CN110234223A

CN110234223A - 将物质导入植物的方法

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Publication number: CN110234223A
Application number: CN201880009184.4A
Authority: CN
Inventors: 加藤纪夫; 市川雅子; 冈本龙史; 古矶成美; 木羽隆敏; 户田绘梨香
Original assignee: Japan Tobacco Inc; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research; Tokyo Metropolitan Public University Corp
Current assignee: Kaneka Corp; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research; Tokyo Metropolitan Public University Corp
Priority date: 2017-01-31
Filing date: 2018-01-31
Publication date: 2019-09-13
Also published as: RU2019126791A; JP2020072645A; RU2019126791A3; US20190390207A1; EP3563673A4; AU2018215445A1; WO2018143480A1; EP3563673A1; BR112019014387A2; CA3051390A1

Abstract

本发明涉及将物质导入植物的方法。本发明的方法包括将物质导入细胞壁形成不完全的植物生殖细胞。

Description

将物质导入植物的方法

技术领域

本发明涉及将物质导入植物的方法。

背景技术

对于植物、特别是单子叶植物的基因重组技术而言，以20世纪90年代在稻、玉米中开发出利用了土壤杆菌的方法为契机，其应用快速普及。迄今为止已经开发出了各种转化方法。然而，已知其中多数需要经由植物组织的脱分化和再分化，因此在物种、品种之间转化的效率存在很大差异。根据物种、品种的不同，转化效率低，无法得到具有重现性的转化植物。例如，对于在玉米中育种上非常重要的系统B73而言，尚未开发出可以效率良好地得到转化植物的通常的转化法。

另外，近些年效率良好地进行基因组编辑逐渐成为可能，但由于根据作物种类、品种的不同，组织培养的容易性不同，这一点对于基因组编辑效率有很大的影响，因此阻碍了其实用化。

另一方面，在20世纪90年代，尝试了从植物体分离精细胞和卵细胞并使它们人工融合的人工受精(体外(in vitro)受精)，成功地制备了植物体。非专利文献1中记载了使玉米的卵细胞及精细胞进行电融合而制备受精卵细胞(体外受精卵)，并将其培养成植物体的方法。非专利文献1中在卵细胞的分离时使用了高浓度的植物组织降解酶的混合物。另外，非专利文献2中记载了通过稻的雌雄配子的电融合制备受精卵细胞，并将其培养成植物体的方法。植物的人工授精(体外受精体系)包括如下3个步骤：从授粉前的花中分离配子细胞(卵细胞和精细胞)、分离出的细胞的融合(受精)、融合细胞(受精卵)的培养。作为代表性的成功例，有玉米(非专利文献1)和稻(非专利文献2)，小麦、烟草也有数例报告。通常，卵细胞可以通过切断授粉前的子房、或者通过在显微镜下分解经纤维素酶、果胶酶等植物组织降解酶处理过的子房或胚珠而得到，精细胞可以通过在适当的渗透压溶液中使花粉破裂而得到。接着，用玻璃毛细管将这些雌雄配子转移至融合用液滴中。对于配子细胞的融合法，报道了电融合(非专利文献1、2)、利用钙离子进行的融合(非专利文献3)、聚乙二醇融合(非专利文献4、5)这3种方法。然而，受精卵细胞生长为胚并再生成植物体这样的报道仅仅是通过电融合制备的受精卵细胞(非专利文献1、2)。这些现有文献中表明能够从人工使雌雄配子融合而得到的受精卵细胞诱导植物体。然而，完全没有记载向受精卵细胞中的导入基因、转化的技术，且完全不清楚是否能使用体外受精卵细胞来进行转化。

对于玉米(非专利文献6)、稻(非专利文献7)、小麦(非专利文献8)、大麦(非专利文献9、11)、烟草(非专利文献10)等物种而言，还已知有从受精后的子房、胚珠中取出受精卵细胞进行培养来制备植物体的例子。涉及玉米、大麦的非专利文献6、11记载了利用显微注射法将DNA导入受精卵细胞。然而，尚未报道以受精卵细胞为对象的基于显微注射法的植物转化法已实际应用的事实。另外，也完全没有通过其它方法进行基因导入的见解。

显微注射法对于具有细胞壁的细胞也能够进行基因导入，不需要特别通过植物组织降解酶处理等来去除导入对象的植物细胞的细胞壁。但是，存在一次导入操作中只能处理一个细胞的缺点，不适于使用了大量植物细胞的中～大规模的基因导入实验。而且，由于需要在显微镜下的复杂操作，且需要熟练的技术，因此难以实用化。作为将基因导入细胞中的其它方法，除了显微注射法以外，还有聚乙二醇法(polyethylene glycol：PEG法)、肽法(非专利文献12)、电穿孔法、土壤杆菌法等。与显微注射法相比，电穿孔法、肽法、PEG法、特别是PEG法具有方法简便且一次可处理大量细胞的优点。然而，由于植物的细胞具有细胞壁，因此，特别是在进行PEG法、电穿孔法时，通常用纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、半纤维素酶等植物组织降解酶处理对组织和细胞进行处理，溶解细胞壁，使细胞原生质体化。根据这样的情况，一直以来在上述方法中，以叶、培养细胞、愈伤组织等能够大量得到原生质体的材料作为对象(非专利文献13、14)。

另一方面，受精卵细胞与叶、培养细胞、愈伤组织等不同，在生成、分离方面花费功夫而无法大量得到原生质体。另外，如果不对即将受精的卵细胞、精细胞进行电处理、添加钙溶液等融合处理，则不会开始分化。另外，对于通过这样的体外受精体系而得到的受精卵细胞，可以认为通过上述的融合处理那样的人工受精操作，可能会对细胞造成某种损伤。此外，对于受精卵细胞，尚不清楚在保持了细胞活性的状态下从受精卵细胞去除细胞壁的方法，所述细胞活性是可以在去除细胞壁后使细胞继续分裂并生长成植物体的活性。根据这样的情况，可以推测卵细胞、精细胞、受精卵细胞不适宜作为导入基因的对象，还没有利用PEG法等方法进行基因导入以至进行细胞分裂的报道。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2016-63785(专利文献1)

非专利文献

非专利文献1：Kranz E.and Loerz H.,(1993),Plant Cell 5:739-746.

非专利文献2：Uchiumi,T.et al.,(2007),Planta 226:581-589.

非专利文献3：Faure,J.E.et el.,(1994),Science 263:1598-1600.

非专利文献4：Sun,M.X.et al.,(1995),Acta Bot Sin 36:489-493.

非专利文献5：Tian,H.Q.and Russell,S.D.(1997),Plant Cell Rep 16:657-661.

非专利文献6：Leduc,N.et al.,(1996),Developmental Biology 177:190-203.

非专利文献7：Zhang,J.et al.,(1999),Plant Cell Reports 19:128-132.

非专利文献8：Kumlehn,J.et al.,(1997),Plant Cell Reports 16:663-667.

非专利文献9：Holm,P.B.et al.,(1994),The Plant Cell 6:531-543.

非专利文献10：Yuchi,H.E.et al.,(2004),Chinese Science Bulletin 49:810-814.

非专利文献11：Holm,P.B.et al.,(2000),Transgenic Research 9:21-32.

非专利文献12：Laksmanan,M.et.al.,(2012),Biomacromolecules 14,10-16.

非专利文献13：Yoo,S.D.et al.(2007),Nature Protocol 2:1565-1572.

非专利文献14：Zhai,Z.et al.(2009),Plant Physiol.149:642-652.

非专利文献15：Kranz,E.et al.,(1995),Plant Journal 8:9-23.

非专利文献16：Toda,E.et al.,(2016),Plant Physiology 171:206-214.

非专利文献17：Koiso,N.et al.,(2017),Plant Direct 1:e00010

非专利文献18：Hiei,Y.and Komari,T.,(2008).Nature Protocols 3:824-834.

