CN109310061A - 将物质导入植物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及将物质导入植物的方法。本发明的方法包括以下工序：(1‑i)从包含植物的受精卵细胞的组织中分离受精卵细胞，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；(1‑ii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的受精卵细胞分离；(1‑iii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，同时将经过酶处理的受精卵细胞分离；(1‑iv)从植物体中分离卵细胞及精细胞，使它们融合，从而制备受精卵，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；或者，(1‑v)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的卵细胞分离，并进一步使其与分离后的精细胞融合；通过上述(1‑i)～(1‑v)获得经过酶处理的分离受精卵细胞，然后进行下述(2)，(2)将选自核酸、蛋白质及肽的物质导入得到的经过酶处理的分离受精卵细胞。

Description

将物质导入植物的方法
技术领域
本发明涉及将物质导入植物的方法。
背景技术
对于植物、特别是单子叶植物的基因重组技术而言，以20世纪90年代在稻、玉米中开发了利用土壤杆菌的方法为契机，其应用快速普及，目前为止已开发出了各种转化方法。然而，已知其中多数需要经由植物组织的脱分化和再分化，因此在物种、品种之间转化的效率有很大不同。根据物种、品种的不同，转化效率低，无法得到具有重现性的转化植物。例如，对于在玉米中育种上非常重要的系统B73而言，尚未开发出具有重现性的转化法。
另外，近年来高效地进行基因组编辑逐渐成为可能，但由于根据作物种类、品种的不同，组织培养的容易性不同，这一点对于基因组编辑效率有很大的影响，因此妨碍了植物中的基因组编辑的实用化。
另一方面，在20世纪90年代，尝试了从植物体分离精细胞和卵细胞并使它们人工融合的人工受精，成功地制备了植物体。非专利文献1中记载了使玉米的卵细胞及精细胞进行电融合而制备受精卵细胞，并将其培养为植物体的方法。非专利文献1中在卵细胞的分离中使用了酶的混合物(0.75％果胶酶(pectinase(Serva))、0.25％pectolyase、0.5％半纤维素、0.5％纤维素酶)，但使用的酶、特别是果胶酶(pectinase)的效价高。而且，也没有记载使用利用该卵细胞制成的受精卵细胞进行基因导入、转化的内容。
另外，非专利文献2中记载了稻的雌雄配偶子(卵细胞和中央细胞)的分离方法。具体而言，从植物体分离胚珠后，在0.3M甘露醇溶液中进行了酶处理(用甘露醇溶液(650mosmol/kg·H2O)+0.3％Pectolyase Y-23、1.5％果胶酶、1％纤维素、1％半纤维素处理10～15分钟)，但与非专利文献1一样，酶、特别是果胶酶的效价高。另外，对象不是受精卵而是受精前卵细胞，对于再生为植物、进行对植物的基因导入、转化的内容也没有记载。
非专利文献3及非专利文献4中记载了通过稻的雌雄配子的电融合而制备受精卵、并将其培养成植物体的方法。这些现有文献中示出了从使雌雄配子人工融合而成的受精卵细胞诱导为植物体的可能性。然而，在上述文献中，与非专利文献2同样地对于基因导入、转化方面完全没有记载，能否使用受精卵进行转化仍然完全不明确。需要说明的是，非专利文献3及4中也没有记载对卵细胞进行酶处理。
对于玉米(非专利文献5、12)、稻(非专利文献6、11)、小麦(非专利文献7)、大麦(非专利文献8、10)、烟草(非专利文献9)等物种而言，已知有从受精后的胚囊采集、培养受精卵、并制备植物体的例子。其中，有如非专利文献5、10那样表明了能够通过显微注射法将DNA导入受精卵细胞的报告，但没有该方法已经实用化的情况的报告。另外，也完全没有利用其它方法进行基因导入的见解。
将基因导入植物细胞的方法除了显微注射法以外，还有聚乙二醇法(polyethylene glycol：PEG法)、电穿孔法等。其中，显微注射法对于具有细胞壁的细胞也能够进行基因导入，不需要特别通过酶处理等除去导入对象的植物细胞的细胞壁。但是，存在一次导入操作中只能处理一个细胞的缺点。与此相对，与显微注射法相比，电穿孔法、PEG法、特别是PEG法具有一次能够处理大量细胞的优点，但需要利用酶等除去细胞壁的过程。对于受精卵细胞而言，作为除去细胞壁的方法，能够在除去细胞壁后继续进行细胞分裂而成长为植物体、且在保持了细胞活性的状态下除去细胞壁的方法仍不明确。因此，对于受精卵细胞而言，尚没有通过PEG法等方法进行基因导入并达到细胞分裂的报告。在上述报告当中，对于稻、小麦、大麦的受精卵细胞而言，无法利用纤维素酶等去除细胞壁的酶，而仅通过使用玻璃针等摘出了受精卵细胞。通过这样的物理方法分离的受精卵中残留有细胞壁，可以推测难以应用PEG法，实际上也没有应用了PEG法的例子的报告。
关于利用酶处理进行细胞壁除去，目前已知利用作为细胞壁分解酶的纤维素酶及果胶酶等进行的处理对于植物细胞的原生质体化是有效的。然而，高浓度或长时间的处理有时对植物细胞造成不良作用。另一方面，在低浓度或短时间的处理中，细胞壁的除去不完全，有时无法实现原生质体化的希望目标。因此，即使是在植物中对卵细胞、受精卵细胞的分离、培养研究较多的玉米，也没有将受精卵细胞原生质体化、用PEG法进行基因导入的例子，对于这样的可能性仍不明确。
实际上，非专利文献5中记载了通过对玉米进行极短时间(2分钟)的酶处理来分离受精卵、并利用显微注射进行了基因导入的内容。另外，非专利文献9中记载了以烟草作为材料，使用显示出非常弱的果胶酶活性的Macerozyme R10进行2阶段总计最多1小时的酶处理。如非专利文献5及9中记载的2个方法那样，进行了极短时间的酶处理、或者用非常弱的酶进行了长时间的酶处理，考虑到酶处理对受精卵细胞的活性及生长能力带来负面效果，可以推测这是由于使其影响为最小限度。但是，短时间的酶处理或利用具有弱活性的酶的处理无法完全除去受精卵细胞的细胞壁，可以认为是不适合作为PEG法的材料的。因此，目前尚没有对受精卵应用了PEG法的例子，而且进行了PEG法的受精卵细胞能否保持分裂能力仍不明确。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Kranz,E.and Lorz,H.,(1993),Plant Cell 5:739-746.
