BR112019014387A2

BR112019014387A2 - Método para introdução de substâncias em uma planta

Info

Publication number: BR112019014387A2
Application number: BR112019014387-4A
Authority: BR
Inventors: Kato Norio; Ichikawa Masako; Okamoto Takashi; Koiso Narumi; Kiba Takatoshi; Toda Erika
Original assignee: Japan Tobacco, Inc.; Riken; Tokyo Metropolitan University
Priority date: 2017-01-31
Filing date: 2018-01-31
Publication date: 2020-03-03
Also published as: EP3563673A1; RU2019126791A3; EP3563673A4; CA3051390A1; CN110234223A; AU2018215445A1; US20190390207A1; WO2018143480A1; RU2019126791A; JP2020072645A

Abstract

a presente invenção refere-se a um método para introduzir uma substância em uma planta. o método da presente invenção compreende introduzir uma substância em uma célula germinativa vegetal com formação incompleta da parede celular.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA INTRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIAS EM UMA PLANTA.

CAMPO TÉCNICO [0001] A presente invenção refere-se a um método para introduzir uma substância em uma planta.

TÉCNICA ANTECEDENTE [0002] As tecnologias transgênicas em plantas, particularmente em plantas monocotiledôneas, têm sido amplamente adotadas rapidamente, uma vez que os métodos que usam Agrobacterium para arroz e milho foram desenvolvidos nos anos 90. Vários métodos de transformação foram desenvolvidos até o momento. No entanto, sabe-se que a eficiência da transformação difere muito entre espécies e variedades, uma vez que muitos destes métodos precisam passar pela desdiferenciação e rediferenciação dos tecidos vegetais. Para determinadas espécies e variedades, a eficiência de transformação é baixa, e plantas transformadas com reprodutibilidade não podem ser obtidas. Por exemplo, em B73, a qual é uma cepa muito importante para o melhoramento de milho, ainda não foram desenvolvidos métodos gerais de transformação que produzem plantas transformadas de forma eficiente.

[0003] Além disso, vem se tornando possível praticar de forma eficiente a edição genômica nos últimos anos. No entanto, seu uso prático também é dificultado, uma vez que a facilidade da cultura de tecidos difere dependendo das espécies de culturas e a variedade afeta grandemente a eficiência da edição genômica.

[0004] Entretanto, a fertilização artificial na qual uma célula espermática e um ovócito isolados de uma planta são artificialmente fundidos (fertilização in vitro) foi tentada nos anos 90, e uma planta foi produzida com sucesso. A Literatura Não Patente (NPL) 1 descreve um método de produção de um ovócito fertilizado (ovo fertilizado in vitro) por meio

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 30/90

2/50 de eletrofusão de um ovócito e uma célula espermática de milho e cultura das mesmas em uma planta. Na NPL 1, uma mistura altamente concentrada de enzimas que degradam tecidos vegetais é usada para separar um ovócito. Além disso, a NPL 2 descreve um método de produção de um ovócito fertilizado por meio de eletrofusão de gametas masculinos e femininos de arroz e cultura em uma planta. A fertilização artificial de uma planta (sistema de fertilização in vitro) é composta de três etapas: isolar células de gametas (um ovócito e um espermatozóide) de uma flor antes de polinização, fundir as células isoladas (fertilização) e cultivar a célula fundida (ovo fertilizado). Exemplos típicos de sucesso incluem milho (NPL 1) e arroz (NPL 2), e alguns exemplos de trigo e tabaco também foram relatados. Em geral, um ovócito é obtido cortando o ovário antes de polinização ou desmontando o ovário ou ovócitos tratados com enzimas degradadoras de tecidos de plantas, tais como celulase e pectinase, sob um microscópio e uma célula espermática é obtida pela ruptura do pólen em uma solução osmótica adequada. Depois disso, os gametas masculinos e femininos são transferidos para uma gotícula de fusão usando um capilar de vidro. Três tipos de métodos para fusão de células de gametas, fusão elétrica (NPLs 1 e 2), fusão usando íons de cálcio (NPL 3) e fusão de polietileno glicol (NPLs 4 e 5) foram relatados. No entanto, foi relatado que apenas ovócitos fertilizados produzidos por fusão elétrica se desenvolvem em embriões, de modo a ser regenerado em plantas (NPLs 1 e 2). Estas literaturas do estado da técnica indicam que plantas podem ser induzidas a partir de um ovócito fertilizado obtida por meio de fusão artificial de gametas masculinos e femininos. No entanto, a introdução de genes em um óvulo fertilizado ou sua transformação não é mencionada em geral, e é totalmente desconhecido se a transformação pode ou não ser realizada usando um ovócito fertilizado in vitro.

[0005] Para espécies como milho (NPL 6), arroz (NPL 7), trigo (NPL

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 31/90

3/50

8), cevada (NPLs 9 e 11) e tabaco (NPL 10), exemplos nos quais um ovócito fertilizado é coletado e cultivado a partir do ovário ou óvulos após a fertilização para produzir uma planta são conhecidos. As NPLs 6 e 11, as quais se referem ao milho e cevada, descrevem a introdução de DNA em um ovócito fertilizado por meio do método de microinjeção. No entanto, não foi relatado que o método de transformação de um ovócito fertilizado por meio do método de microinjeção possa ser usado de forma prática. Além disso, não foi descoberta a introdução de genes por outros métodos em geral.

[0006] O método de microinjeção permite a introdução do gene em uma célula que tem uma parede celular e não há uma necessidade particular de remover a parede celular de uma célula vegetal como um alvo de introdução através de um tratamento com enzimas degradadoras de tecidos vegetais ou similar. No entanto, há uma desvantagem pelo fato de que apenas uma célula poder ser manuseada em uma operação de introdução e ele não é adequado para experimentos de introdução de genes de média a grande escala usando muitas células vegetais. Além disso, uma vez que operações complicadas sob um microscópio e técnicas especializadas são necessárias para a microinjeção, seu uso prático tem sido difícil. Exemplos do método para introduzir um gene em uma célula incluem o método de polietileno glicol (método de polietileno glicol: PEG), o método de peptídeos (NPL 12), o método de eletroporação e o método de Agrobacterium, além do método de microinjeção. O método de eletroporação, o método de peptídeos e o método de PEG, particularmente o método de PEG, têm vantagens pelo fato de que suas abordagens são simples comparado com o método de microinjeção e muitas células podem ser manuseadas de uma só vez. No entanto, uma célula vegetal tem uma parede celular e, portanto, um tecido e uma célula são geralmente tratados com enzimas degradadoras de tecidos ve

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 32/90

4/50 getais, tais como celulase, pectinase, protease e hemicelulase, particularmente no método de PEG ou no método de eletroporação, para dissolver a parede celular, deste modo, protoplastizando a célula. A partir destes fatos, materiais dos quais uma grande quantidade de protoplastos pode ser obtida, tais como folhas, células cultivadas e caules, têm sido usados como alvos nos métodos supracitados (NPLs 13 e 14).

[0007] Entretanto, ao contrário das folhas, células cultivadas e caules, a produção e o isolamento de ovócitos fertilizados consomem tempo e não podem produzir uma grande quantidade de protoplastos. Além disso, um ovócito ou uma célula espermática imediatamente antes da fertilização não iniciar a diferenciação, a menos que seja fundida através de um tratamento elétrico, adição de uma solução de cálcio ou similar. Em tal ovócito fertilizado obtido em um sistema de fertilização in vitro, algum dano pode ter ocorrido possivelmente na célula em virtude da operação para fertilização artificial, tal como a fusão conforme descrito acima. Além disso, não se sabe como remover a parede celular de um ovócito fertilizado ao mesmo tempo em que se mantém a atividade celular que permite que a célula se divida continuamente após a remoção da parede celular de modo a se desenvolver em uma planta. Sob tais circunstâncias, um ovócito, uma célula espermática e um ovócito fertilizado foram considerados inadequados como um alvo no qual um gene é introduzido. Portanto, não foi relatado que um gene é introduzido através de um método, tal como o método de PEG, para alcançar a divisão celular.

LISTA DE CITAÇÕES

LITERATURA DE PATENTE [0008] PTL 1: Patente Japonesa Aberta ao Público N° 2016-6378 5 (PTL 1)

LITERATURA NÃO PATENTE [0009] NPL 1: Kranz E. e Loerz H., (1993), Plant Cell 5: 739-746.

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 33/90

5/50 [0010] NPL2: Uchiumi, T. etaL, (2007), Planta 226: 581-589.

[0011] NPL3: Faure, J.E. et al., (1994), Science 263: 1598-1600.

[0012] NPL 4: Sun, M.XetaL, (1995), Acta Bot Sin 36: 489-493.

[0013] NPL 5: Tian, H.Q. e Russell, S.D. (1997), Plant Cell Rep 16: 657-661.

[0014] NPL 6: Leduc, N. et al., (1996), Developmental Biology 177: 190-203.

[0015] NPL 7: Zhang, J. et al., (1999), Plant Cell Reports 19: 128132.

[0016] NPL 8: Kumlehn, J. etaL, (1997), Plant Cell Reports 16: 663667.

[0017] NPL 9: Holm, P.B. etaL, (1994), The Plant Cell 6: 531-543.

[0018] NPL 10: Yuchi, H.E. et aL, (2004), Chinese Science Bulletin 49: 810-814.

[0019] NPL 11: Holm, P.B. etaL, (2000), Transgenic Research 9: 21-32.

[0020] NPL 12: Laksmanan, M. et aL, (2012), Biomacromolecules 14, 10-16.

[0021] NPL 13: Yoo, S.D. et aL (2007), Nature Protocol 2: 15651572.

[0022] NPL 14: Zhai, Z. et aL (2009), Plant Physiol. 149: 642-652.

[0023] NPL 15: Kranz, E. etaL, (1995), Plant Journal 8: 9-23.

[0024] NPL 16: Toda, E. et aL, (2016), Plant Physiology 171: 206214.

[0025] NPL 17: Koiso, N. etaL, (2017), Plant Direct]: eOO010 [0026] NPL 18: Hiei, Y. e Komari, T., (2008). Nature Protocols 3:

824-834.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

PROBLEMA TÉCNICO [0027] É um objetivo da presente invenção fornecer um método

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 34/90

6/50 para introduzir uma substância em uma planta e uma planta na qual uma substância é introduzida por meio do método da presente invenção.

[0028] Um ovócito fertilizado é uma célula que possui originalmente a capacidade de se desenvolver em uma planta e, portanto, espera-se que não seja afetada pela diferença na eficiência da cultura entre espécies ou variedades. Tratamentos tais como transformação e edição genômica podem ser realizados em uma variedade mais ampla de espécies ou culturas através da introdução de uma substância em um ovócito fertilizado que seja um zigoto, ou um ovócito ou célula espermática que seja um gameta como um alvo do que a situação atual. Como um resultado de estudos diligentes, os inventores descobriram um método que permite a introdução de substâncias em um ovócito fertilizado sem um tratamento com enzimas degradadoras de tecidos vegetais. Além disso, eles descobriram que a introdução de substância em um ovócito fertilizado, indução de divisão e transformação são permitidas ao combinar métodos para cultivar um ovócito fertilizado isolado sem um tratamento com enzimas degradadoras de tecido vegetal, deste modo, concluindo a presente invenção.

SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA [0029] A presente invenção inclui, embora sem limitações, as seguintes modalidades.

Modalidade 1 [0030] Um método para introduzir uma substância em uma planta que compreende introduzir uma substância em uma célula germinativa vegetal com formação incompleta da parede celular.

Modalidade 2 [0031] O método de acordo com a modalidade 1, em que a célula germinativa vegetal isolada não é tratada com uma enzima degradadora de tecido vegetal antes de introdução da substância.

Modalidade 3

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 35/90

7/50 [0032] O método de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que a taxa de formação da parede celular é de 65 % ou menos. Modalidade 4 [0033] Método de acordo com a modalidade 1, em que a célula germinativa vegetal é um ovócito fertilizado.