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供将物质导入植物的方法、通过本发明的方法导入了物质的植物。

受精卵细胞原本是具有生长成植物体的能力的细胞，因此，可期待不受因物种、品种之间的差异所产生的培养效率的影响。只要以作为合子的受精卵细胞、或者作为配子的卵细胞或精细胞为对象进行物质的导入，就能够对比目前更广泛的物种、作物进行例如转化、基因组编辑等处理。本发明人等进行了深入研究，结果发现了可以在不进行植物组织降解酶处理的情况下对受精卵细胞导入物质的方法。进而发现，通过组合对分离出的受精卵细胞进行培养的方法，可以在不进行植物组织降解酶处理的情况下对受精卵细胞导入物质，诱导分裂，进行转化，从而想到了本发明。

用于解决课题的方法

本发明包括以下的方式，但并不限定于此。

[方式1]

一种将物质导入植物的方法，该方法包括：

将物质导入细胞壁形成不完全的植物生殖细胞。

[方式2]

根据方式1所述的方法，其中，在导入物质之前，对分离出的植物生殖细胞不进行利用植物组织降解酶的处理。

[方式3]

根据方式1或2所述的方法，其中，细胞壁形成率为65％以下。

[方式4]

根据方式1所述的方法，其中，植物生殖细胞为受精卵细胞。

[方式5]

根据方式1～4中任一项所述的方法，该方法包括：

通过以下的(1-i)或(1-ii)获得受精卵细胞：

(1-i)将植物的卵细胞与精细胞融合，产生受精卵细胞，

(1-ii)从植物的包含受精卵细胞的组织分离受精卵细胞；

(2)将物质导入得到的受精卵细胞。

[方式6]

根据方式5所述的方法，其中，通过电融合进行(1-i)的卵细胞与精细胞的融合。

[方式7]

根据方式5或6所述的方法，其中，在从获得受精卵细胞起120分钟以内进行工序(2)的物质导入。

[方式8]

根据方式5或6所述的方法，其中，在从获得受精卵细胞起60分钟以内进行工序(2)的物质导入。

[方式9]

根据方式5所述的方法，其中，通过自然受精法进行(1-i)的卵细胞与精细胞的融合。

[方式10]

根据方式5或9所述的方法，其中，在从获得受精卵细胞起360分钟以内进行工序(2)的物质导入。

[方式11]

根据方式5或9所述的方法，其中，在从获得受精卵细胞起240分钟以内进行工序(2)的物质导入。

[方式12]

根据方式1～4中任一项所述的方法，该方法包括：

(1)将物质导入植物的卵细胞及精细胞中的任一者或两者，以及

(2)将经过了工序(1)的卵细胞与精细胞融合，产生受精卵细胞。

[方式13]

根据方式12所述的方法，其中，通过电融合或自然受精法进行(1)的卵细胞与精细胞的融合。

[方式14]

根据方式1～13中任一项所述的方法，其中，使用PEG法或电穿孔法进行物质导入。

[方式15]

根据方式1～14中任一项所述的方法，其中，植物为单子叶植物。

[方式16]

根据方式15所述的方法，其中，植物选自玉米、小麦、大麦、稻及高粱。

[方式17]

一种导入了物质的植物，其是利用方式1～16中任一项所述的方法而得到的。

发明的效果

一直以来认为通过电融合处理等在体外产生的受精卵细胞不适于利用PEG法进行的转化。在本发明中，通过利用“细胞壁形成不完全的植物生殖细胞”，可以在不对细胞进行植物组织降解酶处理的情况下进行物质的导入、转化及培养。根据本发明，即使是以往因培养困难等原因难以进行转化而无法赋予有用性状的植物体，也能够稳定且重现性良好地得到转化体。

附图说明

图1是从稻花分离出的卵细胞(上部分)和精细胞(下部分)的光学显微镜照片。

图2是图1的卵细胞与精细胞的融合过程及产生的受精卵细胞(体外受精卵细胞)的光学显微镜照片。

图3是在通过PEG法导入GFP核酸后，开始了分裂的稻受精卵细胞的荧光显微镜照片。图3A是在配子融合24小时后进行荧光观察(左)及明场观察(右)的结果。图3B是在配子融合2天后进行荧光观察(左)及明场观察(右)的结果。

图4是来自于进行了GFP核酸导入的稻受精卵细胞的细胞块的荧光及光学显微镜照片。在配子融合后，于18天后进行了荧光观察(左)及明场观察(右)。持续观察来自受精卵的荧光的结果(A)和观察了未检测出荧光的结果(B)。

图5是由来自于进行了GFP核酸导入的稻受精卵细胞的细胞块生成的苗的光学显微镜照片。

图6是来自于由图5的细胞块生成的苗的幼植物体。

图7是示出了GFP质粒导入处理1天后的稻受精卵中的质粒量的图。将进行了核酸导入处理的情况表示为PEG处理+，将通过荧光显微镜的观察确认到GFP荧光的情况表示为GFP信号+。

图8是进行了GFP核酸导入处理的玉米受精卵(体外)及来自于该受精卵细胞的细胞块的荧光显微镜照片(上部分)、光学显微镜照片(下部分)及其合并照片(中部分)。

图9是来自于DsRed2转化稻的受精卵及来自于进行了基因组编辑核酸导入处理的DsRed2转化稻受精卵细胞的细胞块的荧光显微镜照片(各上部分)及光学显微镜照片(各下部分)。将对来自于进行配子融合处理而产生的DsRed2转化稻的受精卵细胞进行培养而得到的细胞(无基因组编辑核酸导入)表示为A，将对进行配子融合处理而产生的DsRed2转化稻受精卵细胞进行基因组编辑核酸(质粒DNA)导入处理并培养得到的细胞表示为B。结果表明，在进行了基因组编辑核酸导入处理的DsRed2转化稻受精卵中，DsRed2的荧光消失。

图10是进行了GFP和DsRed2这2种核酸导入处理的稻卵细胞的荧光显微镜照片(左侧和中央)及光学显微镜照片(右侧)。在核酸导入处理24小时后进行了GFP荧光观察(左侧)、RFP荧光观察(中央)及明场观察(右侧)。

具体实施方式

本发明涉及将物质导入植物的方法。

本发明的方法包括将物质导入细胞壁形成不完全的植物生殖细胞。

在一个方式中，该方法包括：

通过以下的(1-i)或(1-ii)获得受精卵细胞：

(1-i)将植物的卵细胞与精细胞融合，产生受精卵细胞，

(1-ii)从植物的包含受精卵细胞的组织分离受精卵细胞；

(2)将物质导入得到的受精卵细胞。

在一个方式中，该方法包括：

植物

植物的种类没有特别限定。可以是双子叶植物及单子叶植物中的任意植物，优选为单子叶植物。进一步优选为禾本科植物，更优选为玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等，最优选为玉米、小麦、稻。

本发明的方法特别是可以用于被认为“难培养”的植物或品种，但并不限定于此。“难培养”是指难以培养，具体是指例如，难以培养从植物体分离得到的细胞、难以形成脱分化等处理的愈伤组织、难以从愈伤组织再分化为植物体。

通常，与双子叶植物相比，单子叶植物更难以培养，但“难培养”的植物包括例如大豆、菜豆、辣椒等。难培养品种是指，比相同物种的通常研究用品种(玉米的情况为A188等)更难以培养的品种，可以列举例如：玉米的B73及来自于B73的玉米的优良品种、小麦的优良品种(例如AC Barrie、TAM等)、大麦的除GoldenPromise及Igri以外的品种、高粱的除296B、C401、SA281、P898012、Pioneer 8505、Tx430以外的品种等。

植物生殖细胞

本发明的方法将物质导入植物的生殖细胞。

生殖细胞是指，具有在生殖时将遗传信息传递至下一代的作用的细胞，而且是构成多细胞生物的细胞中除了体细胞以外的细胞。在本说明书中，“生殖细胞”包括用于有性生殖的配子和受精卵细胞，所述配子包括卵细胞(也称为“卵”、“卵子”)、精细胞(也称为“精子”)，所述受精卵细胞是作为通过配子结合而得到的细胞的合子(也称为“结合体”)，在植物的情况下是通过受精而形成的。

生殖细胞可以是受精卵细胞、卵细胞、精细胞中的任意细胞。优选为受精卵细胞。或者，受精卵细胞优选为在从授粉/受精前的植物体中分离出卵细胞和精细胞后，使它们融合而产生及获得的细胞，但并不限定于此。或者，受精卵细胞可以是从植物的包含胚囊的组织中分离的已受精的卵细胞，即，可以是在植物体的阶段使其授粉/受精、并从该植物体中分离出的受精卵细胞。需要说明的是，本发明的目的在于通过基因导入/重组向用于转化、基因组编辑等的植物细胞导入物质、特别是导入基因，因此，与作为单倍体的受精前的精细胞和卵细胞相比，优选使用多倍体且已确定了基因组序列的受精卵细胞，但并不限定于此。

在本说明书中，“卵细胞”是指，雌蕊中通过胚囊母细胞的减数分裂而形成的雌性配子。卵细胞的分离方法没有限定，例如，可以在适当渗透压的溶液中切断子房，在显微镜下使用玻璃毛细管分离从该切断面露出的卵细胞。

在本说明书中，“精细胞”是指，雄蕊的花药中通过花粉母细胞的减数分裂而形成的雄性配子。精细胞的分离方法没有限定，例如，将从花药采集的花粉浸渍于适当渗透压的溶液中时，在数分钟后，包含精细胞的花粉内容物从花粉释放至溶液中，因此，能够在显微镜下使用玻璃毛细管分离精细胞。