非专利文献2：Uchiumi,T.et al.,(2006),Sex.Plant Reprod.19:37-45.
非专利文献3：Uchiumi,T.et al.,(2007),Planta 226:581-589.
非专利文献4：Okamoto,T.,(2011),Methods Mol.Biol.710:17-27.
非专利文献5：Leduc,N.et al.,(1996),Developmental Biology 177:190-203.
非专利文献6：Zhang,J.et al.,(1999),Plant Cell Reports 19:128-132.
非专利文献7：Kumhehn,J.et al.,(1997),Plant Cell Reports 16:663-667.
非专利文献8：Holm,P.B.et al.,(1994),The Plant Cell 6:531-543.
非专利文献9：Yuchi,H.E.et al.,(2004),Chinese Science Bulletin 49:810-814.
非专利文献10：Holm,P.B.et al.,(2000),Transgenic Research 9:21-32.
非专利文献11：Abiko,et al.,(2013),Journal of Experimental Botany 64:1927-1940.
非专利文献12：Leduc,et al.,(1995),Sex Plant Reprod.8:313-317.
非专利文献13：Yoo,et al.,(2007),Nat Protoc.2(7):1565-72.
非专利文献14：Ishii,S.,(1976),Phytopatholory,66,281-289
非专利文献15：Nelson,N.,(1944),J.Biol.Chem.,153,375-380
非专利文献16：Somogyi,M.,(1952),J.Biol.Chem.195,19-23
非专利文献17：Murashike,T.,and Skoog,F.,(1962)Physiol.Plant.15:473-497.
非专利文献18：Gamborg,O.L.et al.,(1968)Exp.Cell Res.50:151-158
非专利文献19：Chu,et al.,(1975)Sci.Sinica 18:659-668.
非专利文献20：Mol,R.et al.,(1993)Planta 189:213-217.
非专利文献21：Kranz,et al.,(1991)Sex.Plant Reprod.4:12-16.
非专利文献22：Kranz,E.,(1999),Methods Mol.Biol.111:259-67.
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于提供一种将物质导入植物的方法、通过本发明的方法导入了物质的植物。
受精卵原本就是具备成长为植物体的能力的细胞，因此期望不受因物种、品种之间的差异所导致的培养效率的影响。如果能够以这样的受精卵细胞作为对象进行物质的导入，就可以对比现状更大范围的物种、作物进行转化及基因组编辑。本发明人等进行了深入研究，结果发现了不使受精卵细胞的活性消失而原生质体化的方法，并进一步发现通过将高效分离受精卵的方法、培养分离的受精卵细胞的方法进行组合，能够对受精卵细胞导入物质，诱导分裂，进行转化，从而想到了本发明。
解决课题的方法
本发明包括以下的方式，但并不限定于此。
[方式1]
一种将物质导入植物的方法，该方法包括：
通过以下工序(1-i)、(1-ii)或(1-iii)获得经过酶处理的分离受精卵细胞，然后进行下述工序(2)，
(1-i)从包含植物的受精卵细胞的组织中分离受精卵细胞，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；
(1-ii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的受精卵细胞分离；
(1-iii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，同时将经过酶处理的受精卵细胞分离；
(2)将选自核酸、蛋白质及肽中的物质导入得到的经过酶处理的分离受精卵细胞。
[方式2]
一种将物质导入植物的方法，该方法包括：
通过以下工序(1-iv)或(1-v)获得经过酶处理的分离受精卵细胞，然后进行下述工序(2)，
(1-iv)从植物体中分离卵细胞及精细胞，使它们融合，从而制备受精卵，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；
(1-v)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的卵细胞分离，并进一步使其与分离后的精细胞融合；
(2)将选自核酸、蛋白质及肽中的物质导入得到的经过酶处理的分离受精卵细胞。
[方式3]
根据方式1或2所述的方法，其中，植物组织分解酶选自果胶酶(pectinases)、纤维素酶、蛋白酶、半纤维素酶类、葡糖醛酸糖苷酶、酵母裂解酶、几丁质酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶(galactanases)、阿拉伯聚糖酶(arabinanases)及木质素分解酶、以及它们中2种以上的混合物。
[方式4]
根据方式1～3中任一项所述的方法，其中，植物组织分解酶包含果胶酶。
[方式5]
根据方式1～4中任一项所述的方法，其中，植物为单子叶植物。
[方式6]
根据方式5所述的方法，其中，植物选自玉米、小麦、大麦、稻及高粱。
[方式7]
根据方式1～6中任一项所述的方法，其中，植物为玉米B73或来自于B73的玉米品种。
[方式8]
根据方式1～6中任一项所述的方法，其中，从包含植物的卵细胞的组织中将卵细胞分离后，通过精细胞融合，形成受精卵细胞。
[方式9]
根据方式1～8中任一项所述的方法，其中，酶处理时间为3分钟以上且60分钟以下。
[方式10]
根据方式9所述的方法，其中，在酶处理后120分钟以内进行工序(2)的物质导入。
[方式11]
根据方式8或9所述的方法，其中，在精细胞融合后120分钟以内进行工序(2)的物质导入。
[方式12]
