CN105331574A - 一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，公开了一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法。其包括以下操作步骤：将小桐子组培苗叶片切成0.5～1mm宽的叶条，置于酶解液中避光、22～25℃静置酶解6～7h，过滤洗涤原生质体，加入一定的质粒DNA、原生质体和PEG4000/Ca2+溶液处理后，培养18～40h后在激光扫描共聚焦显微镜下观察。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，特别涉及一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法。
背景技术
小桐子(JatrophacarcasL.)，又名麻疯树，为大戟科麻风树属落叶灌木或小乔木。小桐子种子含油率高，经过加工可制成生物柴油，有着较强的市场开发潜力和应用前景。瞬时表达技术是在相对短的时间内将目标基因转入靶细胞内，获得该基因短暂的高水平表达的技术，是一种快速、方便的研究基因-蛋白质的方法。目前，关于获得小桐子原生质体的技术信息十分匮乏。因此，我们通过已有的拟南芥原生质体制备的方法，调整改进后可以获得小桐子高活性的原生质体，可以用于瞬时表达分析研究。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法，包括以下操作步骤：
(1)称取1.82g甘露醇溶于20ml双蒸水中，配制甘露醇溶液装在灭菌小烧杯里；
(2)在超净台上取小桐子组培苗叶片，用刀片切成0.5～1mm宽的叶条，将切好叶条放入甘露醇溶液中；
(3)将叶条捞出放入预先配好的装有15ml酶解液的50ml锥形瓶中，避光，22～25℃静置酶解6～7h；当酶解液变绿时摇晃锥形瓶，促使原生质体释放出来；
(4)加入15ml等体积预冷的W5溶液，用100目的滤网进行过滤，滤液于50ml圆底离心管中置于冰上；
(5)用离心力80g离心2min，去除上清，沿管壁加入5ml预冷的W5溶液，冰上放置30min，同时取20μl溶液用细胞计数板计数；
(6)原生质体沉淀在离心管底部，去除上清，用MMg溶液将原生质体悬浮制成浓度为2х105个/mL的原生质体悬浮液；
(7)在2ml的灭菌离心管中加入10μl的质粒DNA溶液；质粒DNA溶液中含有10～20μg质粒DNA；
(8)向步骤(7)所得质粒DNA溶液中加入100μl步骤(6)所得原生质体悬浮液；
(9)再加入110μlPEG4000/Ca2+溶液，用剪头的枪头吸打混匀；
(10)22～25℃下避光诱导转化混合物15～30min；
(11)加入440μl的W5溶液稀释转化混合液，然后颠倒离心管使之混合以终止转化反应；
(12)80g离心2min然后去除上清；
(13)再用1ml的W5溶液重悬原生质体于六孔组织培养皿中，在W5溶液中加入50μl/ml氨苄青霉素；
(14)在避光和23℃条件下培养原生质体18～40h；
(15)用离心力80g离心2min，然后去上清，留下10～20μl的溶液，在激光扫描共聚焦显微镜下观察基因瞬时表达；
所述酶解液是按照以下方法制备得到：将纤维素酶R10(CellulaseR10)、离析酶R10(MecerozymeR10)、甘露醇(mannitol)、氯化钾(KCl)和pH为5.7的2-吗啉乙磺酸(MES)加入到ddH2O中混合后，55℃水浴加热10分钟；冷却至室温后加入氯化钙(CaCl2)、牛血清蛋白(BSA)和β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)，用0.45μm滤膜过滤后，得到酶解液；各组分在酶解液中的浓度如下：质量分数2.0﹪的纤维素酶R10、质量分数0.4﹪的离析酶R10、0.4M甘露醇、20mM氯化钾、20mM2-吗啉乙磺酸、10mM氯化钙、质量分数0.1﹪的牛血清蛋白、50μlβ-巯基乙醇；
所述W5溶液是按照以下方法制备得到：将葡萄糖(glucose)、氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2)、氯化钾(KCl)和pH为5.7的2-吗啉乙磺酸混合后，用0.45μm滤膜过滤后使用；各组分在W5溶液中的浓度如下：5mM葡萄糖、154mM氯化钠、125mM氯化钙、5mM氯化钾、2mM2-吗啉乙磺酸；
所述MMg溶液是按照以下方法制备得到：将氯化镁(MgCl2)、pH为5.7的2-吗啉乙磺酸和0.4M甘露醇混合后，用0.45μm滤膜过滤后使用；各组分在MMg溶液中的浓度如下：15mM氯化镁、4mM2-吗啉乙磺酸、0.4M甘露醇；
