CN102373235A

CN102373235A - 一种将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法

Info

Publication number: CN102373235A
Application number: CN201110314837XA
Authority: CN
Inventors: 黄敏仁; 谭碧玥; 陈英; 胥猛; 徐立安; 潘惠新; 王光萍; 王明庥
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2011-10-17
Filing date: 2011-10-17
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2031-10-17
Also published as: CN102373235B

Abstract

本发明公开了一种将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，利用PEG-Ca²⁺将含有外源基因的瞬时表达载体转入杨树原生质体中，经培养，使外源基因在原生质体中表达。本发明方法构建得到杨树原生质体瞬时表达系统，易于操作和实现，为开展杨树功能基因研究开辟广阔天地，该方法的转化效率可达70％。

Description

一种将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通过化学诱导将外源基因转入杨树原生质体并进行瞬时表达的方法。

背景技术

杨树以其物种丰富、分布广、适应性强、生长迅速、基因组较小、遗传转化较易等特点，已作为林木中的模式物种(Bradshaw et al.，2000；Brunner et al.，2004)，在生理生化、遗传学、分子生物学和细胞生物学等领域开展广泛研究。2006年美国能源部完成杨树全基因组测序计划(Tuskan et al.)，为杨树甚至林木功能基因组研究奠定了坚实的基础，是林木基础性研究的一大突破，并且对林木育种和改良产生深远的影响。

目前为止，已有多种基于分子和基因组水平的研究技术成功运用于杨树，如基因组测序、EST库的收集、芯片技术、转基因技术等(Jansson and Douglas 2007)。其中，以农杆菌介导的转基因方法已成为研究杨树基因功能的最普遍且行之有效的技术。但是由于转化效率较低、获得转基因植株周期长等因素，限制该技术对杨树基因功能进行大规模地筛选和分析。因此，我们需要寻找一种简便、快捷的方法来更高效地研究基因功能。

在植物中，原生质体瞬时表达分析系统可简便、高效地分析植物基因的功能(Sheen2001)。植物原生质体已去除细胞壁，是一个以细胞为基础的，可供广泛研究的实验平台。另外，通过多种手段可将像DNA、RNA和蛋白质等大分子转入原生质体中，这些手段包括：PEG融合、电穿孔和显微注射等。这样，植物中的信号传导、代谢途径和转录翻译机制可被瞬时操控，以此来研究植物的自主调节和响应(Yoo et al.2007)。这一系统已在拟南芥、玉米(Sheen 2001)、烟草(Locatelli et al.2003)、藜科植物(Lung et al.2010)、胡椒(Jeon et al.2007)等植物中应用，但是在杨树中该平台还未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用PEG-Ca²⁺将外源基因高效转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，以便于更有效地筛选和分析杨树基因的功能。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，使用纤维素酶和果胶酶将杨树叶肉酶解成原生质体，所得到的原生质体经分离、纯化和预处理后，利用PEG-Ca²⁺将含有外源基因的瞬时表达载体转入杨树原生质体中，经培养，使外源基因在原生质体中表达。

本发明中所述的瞬时表达载体通常为含有外源目的基因、小于10kbp的过量表达载体质粒，该质粒通常携带植物35s启动子和终止子，以便于植物中表达。

利用PEG-Ca²⁺将含有外源基因的瞬时表达载体转入杨树原生质体中，经培养，使外源基因在原生质体中表达。

上述方法具体包括如下步骤：

(1)酶液的制备：将15-25mM pH为5.7的MES、0.4-0.8M甘露醇、18-22mM KCl和水混合，70℃水浴3-5min；再加入8-240U/ml纤维素酶(即每1mL反应液中加入10-240U纤维素酶)和5-20U/ml果胶酶(即每1mL反应液中加入5-20U果胶酶)，55℃水浴5-15min；用冰降至室温，然后加入8-12mM CaCl₂和0.05g/100ml-0.1g/100ml BSA，混匀，过滤灭菌，备用；