根据方式9所述的方法，其中，植物组织分解酶包含果胶酶，且工序(1)的酶处理时体系中的果胶酶的Unit/mL为60以下。
[方式13]
根据方式1～12中任一项所述的方法，其中，植物组织分解酶包含果胶酶，且工序(1)的酶处理时体系中的果胶酶的Unit/mL×处理时间为310以下。
[方式14]
根据方式1～13中任一项所述的方法，其中，工序(2)的物质导入使用PEG法或电穿孔法进行。
[方式15]
一种将物质导入植物的方法，该方法包括：
通过以下工序(1-i)、(1-ii)或(1-iii)获得经过酶处理的分离受精卵细胞，然后进行下述工序(2)～(4)，
(1-i)从包含植物的受精卵细胞的组织中分离受精卵细胞，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；
(1-ii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的受精卵细胞分离；
(1-iii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，同时将经过酶处理的受精卵细胞分离；
(2)将选自核酸、蛋白质及肽中的物质导入得到的经过酶处理的分离受精卵细胞；
(3)使导入了物质的受精卵细胞愈伤组织化或胚状体化；
(4)利用再分化培养基使所述愈伤组织化或胚状体化后的组织再分化。
[方式16]
一种将物质导入植物的方法，该方法包括：
通过以下工序(1-iv)或(1-v)获得经过酶处理的分离受精卵细胞，然后进行下述工序(2)～(4)，
(1-iv)从植物体中分离卵细胞及精细胞，使它们融合，从而制备受精卵，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；
(1-v)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的卵细胞分离，并进一步使其与分离后的精细胞融合；
(2)将选自核酸、蛋白质及肽中的物质导入得到的经过酶处理的分离受精卵细胞；
(3)使导入了物质的受精卵细胞愈伤组织化或胚状体化；
(4)利用再分化培养基使所述愈伤组织化或胚状体化后的组织再分化。
[方式17]
一种导入了物质的植物，其是通过方式1～16中任一项所述的方法得到的。
发明的效果
根据本发明，即使是例如玉米B73这样以往难以培养的植物，也能够进行培养、物质的导入及转化。由此，即使是因难以转化而无法赋予有用性状的植物体，也能够稳定地得到重现性良好的转化体。
附图说明
图1是酶处理后的玉米(B73)珠心切片的透射图像。
图2是分离后的玉米(B73)受精卵细胞的光学显微镜照片。
图3是来自于开始分裂的玉米(B73)受精卵细胞的胚性细胞团块的光学显微镜照片。
图4是来自于生长的图3中来自玉米(B73)受精卵细胞的胚性细胞团块的光学显微镜照片。
图5是由图3及4的玉米(B73)的胚性细胞团块生长出的苗的光学显微镜照片。
图6是来自于由图3～图5的胚性细胞团块再生而成的玉米(B73)受精卵细胞的植物体。
图7是利用PEG法进行GFP核酸导入后、开始分裂的玉米(B73)受精卵细胞的荧光显微镜照片。
图8是利用PEG法进行GFP核酸导入后、开始分裂的稻(雪光(ユキヒカリ))受精卵细胞的荧光显微镜照片(上)、光学显微镜照片(下)及它们合并而成的图像(中)。需要说明的是，短条表示20μm。
具体实施方式
本发明涉及将物质导入植物的方法。
本发明的方法包括以下工序：
(1-i)从包含植物的受精卵细胞的组织中分离受精卵细胞，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；
(1-ii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的受精卵细胞分离；或者
(1-iii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，同时将经过酶处理的受精卵细胞分离；
通过上述(1-i)～(1-iii)获得经过酶处理的分离受精卵细胞，然后进行下述(2)，
(2)将选自核酸、蛋白质及肽中的物质导入得到的经过酶处理的分离受精卵细胞。
另外，在另一方式中，本发明的方法包括以下工序：
(1-iv)从植物体中分离卵细胞及精细胞，使它们融合，从而制备受精卵，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；或者
(1-v)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的卵细胞分离，并进一步使其与分离后的精细胞融合；
通过上述(1-iv)、(1-v)获得经过酶处理的分离受精卵细胞，然后进行下述(2)，
(2)将选自核酸、蛋白质及肽中的物质导入得到的经过酶处理的分离受精卵细胞。
另外，在另一方式中，本发明的方法包括以下工序：
(1-i)从包含植物的受精卵细胞的组织中分离受精卵细胞，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；
(1-ii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的受精卵细胞分离；或者
(1-iii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，同时将经过酶处理的受精卵细胞分离；
通过上述(1-i)～(1-iii)获得经过酶处理的分离受精卵细胞，然后进行下述(2)～(4)，
(2)将选自核酸、蛋白质及肽的物质导入得到的经过酶处理的分离受精卵细胞；
(3)使导入了物质的受精卵细胞愈伤组织化或胚状体化；以及
(4)利用再分化培养基使所述愈伤组织化或胚状体化后的组织再分化。
另外，在另一方式中，本发明的方法包括以下工序：
(1-iv)从植物体中分离卵细胞及精细胞，使它们融合，从而制备受精卵，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；或者
(1-v)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的卵细胞分离，并进一步使其与分离后的精细胞融合；
通过上述(1-iv)、(1-v)获得经过酶处理的分离受精卵细胞，然后进行下述(2)～(4)，
