CN108342351A - 一种蓖麻原生质体制备和转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蓖麻原生质体制备和转化方法。本发明通过优化蓖麻叶片原生质体分离制备中叶片材料获取时间、切取叶片的形状、酶浓度、酶解时间和离心转速等，并利用自制的简易装置过滤，获得更多活力较强的原生质体，并利用本发明的方法成功的将外源质粒转化蓖麻叶片原生质体，可以用于进一步的亚细胞定位。本发明为蓖麻功能基因的分析建立了一套高效的蓖麻叶片原生质体制备和转化方法及亚细胞定位体系，利用这套体系可以高效的获得蓖麻叶片原生质体，为获得进行亚细胞定位提供了前提条件，进一步为蓖麻关键功能基因研究奠定了良好的工作基础，为蓖麻原生质体的应用提供技术支持。

Description

一种蓖麻原生质体制备和转化方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种蓖麻原生质体制备和转化方法。

背景技术

原生质体(protoplast)一词是Hanstein在1880年提出的，是指植物细胞去掉细胞壁而被原生质膜包裹的那部分裸露的物质。该裸露的物质具有其自身的全部遗传信息，在适宜的条件下培养，可以再生成和其亲本相似的个体；离体的原生质体具有广泛的用途，不但能通过细胞的融合克服远缘杂交不亲和的障碍，而且是进行基因工程操作，尤其是进行基因的瞬时表达的理想受体，因此科学家们越来越重视原生质体的游离技术。

植物原生质体遗传转化常见的方法有基因枪法、农杆菌共培养转化法、电击穿孔转化法和聚乙二醇(PEG)介导转化法等。其中最常用的是PEG介导转化法，该方法不仅成本低，操作简单，而且还可以很大程度地保持原生质体的活性，是进行植物原生质体转化的第一首选。其基本原理是：PEG带有大量负电荷，可以与水分子以及Ca²⁺结合，并且连接原生质体表面的负电荷，形成静电键，从而引起细胞质膜电荷紊乱甚至会产生微孔，使外源DNA可以通过这些孔隙进入细胞体内。植物种类、原生质体的活力与密度、质粒DNA的浓度与纯度、PEG的分子量和浓度以及处理时间等均会影响转化效率。目前为止由PEG介导的原生质体转化技术在拟南芥和水稻等模式植物中逐渐趋于成熟，然而还有许多非模式植物尚未建立。

蓖麻是大戟科蓖麻属一年生或多年生草本植物，是世界上十大油料作物之一，具有很高的经济利用价值。目前有关蓖麻原生质体游离和转化的研究还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术中无有关蓖麻原生质体制备和转化方法的问题，提供一种操作简便、能高效的获得活力较强的蓖麻叶片原生质体的制备方法，及利用该原生质体进行遗传转化的方法。

本发明的蓖麻原生质体制备方法，包括以下步骤：

a.利用蓖麻完整的种子幼胚培养无菌苗，培养20天后，取叶片并吸干表面水分，舍去主叶脉部分，把叶片切成0.2mm宽细丝，然后将其浸没于W5溶液中，加入酶解液，25℃、50rpm振荡酶解80min；所述的酶解液，含有16g/L的纤维素酶RS、8g/L的离析酶R-10、 0.5M的甘露醇、20mM MES、10mM CaCl₂和1g/L的BSA，余量为水；

b.去掉酶解液，然后加入W5溶液漂洗酶解后的叶片细丝，收集漂洗后的溶液，利用原生质体过滤装置过滤，收集过滤液，700rpm离心5min，倒去上清液，用W5溶液悬浮原生质体，再700rpm离心5min，倒去上清液，用W5溶液悬浮原生质体，再700rpm离心10min，去上清，沉淀即为蓖麻原生质体。

优选，所述的无菌苗的培养方法为：挑取成熟饱满的蓖麻种子于蒸馏水中浸泡一天，剥去外壳，使用75体积分数％的乙醇水溶液浸泡1min，再使用质量分数2％的次氯酸钠浸泡并震荡10-15min，最后使用蒸馏水冲洗3-5次后，用无菌镊子剥离蓖麻完整的幼胚接种于MS 基本培养基上，25±1℃、光照强度为2000lx、光照12h/黑暗12h的条件下培养。

