CN109266669A - 一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法 - Google Patents

一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法 Download PDF

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隋鑫
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Abstract

一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法，本发明属于蛋白质在植物细胞中的定位方法领域，具体涉及蛋白质在植物保卫细胞中的定位方法领域。本发明的目的是为了解决传统方法进行蛋白质亚细胞定位的周期较长、操作复杂等问题。本发明的快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法为：一、植物表达载体的构建，二、植物叶片保卫细胞的分离，三、保卫细胞的转化，四、保卫细胞孵育培养，五、保卫细胞中蛋白质的定位。本发明提供的方法用于蛋白质在植物保卫细胞中的定位。

Description

一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法
技术领域
本发明属于蛋白质在植物细胞中的定位方法领域，具体涉及蛋白质在植物保卫细胞中的定位方法领域。
背景技术
来源于水母的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)，其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时(395nm和479nm)可高效发射清晰可见的绿色荧光，是监测活细胞和组织内基因表达和蛋白质定位的理想探针，已被广泛地用作报告基因，进行活体的细胞学实验研究。以往关于植物蛋白质在细胞中的定位研究，大多数采用的是烟草叶片瞬时转化法。然而，利用烟草叶片进行蛋白质亚细胞定位的周期较长，一般在转化完成48h后才可进行观察，且对叶片的生长状况有所要求，比较复杂。
采用PEG介导法转化分离获得的植物叶片气孔保卫细胞，检测基因的瞬时表达，不仅可运用于蛋白质的亚细胞定位研究，而且还可以用于基因在特定细胞类型(气孔保卫细胞)的表达调控研究等领域，因而对进一步研究其它新基因的功能和表达调的分离并应用于单细胞组学研究有助于解析并了解保卫细胞参与的生理过程，结合气孔保卫控奠定了技术基础。此外，气孔保卫细胞细胞蛋白亚细胞定位技术更有利于了解目的基因的调控机制。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，而提供一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法。
为达到本发明的目的，本发明的快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法按以下步骤进行：
一、植物表达载体的构建：利用高保真酶pfu系列，根据NCBI中primer blast设计目的基因的引物，以提取植物材料RNA并反转生成的cDNA为模板，通过PCR技术将目的基因克隆并测序；将表达载体和基因片段用相同的内切酶消化回收后，通过连接酶将基因片段连接至表达载体pBI121-EGFP上，然后制备目的基因表达载体质粒；所述目的基因表达载体质粒为在pBI121-GUS基础上将GUS基因切除替换成EGFP基因而获得的载体，以CaMV 35S为启动子，用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记目的蛋白为读码框，并以NOS为终止子的双元表达载体构建得到植物表达载体；
二、植物叶片保卫细胞的分离：在超净工作台中向圆皿里加入20-30mL酶解液，取叶片置于酶解液中剪碎，用封口膜封闭并用锡纸包裹进行酶解，酶解条件为温度22-25℃，摇床转速为30-40rpm，酶解时间4-5h；取干净圆皿，将酶解液过滤，并置于50mL提前4度预冷的离心管中；向过滤得到的液体中添加10-20mL洗涤液，4℃，离心机转速为100g，离心3-5min，去除上清液，得到分离开的保卫细胞；
三、保卫细胞的转化：将步骤二得到分离开的保卫细胞用1-2mL悬浮液悬浮，即得到含有保卫细胞的液体；在离心管中依次加入20-30μL步骤一得到的植物表达载体、200-300μL含有保卫细胞的液体、200-300μL PEG介导液，常温下静置20-30min，得到转化后的保卫细胞；
四、保卫细胞孵育培养：将转化后的保卫细胞加入500-700μL洗涤液，常温，离心机转速为100g，离心1-2min，去除上清液；向得到的沉淀加入700μL-1mL孵育液，悬浮培养保卫细胞，22-25℃培养16-20h；