在本说明书中，“受精卵细胞”是指精细胞与卵细胞融合而成的细胞。

需要说明的是，在本说明书中，植物的生殖细胞表示从雄蕊或雌蕊分离出的精细胞或卵细胞、使这些分离出的细胞融合而成的受精卵细胞、或者从雌蕊分离出的受精卵细胞。

受精卵细胞的获得方法

在本发明的一个方式中，可以将植物的卵细胞与精细胞在体外融合来制备受精卵细胞。即，可以首先从植物体分离卵细胞和精细胞，通过电融合法等公知的方法在体外制备受精卵细胞(也称为配子融合)。

电融合法是利用电刺激使2种或2种以上的细胞在体外融合的方法。具体而言，在本说明书中，可以通过在适当渗透压的溶液中对分离出的卵细胞和精细胞施加电脉冲而引起细胞融合，制备受精卵细胞。

在通过电融合进行细胞融合的情况下，本领域技术人员可以根据植物的种类或细胞的大小等来适当确定电压、电极间距离等的条件。例如，可以适用日本特开2016-63785(专利文献1)中记载的条件。

在通过将精细胞和卵细胞电融合来制备1个融合细胞(受精卵细胞)时，优选将直流电压的下限设为10kV以上，更优选设为11kV以上，进一步优选设为12kV以上。另外，优选将上限设为17kV以下，更优选设为16kV以下，进一步优选设为15kV以下。本领域技术人员可以分别适当选择上限和下限。

另外，优选将电极间距离的下限设为待融合的卵细胞与精细胞的直径之和的1.5倍以上，更优选设为2倍以上，进一步优选设为2.5倍以上，最优选设为3倍以上。另外，优选将上限设为6倍以下，更优选设为5倍以下，进一步优选设为4倍以下。本领域技术人员可以分别适当选择上限和下限。作为测定细胞直径的方法，有如下方法：使用安装在显微镜上的测微目镜来测定直径的方法、将用显微镜拍摄的图像导入计算机并用图像分析软件进行测定的方法。

另外，本领域技术人员可以适当选择电极间距离。例如，优选将下限设为80μm以上，更优选设为90μm以上，进一步优选设为100μm以上。另外，优选将上限设为240μm以下，更优选设为220μm以下，进一步优选设为200μm以下。本领域技术人员可以分别适当选择上限和下限。

将精细胞和卵细胞电融合来制备1个融合细胞时所使用的溶液的渗透压可以根据使用的植物的种类进行适当选择。例如，在稻的情况下，优选将下限设为380mosmol/kg H₂O以上，更优选设为390mosmol/kg H₂O以上，进一步优选设为400mosmol/kg H₂O以上。另外，优选将上限设为470mosmol/kg H₂O以下，更优选设为460mosmol/kg H₂O以下，进一步优选设为450mosmol/kg H₂O以下。在玉米的情况下，优选将下限设为500mosmol/kg H₂O以上，进一步优选设为530mosmol/kg H₂O以上。另外，优选将上限设为700mosmol/kg H₂O以下，进一步优选设为680mosmol/kg H₂O以下。本领域技术人员可以分别适当选择上限和下限。

或者，卵细胞与精细胞的细胞融合可以使用钙融合法、PEG融合法等其它公知的细胞融合方法。“钙融合法”是利用容易钙浓度依赖性地发生细胞膜融合的细胞膜的性质的方法。“PEG融合法”是通过用聚乙二醇(polyethyleneglycol、PEG)处理细胞而结合细胞膜，并在除去PEG时使细胞融合的方法。

或者，还可以利用自然受精法在植物体中产生受精卵细胞，由植物体获得产生的受精卵细胞。使用了自然受精法的受精卵细胞的获取方法例如是使柱头露出并附着花粉而使其授粉后、从包含胚囊的组织中分离受精卵细胞的方法。从植物体分离受精卵细胞可以通过如下方式进行：从授粉后的植物体中取出刚刚受精后的子房，在适当渗透压的溶液中切断该子房，在显微镜下使用玻璃毛细管等分离从该切断面露出来的受精卵细胞。或者，可以用酶溶液对子房或胚珠处理一定时间后，使用例如玻璃针等在显微镜下解剖并摘取、分离珠心等组织。需要说明的是，在本说明书中，自然受精法可以是人为地使花粉附着于柱头的人工交配，也可以是自然交配。

物质的导入

本发明的将物质导入植物的方法包括“将物质导入细胞壁形成不完全的植物生殖细胞的工序”。

在本发明中，被导入植物的物质是尺寸和性状能够供给至目标细胞内的物质。可以是天然存在的物质，或者也可以是人工制造的物质。作为例子，可列举出各种生物分子、化合物。作为生物分子，例如可列举出：核酸、蛋白质、肽、多糖、脂质、细胞器等。作为一个方式，物质选自核酸、蛋白质及肽。

核酸没有特别限定，可以是RNA、DNA、两者的结合体、混合物。优选为如载体那样的环状DNA、直链DNA、环状RNA或直链RNA。可根据使用的转化方法而使用任意长度的核酸。例如，核酸的长度优选为100kb以下，更优选为50kb以下。进一步优选为30kb以下，特别优选为20kb以下，最优选为10kb以下。另外，还可以是如染色体那样的核酸和蛋白的复合体。

还可以导入用于基因组编辑的Cas9核酸酶等核酸酶、修饰酶、抗体等蛋白质。蛋白质的大小优选为分子量300kDa以下，更优选为200kDa以下，进一步优选为150kDa以下，但并不限定于此。

肽是各种氨基酸以确定的顺序通过酰胺键(也称为“肽键”)连接而成的分子的总称，通常比蛋白质的长度短。优选为100a.a.以下，更优选为50a.a.以下。

“多糖”是通过糖苷键使2个以上单糖分子聚合而成的物质的总称。例如，如淀粉等那样显示出与作为结构单元的单糖不同的性质。例如包括：淀粉(直链淀粉、支链淀粉)、糖原、纤维素、甲壳质、琼脂糖、卡拉胶、肝素、透明质酸、果胶、木糖葡聚糖(xyloglycan)、葡甘露聚糖等。

“脂质”是从生物中分离的不溶于水的物质的总称。不是由特定的化学、结构性质定义而是由溶解度来定义。在生化学定义中是“具有长链脂肪酸或烃链的、存在于生物体内或来自生物的分子”。包括：(i)仅由醇和脂肪酸通过酯键键合而成的单脂(酰基甘油、神经酰胺等)；(ii)在分子中包含磷酸、糖的脂质，且是通常以鞘氨醇或甘油为骨架的复合脂质(磷脂质、糖脂质、脂蛋白等)；以及(iii)作为通过水解由单脂、复合脂质衍生的疏水性化合物的衍生脂质(脂肪酸、萜类化合物、类固醇、类胡萝卜素等)等。

“细胞器”是具有在细胞的内部特别分化的形态、功能的结构的总称，有时也称为细胞内细胞器、Organelle。作为一个方式，包括核、内质网、高尔基体、内体、溶酶体、线粒体、叶绿体、过氧化物酶体等的被生物膜包围的结构体。另外，还包括细胞骨架、由中心体、鞭毛、纤毛这样的非膜系蛋白质的超复合体形成的结构体。另外，还可包括核仁、核糖体等。

除了生物分子以外的金属离子、化合物等也可包含在“物质”中。可以组合导入2种以上的核酸、蛋白质、肽、多糖和脂质等、金属离子、化合物等物质。例如，核酸可以是2种以上的DNA或RNA，也可以是DNA与RNA的组合。可以同时导入或以复合体的形式导入核酸和蛋白质等不同种类的物质。

另外，可以根据待导入的物质的性状使其担载或含有在导入用载体上来供给。这里，载体是指用于将外来物质供给至细胞内的介质(vehicle)。例如可列举出：脂质体、金属(金、钨等)、由无机物(例如硅化合物)形成的颗粒、晶须、藻酸盐微球、病毒性物质(例如外壳蛋白)。另外，可以同时供给促进将物质导入细胞的物质。例如可列举出：纤粘蛋白等蛋白质、肽、螯合物(例如EDTA)、无机微小结构物(例如纳米结构二氧化硅)。

将物质导入植物的方法只要是能够将希望的物质导入植物的公知的方法即可，没有特别限定，可以根据植物的种类进行适当选择。例如可以优选使用聚乙二醇法(PEG法)、电穿孔法、基因枪法、显微注射法、晶须法等物理化学方法(DNA的直接导入法)、或者土壤杆菌法等生物学方法(DNA的间接导入法)。优选为直接导入法，进一步优选为PEG法或电穿孔法。