优选，所述的W5溶液含有2mM MES、154mM NaCl、125mM CaCl₂和5mM KCl，余量为水。

优选，所述的制备得到的蓖麻原生质体用MMG溶液悬浮，制备得到蓖麻原生质体悬浮液；所述的MMG溶液含有2mM MES、0.5mM甘露醇和15mM MgCl₂，余量为水。

优选，所述的原生质体过滤装置是通过如下方法制备的：将两层300目尼龙膜叠整齐后放置在一个茶漏上，再将另一个相同规格的茶漏放置在尼龙膜上，即制备得到原生质体过滤装置。

本发明的蓖麻原生质体转化方法，包括以下步骤：

a.向待转化质粒中加入适量所述的蓖麻原生质体悬浮液，加入等体积的PEG溶液，轻轻混匀，然后25℃、遮光培养15min；

b.加入W5溶液对原生质体进行洗涤，700rpm离心10min，去掉上清收集沉淀，再用WI溶液悬浮原生质体，25℃、遮光培养12h；然后700rpm离心10min，去除上清，沉淀中即含有成功转化的原生质体。

优选，所述的PEG溶液含有400g/L的PEG4000、0.2mM甘露醇和100mM CaCl₂，余量为水。

优选，所述的WI溶液含有4mM MES、0.5mM甘露醇和20mM KCl，余量为水。

优选，所述的用于蓖麻原生质体转化的质粒可以是多种常用的质粒，比如载体pUC18-35S-eGFP等。

所述的蓖麻原生质体转化方法用于亚细胞定位的用途也属于本发明的保护范围。

目前有关蓖麻叶片原生质体分离制备及转化的方法还未见报道。本发明通过优化蓖麻叶片原生质体分离制备中叶片材料获取时间、切取叶片的形状、酶浓度、酶解时间和离心转速等，并利用自制的简易装置过滤，获得更多活力较强的原生质体，并利用本发明的方法成功的将外源质粒转化蓖麻叶片原生质体，可以用于进一步的亚细胞定位。本发明为蓖麻功能基因的分析建立了一套高效的蓖麻叶片原生质体制备和转化方法及亚细胞定位体系，利用这套体系可以高效的获得蓖麻叶片原生质体，为获得进行亚细胞定位提供了前提条件，进一步为蓖麻关键功能基因研究奠定了良好的工作基础，为蓖麻原生质体的应用提供技术支持。

本发明具有以下优点：

(1)利用自制的简易装置就可以获得数量较多，质量较好的蓖麻叶片原生质体，并且该装置操作简便，价格低廉。而通常其他实验室过滤原生质体专用的细胞筛造价较高，需要一定的操作技术。

(2)本发明所建立的蓖麻叶片原生质体分离制备及转化方法，除了叶片材料来源之外，其余操作都无需严格的无菌操作(如原生质体的获取)，操作容易。而传统的方法要求严格的无菌操作，这给整个过程带来了一定的难度。

(3)本研究首次报道蓖麻叶片原生质体分离制备及转化方法。

附图说明

图1是本发明制备的原生质体过滤装置，(A)两个相同规格的茶漏；(B)两层300目尼龙网；(C)组装好的原生质体过滤装置(Bar＝1cm)。

图2是蓖麻叶片原生质体游离与活力检测，(A)为利用优化后的实验体系(主要实验条件：叶片取材时间为20天，叶片切成0.2mm细丝，酶浓度为16g/L RS和8g/L R-10，酶解时间为80min，离心转速为700rpm)所获得的蓖麻叶片原生质体，(B)蓖麻叶片原生质体活力检测效果(40×)。

图3是利用优化体系进行蓖麻叶片原生质体转化，Bright：明场；Chloroplastauto-fluorescence：叶绿体自发红光；GFP：绿色荧光蛋白信号；Merged：Chloroplastauto-fluorescence与GFP的叠加。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。以下实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