(2)将选自核酸、蛋白质及肽的物质导入得到的经过酶处理的分离受精卵细胞；
(3)使导入了物质的受精卵细胞愈伤组织化或胚状体化；以及
(4)利用再分化培养基使所述愈伤组织化或胚状体化后的组织再分化。
植物
植物的种类没有特别限定。可以是双子叶植物及单子叶植物中的任一者，优选为单子叶植物，进一步优选为玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等，最优选为玉米、小麦、稻。
本发明的方法特别是可以用于被认为“难培养”的植物或品种，但并不限定于此。“难培养”是指难以培养，具体是指例如，难以培养从植物体分离得到的细胞、难以形成脱分化等处理的愈伤组织、难以从愈伤组织再分化为植物体。
通常，与双子叶植物相比，单子叶植物更难以培养，但“难培养”的植物包括例如大豆、菜豆、辣椒等。难培养品种是指，与相同物种的通常研究用品种(玉米的情况为A188等)相比，难以培养的品种，可以列举例如：玉米的B73及源自B73的玉米的优良品种、小麦的优良品种(例如AC Barrie、TAM等)、大麦的除GoldenPromise及Igri以外的品种、高粱的除296B、C401、SA281、P898012、Pioneer 8505、Tx430以外的品种等。
受精卵细胞
在本发明中，导入物质的细胞优选为合子、即受精卵细胞。受精卵细胞是从包含植物的胚囊的组织(子房、胚珠、珠心等)中分离且进行了受精的卵细胞，即，可以是在植物体的阶段使其受粉/受精，再从该植物体中分离而得到的受精卵细胞。或者，也可以从受粉/受精前的植物体中将卵细胞及精细胞分离，然后使它们融合，制备并得到受精卵细胞。即，经过酶处理的分离受精卵细胞可以通过以下(1-i)～(1-v)中任一方式获得：
(1-i)从包含植物的受精卵细胞的组织中分离受精卵细胞，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；
(1-ii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的受精卵细胞分离；
(1-iii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，同时将经过酶处理的受精卵细胞分离；
(1-iv)从植物体中分离卵细胞及精细胞，使它们融合，从而制备受精卵，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；或者
(1-v)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的卵细胞分离，并进一步使其与分离后的精细胞融合。
可以在适当渗透压的溶液中，切断包含胚囊的组织(例如胚珠)，在显微镜下使用玻璃毛细管等分离从该切断面露出的(受精)卵细胞。需要说明的是，在该情况下，酶处理通过用酶溶液对分离后的(受精)卵细胞进行一定时间的处理来得到经过酶处理的受精卵。
或者，可以在用酶溶液对胚珠等包含胚囊的组织进行一定时间的处理后，使用例如玻璃针等在显微镜下解剖珠心等组织进行机械性摘取、分离。在该情况下，可以不进行随后的酶处理而得到酶处理(受精)卵。需要说明的是，通过分离后的卵细胞与精细胞通过融合而得到受精卵时的酶处理可以在卵细胞分离之前、与精细胞融合同时、或者与精细胞融合之后的任一阶段。
酶处理
本发明的方法的特征在于，用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的(受精)卵细胞的组织或(受精)卵细胞进行低效价条件处理。酶处理可以在将(受精)卵细胞从组织中分离之前、与分离同时、或者分离之后的任一时期进行，优选为与分离同时或分离之后。
(i)酶的种类
在植物的细胞壁中，由纤维素形成的基本骨架嵌入由其它的多糖、蛋白质形成的基质(基质、基质凝胶)中。构成基质的多糖传统上分为用热水、酸性缓冲液提取出的果胶(pectin)、和作为能够溶于碱的成分的半纤维素(hemicellulose)，最近通常统称为基质多糖(matrix polysaccharide)。
多数被子植物的细胞壁被称为I型，含有很多纤维素和木葡聚糖，包含果胶、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖等。另一方面，单子叶类的一部分(禾本目)的细胞壁被称为II型，纤维素和木聚糖(葡糖醛酸-阿拉伯木聚糖)、1,3-1,4-β-D-葡聚糖多，而果胶、木葡聚糖少。另外，在I型的细胞壁中，结构蛋白质(伸展蛋白等)发挥了重要的作用，但在II型细胞壁中，蛋白质含量低，酚酸(阿魏酸等)的交联则代替其发挥作用。
本发明的方法中使用的酶只要是植物组织分解酶即可，没有特别限定。“植物组织分解酶”是指，直接或间接作用于植物组织及细胞附近的果胶、纤维素、半纤维素、其它基质多糖、磷脂、蛋白质等，并将其分解的酶的总称。包括例如：原生质体制备用酶、分解细胞膜的磷脂酶、被认为有助于组织分解的鞣酸酶、分解稻等II型细胞壁所含的成分的阿魏酸酯酶、蛋白酶等，但不限定于此。特别是可以使用能够用于溶解植物细胞的细胞壁而制备原生质体的各种原生质体制备用酶。
包括例如：果胶酶、纤维素酶、蛋白酶、半纤维素酶类(半纤维素酶通常是指水解半纤维素的酶的总称)、葡糖醛酸糖苷酶、酵母裂解酶、几丁质酶、葡聚糖酶、木聚糖酶，半乳聚糖酶，阿拉伯聚糖酶及木质素分解酶、或者它们的混合物(这些酶组中2种以上的混合物)。果胶酶包括例如：多聚半乳糖醛酸酶(半乳糖醛酸酶)、果胶裂解酶及果胶甲酯酶。在本说明书中，在没有特别说明的情况下，果胶酶的效价是指这3种酶的效价之和、或者多聚半乳糖醛酸酶及果胶裂解酶这2种酶的效价之和。
植物组织分解酶优选包含果胶酶。可以是单独的果胶酶，或者也可以包含果胶酶和选自上述记载的组中的另外一种以上的酶。优选为纤维素酶及果胶酶。