Modalidade 5 [0034] O método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 que compreende:

obter um ovócito fertilizado ao:

(1-i) fundir um ovócito e uma célula espermática de uma planta para produzir um ovócito fertilizado, ou (1-ii) isolar um ovócito fertilizado de uma planta a partir de um tecido que contém o ovócito fertilizado; e (2) introduzir a substância no ovócito fertilizado obtido.

Modalidade 6 [0035] O método de acordo com a modalidade 5, em que o ovócito e a célula espermática são fundidos em (1-i) por meio de eletrofusão. Modalidade 7 [0036] O método de acordo com a modalidade 5 ou 6, em que a etapa (2) de introdução da substância é realizada dentro de 120 minutos após a obtenção do ovócito fertilizado.

Modalidade 8 [0037] O método de acordo com a modalidade 5 ou 6, em que a etapa (2) de introdução da substância é realizada dentro de 60 minutos após a obtenção do ovócito fertilizado. Modalidade 9 [0038] O método de acordo com a modalidade 5, em que o ovócito e a célula espermática são fundidos em (1-i) por meio de fertilização natural.

Modalidade 10

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 36/90

8/50 [0039] O método de acordo com a modalidade 5 ou 9, em que a etapa (2) de introdução da substância é realizada dentro de 360 minutos após a obtenção do ovócito fertilizado.

Modalidade 11 [0040] O método de acordo com a modalidade 5 ou 9, em que a etapa (2) de introdução da substância é realizada dentro de 240 minutos após a obtenção do ovócito fertilizado.

Modalidade 12 [0041] O método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 que compreende:

(1) introduzir a substância em um ou em ambos do ovócito e da célula espermática da planta; e (2) fundir o ovócito e a célula espermática que foram submetidos à etapa (1) para produzir um ovócito fertilizado.

Modalidade 13 [0042] O método de acordo com a modalidade 12, em que o ovócito e a célula espermática são fundidos em (1) por meio de eletrofusão ou fertilização natural.

Modalidade 14 [0043] O método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 13, em que a substância é introduzida usando um método de PEG ou um método de eletroporação.

Modalidade 15 [0044] O método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 14, em que a planta é uma planta monocotiledônea.

Modalidade 16 [0045] O método de acordo com a modalidade 15, em que a planta é selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, cevada, arroz e sorgo.

Modalidade 17

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 37/90

9/50 [0046] Uma planta na qual foi introduzida uma substância obtida por meio do método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 16.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO [0047] Convencionalmente, a transformação por meio do método de PEG foi considerada inadequada para um ovócito fertilizado produzido in vitro através de um tratamento de eletrofusão ou similar. Na presente invenção, a introdução, transformação e cultura de substâncias podem ser realizadas usando uma célula germinativa vegetal com formação incompleta da parede celular sem tratar a célula com enzimas degradadoras de tecido vegetal. A presente invenção permite que transformantes de plantas, os quais eram convencionalmente difíceis de transformar em virtude da dificuldade da cultura ou similar e, assim, aos quais traços úteis não podem ser conferidos, sejam obtidos de forma estável com boa reprodutibilidade.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0048] A Figura 1 inclui micrografias ópticas de um ovócito (linha superior) e uma célula espermática (linha inferior) isolados de uma flor de arroz.

[0049] A Figura 2 inclui micrografias ópticas que mostram o processo de fusão do ovócito e da célula espermática na Figura 1 e um ovócito fertilizado produzido (ovócito fertilizado in vitro).

[0050] A Figura 3 inclui micrografias fluorescentes de um ovócito fertilizado de arroz que começou a se dividir após a introdução dos ácidos nucleicos de GFP por meio do método de PEG. A Figura 3A inclui os resultados da observação de fluorescência (esquerda) e observação de campo claro (direita) 24 horas após a fusão dos gametas. A Figura 3B inclui os resultados da observação de fluorescência (esquerda) e observação de campo claro (direita) 2 dias após a fusão dos gametas.

[0051] A Figura 4 inclui micrografias ópticas e de fluorescência de uma massa celular derivada de um ovócito fertilizado de arroz no qual

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 38/90

10/50 ácidos nucleicos de GFP foram introduzidos. 18 dias após a fusão dos gametas, observação de fluorescência (esquerda) e observação de campo claro (direita) foram realizadas. Foram observadas a massa celular na qual a fluorescência do óvulo fertilizado foi continuamente observada (A) e uma massa celular na qual a fluorescência não foi detectada (B).

[0052] A Figura 5 é uma micrografia óptica de uma parte aérea gerada a partir de uma massa celular derivada de um ovócito de arroz fertilizado no qual os ácidos nucleicos de GFP foram introduzidos.

[0053] A Figura 6 é uma muda derivada da parte aérea gerada a partir da massa celular da Figura 5.

[0054] A Figura 7 é um gráfico que mostra a quantidade de plasmídeos em um óvulo de arroz fertilizado 1 dia após a introdução do plasmídeo de GFP. Aqueles nos quais os ácidos nucleicos são introduzidos são mostrados como tratamento com PEG + e aqueles nos quais a fluorescência de GFP é observada por um microscópio de fluorescência são mostrados como GFP de sinal +.

[0055] A Figura 8 inclui micrografias de fluorescência (linha superior), micrografias ópticas (linha inferior) e suas combinações (linha do meio) de um óvulo de milho fertilizado no qual ácidos nucleicos de GFP são introduzidos (in vitro) e uma massa celular derivada do ovócito fertilizado.

[0056] A Figura 9 inclui micrografias de fluorescência (linha superior) e micrografias ópticas (linha inferior) de um óvulo fertilizado derivado de arroz transformado por DsRed2 e uma massa celular derivada de um ovócito fertilizado de arroz transformado por DsRed2 no qual são introduzidos ácidos nucleicos para edição genômica. Uma célula obtida por meio de cultura de um ovócito fertilizado derivado de arroz transformado com DsRed2 produzido pela fusão de gametas (sem introdução de ácidos nucleicos para edição genômica) é mostrada como A e uma

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 39/90

11/50 célula obtida pela introdução de ácidos nucleicos para edição genômica (DNA plasmidial) em um ovócito fertilizado de arroz transformado com DsRed2 produzido por meio de fusão de gametas, seguido de cultura, é mostrada como B. No óvulo fertilizado de arroz transformado com DsRed2 no qual são introduzidos ácidos nucleicos para edição genômica, foi mostrado que a fluorescência de DsRed 2 desapareceu.

[0057] A Figura 10 inclui micrografias de fluorescência (esquerda e centro) e uma micrografia óptica (direita) de um ovócito de arroz no qual dois tipos de ácidos nucleicos, GFP e DsRed2, são introduzidos. Observação de fluorescência de GFP (esquerda), observação de fluorescência de RFP (centro) e observação de campo claro (direita) foram realizadas 24 horas após a introdução dos ácidos nucleicos.

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES [0058] A presente invenção se refere a um método para introduzir uma substância em uma planta.

[0059] O método da presente invenção compreende introduzir uma substância em uma célula germinativa vegetal com formação incompleta da parede celular.

[0060] De acordo com uma modalidade, o método compreende: obter um ovócito fertilizado ao:

[0061] De acordo com uma modalidade, o método compreende:

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 40/90

12/50

Plantas [0062] Os tipos de planta não estão especificamente limitados. Tanto plantas dicotiledôneas como plantas monocotiledôneas podem ser empregadas e, de preferência, são empregadas plantas monocotiledôneas. Mais preferivelmente, são empregadas plantas Gramineae, mais preferivelmente milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio e assim por diante e, ainda mais preferivelmente, milho, trigo e arroz.

[0063] O método da presente invenção pode ser particularmente usado, embora sem limitações, para plantas ou variedades difíceis de executar cultura. O termo difícil de executar cultura significa que a cultura é difícil, especificamente, por exemplo, a cultura de uma célula isolada de uma planta é difícil, ou a formação de caule por meio de um tratamento tal como desdiferenciação ou rediferenciação de um caule em uma planta é difícil.

[0064] Em geral, a cultura de plantas monocotiledôneas é mais difícil do que aquela das plantas dicotiledôneas, porém, as plantas difíceis de executar cultura, por exemplo, incluem soja, feijão comum, capsicum e assim por diante. Variedades difíceis de executar cultura significa que a cultura da variedade é mais difícil do que aquela das variedades de pesquisa em geral (tal como milho A188) da mesma espécie. Exemplos das mesmas incluem milho B73, variedades elite de milho derivadas de B73, variedades elite de trigo (tais como AC Barrie e TAM), variedades de cevada diferentes de GoldenPromise e Igri e variedades de sorgo diferentes de 296B, C401, SA281, P898012, Pioneer 8505 e Tx430.

Célula Germinativa Vegetal [0065] O método da presente invenção introduz uma substância em uma célula germinativa de uma planta.

[0066] A célula germinativa é uma célula que desempenha um pa

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 41/90

13/50 pel na transmissão da informação genética para a geração seguinte através da reprodução e é uma célula diferente de células somáticas dentre as células que constituem um organismo multicelular. Na presente descrição, a célula germinativa inclui um gameta para reprodução sexual, incluindo um ovócito (também denominado como ovo ou óvulo) e uma célula espermática (também denominada como espermatozóide) e um zigoto (também denominado como material de conjugação), o qual é uma célula produzida como um resultado de cruzamento de gametas e inclui um ovócito fertilizado formado por meio de fertilização no caso de uma planta.

[0067] A célula germinativa pode ser qualquer ovócito fertilizado, um ovócito e uma célula espermática. Um ovócito fertilizado é preferível. Alternativamente, o ovócito fertilizado é, de preferência, produzido e obtido ao isolar um ovócito e uma célula espermática de uma planta antes de polinização e fertilização e depois fundi-los, sem limitação. Alternativamente, o ovócito fertilizado pode ser um ovócito fertilizado que é isolado de um tecido de uma planta que contém o saco embrionário, isto é, um ovócito fertilizado de uma planta que foi polinizada e fertilizada. Sem limitação, é mais preferível usar um ovócito fertilizado, o qual é um poliploide e cuja sequência genômica tenha sido determinada, do que usar uma célula espermática e um ovócito os quais são haploides antes de fertilização, uma vez que a presente invenção tem como objetivo a transformação por meio da introdução de um gene ou recombinação, introdução de uma substância em uma célula vegetal para edição genômica ou similar e, particularmente, introdução de um gene.

[0068] Na presente descrição, um ovócito significa um gameta feminino formado através de meiose da célula-mãe do saco embrionário no pistilo. Embora o método para isolar um ovócito não seja limitado, o ovário é cortado em uma solução com uma pressão osmótica apropriada e, então, um ovócito exposto na superfície de corte pode ser isolado

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 42/90

14/50 usando um capilar de vidro sob um microscópio, por exemplo.

[0069] Na presente descrição, uma célula espermática significa um gameta masculino formado através de meiose de uma célula-mãe de pólen na antera de um estame. Embora o método para isolar uma célula espermática não seja limitado, quando de imersão do pólen coletado da antera em uma solução com uma pressão osmótica apropriada, o conteúdo do pólen que contém uma célula espermática é liberado do pólen para a solução após um lapso de vários minutos e, então, uma célula espermática pode ser isolada usando um capilar de vidro sob um microscópio, por exemplo.

[0070] Na presente descrição, um ovócito fertilizado significa uma célula na qual uma célula espermática e um ovócito são fundidos.

[0071] Na presente descrição, a célula germinativa vegetal representa uma célula espermática ou um ovócito isolado de um estame ou do pistilo, um ovócito fertilizado no qual as células isoladas são fundidas ou um ovócito fertilizado isolado do pistilo.

Método para Obtenção de Ovócito Fertilizado [0072] De acordo com uma modalidade da presente invenção, um ovócito e uma célula espermática de uma planta podem ser fundidos in vitro para produzir um ovócito fertilizado. Isto é, um ovócito e uma célula espermática podem ser primeiro isolados de uma planta para produzir um ovócito fertilizado in vitro por meio de um método conhecido, tal como eletrofusão (também denominada como fusão de gametas).

[0073] A eletrofusão é um método de fusão de duas ou mais células in vitro por meio de estimulação elétrica. Especificamente na presente descrição, um ovócito fertilizado pode ser produzido ao aplicar um impulso elétrico a um ovócito e uma célula espermática isolados em uma solução com uma pressão osmótica apropriada e, deste modo, fundir as células.