实施例中所采用的茶漏：长11.4cm，上口直径6.4cm，底部滤网直径3.3cm，高2.7cm， 120目过滤网。

以下实施例中所采用的材料及方法：

1.主要试剂的配制

(1)MS基本培养基：无机成分(16.5g/L硝酸铵、19g/L硝酸钾、1.7g/L磷酸二氢钾、3.7g/L七水硫酸镁、4.4g/L二水氯化钙、16.9mg/L一水硫酸锰、8.6mg/L七水硫酸锌、6.2mg/L 硼酸、0.83mg/L碘化钾、0.25mg/L二水硫酸钼二钠、0.025mg/L五水硫酸铜、0.025mg/L 六水氯化钴、37.3mg/L二水乙二胺四乙酸钠、27.8mg/L七水硫酸亚铁)+有机成分(0.1mg/L 盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆醇、0.5mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇)+25g/L 蔗糖+7g/L琼脂，用1mg/L NaOH溶液调整pH至5.8～6.0。培养基在121℃、0.1MPa的条件下灭菌15min。

(2)基本母液(100mL体系)：分别配制100mL体系终浓度为0.2M MES(乙磺酸)(pH5.7)、1M CaCl₂、2M KCl和0.5M MgCl₂，用于后面的实验工作溶液配制；

(3)酶解液(20mL体系)：分别加入不同终浓度的纤维素酶RS(8、16、32g/L)和离析酶R-10(macerozyme R-10)(4、8、16g/L)，以及终浓度为0.5M的甘露醇、20mM MES、 10mMCaCl₂和1g/L(0.10w/v％)的BSA(牛血清蛋白)，搅拌混匀，充分溶解之后定容至 20mL，现配现用；

(4)W5溶液(500mL体系)：将终浓度为2mM MES、154mM NaCl、125mM CaCl₂和5mMKCl充分搅拌溶解，加蒸馏水定容至500mL；

(5)WI溶液(20mL)：将终浓度为4mM MES、0.5mM甘露醇和20mM KCl，充分搅拌溶解加蒸馏水定容；

(6)MMG溶液(10mL)：将终浓度为2mM MES、0.5mM甘露醇和15mM MgCl₂，充分搅拌溶解加蒸馏水定容；

(7)PEG溶液(10mL)：将终浓度为400g/L(40w/v％)PEG4000、0.2mM甘露醇和 100mMCaCl₂水浴锅中煮沸30min溶解。

2.蓖麻无菌苗的获取

挑取适量成熟饱满的蓖麻种子于组培瓶中，加入适量蒸馏水，浸泡一天，剥去外壳，再使用体积分数75％的乙醇水溶液浸泡1min，之后使用质量分数2％的次氯酸钠浸泡并震荡 10-15min，最后使用蒸馏水冲洗3-5次后置于超净工作台上，用无菌镊子小心剥离蓖麻完整的幼胚接种于配制好的MS基本培养基上，在室温为25±1℃、光照强度为2000lx、光照时间为每天12小时的条件下培养不同时间(10、20和40天)，得到蓖麻无菌苗，分别获取叶片为实验材料。

3.原生质体过滤装置的制备

将300目尼龙膜裁剪成10×10cm小块，共获取2块，将2块裁剪好的尼龙膜叠整齐后，放置在一个茶漏上，再用另一个相同规格的茶漏放置在尼龙膜上，即可获得原生质体过滤装置(图1)。

4.获得蓖麻叶片原生质体

从上述蓖麻无菌苗上剪取叶片，用纸巾小心吸干表层水分；在倒扣放置的直径为9cm培养皿上垫一张干净的滤纸进行切割操作，用锋利的刀片把叶子从叶脉两沿切开，舍去主叶脉部分，把切去主叶脉的叶片切成不同形状(0.2mm细丝、0.5×0.5cm小块和1×1cm小块)，并准确称量切好的叶片材料的重量；将切好的叶片材料迅速放入盛有10mL W5溶液的广口瓶(容积为200mL)中，用平头镊子将叶片材料完全浸没，盖上广口瓶盖在室温下静置10-20 min，之后尽量吸去W5溶液，向该广口瓶中加入不同浓度的酶解液(8g/L RS和4g/LR-10、 16g/L RS和8g/L R-10、32g/L RS和16g/L R-10)后盖上盖子，用4层报纸包裹广口瓶，将其置于25℃恒温摇床上以50rpm转速轻轻振荡，进行酶解，酶解时间设为20min、40min、 60min、80min、100min和120min，共6个水平。