五、保卫细胞中蛋白质的定位：吸取20-30μL步骤四悬浮培养的细胞液滴在载玻片上，压片结束后直接在激光共聚焦显微镜下进行检测，在保卫细胞中的蛋白质即可发射荧光，即得到本发明的蛋白质在植物叶片保卫细胞中的位置。
优选地，所述酶解液组分按质量分数为MES(2-吗啉乙磺酸)0.04％-0.05％、甘露醇7.2％-7.5％、KCl 0.15％-0.2％、纤维素酶R-10 1.1％-1.2％、离析酶0.5％-0.6％、CaCl2·2H2O 0.15％-0.2％和BSA(牛血清白蛋白)0.1％-0.15％，用1M KOH调节pH至5.7-5.8。
优选地，所述洗涤液的组分按质量分数为甘露醇7.2％-7.3％和MES(2-吗啉乙磺酸)0.04％-0.05％，用1M KOH调节pH至5.7-5.8。
优选地，所述悬浮液的组分按质量分数为MES 0.08％-0.1％、甘露醇7.2％-7.5％和MgCl2·6H2O 0.3％-0.4％，用1M KOH调节pH至5.7-5.8。
优选地，所述将酶解液通过100-120目筛子过滤。
优选地，所述PEG介导液的组分按质量分数为PEG4000 40％-45％、甘露醇3.6％-3.8％和CaCl2·2H2O 0.15％-0.2％，用1M KOH调节pH至5.7-5.8。
优选地，所述孵育液的组分按质量分数为2-吗啉乙磺酸0.04％-0.05％、甘露醇7.2％-7.5％和KCl 1.45％-1.5％，用1M KOH调节pH至5.7-5.8。
优选地，所述激光共聚焦显微镜下进行检测时，GFP通道参数为465-488nm激发，530-546nm发射；红色荧光信号通道参数为620-633nm激发，发射波长为650-665nm。
优选地，所述植物为双子叶植物；所述双子叶植物为杨树。
优选地，所述CaMV 35S启动子的序列如SEQIDNO.1所示。
优选地，所述NOS终止子的序列如SEQIDNO.2所示。
本发明相对于现有技术的优点：
1.操作简单、快速，较利用烟草叶片进行蛋白质亚细胞定位方法可节省20-24h，不需要复杂的仪器设备和试剂，对操作者技术要求低；2.标记效果好，可以明确蛋白质在特定细胞类型-保卫细胞中的定位情况；3.重复性好，一次分离可以获得多个完整的保卫细胞，能够在多视野中看到蛋白质在保卫细胞中的定位情况：本方法可以分离获得大量完整的保卫细胞，便于观察蛋白质在特定类型细胞中的亚细胞定位。4.本方法同样适用于其它植物组织气孔保卫细胞及原生质体的蛋白质亚细胞定位分析。
附图说明
为了更清楚的说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出来了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明PEG介导的植物气孔保卫细胞瞬时表达方法流程示意图；
图2为分离得到的气孔保卫细胞明场图；
图3为红光激发下的气孔保卫细胞图；
图4为绿光激发下的气孔保卫细胞图；
图5为红光与绿光激发的合并图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此附图中描述和出示的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制权利要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
第一实施例
请参阅图1，本发明实施例提供了快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法，该方法按以下步骤进行：
一、植物表达载体的构建：利用高保真酶pfu系列，根据NCBI中primer blast设计目的基因的引物，以提取植物材料RNA并反转生成的cDNA为模板，通过PCR技术将目的基因克隆并测序；将表达载体和基因片段用相同的内切酶消化回收后，通过连接酶将基因片段连接至表达载体pBI121-EGFP上，然后制备目的基因表达载体质粒；所述目的基因表达载体质粒为在pBI121-GUS基础上将GUS基因切除替换成EGFP基因而获得的载体，以CaMV 35S为启动子，用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记目的蛋白为读码框，并以NOS为终止子的双元表达载体构建得到植物表达载体；
二、植物叶片保卫细胞的分离：在超净工作台中向圆皿里加入20-30mL酶解液，取叶片置于酶解液中剪碎，用封口膜封闭并锡纸包裹进行酶解，酶解条件为温度22-25℃，摇床转速为30-40rpm，酶解时间4-5h；取干净圆皿，将酶解液过滤，并置于50mL提前4度预冷的离心管中；向过滤得到的液体中添加10-20mL洗涤液，4℃，离心机转速为100g，离心3-5min，去除上清液，得到分离开的保卫细胞；