(2)杨树原生质体的制备：采用继代后生长较好的杨树组培苗，选取上部完全展叶的2-3片较嫩的叶片，切得尽量的细，用锋利的刀片切成叶条，并去除中脉，放入步骤(1)制得的酶液中浸透两面，28℃黑暗中静置酶解2-6h，静置前可于黑暗中抽真空半小时；

(3)原生质体收集和纯化：将步骤(2)酶解后的物料加入预冷的等体积的W5溶液，用200目细胞筛或75μm的滤膜过滤到圆底管中，圆底管放入冰中，使其保持低温状态；700-1200rpm 4℃低温离心3-9min；吸除上清，沉淀加入1-2ml的W5溶液，轻轻混匀，用血球计数板计数，计算稀释成4-10*10⁵/ml时所需溶液的体积X；在黑暗条件下冰上放置0.5-1.5h，使原生质体基本静置于管底，吸除上清；加入X体积的MMG溶液，轻轻重悬，若立即使用则置于室温，若保存则置于3-6℃；

(4)原生质体转化：在EP管中加入10-20μg含有外源基因的质粒，质粒体积为A；再加入步骤(3)得到的约4-10*10⁴个原生质体，体积为B；最后加入体积为A+B的PEG-Ca²⁺溶液，轻轻混匀，室温孵育12-18min，孵育结束后加入4倍体积以上的W5溶液，混匀；800-1500rpm水平离心2-10min，吸除上清；在圆底管中加入200ul-1ml WI溶液，25-28℃弱光培养15-48h。

步骤(3)或(4)中，所述的W5溶液配方为：2mM pH为5.7的MES，154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，溶剂为水，22-28℃保存。

步骤(3)中，所述的MMG溶液配方为：4mM pH为5.7的MES，0.3-0.5M甘露醇，15mM MgCl₂，溶剂为水，22-28℃保存。

步骤(4)中，所述的PEG-Ca²⁺溶液配方为：20-40g/100ml PEG4000，0.2-0.4M甘露醇、100mM CaCl₂，溶剂为水。PEG-Ca²⁺溶液一般现配现用，应在转化试验开始前1小时配好，使其慢慢溶解，用45μm的膜过滤灭菌。

步骤(4)中，所述的WI溶液配方为：4mM pH为5.7的MES，0.4M-0.8M甘露醇、20mM KCl，溶剂为水，室温保存。

步骤(4)中，所述的含有外源基因的质粒为含有外源目的基因，小于10kbp的过量表达载体质粒，该质粒携带植物启动子和终止子，以便于植物中表达。在目的基因片段的前段或后端可含有红色或绿色荧光报告基因，hyc、HA、GST、His标签等质粒载体。常用质粒有：p2HAGW7.0，p2GWF7.0，p2FGW7.0，p2RGW7.0，p2GWR7.0，pFRK1::luc等。

本发明适用于杨树组培苗，例如NL895、214、T89、毛果杨等。

本发明不局限于某种基因或者某种质粒或者某种具体的杨树品种，本发明方法适用于将所有外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达。

有益效果：本发明方法构建得到杨树原生质体瞬时表达系统，易于操作和实现，为开展杨树功能基因研究开辟广阔天地，该方法的转化效率可达70％。

附图说明

图1是杨树叶肉经酶解和纯化后得到的原生质体(比例尺＝20μm)。从图1可以看出，本发明可以得到状态均一、生活的原生质体。

图2是杨树原生质体经PEG转化后的瞬时表达效率(比例尺＝20μm)。从图2可以看出，本发明所获得的转化效率达到80％以上。

图3是在杨树中eGFP蛋白的亚细胞定位情况(比例尺＝4μm)。从图3可以看出，含有eGFP融合蛋白在整个细胞中都可以表达，该技术可实现亚蛋白定位。

图4是PEG浓度对原生质体转化的影响。

图5是质粒DNA含量对转化效率的影响。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1～4以含有融合蛋白eGFP的质粒p2FGW7.0为基础进行研究。