果胶是复合多糖类的一种，其中，α-1,4键合有半乳糖醛酸的聚半乳糖醛酸为主成分。作为其分解酶的果胶酶是催化分解果胶的酶反应体系的酶组的总称，分类如下：(a)水解果胶或聚半乳糖醛酸的α-1,4键的多聚半乳糖醛酸酶、(b)通过消除反应分解主链的果胶裂解酶(聚半乳糖醛酸裂解酶)、(c)水解果胶的甲酯的果胶甲酯酶。果胶酶作用于植物的组织中的各细胞彼此的结合部(中层)，是具有将组织分散成单细胞的作用的酶，特别是在不破坏植物细胞而使其游离的浸渍、植物细胞工程学方面是重要的酶。作为果胶酶，可以列举例如：商品名Macerozyme R10(商标)(Yakult Honsha公司制造)、SumiteamAP2(新日本化学工业株式会社制造)等包含多聚半乳糖醛酸酶的酶、PectolyaseY23(Pectolyase Y23)(盛进制药株式会社制造)、以及果胶酶(Pectinase)(Sigma公司制造)等包含果胶裂解酶的酶。可优选列举MacerozymeR10与PectolyaseY23的混合使用、或者果胶酶Y23的单独使用等。
纤维素酶是水解作为植物的细胞壁成分的纤维素的β-1,4-葡聚糖的糖苷键的酶。作为纤维素酶，可以使用例如：商品名Cellulase OnozukaRS(商标)(Yakult Honsha公司制造)、Cellulase OnozukaR10(Yakult Honsha公司制造)、Driselase(协和发酵株式会社制造)等。优选为Cellulase OnozukaRS(商标)及Cellulase(Worthington)，进一步优选为Cellulase(Worthington)。
(ii)酶的效价(Unit)
在本发明的方法中，处理植物的受精卵细胞的植物组织分解酶在“低效价条件”下使用。
“低效价条件”是指，与为了分解植物组织而使用各酶时通常使用的条件相比，酶更加不发挥功能的条件(在本发明中，由于是分解酶，因此为分解对象物质的酶活性低的条件)，具体是指短处理时间、和/或低酶浓度(低酶活性：低Unit/mL)。特别优选为比通常的原生质体制备条件更短的处理时间、和/或更低的浓度。与“低效价条件”相当的条件可以根据待使用的酶的种类、植物的种类等而适当变更。
需要说明的是，Unit的测定可以使用公知的方法。例如，果胶裂解酶的活性测定可以按照Ishii等的方法(非专利文献14)来测定，果胶裂解酶活性1单位(1Unit)可以设为1分钟生成与1μmol不饱和二半乳糖醛酸苷相当的不饱和聚半乳糖醛酸苷的量。另外，多聚半乳糖醛酸酶活性测定可以按照Somogyi-Nelson法(非专利文献15、非专利文献16)来测定，半乳糖醛酸酶活性1单位(1Unit)可以设为1分钟生成1μmol半乳糖醛酸(或其衍生物、修饰物)的量。
在本说明书的实施例中，发现目前被认为作用于植物组织的细胞间的结合的果胶酶不仅对于作为单细胞的受精卵的分离，而且对于随后的再生为植物体的能力也有很大影响。发现对受精卵细胞进行酶处理时酶溶液所含的果胶酶浓度低时，分离后的受精卵细胞可以再生为植物体、和/或能够导入核酸等物质。特别是对于用目前方法难以培养、尤其是难以进行愈伤组织化及植物体再生的玉米B73而言，在酶溶液中含有的果胶酶的Unit/mL为60以下、且Unit/mL×时间为310以下的情况下，可以确认能够获得胚性细胞团块。另外可以确认，通过PEG法可以导入核酸、以及能够再生为植物体。
由此，在本发明中，在植物组织分解酶为果胶酶的情况下，工序(1)的酶处理时体系中的果胶酶的Unit/mL、即本发明中的低效价条件处理优选为60以下、40以下、20以下、15以下、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、2以下、1以下、0.7以下，但并不限定于此。在酶溶液的果胶酶的Unit/mL为60以上时，发生对(受精)卵细胞的损伤，因此不优选。Unit/mL的下限没有特别限定。优选为0.1以上、0.2以上、0.4以上、0.5以上、0.6以上、0.65以上。Unit/mL×时间优选为310以下、300以下、250以下、200以下、100以下、90以下、50以下、30以下。Unit/mL×时间的下限没有特别限定。优选为1以上、2以上、3以上、3.3以上、5以上、10以上、15以上、20以上。
(iii)酶处理的时间
酶处理的时间优选为3分钟以上、更优选为5分钟以上，但并不限定于此。优选为60分钟以下、50分钟以下、45分钟以下。更优选为3分钟以上且60分钟以下、5分钟以上且50分钟以下、5分钟以上且45分钟以下。
在浓(高Unit/mL、或高效价条件)酶液中短时间处理的情况下，随个体而产生酶处理结果的差异，因此不优选。具体而言，例如，为了分离(受精)卵细胞，首先用剃刀等切下包含植物的胚囊的子房或胚珠的一部分，但切端(在机械处理的情况下，例如可以通过对胚珠进行挤压等处理而从切端挤出(受精)卵细胞)至(受精)卵细胞的距离因其胚珠不同而各有不同。特别是在切端至(受精)卵细胞的距离远的情况下，酶液花费时间进行渗透而接触(受精)卵细胞。由于这样的时间损失，在用浓酶液进行短时间处理的情况下，实际上对(受精)卵细胞进行酶处理的时间变短，因此对每个胚珠的酶处理效果不同，导致所谓的不均匀。来自于基本上未被酶处理的胚珠的(受精)卵的(与稀的酶浓度×长时间处理相比)物质导入效率降低，结果是转化效率变差。
与此相对，在用稀酶液长时间处理的情况下，即使切端至(受精)卵的距离多少存在差异，酶液也有充分渗透(受精)卵的时间，因此可以充分进行酶处理。由此，每个胚珠的酶处理程度的不均匀性降低，物质导入的效率提高，因此结果是带来转化效率的提高。因此，进行一定时间以上的处理是很重要的。另外，长时间处理也会导致受精卵的细胞活性降低，因此不优选。
需要说明的是，在制备原生质体时，通常需要长时间(4小时以上)。本发明的酶处理明显在比制备原生质体的酶处理时间短的时间内进行。
(iv)酶处理的其它条件
在进行酶处理时，优选调整渗透压。渗透压的调整方法没有特别限定，例如，可以通过渗压剂的添加来进行。具体而言，可以通过添加多元醇、氨基酸等来进行。优选添加多元醇，可以优选利用甘露醇、麦芽糖、葡萄糖、山梨糖醇、棉子糖、海藻糖、寡糖等，但并不限定于此。
优选的渗透压可以根据待使用的植物种类而适当选择。例如，在稻的情况下，优选将下限设为380mosmol/kg H2O以上，更优选设为390mosmol/kgH2O以上，进一步优选设为400mosmol/kg H2O以上。另外，优选将上限设为470mosmol/kg H2O以下，更优选设为460mosmol/kg H2O以下，进一步优选设为450mosmol/kg H2O以下。在玉米的情况下，优选将下限设为600mosmol/kg H2O以上，进一步优选设为630mosmol/kg H2O以上。另外，优选将上限设为700mosmol/kg H2O以下，进一步优选设为680mosmol/kg H2O以下。