PEG法是使聚乙二醇(PEG)作用于原生质体而将DNA等物质摄入植物细胞内部的方法，但该物质摄入的机制尚不清楚。对于PEG法，例如，可以如非专利文献13等记载的那样按照公知的实验方案来实施。可以将PEG浓度设为10％～30％，但并不限定于此。

电穿孔法是通过对细胞悬浮液施加电脉冲而在细胞膜上打开微小的孔，将细胞悬浮液中的DNA送入细胞内部的方法。需要说明的是，将植物细胞作为材料时，通常使用分解去除了细胞壁的原生质体。通过电穿孔法进行的物质导入可以按照公知的实验方案来实施，本领域技术人员可以根据待使用的植物材料进行适当选择，例如可列举出如下的条件。

通过电穿孔法对细胞施加电脉冲的操作在比色皿电极等电极容器内进行。电极例如由铂、金、铝等金属制成，本领域技术人员可以从例如约0.5mm、约1mm、约2mm、约4mm、约10mm中适当选择电极间距离。

对于电压，作为每1mm电极间距离的下限，本领域技术人员可以从例如5V以上、10V以上、20V以上、30V以上、40V以上、50V以上中适当选择；电压的上限可以从例如5000V以下、1000V以下、500V以下、100V以下中适当选择。电压可以是单次的脉冲，也可以是多次的脉冲。在多次的情况下，例如可以以2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、15次等脉冲的形式施加电压。各脉冲之间的间隔约为0.5至约500毫秒，优选为约5至约250毫秒，更优选为约10至约150毫秒，进一步优选为约40至120毫秒。另外，在以这些间隔施加了多次脉冲后，可以在1秒钟至10秒钟、2秒钟至8秒钟、3秒钟至5秒钟后再次施加相同程度或不同电压的脉冲。此外，在分成多个脉冲施加的情况下，各脉冲的大小可以相同，也可以不同。需要说明的是，各脉冲的时间的下限可以选自0.01毫秒以上、0.1毫秒以上、1毫秒以上，此外其上限可以选自15毫秒以下、10毫秒以下、5毫秒以下、3毫秒以下。

用于电穿孔法的溶液可以是一直以来以植物为对象进行的电穿孔法中使用的溶液。例如可列举出：以PBS、HEPES、MES作为缓冲剂的包含KCl、NaCl、CaCl₂等无机盐的溶液、包含天冬氨酸钾盐、葡糖酸钙盐、谷氨酸钾盐等有机盐的溶液。另外，也可以使用对动物的细胞、组织进行电穿孔法时所使用的溶液。例如为Thermo Fisher Scientific公司制造的Opti-MEM培养基等。溶液的渗透压可以根据待使用的植物的种类进行适当选择。例如，在稻的情况下，优选将下限设为380mosmol/kg H₂O以上，更优选设为390mosmol/kg H₂O以上，进一步优选设为400mosmol/kg H₂O以上。另外，优选将上限设为470mosmol/kg H₂O以下，更优选设为460mosmol/kg H₂O以下，进一步优选设为450mosmol/kg H₂O以下。在玉米的情况下，优选将下限设为500mosmol/kg H₂O以上，进一步优选设为530mosmol/kg H₂O以上。另外，优选将上限设为700mosmol/kg H₂O以下，进一步优选设为680mosmol/kgH₂O以下。

待导入的物质的浓度为1ng/μL～2000ng/μL，优选为10ng/μL～1000ng/μL，更优选为20ng/μL～500ng/μL，但并不限定于此。

在PEG法、电穿孔法中，可以通过将2种以上的DNA等物质溶解于悬浮液中，在植物细胞的存在下添加PEG或施加电脉冲，从而进行多种物质的导入或共转化。

需要说明的是，对于物质的导入，例如，可以是将核酸导入细胞，将该核酸整合至基因组并稳定地保持的导入；也可以是如基因组编辑时的gRNA和Cas9蛋白质那样，未持续且稳定地保持在细胞内而仅在某一时期保持在细胞内的临时导入。

细胞壁形成不完全的植物生殖细胞

在本发明的将物质导入植物的方法中，向“细胞壁形成不完全的植物生殖细胞”中导入选自核酸、蛋白质及肽中的物质。

本发明的特征之一在于，通过利用“细胞壁形成不完全的植物生殖细胞”，不需要在导入物质之前对分离出的植物生殖细胞进行利用植物组织降解酶的处理。

植物组织降解酶是指：直接或间接地作用于植物组织和细胞周边的果胶、纤维素、半纤维素、其它基质多糖、磷脂质、蛋白质等而将其分解的酶的总称。例如可列举出：果胶酶、纤维素酶、蛋白酶、半纤维素酶类等及它们的混合物。然而，通过这些植物组织降解酶进行的植物细胞处理有时会对细胞的存活率产生不良影响，有时成为植物组织培养的困难性的原因之一。在本发明中，由于能够在不对植物细胞进行植物组织降解酶处理的情况下进行培养、物质的导入及转化，因此，即使是以往因培养困难等原因难以进行转化从而无法赋予有用性状的植物体，也能够稳定且重现性良好地得到转化体。

需要说明的是，本说明书中，“对分离出的植物生殖细胞进行利用植物组织降解酶的处理”包括对植物生殖细胞进行以用于PEG法等基因导入等的原生质体化处理为目的的处理，优选不包括进行以仅单纯地从子房等包含胚囊的组织中分离植物生殖细胞为目的的处理(通常使用浓度非常低的酶溶液)。为了单纯地分离植物生殖细胞而使用浓度非常低的酶溶液的方式包含在本发明中。具体而言，本发明中包括以下情况：为了分离卵细胞，进行向胚珠、珠心中添加植物组织降解酶的处理，使精细胞与分离出的卵细胞融合而得到受精卵细胞，然后，利用PEG法、电穿孔法将物质导入分离出的受精卵细胞的情况；仅为了从胚珠、珠心分离利用自然受精法在植物体内产生的受精卵细胞而进行植物组织降解酶处理，并在分离出受精卵细胞后，利用PEG法、电穿孔法将物质导入分离出的受精卵细胞的情况。

“细胞壁形成不完全的细胞”并不是如植物体细胞那样除了胞间连丝以外细胞基本上全部被细胞壁包围的细胞，而是细胞的一部分或全部未被细胞壁包围的细胞。细胞壁形成不完全的植物生殖细胞包括包含卵细胞、精细胞在内的用于有性生殖的配子。或者，包括通过受精而形成的受精卵细胞，其是尚未开始形成细胞壁的细胞、或者是已开始形成细胞壁但尚未完成而处于不完全的状态的受精卵细胞。优选为细胞壁形成不完全的受精卵细胞。

植物生殖细胞的细胞壁形成例如可以通过利用荧光增白剂(Calcofluor)进行的纤维素染色、苯胺蓝染色等公知的方法进行确认。荧光增白剂(Calcofluor)是与植物细胞、真菌等细胞壁中含有的纤维素、甲壳质结合的非特异性荧光染料。激发波长为300～440nm(最大355nm)，0.1M磷酸缓冲液pH7.0中的纤维素的最大荧光为433nm。例如，可以使用共聚焦激光扫描显微镜来测定荧光亮度，而且可以进行荧光强度的图像分析，求出累积亮度，但并不限定于此。

“细胞壁形成率”例如可以用与植物细胞的细胞壁形成完全结束且细胞整体被细胞壁包覆的状态的细胞的亮度进行比较时的亮度的比率来表示，但并不限定于此。“细胞壁形成不完全”是指细胞壁形成率优选为80％以下，更优选为70％以下，进一步优选为65％以下、进一步更优选为63％以下，特别优选为60％以下、特别是进一步优选为50％以下，最优选为30％以下，但并不限定于此。

在本发明的一个方式中，可以使用受精卵细胞作为植物生殖细胞。在该情况下，(1-i)将植物的卵细胞与精细胞融合来产生受精卵细胞、或者(1-ii)从植物的包含受精卵细胞的组织中分离受精卵细胞，由此获得受精卵细胞，然后(2)将物质导入得到的受精卵细胞。

卵细胞在受精前具有与通常的体细胞状态不同的细胞壁，当卵细胞与精细胞融合时，第一次形成完全的细胞壁。在形成细胞壁时，为了进行物质导入处理，需要去除细胞壁。因此，优选在受精后且在细胞壁形成完成前迅速地进行物质导入操作。例如，对于玉米及稻而言，可以认为从受精起20分钟左右开始细胞壁的形成(非专利文献15、16)，在约2小时左右该形成完成，因此优选在2小时(120分钟)以内进行物质导入。另外，在从胚珠等分离通过自然受精法在植物体内产生的受精卵细胞的情况下，也优选在分离受精卵细胞后迅速地进行物质导入操作。