5.蓖麻叶片原生质体的纯化

把酶解后的液体从广口瓶中轻轻吸出，尽量去掉酶解液，然后向广口瓶中加入适量W5 溶液，小心漂洗瓶底的酶解后的叶片，反复漂洗三次，将漂洗后的溶液收集，转移到上述原生质体过滤装置上，经过2层300目尼龙膜过滤过筛，收集过滤液，将其转移至50mL离心管，在eppdorff 5804型离心机里用不同转速(300rpm、700rpm和1400rpm)离心5min，倒去上清液，用30mL W5溶液小心悬浮沉积的原生质体，再用eppdorff 5804型离心机以转速为700rpm离心5min，倒去上清液；用2mL W5溶液轻轻悬浮50mL离心管底部的原生质体，将其转移至2mL圆底离心管；将含有悬浮液的2mL圆底离心管置于转速为700rpm 的eppdorff 5427R台式离心机中，离心10min，去上清留沉淀，最后用约1mL MMG溶液悬浮沉淀，得到纯化后的蓖麻叶片原生质体悬浮液。

6.蓖麻叶片原生质体产量的测定

蓖麻叶片原生质体游离纯化后要对其进行产量和活力的测定，原生质体产量计数可采用血球计数板法。将上述纯化后的蓖麻叶片原生质体悬浮液稀释10倍，吸取10μL置于0.1mm 血球计数板上，静置10s，盖上盖玻片，让液体自然充满整个计数室，于显微镜下观察和统计原生质体产量。在10倍镜弱光下找到计数室的9个方格(每个方格0.1mm³，即0.1μL)，统计4个角上的大方格和中间大方格内的数目，每个样品测定3次取平均值，再根据公式推算出原生质体的产量：

原生质体的产量(个/gFW)＝(5个大方格内原生质体数×1000×稀释倍数)/材料鲜重

7.蓖麻叶片原生质体活力的估测

以伊凡蓝(Evansblue)为染色剂对蓖麻叶片原生质体进行活力检测。伊凡蓝不能自由的穿过活的细胞质膜，只有细胞受损破裂，伊凡蓝才能够进入细胞染色，因而可以通过观察细胞是否被染色来确定原生质体的活性。取10μL上述纯化后的蓖麻叶片原生质体悬浮液，向其加入1μL 10g/L的伊凡蓝溶液，摇匀放置1min，滴在载玻片上，在40倍显微镜下观察染色情况。随机选取10个视野，根据以下公式计算原生质体的活力：

原生质体的活力＝(未被染色的原生质体数/原生质体总数)×100％

8.蓖麻叶片原生质体的转化

先向2mL圆底离心管加入10μL质粒(瞬时表达载体pGFP1,即pUC18-35S-eGFP，该质粒已公开于非专利文献Wang Q,Huang W,Jiang Q,et al.Lower Levels of Expressionof FATA2,Gene Promote Longer Siliques with Modified Seed Oil Content inArabidopsis thaliana[J]. Plant Molecular Biology Reporter,2013,31(6):1368-1375.)(约10μg)，再加100μL上述纯化的蓖麻叶片原生质体悬浮液，最后加110μL常温PEG溶液，轻轻的吸打，使管中的几种物质充分混匀，然后将该盛有混合溶液的2mL圆底离心管横放置于25℃恒温培养箱中遮光培养15min；然后加入1mL W5溶液对原生质体进行洗涤，700rpm离心10min，去掉上清收集沉淀；再用1mL WI溶液悬浮原生质体，再将盛有原生质体的2mL圆底离心管横放置于 25℃恒温培养箱中进行过夜遮光培养(12小时)；对培养好的原生质体进行10min离心，转速为700rpm，收集原生质体，去除上清至剩余约40μL液体，用于悬浮原生质体，最后进行显微观察。

9.亚细胞定位显微观察

用荧光显微镜(OLYMPUS MF30)观察原生质体，所有荧光和光学图片由LSM 5ImageBrowser(Car l Ceiss)和Adobe photoshop 5.0软件处理。统计5个具有代表性的视野中原生质体数和发荧光的原生质体数，并按照以下公式计算转化效率。

转化效率(％)＝(发荧光的原生质体数/原生质体总数)×100％

10.培养条件与数据分析

所有实验都是在相同条件下进行的。MS培养基使用1mol/L HCl溶液或1mg/L NaOH溶液调整培养基的pH至5.8-6.0，然后在121℃，0.1MPa的条件下高压灭菌15min。进行蓖麻无菌培养的条件为2000lx的光照强度，12小时/天的光照时间，25±1℃的培养温度。所有试验处理均重复三次，试验数据为3次重复试验的平均值±标准差表示，所有数据采用SPSSStatistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(P≦0.05)，数据后字母不同表示处理间差异显著。