所述PEG4000/Ca2+溶液是按照以下方法制备得到：将PEG4000、甘露醇和氯化钙(CaCl2)混合后，用无菌水定容至1ml；各组分在PEG4000/Ca2+溶液中的浓度如下：质量体积分数40％(即100ml的溶液中含有40g的PEG4000)的PEG4000、0.2M甘露醇、100mM氯化钙。
步骤(13)所述六孔组织培养皿在使用之前预先用质量分数5％的BSA充分浸润。
步骤(9)所述PEG4000/Ca2+溶液是在使用之前1h配置。
所述离心均是将加速(Accel)与减速(Decel)均调至0档。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明不需要用真空泵于黑暗中抽30min，节省步骤和时间。
(2)本发明改进了酶解液配方，使木本植物的原生质体更易游离出来。
(3)本发明调整了PEG4000/Ca2+溶液的配方，更有效的提高转化效率。
附图说明
图1是使用本发明方法提取的小桐子原生质体，得到的小桐子JcSUT4-GFP瞬时表达图；其中，GFP-Vector为空载体对照、GFP为绿色荧光、Auto-为叶绿体自发荧光、Brightfield为明场、Merged为三个通道的融合。(注：Bar＝10μm)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法
(1)称取1.82g甘露醇溶于20ml双蒸水中，配制甘露醇溶液装在灭菌小烧杯里；
(2)在超净台上取小桐子组培苗叶片，用刀片切成0.5～1mm宽的叶条，将切好叶条放入甘露醇溶液中；
(3)将叶条捞出放入预先配好的装有15ml酶解液的50ml锥形瓶中，避光，22～25℃静置酶解6～7h；当酶解液变绿时摇晃锥形瓶，促使原生质体释放出来；
(4)加入15ml等体积预冷的W5溶液，用100目的滤网进行过滤，滤液于50ml圆底离心管中置于冰上；
(5)用离心力80g离心2min，去除上清，沿管壁加入5ml预冷的W5溶液，冰上放置30min，同时取20μl溶液用细胞计数板计数；
(6)原生质体沉淀在离心管底部，去除上清，用MMg溶液将原生质体悬浮制成浓度为2х105个/mL的原生质体悬浮液；
(7)在2ml的灭菌离心管中加入10μl的质粒DNA溶液；质粒DNA溶液中含有10～20μg质粒DNA；
(8)向步骤(7)所得质粒DNA溶液中加入100μl步骤(6)所得原生质体悬浮液；
(9)再加入110μlPEG4000/Ca2+溶液，用剪头的枪头吸打混匀；
(10)22～25℃下避光诱导转化混合物15～30min；
(11)加入440μl的W5溶液稀释转化混合液，然后颠倒离心管使之混合以终止转化反应；
(12)80g离心2min然后去除上清；
(13)再用1ml的W5溶液重悬原生质体于六孔组织培养皿中，在W5溶液中加入50μl/ml氨苄青霉素；
(14)在避光和23℃条件下培养原生质体18～40h；
(15)用离心力80g离心2min，然后去上清，留下10～20μl的溶液，在激光扫描共聚焦显微镜下观察基因瞬时表达；如图1所示，转入GFP-Vector质粒的原生质体在488nm激光照射下是没有荧光的，转入JcSUT4-GFP载体的原生质体在质膜和叶绿体上能检测到荧光。
所述酶解液是按照以下方法制备得到：将纤维素酶R10(CellulaseR10)、离析酶R10(MecerozymeR10)、甘露醇(mannitol)、氯化钾(KCl)和pH为5.7的2-吗啉乙磺酸(MES)加入到ddH2O中混合后，55℃水浴加热10分钟；冷却至室温后加入氯化钙(CaCl2)、牛血清蛋白(BSA)和β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)，用0.45μm滤膜过滤后，得到酶解液；各组分在酶解液中的浓度如下：质量分数2.0﹪的纤维素酶R10、质量分数0.4﹪的离析酶R10、0.4M甘露醇、20mM氯化钾、20mM2-吗啉乙磺酸、10mM氯化钙、质量分数0.1﹪的牛血清蛋白、50μlβ-巯基乙醇；
所述W5溶液是按照以下方法制备得到：将葡萄糖(glucose)、氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2)、氯化钾(KCl)和pH为5.7的2-吗啉乙磺酸混合后，用0.45μm滤膜过滤后使用；各组分在W5溶液中的浓度如下：5mM葡萄糖、154mM氯化钠、125mM氯化钙、5mM氯化钾、2mM2-吗啉乙磺酸；