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 43/90

15/50 [0074] No caso da fusão das células por meio de eletrofusãoo, condições tais como tensão e distância entre os eletrodos podem ser apropriadamente determinadas por aqueles versados na técnica para corresponderem ao tipo da planta ou aos tamanhos das células. Por exemplo, as condições descritas na Patente Japonesa Aberta ao Público N° 2016-63785 (PTL 1) podem ser usadas.

[0075] Quando uma célula de fusão (um ovócito fertilizado) é produzida por meio de eletrofusão de uma célula espermática e um ovócito, o limite mínimo da tensão CC é, de preferência, 10 kV ou mais, mais preferivelmente 11 kV ou mais, ainda mais preferivelmente 12 kV ou mais. Além disso, o limite máximo é, de preferência, 17 kV ou menos, mais preferivelmente 16 kV ou menos, ainda mais preferivelmente 15 kV ou menos. O limite máximo e o limite mínimo podem ser apropriadamente selecionados por aqueles versados na técnica.

[0076] Além disso, o limite mínimo da distância entre os eletrodos é, de preferência, 1,5 vezes ou mais, mais preferivelmente 2 vezes ou mais, ainda mais preferivelmente 2,5 vezes ou mais, mais preferivelmente 3 vezes ou mais a soma dos diâmetros do ovócito e da célula espermática a serem fundidos. Além disso, o limite máximo é, de preferência, 6 vezes ou menos, mais preferivelmente 5 vezes ou menos, ainda mais preferivelmente 4 vezes ou menos. O limite máximo e o limite mínimo podem ser apropriadamente selecionados por aqueles versados na técnica. Exemplos do método para medir o diâmetro de uma célula incluem um método para medir o diâmetro usando uma ocular micrométrica montada em um microscópio e um método de importar uma imagem capturada com um microscópio em um computador e medir o diâmetro usando um software de análise de imagem.

[0077] Além disso, a distância entre os eletrodos pode ser adequadamente selecionada por aqueles versados na técnica. Por exemplo, o limite mínimo é, de preferência, 80 pm ou mais, mais preferivelmente 90

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 44/90

16/50 μΓΠ ou mais, ainda mais preferivelmente 100 μίτι ou mais. Além disso, o limite máximo é, de preferência, 240 μίτι ou menos, mais preferivelmente 220 μίτι ou menos, mais preferivelmente 200 μίτι ou menos. O limite máximo e o limite mínimo podem ser apropriadamente selecionados por aqueles versados na técnica.

[0078] A pressão osmótica da solução usada quando uma célula de fusão é produzida por meio de eletrofusão de uma célula espermática e um ovócito pode ser apropriadamente selecionada para corresponder ao tipo de planta a ser usada. Por exemplo, no caso do arroz, o limite mínimo é, de preferência, 380 mOsmol/kg de H2O ou mais, mais preferivelmente 390 mOsmol/kg de H2O ou mais, ainda mais preferivelmente 400 mOsmol/kg de H2O ou mais. Além disso, 0 limite máximo é, de preferência, 470 mOsmol/kg de H2O ou menos, mais preferivelmente 460 mOsmol/kg de H2O ou menos, ainda mais preferivelmente 450 mOsmol/kg de H2O ou menos. No caso do milho, 0 limite mínimo é, de preferência, 500 mOsmol/kg de H2O ou mais, mais preferivelmente 530 mOsmol/kg de H2O ou mais. Além disso, 0 limite máximo é, de preferência, 700 mOsmol/kg de H2O ou menos, mais preferivelmente 680 mOsmol/kg de H2O ou menos. O limite máximo e 0 limite mínimo podem ser apropriadamente selecionados por aqueles versados na técnica.

[0079] Alternativamente, outros métodos de fusão celular conhecidos, tais como 0 método de fusão com cálcio e 0 método de fusão com PEG, podem ser usados para a fusão celular de um ovócito e uma célula espermática. O método de fusão com cálcio usa a propriedade das membranas celulares de que a fusão das membranas celulares tende a ocorrer dependendo da concentração de cálcio. O método de fusão com PEG usa a fusão celular ao tratar uma célula com polietileno glicol (PEG) para ligar as membranas celulares, seguido por remoção do PEG.

[0080] Alternativamente, um ovócito fertilizado pode ser produzido

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 45/90

17/50 em uma planta por meio de fertilização natural para obter o ovócito fertilizado produzido a partir da planta. O método para obter um ovócito fertilizado usando fertilização natural é, por exemplo, um método para expor o estigma, juntar o pólen para polinização e depois isolar um ovócito fertilizado de um tecido que contém o saco embrionário. O ovócito fertilizado pode ser isolado da planta ao extrai-lo do ovário imediatamente após fertilização da planta após a polinização, cortar o ovário em uma solução com pressão osmótica apropriada e isolar o ovócito fertilizado exposto sobre a superfície cortada sob um microscópio usando um capilar de vidro ou similar. Alternativamente, o ovócito fertilizado pode ser liberado para ser isolado, por exemplo, ao dissecar um tecido tal como o nucelo usando uma agulha de vidro sob um microscópio, após tratamento do ovário ou óvulos com uma solução enzimática durante um determinado tempo. Na presente descrição, a fertilização natural pode ser o cruzamento artificial no qual o pólen é artificialmente unido ao estigma ou pode ser um cruzamento natural.

Introdução de Substâncias [0081] O método da presente invenção para introdução de uma substância em uma planta compreende uma etapa de introdução de uma substância em uma célula germinativa vegetal com formação incompleta da parede celular.

[0082] Na presente invenção, a substância introduzida na planta é uma substância com um tamanho e propriedades que podem ser conferidos para uma célula que é um alvo. A substância pode estar naturalmente presente ou ser produzida artificialmente. Exemplos das mesmas incluem várias biomoléculas e compostos. Exemplos de biomoléculas incluem ácidos nucleicos, proteínas, peptídeos, polissacáridos, lipídios e organelas celulares. De acordo com uma modalidade, a substância é selecionada a partir do grupo que consiste em ácidos nucleicos, proteínas e peptídeos.

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 46/90

18/50 [0083] Os ácidos nucleicos não estão especificamente limitados e podem ser RNA, DNA e um conjugado ou mistura dos dois. De preferência, os ácidos nucleicos são vetores circulares de tipo DNA, DNA linear, RNA circular ou RNA linear. Aqueles que têm qualquer comprimento que corresponde ao método de transformação a ser empregado podem ser usados. Por exemplo, o comprimento dos ácidos nucleicos é, de preferência, 100 kb ou menos, mais preferivelmente 50 kb ou menos. O comprimento é, mais preferivelmente, 30 kb ou menos, particularmente de preferência 20 kb ou menos, mais preferivelmente 10 kb ou menos. Ele também pode ser um complexo de ácidos nucleicos e proteínas, tais como cromossomos.

[0084] Proteínas para edição genômica, tais como nucleases, incluindo Cas 9 nuclease, enzimas modificadoras e anticorpos podem ser introduzidos. Sem limitação, o tamanho das proteínas é, de preferência, um peso molecular de 300 kDa ou menos, mais preferivelmente 200 kDa ou menos, ainda mais preferivelmente 150 kDa ou menos.

[0085] Peptídeos se refere, em geral, a moléculas em que vários aminoácidos estão ligados em uma ordem fixa através de ligações amida (também denominadas como ligações peptídicas) e têm, em geral, um comprimento mais curto do que as proteínas. De preferência, o comprimento é 100 aa. ou menos, mais preferivelmente 50 aa. ou menos.

[0086] Polissacarídeos se refere, em geral, a materiais nos quais duas ou mais moléculas de monossacarídeos são polimerizadas por ligações glicosídicas. Por exemplo, eles exibem propriedades diferentes daquelas dos monossacarídeos que são unidades constituintes, tal como o amido. Exemplos dos mesmos incluem amido (amilose e amilopectina), glicogênio, celulose, quitina, agarose, carragenina, heparina, ácido hialurônico, pectina, xiloglicina e glucomanana.

[0087] Lipídios se refere, em geral, a substâncias que são isoladas

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 47/90

19/50 de organismos e são insolúveis em água. Eles são definidos pela solubilidade, não por propriedades químicas ou estruturais específicas. Na definição bioquímica, eles são moléculas derivadas in vivo ou biologicamente que possuem ácidos graxos de cadeia longa ou cadeias de hidrocarbonetos. Exemplos dos mesmos incluem: (i) lipídios simples (tais como acilglicerol e ceramida) formados por ligação de éster de apenas um álcool e um ácido graxo, (ii) lipídios complexos (tais como fosfolipídio, lipídio de açúcar e lipoproteína) que contêm um fosfato ou açúcar na molécula e, em geral, têm um esqueleto de esfingosina ou glicerina, e (iii) lipídios derivados (tais como ácido graxo, terpenoide, esteroides e carotenoides), os quais são compostos hidrofóbicos derivados de lipídeos simples ou lipídios complexos através de hidrólise.

[0088] Organelas celulares se refere, em geral, a estruturas com morfologias ou funções especificamente diferenciadas dentro das células e podem ser denominadas de órgãos intracelulares ou organelas. De acordo com uma modalidade, exemplos dos mesmos incluem estruturas envolvidas por biomembranas, tais como núcleos, retículos endoplasmáticos, o aparelho de Golgi, endossomas, lisossomas, mitocôndrias, cloroplastos e peroxissomas. Exemplos incluem ainda esqueletos de células e estruturas compostas de supercomplexos de proteínas não membramáticas, tais como centrossomas, flagelos e cílios. Exemplos podem incluir ainda nucléolos e ribossomos.

[0089] A substância pode também incluir íons metálicos, compostos e outros que não biomoléculas. Dois ou mais tipos de substâncias, tais como ácidos nucleicos, proteínas, peptídeos, polissacarídeos, lipídios, íons metálicos e compostos, podem ser introduzidos em combinação. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser dois ou mais tipos de DNAs ou RNAs ou uma combinação de DNA e RNA. Diferentes tipos de substâncias, tal como um ácido nucleico e uma proteína, podem ser introduzidos simultaneamente ou como um complexo.

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 48/90

20/50 [0090] Além disso, as substâncias podem ser fornecidas enquanto estão sendo transportadas por ou estão contidas em um carreador a ser introduzido, dependendo das propriedades das substâncias. Aqui, o carreador é um meio (veículo) para fornecer substâncias estranhas a uma célula. Exemplos dos mesmos incluem lipossomas, partículas ou whiskers compostos por metais (tais como ouro e tungstênio) ou substâncias inorgânicas (tais como compostos de silício), esferas de alginato e substâncias virais (tais como proteínas de revestimento). Além disso, substâncias que promovem a introdução de substâncias em uma célula podem ser fornecidas simultaneamente. Exemplos das mesmas incluem proteínas, tais como fibronectina, peptídeos, compostos de quelatos (tal como EDTA) e microestruturas inorgânicas (tal como silica nanoestruturada).

[0091] O método para a introdução de uma substância em uma planta não está especificamente limitado, contanto que seja um método conhecido pelo qual uma substância desejada pode ser introduzida em uma planta, e pode ser apropriadamente selecionado para corresponder ao tipo de planta. Por exemplo, métodos físico-químicos (métodos diretos de introdução de DNA), tais como o método de polietileno glicol (método PEG), o método de eletroporação, o método de pistola de partículas, o método de microinjeção e o método whisker, ou métodos biológicos (métodos indiretos de introdução de DNA), tal como o método de Agrobacterium, podem ser preferivelmente usado. Métodos de introdução direta são preferidos e o método de PEG ou o método de eletroporação são ainda mais preferidos.

[0092] O método de PEG é um método de incorporação de substâncias, tal como DNA, em uma célula vegetal, permitindo que o polietileno glicol (PEG) afete um protoplasto, porém, o mecanismo de absorção de substâncias ainda não é bem conhecido. O método de PEG pode ser realizado de acordo com um protocolo conhecido conforme

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 49/90

21/50 descrito, por exemplo, na NPL 13 ou similar. Sem limitação, a concentração de PEG pode ser de 10% a 30%.