实施例1：不同酶液组合对杨树原生质体分离的影响

在配制酶液中，根据植物原生质体分离常用的酶类，选取纤维素酶R-10(CellulaseR10，5000U/g)、RS(Cellulase RS，16000U/g)、Sigma纤维素酶(840U/ml)，果胶酶Y23(Pectolyase Y23，1000U/g)、Sigma果胶酶(Pectinase(sigma)，3800U/ml)，果胶酶R-10(Macerozyse R10，3000U/g)，分别按不同组合溶于酶液中，进行杨树叶肉原生质体的分离实验，酶类组合及浓度如表1。

表1酶液组成及浓度

实验结果表明，在各种酶液组成条件下分离得到的叶肉原生质体的产量和质量各不相同。在相同种类的酶液组合中，随着酶浓度的增加，原生质体产量也会相应的增加，但酶解液中的细胞碎片数量也会逐渐增多，而较多的细胞碎片会对后续的纯化和转化有不利的影响。

由表2中看出，果胶酶Y23在酶解杨树叶片中发挥重要的作用。组合4-6中没有添加Y23，而是采用R10进行酶解反应。经过6h的酶解，原生质体产量很低，基本无法使用。用Y23代替R10后，酶解效率显著提高。从1-3和7-8号组合看到，经过3-4h酶解，可得到2-10×10⁶的原生质体产量。另外，比较组合1-3，使用纤维素酶RS所得产量远高于R10酶解所获得的原生质体。但是在含有RS的组合中，所产生的碎片较多，对后续的纯化和转染实验造成一定的困难。组合7、8的酶解效果优于其它组合，经3h的酶解，就能达到组合1-3酶解4h所获得的产量。原生质体的产量变化大致与酶液浓度呈正相关，其产量随着混合酶液中各种酶浓度的增加而增加。对比组合7和8，可以看出即使用同种酶，但由于酶浓度提高了一倍，就可以获得超过两倍的原生质体产量，酶解效率更高。

表2不同酶液组成及浓度对杨树叶肉原生质体分离的影响

除此之外，我们将分离完成后，分别经24h、48h和72h培养的原生质体进行FDA活力测定，以此判断不同种类酶组合对原生质体活性的影响。从表2中看出，在组合1-3中，纤维素酶RS比R10对原生质体活性的影响更大。经过24h的培养后，均有90％的生活率，差别不大；但是经过72h培养，生活率有明显的差别，单独使用纤维素酶RS的生活率仅有46.52％，而使用纤维素酶R10的生活率有72.38％。而在组合7、8中，不同时间的生活率差别不大。两种组合经培养72h后，仍达到80％以上的生活率。但是较高浓度酶液对原生质体活性还是有一定的影响。经过72h的培养，组合7的酶液浓度比组合8低，但可获得更高的生活率，其相差在3％左右。将1-3和7、8这两种不同类型的酶液组合相比较，明显可以看出组合7、8所使用的酶要优于组合1-3，对比生活率相差大于15％。综合上述酶解时间，获得产量，生活率等条件的考虑，我们选择组合8为最优的酶解组合(图2)，即16.8u/ml纤维素酶和19u/ml果胶酶，酶解2.5-3h能获得足够的产量。

实施例2：PEG浓度对转化效率的影响

PEG作为转化时的媒介，使原生质体和质粒凝聚。本实验选用PEG4000对杨树叶肉原生质体进行转化。所配置PEG溶液的初始浓度梯度是20％g/ml、30％g/ml和40％g/ml，转化体系中加入约6×10⁴个原生质体，质粒DNA10μg和不同浓度的PEG4000，加入的PEG4000为总转化体系体积的1/2，即转化时PEG的浓度分别为10％，15％，20％。25℃孵育15min。转化前，PEG溶液经0.45μm混合纤维素微孔滤膜过滤除菌。实验重复三次。

