CN103374545B - 一种游离苹果果肉原生质体的方法及其专用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种游离果肉原生质体的方法及其专用试剂盒。本发明提供一种用于果肉原生质体游离的试剂盒，包括酶溶液；所述酶溶液由溶质A和溶剂组成，所溶质A由纤维素酶、离析酶、甘露醇、2-N-吗啡啉乙磺酸、抗坏血酸、CaCl₂和BSA组成，所述纤维素酶、所述离析酶R、所述甘露醇、所述2-N-吗啡啉乙磺酸、所述抗坏血酸、所述CaCl₂和所述BSA的配比为(0.3-0.7)g∶(0.3-0.7)g∶(200-600)mmol∶10mmol∶5.7mmol∶5mmol∶0.1g。本发明的实验证明，本发明的方法可以游离出数量多、质量较好的原生质体。

Description

一种游离苹果果肉原生质体的方法及其专用试剂盒

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，特别涉及一种游离苹果果肉原生质体的方法及其专用试剂盒。

背景技术

苹果是落叶果树中原生质体分离及培养研究较早的树种。以往的原生质体游离材料局限于组培苗的幼叶、叶柄，花药及愈伤组织，果实也局限于培养悬浮细胞来游离原生质。1983年，Huang等首次由完整植株的叶肉分离原生质体，以后经不同研究者的技术改进，叶肉原生质体分离得到满意的效果，分离的原生质体经培养可获得愈伤组织。此后不断有一些苹果原生质体再生植株的报道。到目前，已有超过12种苹果基因型原生质体再生植株，其中大多数再生植株起源于叶肉原生质体，也有由茎段、子叶及愈伤组织悬浮细胞系的原生质体再生出植株的报道。此阶段是苹果原生质体培养再生的突破阶段，但再生成功的基因型较少，原生质体来源也较局限。

Ratnasiri(Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2002)将苹果果肉悬浮培养，在细胞到达指数增长阶段的第四天时收集细胞，用酶溶液消化游离原生质体。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于果肉原生质体游离的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括酶溶液；

所述酶溶液由溶质A和溶剂组成，所溶质A由纤维素酶、离析酶、甘露醇、2-N-吗啡啉乙磺酸(MES)、抗坏血酸、CaCl₂和BSA组成，所述纤维素酶、所述离析酶、所述甘露醇、所述2-N-吗啡啉乙磺酸、所述抗坏血酸、所述CaCl₂和所述BSA的配比为(0.3-0.7)g∶(0.3-0.7)g∶(200-600)mmol∶10mmol∶5.7mmol∶5mmol∶0.1g。

上述纤维素酶为纤维素酶R10；上述离析酶为离析酶R10。

纤维素酶R10：5u/mg；离析酶R10：5u/mg；纤维素酶R10酶活定义：1g酶粉(或1ml酶液)在50℃、pH4.8条件下，1min水解底物(滤纸、CMC、脱脂棉或水杨素)产生1μg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位。

离析酶R10酶活定义：1g酶粉(或1ml酶液)在50℃、pH 3.5条件下，1h分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为1个酶活力单位。

上述试剂盒中，所述纤维素酶在所述酶溶液中的浓度为0.3％-0.7％(质量百分含量)；所述纤维素酶在所述酶溶液中的浓度具体为0.3％(质量百分含量)、0.5％(质量百分含量)或0.7％(质量百分含量)；

所述离析酶在所述酶溶液中的浓度为0.3％-0.7％(质量百分含量)，所述离析酶在所述酶溶液中的浓度具体为0.3％(质量百分含量)、0.5％(质量百分含量)或0.7％(质量百分含量)；

所述甘露醇在所述酶溶液中的浓度为200mM-600mM，所述甘露醇在所述酶溶液中的浓度具体为200mM、400mM或600mM；

所述2-N-吗啡啉乙磺酸在所述酶溶液中的浓度为10mM；

所述抗坏血酸在所述酶溶液中的浓度为5.7mM；

所述CaCl₂在所述酶溶液中的浓度为5mM；

所述BSA在所述酶溶液中的浓度为0.1％(质量百分含量)。

上述试剂盒中，所述纤维素酶在所述酶溶液中的浓度为0.5％(质量百分含量)；

所述离析酶在所述酶溶液中的浓度为0.3％(质量百分含量)；

所述甘露醇在所述酶溶液中的浓度为400mM；

所述溶剂为水。

上述试剂盒还包括洗涤溶液；

所述洗涤溶液由溶质B和所述溶剂组成，所溶质B由NaCl、CaCl₂、KCl和2-N-吗啡啉乙磺酸(MES)组成，所述NaCl、所述CaCl₂、所述KCl和所述2-N-吗啡啉乙磺酸的摩尔比为(120-180)∶(100-140)∶(3-7)∶2。