[0093] O método de eletroporação é um método de alimentação de DNA em uma suspensão celular a uma célula ao aplicar um pulso elétrico à suspensão de células para produzir microporos através da membrana celular. No caso do uso de uma célula vegetal como material, geralmente é usado um protoplasto com parede celular rompida e removida. A introdução de substâncias por meio do método de eletroporação pode ser realizada de acordo com um protocolo conhecido. As condições para o mesmo podem ser apropriadamente selecionadas por aqueles versados na técnica, dependendo do material vegetal a ser usado, porém, as condições a seguir podem ser mencionadas, por exemplo.

[0094] A operação de aplicação de um pulso elétrico à célula por meio do método de eletroporação é realizada dentro de um recipiente de eletrodo, tal como uma cubeta de eletrodo. Os eletrodos são, por exemplo, compostos de metais, tais como platina, ouro e alumínio, e a distância entre os eletrodos pode ser apropriadamente selecionada por aqueles versados na técnica, por exemplo, a partir de cerca de 0, 5 mm, cerca de 1 mm, cerca de 2 mm, cerca de 4 mm e cerca de 10 mm.

[0095] O limite mínimo da tensão por distância entre os eletrodos de 1 mm pode ser apropriadamente selecionado por aqueles versados na técnica, por exemplo, a partir de 5 V ou mais, 10 V ou mais, 20 V ou mais, 30 V ou mais, 40 V ou mais e 50 V ou mais, e o limite máximo da tensão pode ser apropriadamente selecionado, por exemplo, a partir de 5000 V ou menos, 1000 V ou menos, 500 V ou menos e 100 V ou menos. A tensão pode ser um único pulso ou múltiplos pulsos. No caso de múltiplos pulsos, a tensão pode ser aplicada como pulsos de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 1 0 vezes ou 1 5 vezes, por exemplo. Cada intervalo entre os pulsos tem cerca de

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 50/90

22/50

0,5 a cerca de 500 ms, de preferência cerca de 5 a cerca de 250 ms, mais preferivelmente cerca de 10 a cerca de 150 ms, ainda mais preferivelmente cerca de 40 a 120 ms. Além disso, após os pulsos serem aplicados múltiplas vezes em tais intervalos, um pulso na mesma ou em outra tensão diferente pode ser aplicado de 1 seg a 10seg, 2 seg a 8 seg ou 3 seg a 5 seg. Além disso, no caso em que uma pluralidade de pulsos é aplicada, a intensidade de pulso pode ser a mesma ou diferente. O limite mínimo da duração de cada pulso pode ser selecionado a partir de 0,01 ms ou mais, 0,1 ms ou mais e 1 ms ou mais, e o limite máximo do mesmo pode ser selecionado a partir de 15 ms ou menos, 10 mseg ou menos, 5 mseg ou menos e 3 mseg ou menos.

[0096] A solução usada no método de eletroporação pode ser uma usada no método de eletroporação que tem sido convencionalmente realizado em uma planta. Exemplos da mesma incluem soluções que contêm sais inorgânicos, tais como KCI, NaCI e CaCl2 usando PBS, HEPES ou MES como um tampão, e soluções que contêm sais orgânicos, tais como aspartato de potássio, gluconato de cálcio e glutamato de potássio. Além disso, soluções usadas quando o método de eletroporação é realizado em células ou tecidos de animais podem ser empregadas. Exemplos das mesmas incluem Meio Opti-MEM fabricado pela Thermo Fisher Scientific K.K. A pressão osmótica de uma solução pode ser apropriadamente selecionada para corresponder ao tipo de planta a ser usada. Por exemplo, no caso do arroz, o limite mínimo é, de preferência, 380 mOsmol/kg de H2O ou mais, mais preferivelmente 390 mOsmol/kg de H2O ou mais, ainda mais preferivelmente 400 mOsmol/kg de H2O ou mais. Além disso, 0 limite máximo é, de preferência, de 470 mOsmol/kg de H2O ou menos, mais preferivelmente 460 mOsmol/kg de H2O ou menos, ainda mais preferivelmente 450 mOsmol/kg de H2O ou menos. No caso do milho, 0 limite mínimo é, de preferência, 500 mOsmol/kg de H2O ou mais, mais preferivelmente 530 mOsmol/kg

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 51/90

23/50 de H2O ou mais. Além disso, 0 limite máximo é, de preferência, 700 mOsmol/kg de H2O ou menos, ainda mais preferivelmente 680 mOsmol/kg de H2O ou menos.

[0097] A concentração da substância a ser introduzida não está limitada, porém, é1 ng/μΕ a 2000 ng/μΕ, de preferência 10 ng/μΕ a 1000 ng/μΕ, mais preferivelmente 20 ng/μΕ a 500 ng/μΕ.

[0098] No método de PEG e no método de eletroporação, a introdução ou cotransformação de uma pluralidade de tipos de substâncias pode ser realizada pela dissolução de dois ou mais tipos de substâncias, tal como DNA em suspensão, e adição de PEG ou aplicação de um pulso elétrico na presença de uma célula vegetal.

[0099] A introdução da substância pode ser, por exemplo, de forma tal que ácidos nucleicos sejam introduzidos em uma célula e os ácidos nucleicos sejam incorporados no genoma e retidos de forma estável no mesmo, ou pode ser introdução temporária, de forma tal que os ácidos nucleicos não são constante e estavelmente retidos em uma célula e são retidos apenas por um determinado período de tempo, tal como gRNA e proteína Cas 9 em edição genômica.

Célula Germinativa vegetal Com Formação de Parede Celular Incompleta [0100] No método da presente invenção para introdução de uma substância em uma planta, uma substância selecionada a partir do grupo que consiste em ácidos nucleicos, proteínas e peptídeos é introduzida na célula germinativa vegetal com formação incompleta da parede celular.

[0101] É uma das características da presente invenção que a célula germinativa vegetal isolada antes de introdução da substância não seja tratada e não precise ser tratada com enzimas degradadoras de tecido vegetal usando a célula germinativa vegetal com formação incompleta da parede celular.

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 52/90

24/50 [0102] Enzimas degradadoras de tecidos vegetal se refere, em geral, a enzimas que atuam direta ou indiretamente sobre a pectina, celulose, hemicelulose, outros polissacarídeos da matriz, fosfolipídios, proteínas e assim por diante, na periferia dos tecidos e células de uma planta para degradá-los. Exemplos das mesmas incluem pectinase, celulase, protease, hemicelulase e suas misturas. Contudo, um tratamento de uma célula vegetal com tal enzima degradadora de tecido vegetal pode afetar adversamente a viabilidade da célula e pode, possivelmente, ser uma das causas da dificuldade em cultivar tecidos vegetais. Uma vez que a presente invenção permite a cultura, introdução de substâncias e transformação sem tratamento de uma célula vegetal com enzimas degradadoras de tecidos vegetais, os transformantes de plantas, os quais eram convencionalmente difíceis de transformar em virtude da dificuldade de realizar cultura ou similar e, portanto, aos quais traços úteis não poderíam ser conferidos, podem ser obtidos de forma estável com boa reprodutibilidade.

[0103] Na presente descrição, um tratamento de uma célula germinativa vegetal isolada com enzimas degradadoras de tecido vegetal inclui um tratamento realizado em uma célula germinativa vegetal para protoplastização, tal como introdução de gene por meio do método de PEG ou similar, e exclui, desejavelmente, um tratamento simplesmente para isolar a célula germinativa vegetal de um tecido que contém o saco embrionário, tal como o ovário (geralmente usando uma solução enzimática com uma concentração muito baixa). A presente invenção inclui uma modalidade de simplesmente usar uma solução enzimática com uma concentração muito baixa para isolar a célula germinativa vegetal. Especificamente, a presente invenção inclui o caso em que, após a adição de enzimas degradadoras de tecido vegetal ao óvulo ou ao nucelo para isolar um ovócito, e uma célula espermática ser fundida com o ovócito isolado para obter um ovócito fertilizado, uma substância é

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 53/90

25/50 introduzida no ovócito fertilizado isolado por meio do método de PEG ou por meio do método de eletroporação, e o caso em que, após um o tratamento com enzimas degradadoras de tecidos vegetais ser realizado apenas para isolar um ovócito fertilizado produzido dentro de uma planta através de fertilização natural do óvulo ou do nucelo, e o ovócito fertilizado ser isolado, uma substância é introduzida no ovócito fertilizado isolado por meio do método de PEG ou o método de eletroporação.

[0104] A célula com formação da parede celular incompleta não é uma célula tal como uma célula vegetal, a qual é quase totalmente rodeada por uma parede celular, exceto a interligação de plasmodesmos, mas uma célula não rodeada por uma parede celular parcial ou totalmente. A célula germinativa vegetal com formação incompleta da parede celular inclui gametas para reprodução sexual, incluindo um ovócito e uma célula espermática. Alternativamente, ela inclui um ovócito fertilizado que é formado através de fertilização e no qual a formação da parede celular não iniciou ou a formação da parede celular foi iniciada, porém, ainda não foi concluída em um estado incompleto. De preferência, ela é um ovócito fertilizado com formação incompleta da parede celular.

[0105] A formação da parede celular de uma célula germinativa vegetal pode ser verificada, por exemplo, através de um método conhecido, tal como coloração de celulose por Calcofluor e coloração com azul de anilina. O Calcofluor é um corante de fluorescência não específico que se liga à celulose ou quitina contida nas paredes celulares das células vegetais, fungos e assim por diante. Ele é excitado a 300 a 440 nm (355 nm no máximo) e a fluorescência máxima da celulose em uma solução tampão de fosfato a 0,1 M com um pH de 7,0 é 433 nm. Sem limitação, o brilho da fluorescência pode ser medido, por exemplo, usando um microscópio confocal de varredura a laser, e o brilho integrado pode ser determinado por meio de análise de imagem da

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 54/90

26/50 intensidade de fluorescência.

[0106] Sem limitação, a taxa de formação da parede celular pode ser expressa, por exemplo, como uma proporção do brilho comparado com o brilho da célula quando a formação da parede celular em uma célula vegetal foi completamente concluída e a célula está inteiramente coberta por uma parede celular. Sem limitação, a formação incompleta da parede celular significa que a taxa de formação da parede celular é, de preferência, de 80% ou menos, mais preferivelmente de 70% ou menos, ainda mais preferivelmente de 65% ou menos, ainda mais preferivelmente de 63% ou menos, particularmente de preferência 60% ou menos, particularmente de preferência 50% ou menos, mais preferivelmente 30% ou menos.

[0107] De acordo com uma modalidade da presente invenção, um ovócito fertilizado pode ser usado como uma célula germinativa vegetal. Neste caso, o ovócito fertilizado é obtido ao (1-i) fudir um ovócito e uma célula espermática de uma planta para produzir um ovócito fertilizado ou (1-ii) isolar um ovócito fertilizado de uma planta a partir de um tecido que contém o ovócito fertilizado; e, depois disso, (2) uma substância é introduzida no ovócito fertilizado obtido.

[0108] Um ovócito, antes da fertilização, tem uma parede celular em um estado diferente daquele de uma célula somática normal, em que uma parede de célula completa é formada pela primeira vez quando um ovócito e uma célula espermática são fundidos. Uma vez formada a parede celular, a parede celular precisa ser removida para introdução da substância. Consequentemente, a operação de introdução da substância é, de preferência, realizada imediatamente após a fertilização antes de conclusão da formação da parede celular. Por exemplo, no caso do milho e arroz, a formação da parede celular começa cerca de 20 minutos após a fertilização (NPLs 1 5 e 16) e está concluída em cerca de 2 horas. Portanto, a introdução da substância é, de preferência, realizada

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 55/90

27/50 dentro de 2 horas (120 minutos). Além disso, também no caso do isolamento de um óvulo fertilizado produzido por meio de fertilização natural em uma planta a partir do óvulo ou similar, a operação de introdução da substância é, de preferência, realizada imediatamente após o isolamento do ovócito fertilizado.