由于转化时所加PEG的体积是转化总体积的1/2，因此在转化时其终浓度分别为10％、15％和20％。经过转化后约24h培养，用荧光显微镜观察，成功转入报告基因eGFP的原生质体会发出绿色荧光。计数统计每个视野成功转化的原生质体个数占总原生质体数的比例。由柱状图4可得，随着PEG浓度的提高，转化效率逐渐升高。尤为突出的是使用30％PEG的转化效率要高于20％的转化效率，而在30％PEG与40％PEG两条件间相比差别不大。但是使用40％PEG转化后经过一段时间的培养，原生质体的生活率明显下降，转化率从24h的80％下降到72h的50％。而用30％PEG转化后，经72h培养仍能达到70％左右。这说明较高浓度的PEG会影响原生质体的生活状态。

综合考虑上述方面，我们选择杨树叶肉原生质体转化中最适PEG浓度为30％。

实施例3：

质粒DNA作为载体，将目的基因带入原生质体细胞中并且短时间内进行表达。其含量对转化效率有较大的影响。依照上述转化方法，向转化体系中加入不同质量的质粒，检测其对转化效率的影响。设定质粒梯度为：5μg，10μg和15μg。转化体系中加入不同质量的质粒，约6×10⁴个原生质体和已优化得到的PEG4000。其中，所加PEG4000为总转化体系体积的1/2，25℃孵育15min。实验重复三次。

根据图5所示，当原生质体细胞数量一定时，转化效率在一定范围内会随着质粒浓度的增加而升高。实验将原生质体数稳定在6×10⁴，当加入10μg质粒时转化效率能达到80％；而加入5μg质粒，其转化效率仅为50％，之间相差30％左右。但是，当加入15μg质粒后，其转化效率与加入10μg质粒时的差别不大，仅提高5％。另外，根据不同培养时间所得生活率来看，外源质粒DNA对原生质体的活性影响不大。在任一浓度梯度下，随着培养时间的增长其生活率的下降幅度不大，并且呈均一趋势。由此说明质粒DNA含量对细胞生活率的影响较小。

实施例4：

先在已灭菌的10ml离心管中加入20mM pH为5.7的MES、0.6M甘露醇、20mMKCl，70℃水浴5min；再加入Sigma纤维素酶16.8U/ml和Sigma果胶酶19U/ml，55℃水浴10min；用冰降至室温，然后加入10mM CaCl₂和0.05％BSA；用45μm的膜过滤灭菌。

使用生根继代后长势较好、叶片平整的’NL895’杨组培苗，选取上部完全展叶的3片较嫩的叶片，用锋利的刀片切成叶条，切叶条时需去除中脉，叶条宽度在1mm左右；将叶条放入酶液中浸透两面；28℃黑暗中静置酶解2h。

酶解结束后，加入预冷的等体积的W5溶液，用200目细胞筛或75μm的滤膜过滤到圆底管中，圆底管放入冰中，使其保持低温状态；900rpm 4℃低温离心5min；小心地吸除上清，加入2ml的W5溶液，轻轻混匀，用血球计数板计数，计算稀释成8×10⁵/ml时所需溶液的体积X；在黑暗条件下冰上放置1h，使原生质体基本静置于管底，小心吸除上清；加入X体积的MMG溶液，轻轻重悬。

在2ml离心管中加入浓度为1μg/μl的p2FGW7.0质粒10μl；再加入100μl原生质体；最后加入110μl的PEG-Ca²⁺溶液，轻轻混匀，室温孵育15min。孵育结束后加入880μl的W5溶液，小心颠倒混匀；1100rpm水平离心5min，小心吸除上清；在圆底管中加入WI溶液100μl，25℃弱光培养24h。

24h后在荧光显微镜下检测其转化效率可达78-83％。

本实施例中所述的W5溶液配方为：2mM pH为5.7的MES，154mM NaCl，125mMCaCl₂和5mM KCl，22-28℃保存。

本实施例中所述的MMG溶液配方为：4mM pH为5.7的MES，0.4M甘露醇和15mMMgCl₂，22-28℃保存。

本实施例中所述的PEG-Ca²⁺溶液配方为：30％(g/ml)PEG4000，0.3M甘露醇和100mM CaCl₂。现配现用，应在转化试验开始前1小时配好，使其慢慢溶解，用45μm的膜过滤灭菌。