上述试剂盒中，所述NaCl在所述洗涤溶液中的浓度为120mM-180mM，所述NaCl在所述洗涤溶液中的浓度具体为120mM、150mM或180mM；

所述CaCl₂在所述洗涤溶液中的浓度为100mM-140mM，所述CaCl₂在所述洗涤溶液中的浓度具体为100mM、120mM或140mM；

所述KCl在所述洗涤溶液中的浓度为3mM-7mM，所述KCl在所述洗涤溶液中的浓度具体为3mM、5mM或7mM；

所述2-N-吗啡啉乙磺酸在所述洗涤溶液中的浓度为2mM。

上述试剂盒中，所述NaCl在所述洗涤溶液中的浓度为120mM；

所述CaCl₂在所述洗涤溶液中的浓度为120mM；

所述KCl在所述洗涤溶液中的浓度为3mM。

上述的试剂盒在果肉原生质体游离中的应用也是本发明保护的范围；上述应用中，上述应用中，所述果肉具体来源于苹果。

本发明的另一个目的是提供一种果肉原生质体游离的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)用上述的试剂盒中的酶溶液酶解果肉，得到酶解产物；

2)用尼龙网过滤所述酶解产物，得到兜有原生质体的尼龙网；

3)用上述的试剂盒中的洗涤溶液洗涤所述兜有原生质体的尼龙网，收集洗洗液，即得到原生质体。

上述方法中，步骤1)中，所述果肉为果核周围1-2cm处的果肉；所述酶解的方式为避光静置，所述酶解的时间为2-4小时，所述酶解时间具体为3小时，所述酶解的温度为25℃；

步骤2)中，所述尼龙网为孔径小于所述原生质体直径的，所述尼龙网的孔径具体为50um；

步骤3)的收集洗液后，还包括将所述洗液离心收集上清液，再将所述上清液悬浮，得到原生质体。

上述方法中，所述悬浮采用的悬浮液按照如下方法制备：将甘露醇、MgCl₂、2-N-吗啡啉乙磺酸和水混合，得到悬浮液，所述甘露醇在所述悬浮液中的浓度为400mM，所述MgCl₂在所述悬浮液中的浓度为15mM，所述2-N-吗啡啉乙磺酸在所述悬浮液中的浓度为4mM；

所述离心的时间为6-10min，所述离心的时间具体为10min，所述离心的转速为200rpm，所述离心半径为13.5cm；

所述果肉来源于苹果。

本发明的实验证明，本发明提供了一种可以直接游离新鲜苹果果肉原生质体的方法，采用了新配方的酶溶液、洗液，可以直接、高效的游离新鲜苹果果肉原生质体，游离出数量多、质量较好的原生质体。

附图说明

图1为I组酶解处理后的原生质体直径图像

图2为最优洗涤溶液洗脱悬浮后原生质体图像

图3为FDA原生质体染色前后图像

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述组分浓度如无特殊说明，均为组合物中的终浓度。

纤维素酶R10：5u/mg；离析酶R10：5u/mg；纤维素酶R10酶活定义：1g酶粉(或1ml酶液)在50℃、pH4.8条件下，1min水解底物(滤纸、CMC、脱脂棉或水杨素)产生1μg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位。

离析酶R10酶活定义：1g酶粉(或1ml酶液)在50℃、pH 3.5条件下，1h分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为1个酶活力单位。

纤维素酶R10(目录号为110921-01)、离析酶R10(目录号为202050)购于YakultHonsha，其他常规生化试剂购自北京经科宏达生物技术公司和北京欣经科生物技术公司。离心管等一般耗材购于Axygen公司。

实施例1、苹果果肉原生质体游离的方法

由于苹果全基因组测序使用的品种是金冠(Golden Delicious)，为方便后续研究，选择金冠果实为研究对象。游离苹果果肉原生质体流程大致为：酶液解离-尼龙网过滤-洗脱悬浮-活性检测，因此从各个步骤设计实验来确定游离苹果果实果肉原生质体的最佳体系。

经典的游离叶片及愈伤组织原生质体的方法，是将材料浸入酶液并轻抽真空，使酶液能渗入到细胞间隙之中，充分解离，所以本实验将材料处理又分为轻抽真空和不抽真空。

一、苹果果肉原生质体游离

1、酶解及其酶溶液组分的优化

1)酶溶液各成分浓度设置及配制方法

根据游离玉米原生质体的经典配方，本实验初步确定酶溶液的成分为纤维素酶R10(Yakult Honsha，Tokyo，Japan)、离析酶R10(Yakult Honsha，Tokyo，Japan)、甘露醇、MES(2-N-吗啡啉乙磺酸)、抗坏血酸、CaCl₂、BSA。游离玉米叶片和拟南芥叶片原生质体的酶液配方无法将苹果果实果肉原生质体完整的游离出来，所以本实验设置了不同成分的浓度梯度，来探索最高效的游离果肉原生质体酶液配方。