三、保卫细胞的转化：将步骤二得到分离开的保卫细胞用1-2mL悬浮液悬浮，即得到含有保卫细胞的液体；在离心管中依次加入20-30μL步骤一得到的植物表达载体、200-300μL含有保卫细胞的液体、200-300μL PEG介导液，常温下静置20-30min，得到转化后的保卫细胞；
四、保卫细胞孵育培养：将转化后的保卫细胞加入500-700μL洗涤液，常温，离心机转速为100g，离心1-2min，去除上清液；向得到的沉淀加入700μL-1mL孵育液，悬浮培养保卫细胞，22-25℃培养16-20h；
五、保卫细胞中蛋白质的定位：吸取20-30μL步骤四悬浮培养的细胞液滴在载玻片上，压片结束后直接在激光共聚焦显微镜下进行检测，在保卫细胞中的蛋白质即可发射荧光，即得到本发明的蛋白质在植物叶片保卫细胞中的位置。
请参阅图2，本发明实施例提供的快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法与前述实施方式不同的是，所述酶解液组分按质量分数为MES(2-吗啉乙磺酸)0.04％-0.05％、甘露醇7.2％-7.5％、KCl 0.15％-0.2％、纤维素酶R-10 1.1％-1.2％、离析酶0.5％-0.6％、CaCl2·2H2O 0.15％-0.2％和BSA(牛血清白蛋白)0.1％-0.15％，用1M KOH调节pH至5.7-5.8。
第二实施例
请参阅图3、图4和图5，本发明实施例提供的另一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法与第一实施例不同的是，所述洗涤液的组分按质量分数为甘露醇7.2％-7.3％和MES(2-吗啉乙磺酸)0.04％-0.05％，用1M KOH调节pH至5.7-5.8。
第三实施例
请参阅图3、图4和图5，本发明实施例提供的另一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法与第一实施例和第二实施例不同的是，所述悬浮液的组分按质量分数为MES 0.08％-0.1％、甘露醇7.2％-7.5％和MgCl2·6H2O 0.3％-0.4％，用1M KOH调节pH至5.7-5.8。
其中，所述将酶解液通过100-120目筛子过滤。
第四实施例
请参阅图3，本发明实施例提供的另一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法与第一实施例至第三实施例不同的是，所述PEG介导液的组分按质量分数为PEG4000 40％-45％、甘露醇3.6％-3.8％和CaCl2·2H2O 0.15％-0.2％，用1M KOH调节pH至5.7-5.8。
其中，所述孵育液的组分按质量分数为2-吗啉乙磺酸0.04％-0.05％、甘露醇7.2％-7.5％和KCl 1.45％-1.5％，用1M KOH调节pH至5.7-5.8。
第五实施例
请参阅图4，本发明实施例提供的另一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法与第一实施例至第四实施例不同的是，所述激光共聚焦显微镜下进行检测时，GFP通道参数为465-488nm激发，530-546nm发射；红色荧光信号通道参数为620-633nm激发，发射波长为650-665nm。
其中，所述植物为双子叶植物；所述双子叶植物为杨树。
第六实施例
请参阅图1至图5，本发明实施例提供的另一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法与第一实施例至第五实施例不同的是，所述CaMV 35S启动子的序列如SEQIDNO.1所示。
第七实施例
请参阅图1至图5，本发明实施例提供的另一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法与第一实施例至第六实施例不同的是，所述NOS终止子的序列如SEQIDNO.2所示。
实施例1
实施例1提供的一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法按以下步骤进行：一、植物表达载体的构建：利用高保真酶pfu系列，根据NCBI中primer blast设计目的基因的引物，以提取植物材料RNA并反转生成的cDNA为模板，通过PCR技术将目的基因克隆并测序；将表达载体和基因片段用相同的内切酶消化回收后，通过连接酶将基因片段连接至表达载体pBI121-EGFP上，然后制备目的基因表达载体质粒；所述目的基因表达载体质粒为在pBI121-GUS基础上将GUS基因切除替换成EGFP基因而获得的载体，以CaMV 35S为启动子，用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记目的蛋白为读码框，并以NOS为终止子的双元表达载体构建得到植物表达载体；