[0109] No entanto, no caso da produção de um ovócito fertilizado através de fertilização natural dentro de uma planta, leva tempo desde o momento em que o pólen é unido ao estigma até a fertilização real na planta e a formação de ovócito fertilizado, diferentemente do caso da fusão entre um ovócito isolado e uma célula espermática. Portanto, em tal caso, é preferível especificar o período de tempo entre a polinização e a fertilização e remover o ovócito fertilizado após a fertilização durante o período de tempo especificado como um método para obter um ovócito fertilizado imediatamente após a fertilização. Por exemplo, o tempo desde a polinização até a fertilização pode ser estimado ao observar a fluorescência ao longo do tempo da taxa de extensão do tubo polínico de um pólen pré-polinizado usando uma solução de coloração, tal como azul de anilina. Levando em conta o tempo desde a polinização até à fertilização (tempo de formação de um ovócito fertilizado) assim estimado, a operação de introdução da substância é, de preferência, realizada dentro do período de tempo antes de conclusão da formação da parede celular no ovócito fertilizado.

[0110] O tempo para conclusão da formação da parede celular em um ovócito fertilizado varia dependendo da variedade da planta. No método da presente invenção, uma substância é introduzida em uma célula com formação incompleta da parede celular, isto é, um ovócito fertilizado antes de conclusão da formação da parede celular na célula. O tempo desde a aquisição de um ovócito fertilizado até à conclusão da introdução da substância pode ser apropriadamente determinado para corresponder à variedade de planta por aqueles versados na técnica.

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 56/90

28/50

Por exemplo, no caso do arroz ou milho, a introdução da substância é, de preferência, realizada dentro de 180 minutos, mais preferivelmente 150 minutos, mais preferivelmente 120 minutos, ainda mais preferivelmente 60 minutos, mais preferivelmente 20 minutos após a obtenção de um ovócito fertilizado ser obtido pela fusão de um ovócito e uma célula espermática isolados, sem limitação. Particularmente no caso do milho, a introdução da substância é realizada dentro de 120 minutos, de preferência 60 minutos, mais preferivelmente 20 minutos, após a aquisição de um ovócito fertilizado.

[0111] Além disso, por exemplo, no caso do arroz ou milho, a introdução da substância é realizada dentro de 6 horas, 5 horas, 4 horas, de preferência de 360 minutos, 240 minutos, 180 minutos, mais preferivelmente 120 minutos, ainda mais preferivelmente 60 minutos após polinização (cruzamento) por meio de fertilização natural, sem limitação.

[0112] Alternativamente, após uma substância ser introduzida, um ou ambos de um ovócito e uma célula espermática antes de cruzamento do ovócito e da célula espermática, o ovócito e a célula espermática podem ser fundidos para produzir um ovócito fertilizado. De preferência, a substância é introduzida no ovócito.

Formação de Caules ou Formação e Rediferenciação de Estruturas de Tipo Embrião (Massa de Células Embrionárias) [0113] O método para introduzir uma substância em uma planta da presente invenção pode ainda compreender: realizar a formação de caule ou a formação de estruturas de tipo embrião (também denominada como massa de células embrionárias) do ovócito fertilizado no qual a substância foi introduzida após a etapa de introdução da substância; e rediferenciar o tecido de caule ou embrionado em um meio de rediferenciação.

[0114] A etapa de formação de caule ou formação da estrutura de tipo embrião e a etapa de rediferenciação não estão especificamente

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 57/90

29/50 limitadas e métodos conhecidos para regeneração de uma planta a partir de um ovócito fertilizado podem ser usados.

[0115] Na etapa de formação de caule ou formação da estrutura de tipo embrião, o ovócito fertilizado no qual a substância foi introduzida obtido é cultivado de modo a formar o caule ou estrutura de tipo embrião. A etapa de induzir À divisão de um ovócito fertilizado e permitir que a célula se desenvolva de modo a formar o caule ou estrutura de tipo embrião não está especificamente limitada, uma vez que as condições ideais diferem dependendo das plantas, porém, de preferência, é o método de cultura com alimentador células adicionadas. Por exemplo, o procedimento pode ser como segue.

[0116] Pré-tratamento·. Um ovócito fertilizado no qual a substância foi introduzida é colocado em uma gotícula de manitol (450 mOsmol/kg de H2O), seguido de lavagem para esterilização.

[0117] Cultura em meio líquido·. O ovócito fertilizado no qual a substância foi introduzida é transferido para um meio, seguido de repouso de um dia para 0 outro e cultura através de agitação suave. A velocidade de agitação é, de preferência, 30 a 50 rpm, mais preferivelmente 35 a 45 rpm. A temperatura de cultura é, de preferência, 24 a 28°C, mais preferivelmente 25 a 27°C. A cultura é, de preferência, realizada no escuro. Neste momento, as células alimentadoras são, de preferência, adicionadas ao meio para realizar a cocultura (método de cultura nutridora). O período de cultura é, de preferência, 4 a 14 dias, mais preferivelmente 5 a 10 dias.

[0118] Meio: Meio Líquido MS (T. Murashige et aí, Physiol. Planta, 15, 473 (1962)), meio B5 (Gamborg O.L. et etal., Experimental Cell Research, 50, 151-15 8(1968)) ou meio N6 (Chu et al., Sei. Sinica, 18, 659-668 (1975)), e assim por diante, ao qual auxinas, tais como ácido

2,4-diclorofenoxiacético e ácido naftalenoacético, são adicionadas.

[0119] As auxinas tais como ácido indol-3-acético, 2,4-D e dicamba

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 58/90

30/50 são preferivelmente adicionadas ao meio. A concentração de auxinas a ser adicionada é, por exemplo, 0,1 a 3,0 mg/L, de preferência 0,1 a 0,3 mg/L, mais preferivelmente 0,15 a 0,25 mg/L.

[0120] Células alimentadoras·. Qualquer célula alimentadora conhecida pode ser usada. Exemplos das mesmas incluem uma cultura de suspensão de células de arroz (Linha Oc, fabricada pelo Riken BioResource Research Center), uma célula nutridora de milho (Mol et al., 1993) e uma suspensão de células não morfogênicas (Kranz et al., 1991).

[0121] Através desta etapa, uma estrutura de tipo embrião esférica com um diâmetro de cerca de 50 a 200 μίτι é formada 4 a 14 dias após o início da cultura.

[0122] A etapa de rediferenciação também pode ser realizada de acordo com uma etapa de rediferenciação conhecida. Por exemplo, ela pode ser executada da seguinte maneira.

[0123] Cultura·. Uma estrutura de tipo embrião esférica é transferida para um meio que não contém células alimentadoras, seguido por outra cultura durante cerca de 10 a 14 dias. Depois disso, a estrutura de tipo embrião é cultivada em um meio arbitrário que não contém auxinas, tal como o meio MS, para formar uma planta. Neste ponto, a cultura é, de preferência, realizada sob irradiação de luz e a luz é, por exemplo, de preferência, 50 a 180 μίτιοΙ/ιτι² por segundo, mais preferivelmente 70 a 150 μίτιοΙ/ιτι² por segundo.

[0124] Meio: Meios sólidos, tais como o meio MS, o meio B5 e o meio N6, os quais usam agarose, ágar, goma gelana, gelrite ou similar são mencionados, por exemplo.

Planta na Qual Substâncias Foram Introduzidas [0125] A presente invenção inclui ainda uma planta na qual substâncias foram introduzidas obtida por meio do método da presente in

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 59/90

31/50 venção. Antes da presente invenção, era difícil ou impossível obter plantas nas quais substâncias foram introduzidas, particularmente plantas e variedades difíceis de realizar cultura. A presente invenção permite que uma planta na qual substâncias foram introduzidas de tais plantas e variedades seja obtida de forma eficiente através de um método simples.

[0126] Além disso, a planta na qual substâncias foram introduzidas obtida por meio do método da presente invenção inclui não apenas plantas com ácidos nucleicos, tais como plasmídeos e fragmentos de sequência gênicas, proteínas ou peptídeos para edição genômica ou similar, introduzidos e mantidos no interior das plantas, mas também plantas transformadas obtidas pela introdução de substâncias, particularmente genes, plantas com genoma editado pela introdução de substâncias associadas à edição genômica, tais como Cas 9 e RNA guia, e suas progênies e clones.

EXEMPLOS [0127] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes com base em exemplos, porém, a presente invenção não está limitada a estes exemplos. Aqueles versados na técnica podem modificar e alterar facilmente a presente invenção com base na divulgação da presente descrição, e tais modificações e alterações estão incluídas no âmbito técnico da presente invenção.

Exemplo 1: Isolamento de Ovócitos e Células Espermáticas de Arroz [0128] Neste exemplo, um ovócito e uma célula espermática foram isolados de uma flor de arroz (Figura 1).

[0129] O ovócito foi isolado como segue. Uma flor imatura, obtida da espiga de arroz, foi dissecada para coletar o ovário. O ovário foi colocado em uma placa de Petri de plástico de 3,5 cm qc 3 μΙ de uma solução de manitol a 6% (370 mOsmol/kg de H2O). O ovário com 0 estigma

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 60/90

32/50 removido foi submerso em 3 ml_ de uma solução de manitol a 6% (370 mOsmol/kg de H2O) em uma nova placa de Petri de 3,5 cm de plástico, e a parte inferior do ovário foi cortada no fundo da placa de Petri usando uma lâmina a laser (FA-10, fabricada pela FEATHER Safety Razor Co., Ltda.). O ovócito liberado do ovário cortado foi observado por microscopia e 0 ovócito foi isolado com um microcapilar. Cerca de 10 a 15 ovócitos foram obtidos a partir de 30 a 40 ovários. Cada ovócito tinha um diâmetro de 40 a 50 pm. Os ovócitos isolados foram transferidos para uma gotícula sobre uma lamínula usando um microcapilar. [0130] A gotícula na lamínula foi criada através do método a seguir.

1) A periferia da lamínula (20 mm x 40 mm) é imersa em uma solução de 1,1,1-tricloroetano que contém diclorometil silano a 2% e, em seguida, seca;

2) 0,2 a 0,3 ml_ de óleo mineral (grau testado em cultura de embriões, fabricado pela Sigma-Aldrich Corporation, 1001279270) são colocados no centro da lamínula; e

3) 1 a 2 pL de uma solução de manitol a 6% (370 mOsmol/kg de H2O) são introduzidos no óleo mineral com uma micropipeta.

[0131] A célula espermática foi isolada como segue. Uma flor imatura obtida da espiga de arroz foi desmontada para coletar a antera. A antera foi colocada em uma placa de Petri de plástico de 3,5 cm que contém 3 ml_ de uma solução de manitol a 6% (370 mOsmol/kg de H2O). Depois que a antera foi submersa na solução de manitol, a antera foi dissecada usando uma pinça para dispersar 0 pólen na solução de manitol. Após um lapso de vários minutos, 0 pólen se rompeu e seu conteúdo que contém a célula espermática foi liberado na solução de manitol. Cada célula espermática tinha um diâmetro de 8 a 10 pm. A célula espermática foi movida para uma gotícula sobre uma lamínula usando um microcapilar.

Exemplo 2: Produção de Ovócito Fertilizado de Arroz Por Meio de

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 61/90

33/50

Fusão de Gametas [0132] Neste exemplo, um ovócito fertilizado de arroz (ovócito fertilizado in vitro de arroz) foi produzido in vitro por meio de eletrofusão de gametas (Figura 2).

[0133] Uma célula espermática e um ovócito isolado por meio do método apresentado no Exemplo 1 foram transferidos para uma gotícula sobre uma lamínula. Em seguida, estas células foram alinhadas sobre eletrodos (CUY5100-100TÍ, Nepa Gene Co., Ltda.) sob corrente alternada (1 MHz, 0,4 kV/cm, ECFG21, Nepa Gene Co., Ltda.). Uma solução de manitol (520 mOsmol/kg de Η₂Ο) foi adicionada gota a gota em uma quantidade que equivale à metade da mesma quantidade da gotícula usando um microcapilar. Depois disso, um pulso de DC (50 με, 12 a 15 kV/cm, com uma distância entre os eletrodos de 5 0 a 150 μηπ) foi aplicado para fundir os gametas, de modo a produzir um ovócito fertilizado.