实施例1：取材时间对蓖麻叶片原生质体的产量与活力的影响

本次实验，对获得叶片材料的时间进行优化，结果如表1所示，取材时间对蓖麻叶片原生质体的产量与活力均有显著的影响，当叶片材料的获取时间为20天(幼胚培养20天获得的无菌苗)时，蓖麻叶片原生质体的产量达最大值，为1.19×10⁶个/gFW；原生质体活力也达最大值，为85.34％；叶片材料取材时间过早或者过晚都不利于获得活力较强的原生质体。

表1 取材时间对蓖麻叶片原生质体的产量与活力的影响

注：1.数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(P≦0.05)，数据后字母不同表示处理间差异显著。

2.主要实验条件：叶片切成0.2mm细丝，酶浓度为16g/L RS和8g/L R-10，酶解时间为80min，获取原生质体的离心转速为700rpm。

实施例2：叶片材料切取形状对蓖麻叶片原生质体的产量与活力的影响

本次实验对3种叶片材料切取形状进行比较研究，发现叶片材料切取形状对蓖麻叶片原生质体的产量有比较显著的影响，但是对原生质体活力没有明显的影响。研究结果(表2) 表明，将叶片切成2mm细丝这种方式，可以获得最大的原生质体产量。

表2 叶片材料切取形状对蓖麻叶片原生质体的产量与活力的影响

注：1.数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(P≦0.05)，数据后字母不同表示处理间差异显著。

2.主要实验条件：叶片取材时间为20天，酶浓度为16g/L RS和8g/L R-10，酶解时间为80min，获取原生质体的离心转速为700rpm。

实施例3：酶浓度对蓖麻叶片原生质体的产量与活力的影响

本次实验对3种酶浓度组合进行比较分析，探讨酶浓度对蓖麻叶片原生质体的产量与活力的影响。实验结果如表3所示，当采用的酶浓度为16g/L RS和8g/L R-10时，所获得的原生质体的产量最多和活力最强。

表3 酶浓度对蓖麻叶片原生质体的产量与活力的影响

注：1.数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(P≦0.05)，数据后字母不同表示处理间差异显著。

2.主要实验条件：叶片取材时间为20天，叶片切成0.2mm细丝，酶解时间为80min，获取原生质体的离心转速为700rpm。

实施例4：酶解时间对蓖麻叶片原生质体的产量与活力的影响

为了进一步优化酶解蓖麻叶片的时间，本次实验利用浓度为16g/L RS和8g/L R-10的酶解液对叶片进行不同时间长度(20、40、80、100和120min)的酶解处理，结果表明随着酶解时间的延长，原生质体的产量随之增加，到酶解时间为80min时，原生质体的产量达最大值，继续延长酶解时间，原生质体产量和活力会逐渐降低。

表4 酶解时间对蓖麻叶片原生质体的产量与活力的影响

注：1.数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(P≦0.05)，数据后字母不同表示处理间差异显著。

2.主要实验条件：叶片取材时间为20天，叶片切成0.2mm细丝，酶浓度为16g/L RS和8g/L R-10，获取原生质体的离心转速为700rpm。

实施例5：离心转速对蓖麻叶片原生质体的产量与活力的影响

为了进一步优化获取原生质体时的离心转速，本次实验利用浓度为16g/L RS和8g/L R-10的酶解液对0.2mm叶片细丝进行80min的酶解处理后，对W5溶液漂洗产物进行300、 700、1400rpm转速的离心获得的原生质体，结果表明随着离心转速的提高，原生质体的产量随之增加，当转速为700rpm时，原生质体的产量达最大值，继续提高离心转速，原生质体的产量和活力均会减少。

表5 离心转速对蓖麻叶片原生质体的产量与活力的影响

注：1.数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(P≦0.05)，数据后字母不同表示处理间差异显著。