二、植物叶片保卫细胞的分离：在超净工作台中向9*9cm圆皿里加入30mL酶解液，取叶片置于酶解液中剪碎，用封口膜封闭并用锡纸包裹进行酶解，酶解条件为温度25℃，摇床转速为30rpm，酶解时间4h；取干净圆皿，将酶解液用100目筛子过滤，并置于50mL提前4度预冷的离心管中；向过滤得到的液体中添加10mL洗涤液，4℃，离心机转速为100g，离心5min，去除上清液，得到分离开的保卫细胞；酶解液30mL组分为：称取0.128g MES、2.186g甘露醇、0.045g KCl、0.325g纤维素酶R-10、0.15g离析酶、0.045g CaCl2·2H2O、0.03g BSA，溶于30mL ddH2O，用1M KOH调节pH至5.7。酶解液需要现用现配。洗涤液的组分：0.729g甘露醇、0.043g MES，溶于10mL ddH2O，用1M KOH调节pH至5.7。
三、保卫细胞的转化：将步骤二得到分离开的保卫细胞用2mL悬浮液悬浮，即得到含有保卫细胞的液体；在离心管中依次加入30μL步骤一得到的植物表达载体、300μL含有保卫细胞的液体、300μL PEG介导液，常温下静置30min，得到转化后的保卫细胞；PEG介导液的组分为4g PEG 4000、0.365g甘露醇、0.147g CaCl2·2H2O，溶于10mL ddH2O，pH5.7，过滤消毒；悬浮液的组分为：0.016g MES、1.46g甘露醇、0.061g MgCl2·6H2O，溶于20mL ddH2O，用1M KOH调节pH至5.7。
四、保卫细胞孵育培养：将转化后的保卫细胞加入500μL洗涤液，常温，离心机转速为100g，离心2min，去除上清液；向得到的沉淀加入700μL孵育液，悬浮培养保卫细胞，25℃培养16h；孵育液的组分为2-吗啉乙磺酸0.04g、甘露醇7.3g和KCl 1.46g，用1M KOH调节pH至5.7。
五、保卫细胞中蛋白质的定位：吸取20μL步骤四悬浮培养的细胞液滴在载玻片上，压片结束后直接在激光共聚焦显微镜下进行检测，GFP通道参数为470nm激发，540nm发射；红色荧光信号通道参数为630nm激发，发射波长为655nm，然后即可观察到在保卫细胞中的蛋白质发射荧光，即得到本发明的蛋白质在植物叶片保卫细胞中的位置。
通过本实施例提供的方法能够准确地确定蛋白质在植物叶片保卫细胞中的位置，图1是气孔保卫细胞的分离及转化流程图，图2-图5分别为气孔保卫细胞转化后的明场图、红色荧光激发图、绿色荧光激发图、绿色荧光和红色荧光合并图，由此可判断本实施例的蛋白质在气孔保卫细胞中的定位在叶绿体及其他细胞器中。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式和实施例仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京林业大学
<120> 一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法
<130> B181241
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 346
<212> DNA
<213> CaMV 35S启动子
<400> 1
tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 60
ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 120
cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 180
cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 240
ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca 300
agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag agaaca 346
<210> 2
<211> 253
<212> DNA
<213> NOS终止子
<400> 2
gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60
atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120
atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180
gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240
atgttactag atc 253

Claims (10)

1.一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法，其特征在于：该方法按以下步骤进行：