Exemplo 3: Introdução de Ácidos Nucleicos no Ovócito Fertilizado de Arroz [0134] Neste exemplo, ácidos nucleicos foram introduzidos no ovócito fertilizado in vitro de arroz produzido no Exemplo 2.

[0135] O ovócito fertilizado produzido no Exemplo 2 foi tratado de acordo com este exemplo, de modo que a introdução da substância estivesse concluída dentro de 120 minutos após a fusão dos gametas. O ovócito fertilizado produzido foi transferido para uma gotícula (cerca de 2 μι) de uma solução de MMG (MgCl2 a 15 mM, MES a 4 mM (pH de 5,7), manitol a 450 mOsmol/kg de H2O) e foi posteriormente movido para uma gotícula de MMG à qual um plasmídeo (DNA plasmidial para expressão de GFP, cerca de 6.000 pb) com uma sequência de base a ser introduzida, Promotor 35S :: sequência sinalizadora :: GFP :: sinal de retenção no retículo endoplasmático (HDEL) :: terminador

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 62/90

34/50

NOS, foi adicionado. O plasmídeo foi preparado de acordo com a descrição da NPL 17. Em seguida, a gotícula que contém o ovócito fertilizado foi misturada com uma gotícula (cerca de 2 μΙ_) de uma solução de PEG (obtida por meio da adição de 7,5 g de PEG400 0 e 2,5 mL de cloreto de cálcio a 1 M a 12,5 mL de uma solução de manitol (450 mOsmol/kg de H2O) e ajustada para 25 mg usando água destilada), seguido por agitação 30 a 50 vezes usando um capilar de vidro.

Exemplo 4: Cultura de Ovócitos Fertilizados de Arroz [0136] Neste exemplo, ovócito fertilizado de arroz no qual ácidos nucleicos foram introduzidos no Exemplo 3 foi cultivada.

[0137] De modo a cultivar do ovócito fertilizado obtido no Exemplo 3 com ácidos nucleicos introduzidos, foi preparado um meio para célula fertilizada. O meio para célula fertilizada foi 0 meio N6Z (Kumlehn J. et aí. (1998) Planta 205: 327-333) modificado como segue: 2 g/L de mistura de sais basais de CHU (N6) (fabricada pela Sigma-Aldrich Corporation), 0,025 mg/L de Na2 Μοθ4·2Η2θ, 0,025 mg/L de CoCl2-6H2O, 0,025 mg/L de CuSOzi-SFLO, 0,01 mg/L de retinol, 0,01 mg/L de calciferol, 0,01 mg/L de biotina, 1 mg/L de tiamina-FLO, 1 mg/L de ácido nicotínico, 1 mg/L de piridoxina-HCI, 1 mg/L de cloreto de colina, 1 mg/L de Ca-ácido pantotênico, 0,2 mg/L de riboflavina, 0,2 mg/L de 2,4-D, 0,02 mg/L de cobalamina, 0,02 mg/L de ácido p-aminobenzoico, 0,4 mg/L de ácido fólico, 2 mg/L de ácido ascórbico, 40 mg/L de ácido málico, 4 0 mg/L de ácido cítrico, 40 mg/L de ácido fumárico, 20 mg/L de ácido Na-pirúvico, 1.000 mg/L de glutamina, 250 mg/L de hidrolisado de caseína e 100 mg/L de mioinositol. A pressão osmótica foi ajustada para 450 mOsmol/kg de H2O (pH de 5,7) com glicose para produção. O meio para a célula fertilizada (0,2 mL) produzido foi colocado em um inserto Millicell CM com um diâmetro de 12 mm (fabricado pela Millipore Corporation) e foi colocado em uma placa de Petri de plástico de 3,5 cm que contém 2 mL do

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 63/90

35/50 meio. Além disso, 40 a 60 μί de cultura de suspensão de células de arroz (Linha Oc, fabricada pela Riken BioResource Research Center) foram adicionados à placa de Petri como células alimentadoras.

[0138] Usando um microcapilar lavado e esterilizado, o ovócito fertilizado com ácidos nucleicos introduzidos foi colocado em uma gotícula de manitol fresca (450 mOsmol/kg de H2O) e, em seguida, foi transferido para uma membrana no inserto CM que contém 0 meio para célula fertilizada.

[0139] O ovócito fertilizado com ácidos nucleicos introduzidos foi deixado em repouso no escuro a 26°C durante um dia e depois observado com um microscópio de fluorescência para verificar 0 estado de expressão dos ácidos nucleicos introduzidos e 0 estado de divisão celular com base na presença ou ausência de fluorescência de GFP. A Figura 3A mostra os resultados. Uma vez que a fluorescência de GFP foi observada com certeza em ovócitos fertilizados com ácidos nucleicos introduzidos, a introdução de ácidos nucleicos pôde ser confirmada. Além disso, como um resultado da observação dos ovócitos fertilizados após agitação da cultura durante 2 dias, a divisão em embriões precoces foi confirmada, e novas emissões de luz pela GFP também puderam ser observadas nas células embrionárias iniciais (Figura 3B). Pode-se confirmar com isto que os ácidos nucleicos introduzidos nos ovócitos fertilizados também foram retidos no grupo de células da massa celular embrionária.

[0140] Estes primeiros embriões foram adicionalmente cultivados com agitação no escuro durante cerca de 16 dias para se obter uma massa de células embrionárias. Neste ponto, as células alimentadoras foram removidas do líquido de cultura 5 a 7 dias após 0 início da cultura. Como um resultado de observação da massa de células embrionárias cultivada durante 18 dias, uma massa celular a partir da qual a emissão de luz por GFP foi detectada (Figura 4A) e uma massa celular

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 64/90

36/50 na qual a fluorescência não foi detectada (Figura 4B) foram observadas. Isto revelou que havia dois casos, um onde a GFP era continuamente expressa a partir do estágio de ovócito fertilizado até o estágio de massa celular e um onde a GFP era expressa transitoriamente do estágio de ovócito fertilizado até o estágio de embrião precoce. Além disso, uma vez que a fluorescência foi observada em uma massa de células embrionárias que tinha sido continuamente cultivada durante uma semana ou mais, foi confirmado que os ácidos nucleicos introduzidos no ovócito fertilizado se transformaram para produzir de forma estável proteínas fluorescentes. Os resultados acima revelaram que um gene pode ser introduzido em uma planta para ser expresso transitória ou estavelmente por meio do método da presente invenção.

Exemplo 5: Diferenciação Induzida Por Cultura de Massa de Células Embrionárias de Arroz [0141] Neste exemplo, a diferenciação foi induzida por cultura da massa de células embrionárias de arroz obtida no Exemplo 4.

[0142] A massa de células embrionárias de arroz obtida no Exemplo 4 foi transferida para meio de diferenciação-indução 1 (meio MS modificado; sais MS, vitaminas MS, 100 mg/L de mio-inositol, 2 g/L de casaminoácidos, 30 g/L de sacarose, 30 g/L de sorbitol, 0,2 mg/L de ácido L- naftalenoacético (NAA), 1 mg/LdecinetinaegelriteaO,3%). A cultura foi realizada a 30°C sob fotoirradiação contínua. Os brotos diferenciaram 10 dias após o transplante (Figura 5). Além disso, a massa de células embrionárias nas quais os brotos diferenciaram foi transferida para meio de indução de diferenciação 2 (meio MS modificado; sais MS, vitaminas MS, 100 mg/L de mioinositol, 30 g/L de sacarose e gelrite a 0,3%). A cultura foi realizada a 30°C sob fotoirradiação contínua. As mudas foram obtidas 7 dias após o transplante (Figura 6). As mudas foram rediferenciadas de acordo com a descrição da NPL 18.

Exemplo 6: Relação Entre o Tempo Após Fusão e a Eficiência de

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 65/90

37/50

Introdução de Substâncias [0143] Neste exemplo, o estágio de um ovócito fertilizado no qual uma substância podería ser introduzida por meio do método de PEG sem um tratamento enzimático foi investigado. O tempo decorrido após a eletrofusão foi usado como indicador do estágio dos ovócitos fertilizados. O DNA plasmidial para expressão de GFP usado no Exemplo 3 foi introduzido após um lapso de um determinado tempo em um ovócito fertilizado de arroz produzido usando eletrofusão de acordo com os Exemplos 1 e 2, e a introdução de ácidos nucleicos foi confirmada conforme no Exemplo 4. Posteriormente, o ovócito fertilizado, no qual a introdução de ácidos nucleicos tinha sido confirmada, foi continuamente cultivado sob as condições do Exemplo 4 e a divisão em embriões precoces foi confirmada. A Tabela 1 mostra os resultados. A partir dos resultados, nenhuma diferença na eficiência de introdução foi reconhecida entre a introdução da substância 5 a 20 minutos após a fusão dos gametas e a introdução da substância 120 minutos após a fusão dos gametas. Uma vez que não havia diferença na eficiência introdução de substância 5 a 20 minutos e 120 minutos após a fusão dos gametas, entende-se que a introdução de substâncias não foi causada pela influência de eletrofusão em produzir o ovócito fertilizado, porém, pelo método de PEG. Após um intervalo de 240 minutos, a introdução de ácidos nucleicos foi confirmada com um rendimento baixo, porém, o ovócito fertilizado não se dividiu.

Tabela 1

Tempo decorrido (min) após a fusão dos gametas	Número de ovócitos fertilizados	Número de ovócitos fertilizados com introdução confirmada	Número de ovócitos fertilizados com divisão confirmada
5-20	34	16	15
60	7	4	3
120	18	8	8
240	6	1	0

Exemplo 7: Medição do Grau de Formação da Parede Celular [0144] Neste exemplo, o grau de formação da parede celular em um

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 66/90

38/50 ovócito fertilizado de arroz foi medido.

[0145] Conforme descrito no Exemplo 2, coloração com Calcofluor a 0,005% foi realizada em um ovócito fertilizado após decorrido um intervalo de 2 horas a partir da eletrofusão e um ovócito fertilizado 20 horas após a indução elétrica que foi estimado como tendo uma parede celular suficientemente desenvolvida, e o brilho da fluorescência foi medido usando um microscópio confocal de varredura a laser. Como um resultado da análise de imagens de três células para determinar o brilho integrado e comparação das mesmas, foi confirmado que o brilho de fluorescência detectado pelo Calcofluor a partir das paredes celulares 2 horas após a fertilização foi de cerca de 63% daquele das células fertilizadas após 20 horas.

Exemplo 8: Estimativa da quantidade relativa de plasmídeo no ovócito fertilizado de arroz nos quais ácidos nucleicos foram introduzidos [0146] Neste exemplo, ácidos nucleicos plasmidiais foram introduzidos em um ovócito fertilizado de arroz e a quantidade relativa do plasmídeo na célula foi estimada.

[0147] De acordo com os Exemplos 1 a 3, um ovócito fertilizado de arroz foi produzido por meio de eletrofusão de gametas e ácidos nucleicos foram introduzidos no mesmo através do método de PEG. No entanto, o processo foi realizado 10 minutos a 1 hora após a eletrofusão usando um plasmídeo (DNA plasmidial para expressão de GFP, cerca de 6.000 pb) que contém promotor 35S:: sequência sinalizadora :: GFP :: sinal de retenção no retículo endoplasmático (HDEL) :: Terminador NOS, de modo que a introdução da substância estivesse concluída em 120 minutos da fusão. Depois disso, o ovócito fertilizado foi cultivado de acordo com o Exemplo 4 e a fluorescência derivada de GFP foi observada usando um microscópio de fluorescência. Posteriormente, os ovó

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 67/90

39/50 citos fertilizados foram transferidos para 10 μι de uma solução quantitativa para PCR, um por um, usando um microcapilar. Neste ponto, LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche Applied Science) como a solução para PCR quantitativa e iniciadores específicos configurados para amplificar SP-GFP-ER no plasmídeo (5'-TCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAG-3' e 5'-TGGTGCAGATGAACTTCAGG-3') como iniciadores foram usados. A quantidade relativa do plasmídeo no ovócito fertilizado foi estimada com um ciclo de reação de PCR de 94°C durante 10 segundos, 55°C durante 10 segundos e 72°C durante 10 segundos, usando um ovócito fertilizado sem introdução de genes como o controle. A Figura 7 mostra os resultados.