但是，通过自然受精法在植物体内产生受精卵细胞的情况与将分离卵细胞和精细胞融合的情况不同，在从花粉管附着于柱头至实际在植物体内进行受精并形成受精卵细胞为止花费时间。因此，在该情况下，作为得到刚受精后的受精卵细胞的方法，优选确定从授粉至受精的时间段，在受精后于该确定的时间段内摘取受精卵细胞。例如，如果预先对已授粉的花粉的花粉管的伸长速度经时地进行使用了苯胺蓝等染色液的荧光观察，就能够推测出从授粉至受精的时间。在鉴于由此推测出的从授粉至受精的时间(直至形成受精卵的时间)的基础上，优选在直至该受精卵细胞的细胞壁形成完成的时间段内进行物质导入操作。

直至受精卵细胞的细胞壁形成完成的时间根据植物品种而不同。在本发明的方法中，将物质导入“细胞壁形成不完全的细胞”、即受精卵细胞的细胞壁形成完成之前的细胞。本领域技术人员可以根据植物品种的种类适当确定从获得受精卵细胞至物质导入完成的时间。例如，对于稻、玉米而言，在通过分离出的卵细胞与精细胞的融合处理而获得受精卵细胞后，优选在180分钟以内、优选在150分钟以内、更优选在120分钟以内、进一步优选在60分钟以内、更优选在20分钟以内进行物质导入，但并不限定于此。特别是对于玉米而言，在获得受精卵细胞后，为120分钟以内，优选为60分钟以内，更优选为20分钟以内。

另外，例如对于稻、玉米而言，在通过自然受精法进行授粉(交配)处理后，在6小时以内、5小时以内、4小时以内、优选在360分钟以内、240分钟以内、180分钟以内、进一步优选在120分钟以内、更优选在60分钟以内进行物质导入，但并不限定于此。

或者，可以在进行卵细胞与精细胞的结合之前，将物质导入卵细胞和精细胞中的任一者或两者，然后使卵细胞与精细胞融合来产生受精卵细胞。优选将物质导入卵细胞。

愈伤组织或胚状体(胚的细胞块)化/再分化

本发明的将物质导入植物的方法可以在导入物质的工序之后进一步包括：将导入了物质的受精卵细胞进行愈伤组织化或胚状体(也称为胚的细胞块)化；以及，在再分化培养基中使上述愈伤组织化或胚状体化的组织再分化。

愈伤组织化或胚状体化工序及再分化工序没有特别限定，可以利用用于从受精卵细胞再生成植物体的公知的方法。

在愈伤组织化或胚状体化工序中，对得到的导入了物质的受精卵细胞进行培养，形成胚状体或愈伤组织。诱导受精卵细胞分裂并使细胞增殖而形成愈伤组织或胚状体的工序根据植物而最佳条件不同，因此没有特别限定，优选为加入了饲养细胞的看护培养法。例如可以如下进行。

前处理：将导入了物质的受精卵细胞放入甘露醇液滴(450mosmol/kg H₂O)中清洗，进行无菌化。

液体培养基中的培养：将导入了物质的受精卵细胞转移至培养基中，静置过夜后，进行平缓的振荡培养。振荡速度优选为30～50rpm，更优选为35～45rpm。培养的温度优选24～28℃，更优选25～27℃。培养优选在暗处进行。此时，优选在培养基中加入饲养细胞进行共培养(看护培养法)。该培养期间优选为4～14天，更优选为5～10天。

培养基：添加了2,4-二氯苯氧基乙酸、萘乙酸等生长素的液体的MS培养基(T.Murashige et al.,Physiol.Plant.,15,473(1962))、B5培养基(O.L.Gamborg et al,Experimental Cell Research,50,151-158(1968))、N6培养基(Chu et al.,Sci.Sinica,18,659-668(1975))等。

优选在培养基中添加吲哚-3-乙酸、2,4-D、麦草畏等生长素类。生长素的添加浓度可列举出0.1～3.0mg/L，优选为0.1～0.3mg/L，更优选为0.15～0.25mg/L。

饲养细胞：可以使用公知的饲养细胞。例如可列举出：稻悬浮细胞培养物(LineOc,Riken BioResource Research Center制)、玉米的哺育细胞(Mol et al.,1993)、非形态发生型细胞(non-morphogenic cell)培养物(nonmorphogenic cell suspension:Kranzet al.1991)等。

通过该工序，可以在培养开始起4～14天后形成直径50～200μm左右的球状的胚状体。

再分化工序也可以按照公知的再分化工序来实施。例如，作为一个例子，可以如下进行。

培养：将球状的胚状体转移至未加入饲养细胞的上述培养基中，进一步培养10～14天左右。然后，放入未添加生长素的任意培养基、例如MS培养基中进行培养，形成植物体。此时，优选照射光进行培养，光例如优选为50～180μmol/m²·秒，更优选为70～150μmol/m²·秒。

培养基：例如为MS培养基、B5培养基、N6培养基，可列举出使用了琼脂糖、琼脂、结冷胶、植物凝胶(Gelrite)等的固体培养基等。

导入了物质的植物

本发明还包括通过本发明的方法得到的导入了物质的植物。需要说明的是，在本发明以前，对于特别是被认为是“难培养”的植物、品种而言，难以或无法得到导入了物质的植物。根据本发明，对于这样的植物、品种也能够利用简便地方法效率良好地得到导入了物质的植物。

另外，通过本发明的方法得到的导入了物质的植物不仅包括导入了质粒、基因序列片段等的核酸、用于基因组编辑等的蛋白、肽并保持在植物内的植物，而且包括通过导入物质、特别是导入基因而得到的转化植物、通过导入与Cas9、向导RNA等的基因组编辑相关的物质而进行了基因组编辑的植物、以及它们的后代、克隆等。

实施例

以下，基于实施例对本发明进行详细地说明，但本发明并不限定于这些实施例。本领域技术人员可以基于本说明书的记载而容易地对本发明进行修饰、变更，这些内容也包含于本发明的技术范围。

实施例1稻的卵细胞和精细胞的分离

在本实施例中，进行了从稻的花中分离卵细胞和精细胞(图1)。

如下所述进行了卵细胞的分离。解剖由稻的穗得到的未开花的花，采集子房，将子房放入加入了3mL的6％甘露醇溶液(370mosmol/kg H₂O)的3.5cm塑料培养皿中。将去除了柱头的子房沉入新的3.5cm塑料培养皿中的3mL的6％甘露醇溶液(370mosmol/kg H₂O)，在培养皿底部利用激光刀片(FEATHER Safety Razor公司、FA-10)将子房的下部切断。通过显微镜观察确认从切断部露出来的卵细胞，用微毛细管分离了卵细胞。从约30～40个子房中得到了约10～15个卵细胞。各卵细胞的直径为40～50μm。使用微毛细管将分离出的卵细胞移动至盖玻片上的液滴中。

需要说明的是，通过以下的方法制作了盖玻片上的液滴。

1)将盖玻片(20mmX40mm)的周围浸渍在含有2％二氯甲基硅烷的1,1,1-三氯乙烷溶液中，进行干燥；

2)在该盖玻片中央部分放置0.2～0.3mL的矿物油(Embryo Culture-testedGrade，Sigma-Aldrich公司制、1001279270)；以及

3)用微量移液管将1～2μL的6％甘露醇液(370mosmol/kg H₂O)插入该矿物油内。

如下所示进行了精细胞的分离。解剖由稻的穗得到的未开花的花，采集花药，放入加入了3mL的6％甘露醇溶液(370mosmol/kg H₂O)的3.5cm塑料培养皿中。将花药沉入甘露醇溶液后，用镊子将花药分解，由此使花粉分散在甘露醇溶液中。数分钟后，花粉破裂，包含精细胞的内容物释放至甘露醇溶液中。各精细胞的直径为8～10μm。使用微毛细管将该精细胞移动至盖玻片上的液滴中。

实施例2通过配子融合产生稻受精卵细胞

在本实施例中，通过基于电融合的配子融合在体外产生了稻的受精卵细胞(稻的体外受精卵细胞)(图2)。

将通过实施例1所示的方法分离出的精细胞和卵细胞一个一个地移动至盖玻片上的液滴中。然后，在交流电下(1MHz、0.4kV/cm、NEPAGENE公司ECFG21)将这些细胞排列在电极(NEPAGENE公司CUY5100-100Ti)上。用微毛细管在该液滴中加入液滴的一半量～等量的甘露醇溶液(520mosmol/kg H₂O)。然后，通过施加DC脉冲(50μs、12～15kV/cm、电极间距离50～150μm)，使配子融合，产生了受精卵细胞。