pH只要为能够制造原生质体的pH范围即可，没有特别限制。优选为pH5.0以上且7.0以下。
对于进行酶处理的温度，可以根据待使用的酶而适当设定。但是，在低于10℃的条件下，无法充分获得期待的酶活性的酶多，因此优选为10℃以上。
物质的导入
本发明的将物质导入植物的方法包括将选自核酸、蛋白质及肽中的物质导入得到的经过酶处理的分离受精卵细胞的工序(工序(2))。
在本发明中，导入植物的物质选自核酸、蛋白质及肽。核酸没有特别限定，可以是RNA、DNA、两者的结合体、混合物。优选为载体这样的环状DNA、直链DNA、环状RNA或直链RNA。可以使用与待使用的转化方法相应的任意长度的核酸。例如，在使用PEG法的情况下，核酸的长度优选为100kb以下，更优选为50kb以下。进一步优选为30kb以下，最优选为20kb以下。
也可以导入用于基因组编辑的锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease、ZFN)、TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)、Cas9核酸酶等核酸酶、修饰酶、抗体等蛋白质及这些的复合体。蛋白质的大小优选为分子量300kDa以下，更优选为200kDa以下，但并不限定于此。需要说明的是，可以包含辅酶这样的、为了使导入植物的蛋白质在细胞内发挥功能所需要的化学物质。
肽是各种氨基酸以确定的顺序通过酰胺键(“肽键”)连接而成的分子的总称，通常比蛋白质的长度短。优选为100a.a.以下，更优选为50a.a.以下。
可以导入2种以上的核酸、蛋白质及肽。可以导入核酸和蛋白质等不同种的物质。
将物质导入植物的方法只要是能够将希望的物质导入植物的公知方法即可，没有特别限定，可以根据植物的种类而适当选择。例如，可以优选使用聚乙二醇法(PEG法)、电穿孔法、基因枪法、显微注射法、晶须法等物理化学方法(DNA直接导入法)、或者土壤杆菌法等生物学方法(DNA间接导入法)。本发明的方法的特征在于，用含有植物组织分解酶的酶溶液对来自于包含植物的受精卵细胞的组织的受精卵细胞进行低效价条件处理。因此，导入物质的工序中使用的方法优选为使用利用酶分解了植物的细胞壁的状态(原生质体)的方法。优选为PEG法或电穿孔法，最优选为PEG法。
PEG法是使聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)作用于原生质体、使DNA进入植物细胞内部的方法。该DNA进入的机理尚不完全明确。对于PEG法，例如，可以如非专利文献13等记载的那样，按照公知的实验方案来实施。
电穿孔法是如下方法：通过对细胞悬浮液施加电脉冲而在细胞膜上打开微小的孔，将细胞悬浮液中的DNA送入细胞内部，从而进行转化。在以植物细胞作为材料的情况下，通常使用分解除去了细胞壁后的原生质体。但是，也可以使用具有细胞壁的细胞进行转化，这被称为电子注射法。在电穿孔法、电子注射法中，可以通过将2种以上的DNA溶解在悬浮液中，在植物细胞存在下施加电脉冲，从而进行共转化。
卵细胞在受精前具有与普通体细胞不同状态的细胞壁，只有卵细胞与精细胞融合才形成完整的细胞壁。特别是在利用PEG法进行的基因导入中，通常需要对植物细胞进行酶处理，使其原生质体化，而且，这样得到的原生质体随着时间经过，细胞壁会再生，有时返回成具有完整的细胞壁的植物细胞。因此，在从胚珠等中分离受精卵细胞时使用酶的情况下，也优选在分离后快速进行物质导入操作。
因此，至进行物质导入的时间优选为酶处理后120分钟以内、60分钟以内、40分钟以内、20分钟以内。或者，在酶处理后进行精细胞融合的情况下，至进行物质导入的时间优选为细胞融合后120分钟以内、60分钟以内、40分钟以内、20分钟以内。
愈伤组织或胚状体(胚性细胞团块)化/再分化
本发明的将物质导入植物的方法在导入物质的工序(工序(2))之后进一步包括：
(3)使导入了物质的受精卵细胞愈伤组织化或胚状体(胚性细胞团块)化；以及
(4)用再分化培养基使上述愈伤组织化或胚状体化后的组织再分化。
工序(3)的愈伤组织化或胚状体化工序、及工序(4)的再分化工序没有特别限定，可以利用用于从受精卵细胞再生为植物体的公知方法。
在愈伤组织化或胚状体化工序中，对得到的导入了物质的受精卵细胞进行培养，使其形成胚状体或愈伤组织。对于分裂诱导受精卵细胞、使细胞增殖而形成愈伤组织或胚状体的工序而言，根据植物，最优条件不同，因此没有特别限定，优选为加入了饲养细胞的看护培养(nurse culture)法。例如，可以如下所述进行。
受精卵细胞在液体培养基中的培养：将导入了物质的受精卵细胞转移至培养基，静置过夜，然后平稳地进行振荡培养。振荡速度优选为30～50rpm，更优选为35～45rpm。培养的温度优选为24～28℃，更优选为25～27℃。培养优选在黑暗中进行。此时，优选在培养基中加入饲养细胞进行共培养(看护培养法)。该培养期间优选为4～14天，更优选为5～10天。
培养基：添加了2,4-二氯苯氧基乙酸、萘乙酸等生长素的液体的MS培养基(非专利文献17)、B5培养基(非专利文献18)、N6培养基(非专利文献19)等。
培养基中优选添加吲哚-3-乙酸、2,4-D、麦草畏等生长素类。生长素的添加浓度可以举出0.1～3.0mg/L，优选为0.1～0.3mg/L，更优选为0.15～0.25mg/L。
饲养细胞：可以使用公知的饲养细胞。可以列举例如：稻细胞悬浮培养物(LineOc、Riken BioResource Research Center制造)、玉米的抚育细胞(nurse cell)(非专利文献20)、非形态形成型细胞培养物(nonmorphogenic cell suspension：非专利文献21)等。
根据该工序，可以在开始受精卵细胞培养起4～14天后形成直径50～200μm左右的球状胚状体。
再分化工序也可以按照公知的再分化工序来实施。例如，作为一例，可以如下所述进行。
胚状体的培养：将球状的胚状体转移至未加入饲养细胞的上述培养基，进一步培养10～14天左右。然后，加入未添加生长素的任意培养基、例如MS培养基中进行培养，使其形成植物体。此时，培养优选照射光来进行，光例如优选为50～180μmol/m2·秒，更优选为70～150μmol/m2·秒。