[0148] Conforme mostrado na Figura 7, foi confirmado que os ácidos nucleicos foram introduzidos não apenas nas células nas quais a fluorescência derivada de GFP foi observada com o microscópio de fluorescência, mas também em alguns indivíduos dentre as células nos quais não foi observada fluorescência. Além disso, houve uma correlação positiva entre a intensidade da fluorescência de GFP e a quantidade do plasmídeo introduzido em indivíduos nos quais a fluorescência derivada de GFP foi observada.

Exemplo 9: Isolamento de Ovócitos e Células Espermáticas de Milho [0149] Neste exemplo, um ovócito e uma célula espermática de milho foram isolados. O ovócito e a célula espermática foram isolados com referência a Kranz E. e Loerz H. (NPL 1) como segue.

[0150] Uma espiga de milho (variedade: A188) em um período de cruzamento crescida em uma estufa e ensacada antes de floração foi testada. Uma seção de nucelo que contém o saco embrionário foi liberado do óvulo da espiga coletada, 1,5 ml_ de uma solução enzimática foram adicionados a uma placa de Petri de plástico de 3,5 cm e a espiga foi deixada de pé em temperatura ambiente. A solução enzimática

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 68/90

40/50 usada foi obtida ao adicionar celulase a 0,33 % (fabricada pela Worthington Biochemical Corporation), Macerozyme R10 a 0,1 % (fabricada pela Yakult Honsha Co., Ltda.) e Pectolyase Y23 a 0,017 % (fabricada pela Morishin Pharmaceutical Co., Ltda.) a uma solução de manitol a 10 % (650 mOsmol/kg de H2O).

[0151] Após tratamento enzimático por 20 a 30 minutos, um ovócito foi isolado usando duas agulhas de vidro. A seção de nucelo foi fixada com uma das agulhas de vidro de modo a não se mover e os tecidos na área na qual 0 ovócito fertilizado estava presente foram raspados com a outra agulha de vidro, deste modo, isolando 0 ovócito. A área na qual 0 ovócito estava localizado foi estimada com base na posição do saco embrionário observado na seção de nucelo. O ovócito isolado foi transferido para uma gotícula de manitol sobre uma lamínula usando um capilar de vidro. A gotícula de manitol na lamínula foi produzida de acordo com 0 Exemplo 1 e a operação foi realizada de modo que a solução enzimática a partir da qual 0 ovócito foi isolado não fosse incorporada na gotícula de manitol tanto quanto possível.

[0152] A célula espermática foi isolada da seguinte forma. O pólen foi coletado do pendão de milho (variedade: B73) em uma placa de Petri de plástico de 3,5 cm e 3 mL de uma solução de manitol a 10% (650 mOsmol/kg de H2O) foram adicionados à mesma. Após cerca de 3 a 5 minutos, 0 pólen se rompeu na solução de manitol e 0 conteúdo do pólen que contém uma célula espermática foi liberado na solução de manitol. Cada célula espermática tinha um diâmetro de 10 μηπ. A célula espermática foi movida para uma gotícula de manitol sobre uma lamínula usando um capilar de vidro.

Exemplo 10: Produção de Ovócito Fertilizado de Milho Por Meio de Fusão de Gametas [0153] Neste exemplo, um ovócito fertilizado de milho foi produzido in vitro por meio de fusão de gametas através de eletrofusão.

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 69/90

41/50 [0154] Uma célula espermática e um ovócito isolados por meio do método mostrado nos Exemplos 8 e 9 foram movidos para uma gotícula sobre uma lamínula. Em seguida, estas células foram alinhadas sobre eletrodos (CUY5100-100TÍ, Nepa Gene Co., Ltda.) sob corrente alternada (1 MHz, 0,4 kV/cm, ECFG21, Nepa Gene Co., Ltda.). Depois disso, um pulso de DC (50 με, 12 a 15 kV/cm, com uma distância entre os eletrodos de 50 a 150 μηπ) foi aplicado para fundir os gametas masculinos e femininos e produzir um ovócito fertilizado.

Exemplo 11: Introdução de Ácidos Nucleicos em Ovócito Fertilizado de Milho [0155] Neste exemplo, ácidos nucleicos foram introduzidos no ovócito fertilizada in vitro de milho produzido no Exemplo 10.

[0156] O ovócito fertilizado produzido no Exemplo 10 foi tratado de acordo com este exemplo, de modo que a introdução de substância estivesse concluída dentro de 30 a 90 minutos após a fusão dos gametas. O ovócito fertilizado produzido foi transferido para uma gotícula (cerca de 2 μι) de uma solução de MMG (MgCl2 a 15 mM, MES a 4 mM (pH de 5,7) e manitol a 650 mOsmol/kg de H2O) e depois foi posteriormente transferido para uma gotícula de MMG para a introdução de ácidos nucleicos à qual um plasmídeo (DNA plasmidial para a expressão de GFP, cerca de 6.000 pb) com uma sequência de base a ser introduzida, promotor 35S :: sequência sinalizadora :: GFP :: sinal de retenção no retículo endoplasmático (HDEL) :: terminador NOS, foi adicionado na concentração de 160 ng/μΕ. O plasmídeo foi preparado de acordo com a descrição da NPL 17. Em seguida, a gotícula para introdução de ácidos nucleicos que contém 0 ovócito fertilizado foi misturada com uma gotícula (cerca de 2 μι) de uma solução de PEG (obtida ao adicionar 7,5 g de PEG4000 e 2,5 mL de cloreto de cálcio a 1 M a 12,5 mL de uma solução de manitol (650 mOsmol/kg de H2O) e ajustado para 25 mg usando água destilada), seguido por agitação 30 a 50 vezes usando um

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 70/90

42/50 capilar de vidro.

[0157] Usando um microcapilar lavado e esterilizado, o ovócito fertilizado no qual ácidos nucleicos foram introduzidos foi colocado em uma gotícula fresca de manitol a 10% (650 mOsmol/kg de H2O) e, em seguida, foi transferido para uma membrana no inserto CM que contém 0 meio para célula fertilizada.

[0158] O ovócito fertilizado no qual ácidos nucleicos foram introduzidos foi deixado em repouso ainda no escuro a 26°C durante um dia, seguido por cultura com agitação contínua. A célula após cultura foi observada com um microscópio de fluorescência invertido para verificar 0 estado de expressão dos ácidos nucleicos introduzidos e 0 estado de divisão celular com base na presença ou ausência de fluorescência de GFP. A emissão de luz pela GFP foi observada com certeza no ovócito fertilizado com ácidos nucleicos introduzidos e, assim, a introdução de ácidos nucleicos pôde ser confirmada. Além disso, como um resultado de observação do ovócito fertilizado no qual ácidos nucleicos foram introduzidos após agitação da cultura durante 6 dias, a divisão em embriões precoces foi confirmada, e outras emissões de luz pela GFP em células embrionárias precoces também puderam ser observadas (Figura 8). Pôde ser confirmado a partir disso que os ácidos nucleicos introduzidos no ovócito fertilizado foram mantidos de forma estável também no grupo de células da massa celular embrionária de milho.

[0159] O meio para 0 ovócito fertilizado foi produzido como segue. [0160] NFUNOsno meio MS foi modificado para 165 mg/L e a composição de matéria orgânica foi a seguinte: 1 mg/L de ácido nicotínico, 10 mg/L de tiamina-HCI, 1 mg/L de piridoxina-HCI, 0,025 mg/L, 750 mg/L de glutamina, 150 mg/L de prolina, 100 mg/L de asparagina e 100 mg/L de mioinositol. 2 mg/L de 2,4-D foram adicionados ao mesmo e a pressão osmótica foi ajustada com glicose a 650 mOsmol/kg de H2O (pH de 5,7) para produção. O meio para 0 ovócito fertilizado produzido

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 71/90

43/50 foi colocado sobre um inserto Millicell CM com um diâmetro de 12 mm (fabricado pela Millipore Corporation) e colocado em uma placa de Petri de plástico de 3,5 cm que contém 2 ml_ do meio. Além disso, 40 a 60 μΙ_ de cultura em suspensão de células de arroz (Linha Oc, fabricada por Riken Bioresource Research Center) foram adicionados à placa de Petri como células alimentadoras para se obter o meio para ovócito fertilizado.

Exemplo 12: Medição do Grau de Formação de Parede Celular no Ovócito Fertilizado de Arroz Obtido Por Fertilização Natural [0161] Neste exemplo, o grau de formação da parede celular no ovócito fertilizado obtido por meio de fertilização natural (cruzamento artificial) foi medido.

[0162] Uma variedade de arroz, Yukihikari, cultivada em um ambiente de uma faixa de temperatura diária de cerca de 28°C e uma temperatura noturna de cerca de 23°C e uma umidade de 40 a 90% foi artificialmente cruzada. O cruzamento artificial foi realizado beliscando florzinhas de arroz imediatamente antes de floração com os dedos. Ela foi cultivada no mesmo ambiente durante 90 minutos até que a operação de isolamento fosse iniciada. Um ovócito fertilizado foi isolado através da mesma operação conforme no isolamento de um ovócito de acordo com o Exemplo 2. A parede do ovócito fertilizado 3 horas, 5 horas, 8,5 horas e 20 horas após o cruzamento artificial foi corada com Calcofluor a 0,005%. Enquanto isso, o ovócito fertilizado foi tratado em uma faixa de temperatura de cerca de 23°C. O ovócito fertilizado corado por Calcofluor durante 10 minutos foi fotografado com um microscópio AxioObserver A1, fabricado pela Carl Zeiss, dotado de um filtro, CFW LP01-Clinicai. Condições de imagiologia com um tempo de exposição de 25 mseg e um equilíbrio de branco de 3200 K foram usadas. O brilho de fluorescência pelo Calcofluor por célula foi medido usando um

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 72/90

44/50 software de análise de imagem ZEN2. Considerando como 100% o brilho da fluorescência do ovócito fertilizado 20 horas após o cruzamento no qual a parede celular foi estimada como suficientemente desenvolvida, a proporção do brilho de fluorescência do ovócito fertilizado várias horas após o cruzamento foi tomada como o grau de formação da parede celular. A Tabela 2 mostra os resultados. O grau de formação da parede celular no ovócito fertilizado foi de 38% em 3 horas após o cruzamento, 52% em 5 horas após o cruzamento e 84% e, 8,5 horas após o cruzamento.

Tabela 2

Tempo (h) após cruzamento	Brilho de fluorescência por célula	Proporção (%) do brilho de fluorescência em relação ao ovócito fertilizado 20 horas após cruzamento
3	427	38
5	582	52
8,5	944	84
20	1121	100

Exemplo 13: Introdução de Ácidos Nucleicos no Ovócito Fertilizado de Arroz Obtido Através de Fertilização Natural Por Meio do Método De Eletroporação [0163] Neste exemplo, os ácidos nucleicos de GFP foram introduzidos por meio de eletroporação em um ovócito fertilizado de arroz obtido através de cruzamento artificial.

[0164] O arroz foi artificialmente cruzado de acordo com o Exemplo 12 para isolar um ovócito fertilizado. Um fragmento de DNA linear composto de uma sequência de base que codifica o promotor de ubiquitina de milho :: íntron de ubiquitina de milho :: GFP :: terminador NOS foi introduzido no ovócito fertilizado isolado, de modo que o tempo para completar o fragmento de DNA fosse de 4 horas após o cruzamento. Um meio Opti-MEM que contém o fragmento de DNA em uma concentração de 100 ng/μΕ com a pressão osmótica ajustada para 450 mOsmol/kg de H2O de manitol foi misturado com 0 ovócito fertilizado. Usando

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 73/90

45/50

NEPA21, fabricado pela Nepa Gene Co., Ltda., a eletroporação foi realizada. Como as condições para eletroporação, eletrodos de 1 mm de largura foram usados e uma tensão de 30 V foi aplicada 4 vezes em uma largura de pulso de 2,0 mseg e um intervalo de pulso de 50 mseg. [0165] O ovócito fertilizado no qual ácidos nucleicos foram introduzidos por meio do método de eletroporação foi cultivado de acordo com o método do Exemplo 4. A introdução de GFP em um caule formado a partir da massa celular embrionária foi confirmada através do método de PCR e a sequência do fragmento amplificada no 42- dia da cultura. Neste ponto, iniciadores específicos (5'-atggtgagcaagggcgag-3' e 5'ccatgatatagacgttgtggctg-3') configurados para amplificar a GFP foram usados como iniciadores para PCR. Como um resultado de uma análise de sequência do fragmento de DNA obtido pela reação de PCR, a sequência de base do produto de PCR coincidiu com a sequência de GFP. [0166] Este resultado mostrou que o fragmento de DNA (GFP) foi introduzido com certeza no ovócito fertilizado no qual ácidos nucleicos foram introduzidos por meio do método de eletroporação. Um caule derivado do ovócito fertilizado no qual foi confirmado que o fragmento de DNA tinha sido introduzido foi cultivado de acordo com o método do Exemplo 5 e a diferenciação foi induzida. Como um resultado, indivíduos rediferenciados puderam ser obtidos.