实施例3向稻受精卵细胞导入核酸

在本实施例中，将核酸导入了实施例2中产生的稻的体外受精卵细胞。

根据本实施例对实施例2中产生的受精卵细胞进行了处理，使得在从配子融合处理起120分钟的时刻完成物质的导入。将产生的受精卵细胞移动至MMG溶液(15mM MgCl₂、4mM MES(pH5.7)、450mosmol/kg H₂O甘露醇)的液滴(约2μL)中，然后移动至在MMG中加入了包含待导入的碱基序列、35S启动子::信号序列::GFP::内质网滞留信号(HDEL)::NOS终止子的质粒(GFP表达用的质粒DNA、约6000bp)的液滴中。需要说明的是，该质粒按照非专利文献17的记载制备。接着，将包含受精卵细胞的液滴与PEG溶液(在12.5mL甘露醇溶液(450mosmol/kg H₂O)中加入7.5g的PEG4000、2.5mL的1M盐化钙，并用蒸馏水调整为25mg)的液滴(约2μL)混合，用玻璃毛细管搅拌了30～50次。

实施例4稻受精卵细胞的培养

在本实施例中，培养了实施例3中导入了核酸的稻受精卵细胞。

为了培养实施例3中得到的导入了核酸的受精卵细胞，准备了受精细胞用培养基。受精细胞用培养基是在改良型N6Z培养基(Kumlehn J.et.al.(1998)Planta 205:327-333)中进行了以下改变的培养基：2g/L CHU(N6)basal salt mixture(Sigma-Aldrich公司制)、0.025mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.01mg/L视黄醇、0.01mg/L骨化醇、0.01mg/L生物素、1mg/L硫胺素·H₂O、1mg/L烟酸、1mg/L吡哆醇·HCl、1mg/L氯化胆碱、1mg/L泛酸钙、0.2mg/L核黄素、0.2mg/L 2,4-D、0.02mg/L钴胺素、0.02mg/L对氨基苯甲酸、0.4mg/L叶酸、2mg/L抗坏血酸、40mg/L苹果酸、40mg/L柠檬酸、40mg/L富马酸、20mg/L丙酮酸钠、1000mg/L谷氨酰胺、250mg/L酪蛋白水解物及100mg/L肌醇。渗透压用葡萄糖调整为450mosmol/kg H₂O(pH5.7)而制成。将制成的受精细胞用培养基(0.2mL)放入直径12mm的Millicell CM插件(Millipore公司制)内，放入加入了2mL培养基的3.5cm塑料培养皿中。进一步，将40～60μL的稻悬浮细胞培养物(Line Oc,RikenBioResource Research Center制)作为饲养细胞加入培养皿。

使用经过清洗、灭菌的微毛细管将导入了核酸的受精卵细胞投入新鲜的甘露醇液滴(450mosmol/kg H₂O)中，然后，转移至加入了受精细胞用培养基的CM插件内的膜上。

将导入了核酸的受精卵细胞在暗处、26℃下静置1天，然后用荧光显微镜进行观察，通过GFP荧光的有无确认了导入的核酸的表达状况和细胞的分裂状况。将该结果示于图3A。由于在导入了核酸的受精卵细胞中确实观察到了GFP的发光，因此能够确认核酸导入。进而，将这些受精卵细胞振荡培养2天后进行观察，结果是可以确认分裂为早期胚，进而还能观察到早期胚细胞中的GFP的发光(图3B)。由此，在胚细胞块的细胞团中也能够确认到保持了导入受精卵细胞中的核酸。

进而将这些早期胚在暗处振荡培养约16天，得到了胚细胞块。此时，在培养开始后5～7天后，从培养液中去除了饲养细胞。观察了培养18天后的胚细胞块，结果是观察到检测出GFP的发光的细胞块(图4A)和未检测出荧光的细胞块(图4B)。由此表明存在以下两种情况：GFP的表达从受精卵持续到细胞块的阶段的情况；在从受精卵到早期胚的阶段短暂表达GFP的情况。另外，由于在持续培养了1周以上的胚细胞块中也观察到荧光，因此，证实了通过导入受精卵的核酸进行转化而稳定地产生了荧光蛋白。根据以上的结果表明，通过本发明的方法将基因导入植物，能够短暂或稳定地表达。

实施例5通过培养稻胚细胞块进行的分化诱导

在本实施例中，通过培养实施例4中得到的稻胚细胞块进行了分化诱导。

将实施例4中得到的稻胚细胞块转移至分化诱导培养基1(改良的MS培养基；MS盐、MS维生素、100mg/L肌醇、2g/L酪蛋白氨基酸(casamino acid)、30g/L蔗糖、30g/L山梨醇、0.2mg/L l-萘乙酸(NAA)、1mg/L激动素及0.3％植物凝胶(Gelrite))。一边在30℃下持续照射光，一边进行培养。在移植10天后，分化出苗(图5)。进而，将分化出苗的胚细胞块转移至分化诱导培养基2(改良的MS培养基；MS盐、MS维生素、100mg/L肌醇、30g/L蔗糖及0.3％植物凝胶(Gelrite))。一边在30℃下持续照射光，一边进行培养。在移植7天后，得到了幼植物体(图6)。需要说明的是，按照非专利文献18的记载使该幼植物体再分化。

实施例6融合后的时间与物质导入效率的关系

在本实施例中，对于不进行酶处理而利用PEG法能够进行物质导入的受精卵的阶段进行了研究。受精卵的阶段以电融合后的经过时间作为指标。对于按照实施例1及2使用电融合产生的稻受精卵细胞，在经过给定的时间后，导入实施例3中使用的GFP表达用的质粒DNA，如实施例4所述，确认了核酸导入。对于确认到核酸导入的受精卵细胞，随后在实施例4的条件下继续培养，确认到分裂为早期胚。将该结果示于表1。根据结果可知，对于在配子融合后5～20分钟和120分钟的时刻的物质导入而言，未确认到导入效率方面存在差异。由于在配子融合后5～20分钟和120分钟的时刻在物质导入效率方面没有差异，因此可以理解，物质导入不是产生受精卵细胞时的电融合的影响所引起的，而由PEG法引起的。需要说明的是，虽然经过240分钟后确认到核酸导入为低效率，但未导致受精卵的分裂。

[表1]

实施例7细胞壁形成度的测定

在本实施例中，进行了稻受精卵细胞的细胞壁形成度的测定。

如实施例2中的记载所述，对电融合后经过2小时时的受精卵细胞、以及推测处于细胞壁充分发育阶段的电诱导后20小时后的受精卵细胞进行0.005％荧光增白剂(Calcofluor)染色，使用共聚焦激光扫描显微镜测定了荧光亮度。分别对3个细胞进行图像分析，求出累积亮度，进行比较，结果是确认了，与20小时后的受精卵细胞相比，从受精后2小时后的细胞壁检测出的荧光增白剂发出的荧光亮度为63％左右。

实施例8核酸导入处理稻受精卵细胞中的相对质粒量的推算

在本实施例中，将质粒核酸导入稻受精卵细胞，推算了细胞中的相对质粒量。

按照实施例1～3，通过配子的电融合产生稻受精卵细胞，进行了基于PEG法的核酸导入。其中，在从电融合处理起10分钟～1小时后，使用包含35S启动子::信号序列::GFP::内质网滞留信号(HDEL)::NOS终止子的质粒(GFP表达用的质粒DNA、约6000bp)DNA进行了处理，使得物质导入在从融合处理至120分钟内完成。然后，按照实施例4培养该受精卵细胞，用荧光显微镜观察了来自GFP的荧光，然后，使用微毛细管将各受精卵细胞一个一个地转移至10μL的定量PCR溶液中。此时，作为定量PCR溶液使用了LightCy cler 480SYBR Green IMaster(Roche Applied Science)，引物使用了对质粒中的SP-GFP-ER进行扩增的特异性引物(5’-TCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’、5’-TGGTGCAGATGAACTTCAGG-3’)。PCR反应循环以94℃10秒钟、55℃10秒钟、72℃10秒钟进行，将未进行基因导入处理的受精卵细胞作为对照，推算了受精卵细胞内的相对质粒量。将该结果示于图7。

如图7所示，不仅可以确认能够用荧光显微镜观察到来自GFP的荧光的细胞，而且也可以确认在未观察到荧光的细胞中存在进行了核酸导入的个体。另外表明，对于观察到来自GFP的荧光的个体，GFP荧光强度与被导入的质粒的量存在正相关的关系。