本实施例中所述的WI溶液配方为：4mM pH为5.7的MES，0.6M甘露醇和20mMKCl，22-28℃保存。

实施例5：

先在已灭菌的10ml离心管中加入20mM pH为5.7的MES、0.5M甘露醇、22mMKCl，70℃水浴5min；再加入10U/ml纤维素酶R10，160U/ml纤维素酶RS和5U/ml果胶酶Y23，55℃水浴5min；用冰降至室温，然后加入8mM CaCl₂和0.075％(g/ml)BSA；用45μm的膜过滤灭菌。

使用生根继代后长势较好、叶片平整的T89组培苗，选取上部完全展叶的3片较嫩的叶片，用锋利的刀片切成叶条，切叶条时需去除中脉，叶条宽度在1mm左右；将叶条放入酶液中浸透两面；28℃黑暗中静置酶解4h。

酶解结束后，加入预冷的等体积的W5溶液，用200目细胞筛或75μm的滤膜过滤到圆底管中，圆底管放入冰中，使其保持低温状态；1200rpm 4℃低温离心5min；小心地吸除上清，加入2ml的W5溶液，轻轻混匀，用血球计数板计数，计算稀释成6×10⁵/ml时所需溶液的体积X；在黑暗条件下冰上放置1h，使原生质体基本静置于管底，小心吸除上清；加入X体积的MMG溶液，轻轻重悬。

在2ml离心管中加入浓度为1μg/μl的p2FGW7.0质粒10μl；再加入100μl原生质体；最后加入110μl的PEG-Ca²⁺溶液，轻轻混匀，室温孵育12min。孵育结束后加入880μl的W5溶液，小心颠倒混匀；1100rpm水平离心5min，小心吸除上清；在圆底管中加入WI溶液100μl，25℃弱光培养24h。

24h后在荧光显微镜下检测其转化效率可达73-79％。

本实施例中所述的W5水溶液配方为：2mM pH为5.7的MES，154mM NaCl，125mMCaCl₂和5mM KCl，22-28℃保存。

本实施例中所述的MMG水溶液配方为：4mM pH为5.7的MES，0.3M甘露醇和15mMMgCl₂，22-28℃保存。

本实施例中所述的PEG-Ca²⁺水溶液配方为：40％(g/ml)PEG4000，0.4M甘露醇和100mM CaCl₂。现配现用，应在转化试验开始前1小时配好，使其慢慢溶解，用45μm的膜过滤灭菌。

本实施例中所述的WI水溶液配方为：4mM pH为5.7的MES，0.5M甘露醇和20mMKCl，22-28℃保存。

实施例6：

先在已灭菌的10ml离心管中加入25mM pH为5.7的MES、0.4M甘露醇、20mMKCl，70℃水浴5min；再加入240U/ml纤维素酶RS和5U/ml果胶酶Y23，55℃水浴5min；用冰降至室温，然后加入12mM CaCl₂和0.1％(g/ml)BSA；用45μm的膜过滤灭菌。

使用生根继代后长势较好、叶片平整的毛果杨组培苗，选取上部完全展叶的3片较嫩的叶片，用锋利的刀片切成叶条，切叶条时需去除中脉，叶条宽度在1mm左右；将叶条放入酶液中浸透两面；28℃黑暗中静置酶解6h。

酶解结束后，加入预冷的等体积的W5溶液，用200目细胞筛或75μm的滤膜过滤到圆底管中，圆底管放入冰中，使其保持低温状态；800rpm 4℃低温离心9min；小心地吸除上清，加入1ml的W5溶液，轻轻混匀，用血球计数板计数，计算稀释成4×10⁵/ml时所需溶液的体积X；在黑暗条件下冰上放置0.5h，使原生质体基本静置于管底，小心吸除上清；加入X体积的MMG溶液，轻轻重悬。

在2ml离心管中加入浓度为1μg/μl的p2RGW7.0质粒20μl；再加入100μl原生质体；最后加入120μl的PEG-Ca²⁺溶液，轻轻混匀，室温孵育12min。孵育结束后加入880μl的W5溶液，小心颠倒混匀；1100rpm水平离心5min，小心吸除上清；在圆底管中加入WI溶液100μl，25℃弱光培养24h。