酶溶液各成分终浓度具体如下，其各组分不同浓度的排列组合共有27种具体见表1：

纤维素酶R10：0.3％、0.5％、0.7％(质量百分含量)

离析酶R10：0.3％、0.5％、0.7％(质量百分含量)

甘露醇：200mM、400mM、600mM

MES(2-N-吗啡啉乙磺酸，Amresco，E169)：10mM

将上述各组分按照表1所示的不同的浓度组合混匀，55℃加热10min，冷却至室温(25℃)分别加入以下成分：

抗坏血酸：5.7mM

CaCl₂：5mM

用0.45um滤膜抽滤灭菌

再加入0.1％(质量百分含量)的BSA，用NaOH调节pH＝5.7，得到27种酶溶液。

2)酶解

采用刚刚成熟的新鲜金冠苹果果实，分别取近果核1-2cm、近果皮1-2cm的果肉两组材料，编号I、II。

先用近果核果肉(I组)进行酶溶液成分的探究，将I组材料用双面刀片切成长1cm、宽0.5cm、厚0.1cm的果片，共54个处理，其中27个处理进行避光25℃静置酶解三小时，剩下的27个处理进行避光25℃静置酶解三小时的同时轻抽真空(将果片与酶溶液放入20ml医用注射器，排出管内空气，去掉针头，堵住注射器管口，轻轻向外拉动注射器，见有微小气泡冒出果片即可)，每一组的27个处理中的每个处理用5ml表1所示一种组分组合的酶溶液处理5片果片，每个处理重复3次。

吸取200ul酶解后溶液在显微镜下观察原生质体解离情况。

结果如下：轻抽真空的27个处理游离出来的原生质体绝大多数破损，只有极少数完整的原生质体残留，推测是由于苹果果肉液泡较大，细胞壁、细胞膜较薄，不适用于游离原生质体的方法。

在不抽真空的27个处理中，使用细胞计数板估算每毫升完整的原生质体数量，细胞数(/ml)＝四大格细胞总数/4×10⁴

具体结果如下表1所示：

表1为不抽真空的不同的酶溶液组分组合酶解得到原生质体数量

表1中不同编号的组合中均还包括MES 10mM、抗坏血酸5.7mM、CaCl₂ 5mM、BSA 0.1％(质量百分含量)。

根据上述实验结果可知，最佳的处理方法为不抽真空，且游离苹果果实果肉原生质体效率最高的酶溶液(最优酶溶液)配方如下：

纤维素酶R10 0.5％(质量百分含量)、离析酶R10 0.3％(质量百分含量)、甘露醇400mM、MES 10mM、抗坏血酸5.7mM、CaCl₂ 5mM、BSA 0.1％(质量百分含量)和水，pH＝5.7。

2、过滤及游离所需材料的选取

将上述1的I组材料和II组材料分别用双面刀片切成长1cm、宽0.5cm、厚0.1cm的果片，再分别用5ml上述1得到的最优酶溶液处理5片果片，避光25℃静置酶解三小时，分别得到两组酶解产物(含有游离原生质体)。

分别吸取200ul酶解产物的溶液在光学显微镜观察并测量I、II两组原生质体直径，结果为I组酶解处理后的原生质体直径范围在70um-100um之间(图1所示)，II组酶解处理后的原生质体直径范围较大，在80um-150um之间；其中I组果肉大小较为均一，因此，近果核1-2cm的果肉游离原生质体更好。

选择I组果肉继续进行原生质体游离：将上述I组酶解产物采用孔径小于原生质体直径的尼龙网(50um)过滤，原生质体过滤到尼龙网上，得到含有原生质体的尼龙网。

3、洗涤、悬浮及洗涤溶液组分的优化

分别用下述27种组分浓度排列组合(排列方式如表2所示)得到的洗涤溶液轻轻冲洗上述2得到的含有原生质体的尼龙网，分别收集洗液(带有原生质)，将洗液200rpm(25℃，离心半径13.5cm)离心10min，收集上清液，再用悬浮液悬浮，分别得到27种游离原生质体。