实施例9玉米卵细胞和精细胞的分离

在本实施例中，进行了玉米的卵细胞和精细胞的分离。以Kranz E.and Loerz H.(非专利文献1)为参考，如下进行了卵细胞和精细胞的分离。

将在温室内培育、并在开花前装袋的玉米(品种：A188)的交配期的雌穗供于试验。从采集到的雌穗的胚珠中摘取包含胚囊的珠心切片，加入至3.5cm塑料培养皿中的1.5mL酶溶液，在室温下静置。作为酶溶液，使用了在10％甘露醇溶液(650mosmol/kg H₂O)中添加有0.33％纤维素酶(Worthington公司制)、0.1％离析酶R10(Yakult Honsha公司制)、0.017％果胶溶酶(Pectolyase)Y23(盛进制药株式会社制)的酶溶液。

在20～30分钟的酶处理后，使用2根玻璃针进行了卵细胞的分离。用一根玻璃针固定珠心切片使其不移动，用另一根玻璃针刮取推测存在卵细胞的区域的组织，由此分离了卵细胞。基于在珠心切片内观察到的胚囊的位置进行了卵细胞所在区域的推测。使用玻璃毛细管将分离出的卵细胞移动至盖玻片上的甘露醇液滴中。需要说明的是，按照实施例1制成盖玻片上的甘露醇液滴，以分离了卵细胞的酶液尽可能不混入甘露醇液滴中的方式进行了操作。

如下所述进行了精细胞的分离。从玉米(品种：B73)的雄穗将花粉采集至3.5cm塑料培养皿，向其中加入3mL的10％甘露醇溶液(650mosmol/kg H₂O)。约3～5分钟后，花粉在甘露醇溶液中破裂，包含精细胞的花粉内容物释放在甘露醇溶液中。各精细胞的直径为10μm。使用玻璃毛细管将该精细胞移动至盖玻片上的甘露醇液滴中。

实施例10通过配子融合产生玉米受精卵

在本实施例中，通过基于电融合的配子融合在体外产生了玉米的受精卵细胞。

将利用实施例8及9所示的方法分离出的精细胞和卵细胞一个一个地移动至盖玻片上的液滴中。然后，将这些细胞在交流电下(1MHz、0.4kV/cm、NEPAGENE公司ECFG21)排列在电极(NEPAGENE公司CUY5100-100Ti)上。然后，通过施加DC脉冲(50μs、12～15kV/cm、电极间距离50～100μm)，使雌雄配子融合，产生了受精卵细胞。

实施例11向玉米受精卵导入核酸

在本实施例中，将核酸导入实施例10中产生的玉米的体外受精卵细胞。

按照本实施例对实施例10中产生的受精卵细胞进行了处理，使得物质导入在从配子融合处理30～90分钟的时刻完成。将产生的受精卵细胞移动至MMG溶液(15mM MgCl₂、4mMMES(pH5.7)、650mosmol/kg H₂O甘露醇)的液滴(约2μL)，然后，进一步移动至核酸导入用液滴，所述核酸导入用液滴对于MMG加入了160ng/μL的包含作为待导入的碱基序列的35S启动子::信号序列::GFP::内质网滞留信号(HDEL)::NOS终止子的质粒(GFP表达用的质粒DNA、约6000bp)。需要说明的是，该质粒按照非专利文献17的记载制备。接着，将包含受精卵细胞的该核酸导入用液滴与PEG溶液(在12.5mL甘露醇溶液(650mosmol/kg H₂O)中加入7.5g的PEG4000、2.5mL的1M盐化钙，并用蒸馏水调整为25mg)的液滴(约2μL)混合，用玻璃毛细管搅拌了30～50次。

使用经过清洗、灭菌的微毛细管将进行了核酸导入处理的受精卵细胞投入新鲜的10％甘露醇液滴(650mosmol/kg H₂O)中，然后，转移至加入了受精细胞用培养基的CM插件内的膜上。

将导入了核酸的受精卵细胞在暗处、26℃下静置1天，然后继续进行振荡培养。用倒置式荧光显微镜观察培养后的细胞，通过GFP荧光的有无确认了导入的核酸的表达状况和细胞的分裂状况。由于进行了核酸导入处理的受精卵细胞确实可观察到GFP的发光，因此能够确认核酸导入。进而，将这些导入了核酸的受精卵细胞振荡培养6天，然后进行观察，结果是可以确认分裂为早期胚，进而还能够观察到早期胚胎细胞中的GFP的发光(图8)。由此，在玉米的胚细胞块的细胞团中也能够确认到保持了导入受精卵细胞中的核酸。

需要说明的是，如下所述制作了受精细胞用培养基。

将MS培养基的NH₄NO₃变更为165mg/L，有机物组成如下所述。1mg/L烟酸、10mg/L硫胺素·HCl、1mg/L吡哆醇·HCl、0.025mg/L、750mg/L谷氨酰胺、150mg/L脯氨酸、100mg/L天冬酰胺、100mg/L肌醇。在其中加入2mg/L2,4-D，渗透压用葡萄糖调整为650mosmol/kg H₂O(pH5.7)而制成。将制成的受精细胞用培养基放入直径12mm的Millicell CM插件(Millipore公司制)内，放入加入了2mL培养基的3.5cm塑料培养皿中。进一步，将40～60μL的稻悬浮细胞培养物(Line Oc,Riken BioResource Research Center制)作为饲养细胞加入培养皿，制成受精细胞用培养基。

实施例12通过自然受精法得到的稻受精卵细胞的细胞壁形成度的测定

在本实施例中，进行了通过自然受精法(人工交配)得到的受精卵细胞的细胞壁形成度的测定。

对在日温28℃左右、夜温23℃左右的温度范围且湿度为40～90％的环境下栽培的稻品种Yukihikari进行了人工交配。人工交配通过用手指捏住即将开花的稻的小花来进行。在开始进行分离操作前的90分钟，在相同环境下进行了栽培。通过与实施例2中记载的卵细胞分离相同的操作进行了受精卵细胞的分离。利用0.005％荧光增白剂(Calcofluor)对人工交配后3小时、5小时、8.5小时、20小时的受精卵的细胞壁进行了染色。在此期间，受精卵细胞在23℃左右的温度范围进行处理。对于进行了10分钟荧光增白剂(Calcofluor)染色的受精卵细胞，在Zeiss公司制造的显微镜AxioObserver A1中设置滤光片CFW-LP01-Clinical进行拍摄。对于拍摄条件而言，将曝光时间设为25毫秒，将白平衡设为3200K。使用图像分析软件ZEN2测定了每1个细胞的荧光增白剂(Calcofluor)荧光亮度。将推测处于细胞壁充分发育阶段的交配20小时后的受精卵的荧光亮度设为100％时，将交配数小时后的受精卵的荧光亮度的比例作为细胞壁形成度。将该结果示于表2。交配3小时后的受精卵细胞为38％的细胞壁形成度，5小时后为52％的细胞壁形成度，8.5小时后为84％的细胞壁形成度。

[表2]

实施例13通过电穿孔法对利用自然受精法得到的稻受精卵细胞进行核酸导入

在本实施例中，使用电穿孔将GFP核酸导入了通过人工交配得到的稻受精卵细胞。

按照实施例12对稻进行人工交配，分离出受精卵细胞。对于分离出的受精卵细胞，导入了由编码玉米泛素启动子::玉米泛素内含子::GFP::NOS终止子的碱基序列构成的直链DNA片段，使得至DNA片段导入完成的时间为杂交后4小时。将受精卵细胞与Opti-MEM培养基混合，所述Opti-MEM培养基以100ng/μL的浓度含有该DNA片段且使用甘露醇将渗透压调整为450mOsmol/kg H₂O。使用NEPAGENE制造的NEPA21进行了电穿孔。对于电穿孔的条件，使用1mm宽的电极，以脉冲宽度2.0毫秒、脉冲间隔50毫秒进行了4次电压30V的处理。

按照实施例4中记载的方法培养了通过电穿孔法进行了核酸导入处理的受精卵细胞。对于由胚细胞块形成的愈伤组织，在培养第42天通过PCR法及扩增片段的序列确认了GFP的导入。此时，PCR引物使用了对GFP进行扩增的特异性引物(5’-atggtgagcaagggcgag-3’及5’-ccatgatatagacgttgtggctg-3’)。对通过PCR反应得到的DNA片段进行了测序，结果是该PCR产物的碱基序列与GFP序列一致。

该结果表明，对于通过电穿孔法导入了核酸的受精卵细胞，确实导入了DNA片段(GFP)。需要说明的是，按照实施例5中记载的方法培养来自于确认到该DNA片段导入的受精卵的愈伤组织，并进行了分化诱导，结果是可以得到再分化个体。

实施例14向稻受精卵细胞导入核酸和蛋白质

在本实施例中，进行了向稻受精卵中导入核酸和蛋白质。具体而言，使用使来自于导入了编码DsRed2(Clontech)的核酸的稻的卵细胞与来自于野生型稻的精细胞融合而得到的受精卵细胞，进行了基因组编辑实验。