Exemplo 14: Introdução de Ácidos Nucleicos e Proteínas no Ovócito Fertilizado de Arroz [0167] Neste exemplo, ácidos nucleicos e proteínas foram introduzidos em um ovócito fertilizado de arroz. Especificamente, foram realizados experimentos de edição genômica usando um ovócito fertilizado obtido pela fusão de um ovócito derivado de um arroz no qual os ácidos nucleicos que codificam DsRed 2 (Clontech) foram introduzidos e uma célula espermática derivada de um arroz selvagem.

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 74/90

46/50 [0168] O arroz no qual um gene que codifica a DsRed 2 foi introduzido foi produzido como segue. Um plasmídeo pLC4 (N° de Acesso LC215698) que contém a sequência do promotor de ubiquitina do milho:: gene que codifica DsRed2 :: terminador Nos :: terminador CaMV35S e um gene marcador de resistência à fosfinotricina foi preparado para ser transformado em um arroz (variedade: Yukihikari) de acordo para Hiei e Komari (NPL 18), de modo que um arroz transformado com DsRed2 fosse produzido.

[0169] De acordo com os Exemplos 1 e 2, um ovócito foi isolado a partir do arroz transformado com DsRed2 produzido e uma célula espermática foi isolada de um arroz selvagem (variedade: Yukihikari) para obter um ovócito fertilizado por meio de eletrofusão. De acordo com o Exemplo 3, um DNA de plasmídeo ou um complexo de proteína Cas 9 foi introduzido no ovócito fertilizado obtido. O DNA de plasmídeo e o complexo de proteína Cas 9 a serem introduzidos foram produzidos como segue.

Produção de DNA De plasmídeo a Ser Introduzido:

[0170] Usando os conjuntos de iniciadores mostrados na Tabela 3, o tRNA-tRNA-gRNA 2 foi amplificado para produzir uma unidade de tRNA-gRNA.

Tabela 3

iniciador	Alvo	Iniciador direto (5'- 3')	Iniciador reverso (5'-3j
Vetor CRISPR/Cas 9 tudo-emum	gDsRed2	TGCAGTGAAGCTGAAGGTGAC- CAA	AAACTTGGTCACCTTCA- GCTTCAC
Síntese de sgRNA	sgDsRed2	TAATACGACTCACTATAGG- TGAAGCTGA AGGTGACCAA	TTCTAGCTCTAAAAC- TTGGTCACCTTCA GCTTCAC
Sequência de PCR do genoma	DsRed2-1	ATGGCCTCCTCCGAGAACGTC	CTACAGGAACAGGTGG- TGGCG
DsRed2-2	ACGTCATCACCGAGTTCATGC	GGAAGGACAGCTT- CTTGTAGTCG

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 75/90

47/50 [0171] A unidade de tRNA-gRNA produzida foi introduzida no sítio Bsal de um vetor CRISPR multiplex/Cas 9 usando o método de clonagem Golden Gate e, assim, um vetor de plasmídeo CRISPR/Cas 9 tudo-em-um que contém o promotor U6snRNA de arroz :: unidade de tRNA-gRNA foi produzido.

Produção do Complexo de Proteína Cas 9 a Ser Introduzido:

[0172] Usando um kit GeneArt Precision gRNA Synthesis (Thermo Fisher Scientific KK), o sgRNA foi sintetizado. A Tabela 3 mostra os conjuntos de iniciadores usados. Um complexo de proteína Cas 9 foi obtido mediante adição de 2 a 3 μg de sgRNA, 1 μg de proteína Cas 9 (GeneArt Platinum Cas 9 que tem uma etiqueta sinalizadora de localização de ácidos nucleicos; Thermo Fisher Scientific KK) a 1,5 a 2,1 μΙ_ de um tampão para armazenamento de proteína Cas 9 (Tris-HCI a 10 mM (pH de 8,0), NaCI a 150 m, TCEP a 0,6 mM e glicerol a 50 %), seguido de incubação.

Introdução de DNA de Plasmídeo ou Proteína Cas 9:

[0173] Ao complexo de proteína Cas 9 ou o DNA de plasmídeo obtido ajustado para 80 a 320 ng/μΕ foram, cada um, adicionados a 10 μΙ_ de MMG sobre uma lamínula e foi introduzido em um ovócito fertilizado de arroz de acordo com o Exemplo 3. O ovócito fertilizado com o DNA de plasmídeo introduzido ou o ovócito fertilizado com o complexo de proteína Cas 9 introduzido assim obtido foi cultivado de acordo com o Exemplo 4 e a fluorescência de DsRed 2 foi observada com um microscópio de fluorescência. A Figura 9 mostra micrografias de fluorescência e micrografias ópticas do ovócito fertilizado com o DNA de plasmídeo introduzido. Foi confirmado, a partir dos resultados, que a fluorescência de DsRed 2 foi extinta com cultura tanto em ovócitos fertilizados nos quais foi introduzido o DNA de plasmídeo como o complexo de proteína Cas 9.

[0174] No ovócito fertilizado no qual o DNA de plasmídeo não foi

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 76/90

48/50 introduzido (Figura 9A), a expressão de DsRed2 foi reconhecida em todas as células logo imediatamente após a fusão de gametas (Figura 9A: Dia 0) para o grupo de células da massa celular embrionária (Figura 9A: Dia 7). Em contraste, no ovócito fertilizado com o DNA de plasmídeo introduzido (Figura 9B), a emissão de DsRed 2 foi reconhecida imediatamente após a fusão de gametas e a introdução de ácidos nucleicos (Figura 9B: Dia 0) não foi reconhecida à medida que o número de dias de cultura aumentava (Figura 9B: Dia 7). Isto ocorreu porque a sequência do gene que codifica DsRed 2 no genoma do arroz transformado foi editada à medida que o DNA de plasmídeo era introduzido e, finalmente, foi extinta.

[0175] Além disso, a diferenciação do ovócito fertilizado obtido no qual o DNA de plasmídeo foi introduzido foi induzida de acordo com o Exemplo 5 para obter indivíduos rediferenciados. O DNA foi extraído de uma folha de um indivíduo rediferenciado obtido e a sequência gênica que codifica DsRed 2 foi verificada usando o método de PCR e análise de sequência. A eliminação ou inserção de ácidos nucleicos foi reconhecida com certeza em parte da sequência gênica do indivíduo DsRed2 rediferenciado codificada, indicando que a edição genômica foi induzida.

[0176] Uma vez que os mesmos resultados foram obtidos também no 1 fertilizado com o complexo de proteína Cas 9 introduzido, foi demonstrado que a sequência do gene DsRed 2 do arroz transformado foi editada da mesma maneira também como pela introdução do complexo de proteína Cas 9.

[0177] A partir dos resultados, descobriu-se que o método da presente invenção permite que não apenas um plasmídeo de ácido nucleico, mas também uma substância tal como a proteína Cas 9, seja introduzida em um ovócito fertilizado e o método da presente invenção permite, adicionalmente, a edição genômica.

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 77/90

49/50

Exemplo 15: Introdução Simultânea de Uma Pluralidade de Tipos de Ácidos Nucleicos em Ovócitos de Arroz [0178] Um ovócito de arroz foi isolado de acordo com o Exemplo 1. O ovócito isolado foi movido para uma gotícula (cerca de 2 μΙ_) de uma solução MMG e foi depois transferido para uma gotícula de MMG à qual um plasmídeo com uma sequência de base a ser introduzido, promotor 35S :: :: sequência sinalizadora :: sinal de retenção no retículo endoplasmático (HDEL) :: GFP :: terminador Nos (NPL 17) e um plasmídeo que contém o promotor de ubiquitina :: sequência intrônica do gene que codifica a ubiquitina DsRed2 :: terminador NOS foram adicionados. Então, de acordo com o Exemplo 3, a gotícula que contém o ovócito e os dois tipos de plasmídeos e uma gotícula (cerca de 2 μΙ_) de uma solução de PEG foram misturados, seguido por agitação 30 a 50 vezes usando um capilar de vidro, de modo que os ácidos nucleicos fossem introduzidos no ovócito por meio do método de PEG.

[0179] O ovócito no qual ácidos nucleicos foram introduzidos foi observado com um microscópio de fluorescência 12 a 16 horas após a introdução para verificar o estado de expressão dos ácidos nucleicos introduzidos com base na presença ou ausência de fluorescência de GFP e DsRed2. A Figura 10 mostra os resultados. Uma vez que emissão de luz tanto por GFP (Figura 10: esquerda) como DsRed 2 (Figura 10: centro) foi observada no mesmo ovócito, pôde ser confirmado que os dois tipos de ácidos nucleicos poderíam ser simultaneamente introduzidos também em um ovócito por meio do método da presente invenção.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL [0180] A presente invenção permite a introdução de substâncias, transformação e cultura sem tratamento de uma célula vegetal com enzimas degradadoras de tecidos. Isto permite que transformantes ou indivíduos de plantas com genoma editado, os quais eram convencionalmente difíceis de transformar em virtude da dificuldade de executar a

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 78/90

50/50 cultura ou similar e, assim, aos quais traços úteis não podiam ser conferidos, sejam obtidos de forma fácil e estável com boa reprodutibilidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para introduzir uma substância em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir uma substância em uma célula germinativa vegetal com formação incompleta da parede celular.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula germinativa vegetal isolada não é tratada com uma enzima degradadora de tecidos vegetais antes de introdução da substância.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a taxa de formação da parede celular é de 65% ou menos.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula germinativa vegetal é um ovócito fertilizado.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende:

obter um ovócito fertilizado ao:

(1-i) fundir um ovócito e uma célula espermática de uma planta para produzir um ovócito fertilizado, ou (1-ii) isolar um ovócito fertilizado de uma planta a partir de um tecido que contém o ovócito fertilizado; e (2) introduzir a substância no ovócito fertilizado obtido.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ovócito e a célula espermática são fundidos em (1 -i) por meio de eletrofusão.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a etapa (2) de introdução da substância é realizada em 120 minutos após a obtenção do ovócito fertilizado.
8. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracteri

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 80/90

2/3 zado pelo fato de que a etapa (2) de introdução da substância é realizada em 60 minutos após a obtenção do ovócito fertilizado.
9. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ovócito e a célula espermática são fundidos em (1 -i) por meio de fertilização natural.
10. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 9, caracterizado pelo fato de que a etapa (2) de introdução da substância é realizada em 360 minutos após a obtenção do ovócito fertilizado.
11. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 9, caracterizado pelo fato de que a etapa (2) de introdução da substância é realizada em 240 minutos após a obtenção do ovócito fertilizado.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende:

(1) introduzir a substância em um ou em ambos do ovócito e da célula espermática; e (2) fundir o ovócito e a célula espermática que foram submetidos à etapa (1) para produzir um ovócito fertilizado.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o ovócito e a célula espermática são fundidos em (1) por meio de eletrofusão ou fertilização natural.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a substância é introduzida usando um método de PEG ou um método de eletroporação.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta monocotiledônea.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, cevada, arroz e sorgo.

Petição 870190065235, de 11/07/2019, pág. 81/90

3/3
17. Planta na qual uma substância foi introduzida, caracterizada pelo fato de que é obtida por meio do método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.