培养基：例如，MS培养基、B5培养基、N6培养基，其是使用了琼脂糖、琼脂、结冷胶、Gelrite等的固体培养基。
导入了物质的植物
本发明还包括通过本发明的方法得到的导入了物质的植物。导入了物质的植物是指，例如，将导入的核酸的一部或全部引入植物基因组而成的转化植物、将核酸及Cas9核酸酶等蛋白质暂时导入植物并通过基因组编辑技术对基因组进行了编辑而得到的植物等暂时或永久性导入了物质而得到的植物。在本发明以前，对于特别是被认为“难培养”的植物、品种而言，难以或无法得到导入物质植物。根据本发明，对于这样的植物、品种，也可以用间便的方法效率良好地得到导入了物质的植物。
实施例
以下，基于实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于这些实施例。本领域技术人员基于本说明书的记载可以容易地对本发明进行修改、变更，这些也包含于本发明的技术范围。
实施例1玉米的受精卵细胞的分离
使从玉米的雄穗采集的花粉受粉至温室内长成的玉米(品种：B73)的交配期的雌穗柱头上。交配时间在上午10点30分前后进行。用由石蜡纸制成的袋包覆交配后雌穗，以便防止其它花粉飞来。
从交配后经过了24小时的雌穗的胚珠取出包含胚囊的珠心切片，放入3.5cm塑料培养皿中的1mL的10％甘露醇溶液(650mosmol/kg H2O)中。在3.5cm塑料培养皿中加入酶混合液0.5mL，制成1.5mL酶溶液，在室温放置5～45分钟。对于酶，使用了以下的酶。使用纤维素酶(Worthington公司制造)、Macerozyme R10(Yakult Honsha公司制造；多聚半乳糖醛酸酶活性0.5Unit/mg)、PectolyaseY23(盛进制药株式会社制造；果胶裂解酶活性1Unit/mg)、或Sumiteam AP2(新日本化学工业株式会社制造；多聚半乳糖醛酸酶活性12.4Unit/mg)，按照表1中记载的各浓度溶解于10％甘露醇溶液(650mosmol/kg H2O)。需要说明的是，在所有的部分中，纤维素酶为0.3％。需要说明的是，表中的酶溶液中的果胶酶(Unit/mL)表示多聚半乳糖醛酸酶及果胶裂解酶的Unit/mL的合计值。
在以后述的表1中记载的各时间进行了处理后，用移液管除去酶溶液，并用10％甘露醇溶液清洗2次，将经过酶处理的珠心切片放入1.5mL的相同浓度的甘露醇溶液中，供于分离操作。
分离使用2根玻璃针进行。用一根玻璃针固定珠心切片使其不移动，用另一根玻璃针扒出推测存在受精卵细胞的区域的组织，从而分离了受精卵细胞。区域的推测如下进行：在进行受精时，在2个存在的助细胞中，花粉管侵入者变性而变成暗褐色，以此作为标记。使用微量移液管将分离后的受精卵细胞转移至盖玻片上的液滴中。
需要说明的是，盖玻片上的液滴通过以下方法制成。
1)将盖玻片的周边浸渍于含有5％二氯甲基硅烷的1,1,1-三氯乙烷溶液，并使其干燥；
2)将0.2-0.3mL矿物油(Embryo Culture-tested Grade，Sigma-Aldrich公司制造、1001279270)置于该盖玻片中央部分；然后，
3)用微量移液管在该矿物油内插入1～2μL的10％甘露醇溶液(650mosmol/kgH2O)。
实施例2胚状体(胚性细胞团块)的获得
准备了0.2mL的受精细胞用培养基。受精细胞用培养基是在改良型N6Z培养基(Kumlehn J.et.al.(1998)Planta 205:327-333)中进行以下改良而成的：2g/L CHU(N6)basal salt mixture(Sigma-Aldrich公司制造)、0.025mg/LNa2MoO4·2H2O、0.025mg/LCoCl2·6H2O、0.025mg/L CuSO4·5H2O、0.01mg/L视黄醇、0.01mg/L麦角钙化醇、0.01mg/L生物素、1mg/L硫胺素·H2O、1mg/L烟酸、1mg/L吡哆醇·HCl、1mg/L氯化胆碱、1mg/L Ca-泛酸、0.2mg/L核黄素、0.2mg/L 2,4-D、0.02mg/L钴胺素、0.02mg/L对氨基苯甲酸、0.4mg/L叶酸、2mg/L抗坏血酸、40mg/L苹果酸、40mg/L柠檬酸、40mg/L富马酸、20mg/L Na-丙酮酸、1,000mg/L谷氨酰胺、以及250mg/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇(myoinositol)。渗透压用葡萄糖调整为450mosmol/kg H2O(pH5.7)而制成。将制成的受精细胞用培养基加入直径12mm的Millicell CM插入式培养器(Millipore公司制造)内，放入加入了2mL培养基的3.5cm塑料培养皿中。进而，将40～60μL的稻细胞悬浮培养物(Line Oc、Riken BioResourceResearchCenter制造)作为饲养细胞加入培养皿。
使用清洗、灭菌后的微量毛细管将分离后的受精卵细胞投入新鲜的10％甘露醇溶液液滴(650mosmol/kg H2O)中，然后转移至加入了受精细胞用培养基的CM插入式培养器内的膜上。
受精卵细胞在暗处于26℃下静置1天，然后进行了20天振荡培养。
将培养后的胚状体(胚性细胞团块)的形成结果记载于表1。在酶的效价、特别是果胶酶的Unit/mL或Unit/mL×时间高的部分(试验区8～10)中，没有得到胚状体，但在Unit/mL或Unit/mL×时间低的部分(试验区1～7)中，得到了胚状体。其中，试验区7的胚状体比其它区生长稍差。
[表1]
实施例3植物体的再生
将实施例1及2中得到的胚状体(胚性细胞团块)转移至再分化培养基(改良的MS培养基；MS盐、MS维生素、100mg/L肌醇、2g/L酪蛋白氨基酸、30g/L蔗糖、30g/L山梨糖醇、0.2mg/L l-萘乙酸(NAA)、1mg/L激动素及0.3％Gelrite)。培养在30℃、持续进行光照射下进行了12～30天。其结果是得到了植物体(图6)。根据该结果，即使是被认为最难以培养的玉米B73，也显示出能够进行从细胞的培养、植物体的再生。
实施例4对受精卵进行核酸导入
使用玉米(品种：B73)作为植物，将酶溶液浓度设为0.3％纤维素酶(Worthington公司制造)，使用0.1％Macerozyme R10、0.017％PectolyaseY23，将处理时间设为15分钟，除此以外，与实施例1同样地进行了受精卵的分离。需要说明的是，在该酶处理条件中，果胶酶浓度为0.67Unit/mL，Unit/mL×处理时间为10.05。