24h后在荧光显微镜下检测其转化效率可达70-87％。

本实施例中所述的MMG水溶液配方为：4mM pH为5.7的MES，0.5M甘露醇和15mMMgCl₂，22-28℃保存。

本实施例中所述的PEG-Ca²⁺水溶液配方为：40％(g/ml)PEG4000，0.2M甘露醇和100mM CaCl₂。现配现用，应在转化试验开始前1小时配好，使其慢慢溶解，用45μm的膜过滤灭菌。

本实施例中所述的WI水溶液配方为：4mM pH为5.7的MES，0.4M甘露醇和20mMKCl，22-28℃保存。

实施例7：

先在已灭菌的10ml离心管中加入15mM pH为5.7的MES、0.8M甘露醇、22mMKCl，70℃水浴5min；再加入Sigma纤维素酶8.4U/ml和Sigma果胶酶9.5U/ml，55℃水浴15min；用冰降至室温，然后加入12mM CaCl₂和0.05％(g/ml)BSA；用45μm的膜过滤灭菌。

使用生根继代后长势较好、叶片平整的杨树’214’组培苗，选取上部完全展叶的2片较嫩的叶片，用锋利的刀片切成叶条，切叶条时需去除中脉，叶条宽度在1mm左右；将叶条放入酶液中浸透两面；28℃黑暗中静置酶解4h。

酶解结束后，加入预冷的等体积的W5溶液，用200目细胞筛或75μm的滤膜过滤到圆底管中，圆底管放入冰中，使其保持低温状态；1200rpm 4℃低温离心4min；小心地吸除上清，加入1ml的W5溶液，轻轻混匀，用血球计数板计数，计算稀释成10×10⁵/ml时所需溶液的体积X；在黑暗条件下冰上放置0.5h，使原生质体基本静置于管底，小心吸除上清；加入X体积的MMG溶液，轻轻重悬。

在2ml离心管中加入浓度为1μg/μl的p2HAGW7.0质粒10μl；再加入100μl原生质体；最后加入110μl的PEG-Ca²⁺溶液，轻轻混匀，室温孵育12min。孵育结束后加入1ml的W5溶液，小心颠倒混匀；1200rpm水平离心3min，小心吸除上清；在圆底管中加入WI溶液500μl，25℃弱光培养16h。

16h后收集，使用western blot检测其转化程度，转化效率为86-97％。

本实施例中所述的MMG水溶液配方为：4mM pH为5.7的MES，0.4M甘露醇和15mMMgCl₂，22-28℃保存。

本实施例中所述的PEG-Ca²⁺水溶液配方为：30％(g/ml)PEG4000，0.3M甘露醇和100mM CaCl₂。现配现用，应在转化试验开始前1小时配好，使其慢慢溶解，用45μm的膜过滤灭菌。

实施例8：

先在已灭菌的10ml离心管中加入15mM pH为5.7的MES、0.8M甘露醇、22mMKCl，70℃水浴3min；再加入10U/ml纤维素酶R10，160U/ml纤维素酶RS和5U/ml果胶酶Y23，55℃水浴5min；用冰降至室温，然后加入8mM CaCl₂和0.075％(g/ml)BSA；用45μm的膜过滤灭菌。

使用生根继代后长势较好、叶片平整的杨树’NL895’组培苗，选取上部完全展叶的3片较嫩的叶片，用锋利的刀片切成叶条，切叶条时需去除中脉，叶条宽度在1mm左右；将叶条放入酶液中浸透两面；28℃黑暗中静置酶解4h。

酶解结束后，加入预冷的等体积的W5溶液，用200目细胞筛或75μm的滤膜过滤到圆底管中，圆底管放入冰中，使其保持低温状态；700rpm 4℃低温离心9min；小心地吸除上清，加入1ml的W5溶液，轻轻混匀，用血球计数板计数，计算稀释成8×10⁵/ml时所需溶液的体积X；在黑暗条件下冰上放置1h，使原生质体基本静置于管底，小心吸除上清；加入X体积的MMG溶液，轻轻重悬。

