℃是倒入直径5cm、高9.5cm的圆形玻璃培养瓶中，每瓶20mL，待培养基完全凝固后备用；
4、根据不定芽高度(H)分为3组(0.5cm＞H≥0.3cm、1cm＞H≥0.5cm、H≥1cm)，分别在培养80天、87天、94天、101天和108天时记录不同高度的不定芽数目，并进行统计分析。
本实施例中，以山新杨叶柄作为离体快速繁殖的起始材料，仅对叶柄进行抽真空12min处理，统计抽真空组和与空白对照组叶柄在不同培养阶段的不定芽数目，结果表明：抽真空12min处理不仅可以显著提高叶柄分化的不定芽总数，还能增加芽高度(H)在0.5cm以上不定芽的数目及其占比(图8)，抽真空12min处理有效促进了杨树外植体大量、快速分化成芽。

Claims (3)

1.一种利用抽真空处理促进杨树外植体大量、快速分化成芽的方法，其特征在于，将杨树外植体放入处理液中进行抽真空处理，然后在分化培养基上形成丛生芽，具体步骤包括：
(1)选取杨树组培苗叶片，去除叶片的边缘部分，切成若干叶盘或叶柄；
(2)将叶盘或叶柄放入处理液，置于真空泵中进行抽真空处理；
(3)取出叶盘或叶柄后立即用吸水纸吸去表面液体，将叶片背面朝下置于装有分化培养基的培养皿中培养，使其分化成芽；
步骤(2)中所述抽真空的压力值为0.08Mpa；
步骤(2)中所述抽真空处理具体时间为3-15min；
步骤(3)中所述分化培养基为：MS+蔗糖30g/L+Phytagel 2.5g/L+6-BA 0.4mg/L+TDZ0.01mg/L+NAA 0.1mg/L或MS+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+6-BA 0.4mg/L+TDZ 0.01mg/L+NAA0.1mg/L。
2.根据权利要求1所述的利用抽真空处理促进杨树外植体大量、快速分化成芽的方法，其特征在于，步骤(2)中所述抽真空处理具体时间为12min。
3.根据权利要求1所述的利用抽真空处理促进杨树外植体大量、快速分化成芽的方法，其特征在于，步骤(2)中所述处理液为1/2MS。
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簸箕柳组培再生体系的建立;孙永莲等;《南京林业大学学报(自然科学版)》;第43卷(第02期);第31-37页 *

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