所述MMg溶液是按照以下方法制备得到：将氯化镁(MgCl2)、pH为5.7的2-吗啉乙磺酸和0.4M甘露醇混合后，用0.45μm滤膜过滤后使用；各组分在MMg溶液中的浓度如下：15mM氯化镁、4mM2-吗啉乙磺酸、0.4M甘露醇；
所述PEG4000/Ca2+溶液是按照以下方法制备得到：将PEG4000、甘露醇和氯化钙(CaCl2)混合后，用无菌水定容至1ml；各组分在PEG4000/Ca2+溶液中的浓度如下：质量体积分数40％的PEG4000、0.2M甘露醇、100mM氯化钙。
步骤(13)所述六孔组织培养皿在使用之前预先用质量分数5％的BSA充分浸润。
步骤(9)所述PEG4000溶液是在使用之前1h配置。
所述离心均是将加速(Accel)与减速(Decel)均调至0档。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)称取1.82g甘露醇溶于20ml双蒸水中，配制甘露醇溶液装在灭菌小烧杯里；
(2)在超净台上取小桐子组培苗叶片，用刀片切成0.5～1mm宽的叶条，将切好叶条放入甘露醇溶液中；
(3)将叶条捞出放入预先配好的装有15ml酶解液的50ml锥形瓶中，避光，22～25℃静置酶解6～7h；当酶解液变绿时摇晃锥形瓶，促使原生质体释放出来；
(4)加入15ml等体积预冷的W5溶液，用100目的滤网进行过滤，滤液于50ml圆底离心管中置于冰上；
(5)用离心力80g离心2min，去除上清，沿管壁加入5ml预冷的W5溶液，冰上放置30min，同时取20μl溶液用细胞计数板计数；
(6)原生质体沉淀在离心管底部，去除上清，用MMg溶液将原生质体悬浮制成浓度为2х105个/mL的原生质体悬浮液；
(7)在2ml的灭菌离心管中加入10μl的质粒DNA溶液；质粒DNA溶液中含有10～20μg质粒DNA；
(8)向步骤(7)所得质粒DNA溶液中加入100μl步骤(6)所得原生质体悬浮液；
(9)再加入110μlPEG4000/Ca2+溶液，用剪头的枪头吸打混匀；
(10)22～25℃下避光诱导转化混合物15～30min；
(11)加入440μl的W5溶液稀释转化混合液，然后颠倒离心管使之混合以终止转化反应；
(12)80g离心2min然后去除上清；
(13)再用1ml的W5溶液重悬原生质体于六孔组织培养皿中，在W5溶液中加入50μl/ml氨苄青霉素；
(14)在避光和23℃条件下培养原生质体18～40h；
(15)用离心力80g离心2min，然后去上清，留下10～20μl的溶液，在激光扫描共聚焦显微镜下观察基因瞬时表达；
所述酶解液是按照以下方法制备得到：将纤维素酶R10、离析酶R10、甘露醇、氯化钾和pH为5.7的2-吗啉乙磺酸加入到ddH2O中混合后，55℃水浴加热10分钟；冷却至室温后加入氯化钙、牛血清蛋白和β-巯基乙醇，用0.45μm滤膜过滤后，得到酶解液；各组分在酶解液中的浓度如下：质量分数2.0﹪的纤维素酶R10、质量分数0.4﹪的离析酶R10、0.4M甘露醇、20mM氯化钾、20mM2-吗啉乙磺酸、10mM氯化钙、质量分数0.1﹪的牛血清蛋白、50μlβ-巯基乙醇；
所述W5溶液是按照以下方法制备得到：将葡萄糖、氯化钠、氯化钙、氯化钾和pH为5.7的2-吗啉乙磺酸混合后，用0.45μm滤膜过滤后使用；各组分在W5溶液中的浓度如下：5mM葡萄糖、154mM氯化钠、125mM氯化钙、5mM氯化钾、2mM2-吗啉乙磺酸；
所述MMg溶液是按照以下方法制备得到：将氯化镁、pH为5.7的2-吗啉乙磺酸和0.4M甘露醇混合后，用0.45μm滤膜过滤后使用；各组分在MMg溶液中的浓度如下：15mM氯化镁、4mM2-吗啉乙磺酸、0.4M甘露醇；
所述PEG4000/Ca2+溶液是按照以下方法制备得到：将PEG4000、甘露醇和氯化钙混合后，用无菌水定容至1ml；各组分在PEG4000/Ca2+溶液中的浓度如下：质量体积分数40％的PEG4000、0.2M甘露醇、100mM氯化钙。
2.根据权利要求1所述的一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法，其特征在于：步骤(13)所述六孔组织培养皿在使用之前预先用质量分数5％的BSA充分浸润。
3.根据权利要求1所述的一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法，其特征在于：步骤(9)所述PEG4000/Ca2+溶液是在使用之前1h配置。
4.根据权利要求1所述的一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法，其特征在于：所述离心均是将加速与减速均调至0档。
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