一、植物表达载体的构建：利用高保真酶pfu系列，根据NCBI中primer blast设计目的基因的引物，以提取植物材料RNA并反转生成的cDNA为模板，通过PCR技术将目的基因克隆并测序；将表达载体和基因片段用相同的内切酶消化回收后，通过连接酶将基因片段连接至表达载体pBI121-EGFP上，然后制备目的基因表达载体质粒；所述目的基因表达载体质粒为在pBI121-GUS基础上将GUS基因切除替换成EGFP基因而获得的载体，以CaMV 35S为启动子，用增强型绿色荧光蛋白标记目的蛋白为读码框，并以NOS为终止子的双元表达载体构建得到植物表达载体；
二、植物叶片保卫细胞的分离：在超净工作台中向圆皿里加入20-30mL酶解液，取叶片置于酶解液中剪碎，用封口膜封闭并用锡纸包裹进行酶解，酶解条件为温度22-25℃，摇床转速为30-40rpm，酶解时间4-5h；取干净圆皿，将酶解液过滤，并置于50mL提前4度预冷的离心管中；向过滤得到的液体中添加10-20mL洗涤液，4℃，离心机转速为100g，离心3-5min，去除上清液，得到分离开的保卫细胞；
三、保卫细胞的转化：将步骤二得到分离开的保卫细胞用1-2mL悬浮液悬浮，即得到含有保卫细胞的液体；在离心管中依次加入20-30μL步骤一得到的植物表达载体、200-300μL含有保卫细胞的液体、200-300μL PEG介导液，常温下静置20-30min，得到转化后的保卫细胞；
四、保卫细胞孵育培养：将转化后的保卫细胞加入500-700μL洗涤液，常温，离心机转速为100g，离心1-2min，去除上清液；向得到的沉淀加入700μL-1mL孵育液，悬浮培养保卫细胞，22-25℃培养16-20h；
五、保卫细胞中蛋白质的定位：吸取20-30μL步骤四悬浮培养的细胞液滴在载玻片上，压片结束后直接在激光共聚焦显微镜下进行检测，在保卫细胞中的蛋白质即可发射荧光，即得到本发明的蛋白质在植物叶片保卫细胞中的位置。
2.根据权利要求1所述的一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法，其特征在于：所述酶解液组分按质量分数为2-吗啉乙磺酸0.04％-0.05％、甘露醇7.2％-7.5％、KCl 0.15％-0.2％、纤维素酶1.1％-1.2％、离析酶0.5％-0.6％、CaCl2·2H2O0.15％-0.2％和牛血清白蛋白0.1％-0.15％，用1M KOH调节pH至5.7-5.8。
3.根据权利要求1所述的一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法，其特征在于：所述洗涤液的组分按质量分数为甘露醇7.2％-7.3％和2-吗啉乙磺酸0.04％-0.05％，用1M KOH调节pH至5.7-5.8。
4.根据权利要求1所述的一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法，其特征在于：所述悬浮液的组分按质量分数为2-吗啉乙磺酸0.08％-0.1％、甘露醇7.2％-7.5％和MgCl2·6H2O 0.3％-0.4％，用1M KOH调节pH至5.7-5.8。
5.根据权利要求1所述的一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法，其特征在于：所述PEG介导液的组分按质量分数为PEG4000 40％-45％、甘露醇3.6％-3.8％和CaCl2·2H2O 0.15％-0.2％，用1M KOH调节pH至5.7-5.8。
6.根据权利要求1所述的一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法，其特征在于：所述孵育液的组分按质量分数为2-吗啉乙磺酸0.04％-0.05％、甘露醇7.2％-7.5％和KCl 1.45％-1.5％，用1M KOH调节pH至5.7-5.8。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法，其特征在于：所述激光共聚焦显微镜下进行检测时，GFP通道参数为465-488nm激发，530-546nm发射；红色荧光信号通道参数为620-633nm激发，发射波长为650-665nm。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法，其特征在于：所述将酶解液通过100-120目筛子过滤。
9.根据权利要求8所述的一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法，其特征在于：所述CaMV 35S启动子的序列如SEQIDNO.1所示。
10.根据权利要求8所述的一种快速定位蛋白质在植物叶片保卫细胞中位置的方法，其特征在于：所述NOS终止子的序列如SEQIDNO.2所示。
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