如下所述制备导入了编码DsRed2的基因的稻；制备包含玉米泛素启动子::编码DsRed2的基因序列::NOS终止子::CaMV35S终止子及膦丝菌素耐性标志物基因的pLC41质粒(Genebank accession No.LC215698)，按照Hiei and Komari(非专利文献18)转化至稻(品种：Yukihikari)中，制备了DsRed2转化稻。

按照实施例1和2，从制备的DsRed2转化稻分离卵细胞，从野生型稻(品种：Yukihikari)分离精细胞，通过电融合得到了受精卵细胞。按照实施例3对得到的受精卵细胞导入了质粒DNA或Cas9蛋白质复合体。需要说明的是，如下所述制备了待导入的质粒DNA和Cas9蛋白质复合体。

待导入的质粒DNA的制备：

使用表3所示的引物集对tRNA1-tRNA-gRNA2进行扩增，制备了tRNA-gRNA单元。

[表3]

使用Golden Gate克隆法将制成的tRNA-gRNA单元导入multiplex CRISPR/Cas9载体的BsaI位点，由此制备了包含稻U6snRNA启动子::tRNA-gRNA单元的一体化(All-in-one)CRISPR/Cas9载体质粒。

待导入的Cas9蛋白质复合体的制备：

使用GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific公司)合成了sgRNA。将使用的引物集示于表3。将2～3μg的sgRNA和1μg的Cas9蛋白质(具有核定位信号标签的GeneArt Platinum Cas9；Thermo Fisher Scientific公司)加入1.5～2.1μL的Cas9蛋白质存储缓冲液(10mM TrisHCl(pH8.0)、150mM NaCl、0.6mM TCEP、50％甘油)中进行温育，由此得到了Cas9蛋白质复合体。

质粒DNA或Cas9蛋白质的导入：

将得到的Cas9蛋白质复合体或调整为80～320ng/μL的上述质粒DNA分别添加至盖玻片上的10μL的MMG，按照实施例3导入了稻受精卵细胞。按照实施例4对由此得到的导入了质粒DNA的受精卵或导入了Cas9蛋白质复合体的受精卵细胞进行培养，用荧光显微镜观察了DsRed2的荧光。将导入了质粒DNA的受精卵的荧光显微镜和光学显微镜照片示于图9。根据该结果可以确认，对于导入了质粒DNA的受精卵和导入了Cas9蛋白质复合体的受精卵中的任一者而言，随着培养进行，DsRed2的荧光淬灭。

对于未进行质粒DNA导入处理的受精卵(图9A)而言，从刚刚进行配子融合处理后(图9A：0天)至胚细胞块的细胞团(图9A：7天)，在全部细胞中确认到了DsRed2的表达。与此相对，对于导入了质粒DNA的受精卵(图9B)而言，在刚刚进行配子融合处理和核酸导入处理后(图9B：0天)确认到的DsRed2的发光随着培养天数的增加而变得无法识别(图9B：7天)。这是由于，随着质粒DNA导入，转化稻的基因组中的编码DsRed2的基因序列被编辑，结果发生淬灭。

另外，按照实施例5对得到的导入了质粒DNA的受精卵细胞进行分化诱导，得到了再分化个体。从得到的再分化个体的叶中提取DNA，使用PCR法和测序对编码DsRed2的基因序列进行了确认，结果是确实在再分化个体所具有的编码DsRed2的基因序列的一部分确认到缺失、核酸的插入，表明已经被进行了基因组编辑。

需要说明的是，由于在导入了Cas9蛋白质复合体的受精卵细胞中也得到了同样的结果，因此表明，通过Cas9蛋白质复合体的导入，也同样地对转化稻的DsRed2基因序列进行了基因组编辑。

根据该结果可知，通过本发明的方法不仅能够将核酸质粒导入受精卵细胞中，而且还可以导入如Cas9蛋白质那样的物质，进而根据本发明的方法还可以进行基因组编辑。

实施例15向稻的卵细胞同时导入多种核酸

按照实施例1分离了稻的卵细胞。将分离出的卵细胞移动至MMG溶液的液滴(约2μL)，然后移动至如下液滴中，所述液滴在MMG中加入了待导入的碱基序列、包含35S启动子::信号序列::GFP::内质网滞留信号(HDEL)::NOS终止子的质粒(非专利文献17)、以及包含泛素启动子::泛素内含子::编码DsRed2的基因序列::NOS终止子的质粒。接着，按照实施例3将包含卵细胞及上述2种质粒的液滴与PEG溶液的液滴(约2μL)混合，用玻璃毛细管搅拌30～50次，由此对卵细胞进行了基于PEG法的核酸导入处理。

在从导入处理起12～16小时后用荧光显微镜观察进行了核酸导入处理的卵细胞，通过GFP和DsRed2的荧光的有无确认了导入的核酸的表达状况。将该结果示于图10。由于在同一卵细胞内观察到了基于GFP(图10：左)和DsRed2(图10：中央)这两者的发光，因此可以确认能够通过本发明的方法将2种核酸同时导入卵细胞。

工业实用性

根据本发明，即使在不对细胞进行植物组织降解酶处理的情况下也能够进行物质的导入、转化及培养。由此，是以往因培养困难等原因难以进行转化而无法赋予有用性状的植物体，也能够简便、稳定且重现性良好地得到转化体、基因组编辑个体。

序列表

<110> 日本烟草产业株式会社(JAPAN TOBACCO INC.)

国立研究开发法人理化学研究所(RIKEN)

公立大学法人首都大学东京(Tokyo Metropolitan University)

<120> 将物质导入植物的方法

<130> FA0392-17214

<150> 2017-015371

<151> 2017-01-31

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SP-GFP-ER 正向引物

<400> 1

tctagaatgg tgagcaaggg cgag 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SP-GFP-ER 反向引物

<400> 2

tggtgcagat gaacttcagg 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GFP 正向引物

<400> 3

atggtgagca agggcgag 18

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GFP 反向引物

<400> 4

ccatgatata gacgttgtgg ctg 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 一体化CRISPR/Cas9 载体 (目标gDsRed2) 正向引物

<400> 5

tgcagtgaag ctgaaggtga ccaa 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 一体化CRISPR/Cas9 载体 (目标gDsRed2) 反向引物

<400> 6

aaacttggtc accttcagct tcac 24

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sg RNA合成 (目标sgDsRed2) 正向引物

<400> 7

taatacgact cactataggt gaagctgaag gtgaccaa 38

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sg RNA合成 (目标sgDsRed2) 反向引物

<400> 8

ttctagctct aaaacttggt caccttcagc ttcac 35

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因组PCR序列 (目标DsRed2-1) 正向引物

<400> 9

atggcctcct ccgagaacgt c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因组PCR序列 (目标DsRed2-1) 反向引物

<400> 10

ctacaggaac aggtggtggc g 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因组PCR序列 (目标DsRed2-2) 正向引物

<400> 11

acgtcatcac cgagttcatg c 21

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因组PCR序列 (目标DsRed2-2) 反向引物

<400> 12

ggaaggacag cttcttgtag tcg 23

Claims

1.一种将物质导入植物的方法，该方法包括：

将物质导入细胞壁形成不完全的植物生殖细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在导入物质之前，对分离出的植物生殖细胞不进行利用植物组织降解酶的处理。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，细胞壁形成率为65％以下。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，植物生殖细胞为受精卵细胞。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，该方法包括：

通过以下的(1-i)或(1-ii)获得受精卵细胞：

(1-i)将植物的卵细胞与精细胞融合，产生受精卵细胞，

(1-ii)从植物的包含受精卵细胞的组织分离受精卵细胞；

(2)将物质导入得到的受精卵细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，通过电融合进行(1-i)的卵细胞与精细胞的融合。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，在从获得受精卵细胞起120分钟以内进行工序(2)的物质导入。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其中，在从获得受精卵细胞起60分钟以内进行工序(2)的物质导入。

9.根据权利要求5所述的方法，其中，通过自然受精法进行(1-i)的卵细胞与精细胞的融合。

10.根据权利要求5或9所述的方法，其中，在从获得受精卵细胞起360分钟以内进行工序(2)的物质导入。

11.根据权利要求5或9所述的方法，其中，在从获得受精卵细胞起240分钟以内进行工序(2)的物质导入。

12.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，该方法包括：

13.根据权利要求12所述的方法，其中，通过电融合或自然受精法进行(1)的卵细胞与精细胞的融合。

14.根据权利要求1～13中任一项所述的方法，其中，使用PEG法或电穿孔法进行物质导入。

15.根据权利要求1～14中任一项所述的方法，其中，植物为单子叶植物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，植物选自玉米、小麦、大麦、稻及高粱。

17.一种导入了物质的植物，其是利用权利要求1～16中任一项所述的方法而得到的。