2.主要实验条件：叶片取材时间为20天，叶片切成0.2mm细丝，酶浓度为16g/L RS和8g/L R-10，酶解时间为80min。

实施例6：利用蓖麻叶片原生质体瞬时转化的效率

利用优化后的实验体系(主要实验条件：叶片取材时间为20天，叶片切成0.2mm细丝，酶浓度为16g/L RS和8g/L R-10，酶解时间为80min，离心转速为700rpm)所获得的蓖麻叶片原生质体(图2)进行瞬时转化，所用载体为瞬时表达载体pGFP1(pUC18-35S-eGFP)，在荧光显微镜下随机观察5个视野(图3)，根据发绿色荧光的原生质体和总原生质体数，计算得出转化效率的平均值为12.37％。

表6 利用蓖麻叶片原生质体瞬时转化的效率

注：曝光时间为600ms。

Claims (10)

1.一种蓖麻原生质体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.利用完整的种子幼胚培养蓖麻无菌苗，培养20天后，取叶片并吸干表面水分，舍去主叶脉部分，把叶片切成0.2mm宽细丝，然后将其浸没于W5溶液中，加入酶解液，25℃、50rpm振荡酶解80min；所述的酶解液，含有16g/L的纤维素酶RS、8g/L的离析酶R-10、0.5M的甘露醇、20mM MES、10mM CaCl₂和1g/L的BSA，余量为水；

b.去掉酶解液，然后加入W5溶液漂洗酶解后的叶片细丝，收集漂洗后的溶液，利用原生质体过滤装置过滤，收集过滤液，700rpm离心5min，倒去上清液，用W5溶液悬浮原生质体，再700rpm离心5min，倒去上清液，用W5溶液悬浮原生质体，再700rpm离心10min，去上清，沉淀即为蓖麻原生质体。

2.根据权利要求1所述的蓖麻原生质体制备方法，其特征在于，所述的无菌苗的培养方法为：挑取成熟饱满的蓖麻种子于蒸馏水中浸泡一天，剥去外壳，使用75体积分数％的乙醇水溶液浸泡1min，再使用质量分数2％的次氯酸钠浸泡并震荡10-15min，最后使用蒸馏水冲洗3-5次后，用无菌镊子剥离蓖麻完整的幼胚接种于MS基本培养基上，25±1℃、光照强度为2000lx、光照12h/黑暗12h的条件下培养。

3.根据权利要求1所述的蓖麻原生质体制备方法，其特征在于，所述的W5溶液含有2mMMES、154mM NaCl、125mM CaCl₂和5mM KCl，余量为水。

4.根据权利要求1所述的蓖麻原生质体制备方法，其特征在于，所述的制备得到的蓖麻原生质体用MMG溶液悬浮，制备得到蓖麻原生质体悬浮液；所述的MMG溶液含有2mM MES、0.5mM甘露醇和15mM MgCl₂，余量为水。

5.根据权利要求1所述的蓖麻原生质体制备方法，其特征在于，所述的原生质体过滤装置是通过如下方法制备的：将两层300目尼龙膜叠整齐后放置在一个茶漏上，再将另一个相同规格的茶漏放置在尼龙膜上，即制备得到原生质体过滤装置。

6.一种蓖麻原生质体转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.向待转化质粒中加入适量权利要求4所述的蓖麻原生质体悬浮液，加入等体积的PEG溶液，轻轻混匀，然后25℃、遮光培养15min；

b.加入W5溶液对原生质体进行洗涤，700rpm离心10min，去掉上清收集沉淀，再用WI溶液悬浮原生质体，25℃、遮光培养12h；然后700rpm离心10min，去除上清，沉淀中即含有成功转化的原生质体。

7.根据权利要求6所述的蓖麻原生质体转化方法，其特征在于，所述的PEG溶液含有400g/L的PEG4000、0.2mM甘露醇和100mM CaCl₂，余量为水。

8.根据权利要求6所述的蓖麻原生质体转化方法，其特征在于，所述的W5溶液含有2mMMES、154mM NaCl、125mM CaCl₂和5mM KCl，余量为水。

9.根据权利要求6所述的蓖麻原生质体转化方法，其特征在于，所述的WI溶液含有4mMMES、0.5mM甘露醇和20mM KCl，余量为水。

10.根据权利要求6所述的蓖麻原生质体转化方法，其特征在于，所述的用于蓖麻原生质体转化的质粒是pUC18-35S-eGFP。