上述不同组分排列组合得到的洗涤溶液的各组分浓度具体如下：

NaCl：120mM、150mM、180mM

CaCl₂：100mM、120mM、140mM

KCl：3mM、5mM、7mM

MES：2mM。

将上述各组分的浓度进行随机排列组合，共得到27种洗涤溶液，用NaOH调节pH＝5.7。每种配方重复3次。

悬浮液配方：将甘露醇、MgCl₂、MES和水混合，得到悬浮液，甘露醇在悬浮液中的浓度为400mM，MgCl₂在悬浮液中的浓度为15mM，MES在悬浮液中的浓度为4mM。

将上述27种游离原生质体在显微镜下观察，结果如表2，可以看到，用洗涤溶液配方为NaCl 120mM、CaCl₂ 120mM、KCl 3mM、MES 2mM洗脱后原生质体破损率最小(见图2)。

表2为不同的洗涤溶液组分组合进行洗脱、悬浮后的原生质体数量

因此，最优的洗涤溶液配方为NaCl 120mM、CaCl₂ 120mM、KCl 3mM、MES 2mM和水。而且用此洗涤溶液洗涤后悬浮得到的原生质体最多。

二、游离的原生质体活性检测

采取荧光素双醋酸酯(FDA)染色法(黄静，赵琦，等.烟草原生质体活力检测和细胞核染色方法的研究[J].首都师范大学学报，2007，28(4)：42-45)检测10ul上述一最优的洗涤溶液洗脱、悬浮后得到的游离原生质体(56.8个/ul)活性，FDA储存液为2 mg/L丙酮溶液，4℃保存，工作液浓度为0.01％(质量百分含量)。

FDA染色后发黄绿荧光的原生质体是有活力的，红色荧光(叶绿体产生)则表示死亡。但由于苹果果肉细胞中叶绿体含量很少，所以本实验将没有黄绿荧光的原生质体定为无活性。

结果如图3所示，游离原生质体中60％原生质体能够较好的上色(发黄绿荧光)，说明有足够多数量并保证质量的原生质体被游离出来，可以进行后续研究。

Claims (6)

1.一种用于苹果果肉原生质体游离的试剂盒，包括酶溶液；

所述酶溶液由溶质A和溶剂组成，所溶质A由纤维素酶、离析酶、甘露醇、2-N-吗啡啉乙磺酸、抗坏血酸、CaCl₂和BSA组成，

所述2-N-吗啡啉乙磺酸在所述酶溶液中的浓度为10mM；

所述抗坏血酸在所述酶溶液中的浓度为5.7mM；

所述CaCl₂在所述酶溶液中的浓度为5mM；

所述BSA在所述酶溶液中的质量百分含量为0.1％；

所述纤维素酶在所述酶溶液中的质量百分含量为0.5％；

所述离析酶在所述酶溶液中的质量百分含量为0.3％；

所述甘露醇在所述酶溶液中的浓度为400mM；

所述溶剂为水。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括洗涤溶液；

所述洗涤溶液由溶质B和所述溶剂组成，所溶质B由NaCl、CaCl₂、KCl和2-N-吗啡啉乙磺酸组成；

所述NaCl在所述洗涤溶液中的浓度为120mM；

所述CaCl₂在所述洗涤溶液中的浓度为120mM；

所述KCl在所述洗涤溶液中的浓度为3mM。

3.权利要求1或2所述的试剂盒在果肉原生质体游离中的应用；所述果肉来源于苹果。

4.一种果肉原生质体游离的方法，包括如下步骤：

1)用权利要求1或2所述的试剂盒中的酶溶液酶解果肉，得到酶解产物；

所述果肉为果核周围1-2cm处的果肉；

2)用尼龙网过滤所述酶解产物，得到兜有原生质体的尼龙网；

3)用权利要求1或2所述的试剂盒中的洗涤溶液洗涤所述兜有原生质体的尼龙网，收集洗液，即得到原生质体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

步骤1)中，所述酶解的方式为避光静置，所述酶解时间为3小时，所述酶解的温度为25℃；

步骤2)中，所述尼龙网为孔径小于所述原生质体直径的尼龙网，所述尼龙网的孔径为50um；

步骤3)的收集洗液后，还包括将所述洗液离心收集上清液，再将所述上清液悬浮，得到原生质体。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述悬浮采用的悬浮液按照如下方法制备：将甘露醇、MgCl₂、2-N-吗啡啉乙磺酸和水混合，得到悬浮液，所述甘露醇在所述悬浮液中的浓度为400mM，所述MgCl₂在所述悬浮液中的浓度为15mM_，所述2-N-吗啡啉乙磺酸在所述悬浮液中的浓度为4mM；

所述离心的时间为10min，所述离心的转速为200rpm，所述离心半径为13.5cm；

所述果肉来源于苹果。