在2ml离心管中加入浓度为1μg/μl的pFRK1::luc质粒10μl；再加入100μl原生质体；最后加入110μl的PEG-Ca²⁺溶液，轻轻混匀，室温孵育15min。孵育结束后加入1ml的W5溶液，小心颠倒混匀；1500rpm水平离心3min，小心吸除上清；在圆底管中加入WI溶液500μl，25℃弱光培养15h。

15h后收集，使用酶标仪检测其转化程度，转化效率为73-88％。

本实施例中所述的WI水溶液配方为：4mM pH为5.7的MES，0.6M甘露醇和20mMKCl，22-28℃保存。

实施例9：

同实施例4的方法相同，所不同的是，使用的质粒为pGWF7.0，最终转化效率为80-90％。

实施例10：

同实施例4的方法相同，所不同的是，使用的质粒为pUC-SPYNE，最终转化效率为80-85％。

实施例11：

同实施例4的方法相同，所不同的是，使用的质粒为pMDC83，最终转化效率为70-80％。

实施例12：

同实施例4的方法相同，所不同的是，使用的质粒为pH35GY，最终转化效率为70-80％。

实施例13：

同实施例4的方法相同，所不同的是，使用的质粒为pBGGN，最终转化效率为70-80％。

Claims

1.一种将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，利用PEG-Ca²⁺将含有外源基因的瞬时表达载体转入杨树原生质体中，经培养，使外源基因在原生质体中表达。

2.根据权利要求1所述的将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)酶液的制备：将15-25mM pH为5.7的MES、0.4-0.8M甘露醇、18-22mM KCl和水混合，70℃水浴3-5min；再加入8-240U/ml纤维素酶和5-20U/ml果胶酶，55℃水浴5-15min；用冰降至室温，然后加入8-12mM CaCl₂和0.05g/100ml-0.1g/100ml BSA，混匀，过滤灭菌，备用；

(2)杨树原生质体的制备：采用继代后的杨树组培苗，选取上部完全展叶的2-3片较嫩的叶片，用锋利的刀片切成叶条，并去除中脉，放入步骤(1)制得的酶液中浸透两面，28℃黑暗中静置酶解2-6h；

(3)原生质体收集和纯化：将步骤(2)酶解后的物料加入预冷的等体积的W5溶液，用200目细胞筛或75μm的滤膜过滤到圆底管中，圆底管放入冰中，使其保持低温状态；700-1200rpm 4℃低温离心3-9min；吸除上清，沉淀加入1-2ml的W5溶液，轻轻混匀，用血球计数板计数，计算稀释成4-10*10⁵/ml时所需溶液的体积X；在黑暗条件下冰上放置0.5-1.5h，使原生质体基本静置于管底，吸除上清；加入X体积的MMG溶液，重悬，若立即使用则置于室温，若保存则置于3-6℃；

3.根据权利要求2所述的将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(2)中，静置酶解前，酶液浸透后，置于黑暗中抽真空半小时。

4.根据权利要求2所述的将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(3)或(4)中，所述的W5溶液配方为：2mM pH为5.7的MES，154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，溶剂为水，22-28℃保存。

5.根据权利要求2所述的将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的MMG溶液配方为：4mM pH为5.7的MES，0.3-0.5M甘露醇，15mM MgCl₂，溶剂为水，22-28℃保存。

6.根据权利要求2所述的将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的PEG-Ca²⁺溶液配方为：20-40g/100ml PEG4000，0.2-0.4M甘露醇、100mM CaCl₂，溶剂为水。

7.根据权利要求2所述的将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的WI溶液配方为：4mM pH为5.7的MES，0.4M-0.8M甘露醇、20mM KCl，溶剂为水，室温保存。

8.根据权利要求2所述的将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的含有外源基因的质粒为含有外源目的基因，小于10kbp的过量表达载体质粒，该质粒携带植物35s启动子和终止子，以便于植物中表达。

9.根据权利要求2所述的将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，所述的杨树原生质体为杨树组培苗的原生质体。