将分离后的受精卵细胞移至MMG溶液(15mM MgCl2、4mMMES(pH5.7)、10％甘露醇(650mosmol/kg H2O))的液滴(约2μL)，然后转移至将加入了质粒(非专利文献11)的液滴，所述质粒包含待导入MMG的碱基序列、35S启动子::信号序列::GFP::内质网滞留信号(HDEL)::NOS终止子。接着，将包含受精卵细胞的液滴和PEG溶液(在12.5mL 10％甘露醇溶液(650mosmol/kgH2O)中加入7.5g的PEG4000、2.5mL的1M氯化钙，并用蒸馏水调整至25mg)的液滴(约2μL)混合，用玻璃毛细管搅拌30～50次。
进行了核酸导入处理的受精卵细胞与实施例3同样地转移至受精细胞用培养基，在暗处静置培养。从PEG处理起12～16小时后，用荧光显微镜观察受精卵细胞，通过有无GFP的荧光确认了导入的核酸的表达状况及细胞的分裂状况。
将该结果示于图7。由于进行了核酸导入处理的受精卵确实观察到了由GFP带来的发光，因此可以确认核酸导入。另外，可以确认开始了分裂。
实施例5由导入了核酸的受精卵细胞进行植物体再生
对于实施例4中得到的导入了核酸的受精卵细胞(玉米(品种：B73))，按照实施例2及3获得胚状体(胚性细胞团块)，进一步进行培养。2周后，将培养基更新为不含稻细胞悬浮培养物的改良型N6Z培养基，进一步培养了2周。将增殖至2mm左右的细胞团块放置在交配后经过了10天的玉米A188的颖果切片上，用含有5μM CuSO4·5H2O的再分化培养基RMS1培养基(非专利文献22)在25℃的亮处培养2天。然后，将细胞团块转移至含有5μM CuSO4·5H2O的再分化培养基RMS1培养基，在亮处于25℃下进了2周的再分化培养。
结果是，由于从变绿了的细胞团块再分化出了多个个体，因此对细胞团块进行分割，用再分化培养基RMS2培养基(非专利文献22)进一步在25℃的亮处培养至生根。按照生根的个体的顺序依次转移至再分化培养基RMS3培养基，在25℃的亮处培养至苗为10cm左右。将苗呈红褐色的个体在含有10g/L抗坏血酸的RMS3培养基中进行培养。将充分生根的个体移植到装入了土的盆中，在温室中进行栽培。其结果是，可以从1个进行了核酸导入的受精卵得到再生个体。
实施例6获得稻的卵细胞
将从稻穗得到的未开花的花分解，采集子房和花药。将子房和花药放入加入了3mL的6％甘露醇溶液(370mosmol/kg H2O)的3.5cm塑料培养皿中。
将去除了柱头的子房浸入新的3.5cm塑料培养皿中的3mL的6％甘露醇溶液(370mosmol/kg H2O)中，在培养皿底，用激光刀片(FEATHER Safety Razor公司、FA-10)切断子房的下部。通过显微镜观察确认从切断部出来的卵细胞，用微量毛细管分离了卵细胞。从30～40个子房得到了约10～15个卵细胞。各卵细胞的直径为40～50μm。
通过使分离后的精细胞与得到的未受精卵细胞融合，制备受精卵。然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对受精卵细胞进行低效价条件处理。
实施例7对来自于不同品种的玉米的受精卵进行核酸导入及植物体再生
通过与实施例1相同的方法分离了玉米品种A188的受精卵。其中，将酶处理方法设为：使用包含0.33％纤维素酶、0.1％Macerozyme R10、0.017％PectolyaseY23的酶溶液(酶溶液中果胶酶浓度为4.17Unit/mL)进行10分钟，进而，用包含0.165％纤维素酶、0.05％Macerozyme、0.008％Pectolyase的酶溶液(酶溶液中果胶酶浓度为2.08Unit/mL)进行20分钟。需要说明的是，该酶处理中的Unit/mL×处理时间的总计为83.4。
将由编码玉米泛素启动子::玉米泛素内含子::GFP::NOS终止子的碱基序列构成的DNA片段导入分离后的受精卵。使用以150μg/mL的浓度含有DNA片段的MMG溶液，按照使用了将PEG4000的含量改为10g/25mL的PEG溶液的实施例4中记载的方法进行了核酸导入。然后，通过实施例2的方法对经过了核酸导入处理的受精卵进行培养。在2周后，将培养基更新为不含稻细胞悬浮培养物的改良型N6Z培养基，进一步培养2周。将增殖为2mm左右的细胞团块放置在交配后经过了10天的玉米A188的颖果切片上，用含有5μM CuSO4·5H2O的再分化培养基RMS1培养基在25℃的亮处培养了6天。然后，将细胞团块转移至含有5μM CuSO4·5H2O的再分化培养基RMS1培养基，在暗处于25℃下进行了2周的再分化培养。按照生根的个体的顺序，转移至再分化培养基RMS3培养基，在25℃的亮处培养至苗为10cm左右。将苗呈红褐色的个体用含有10g/L抗坏血酸的RMS3培养基进行培养。将充分生根的个体移植至装有土的盆中，在温室中进行栽培。结果是，可以从进行了核酸导入的玉米A188受精卵得到再分化个体。
实施例8对来自于稻的受精卵进行核酸导入及植物体再生
从温室内长成的稻(品种：雪光(ユキヒカリ))中分离受精卵。对于受精卵的分离而言，除了采集开花后2～3小时后的子房以外，按照实施例7及非专利文献11(Abiko,et al.,(2013))进行。
通过与实施例1相同的方法对得到的稻受精卵细胞进行了20分钟酶处理。其中，作为酶处理方法，使用将各酶以表2中记载的各浓度溶解于7.5％甘露醇溶液(450mosmol/kgH2O)而得到的酶溶液来进行。
[表2]
将pMON30049载体导入进行了酶处理的稻受精卵，所述pMON30049载体包含由编码35S启动子::HSP70内含子::SP::GFP::HDEL的碱基序列构成的DNA片段。使用以130μg/mL的浓度含有该载体的MMG溶液，通过实施例4中记载的方法进行了核酸导入。然后，从PEG处理起16～24小时后，通过荧光显微镜观察稻受精卵细胞，根据有无GFP的荧光确认了导入的核酸的表达。将该结果示于图8。而且，可以确认到该稻受精卵细胞开始了分裂。
然后，按照非专利文献3对进行了核酸导入处理的稻受精卵进行18～19天的培养及再分化处理。结果是，可以由进行了核酸导入的稻受精卵得到再分化个体。

Claims (17)

1.一种将物质导入植物的方法，该方法包括：
通过以下工序(1-i)、(1-ii)或(1-iii)获得经过酶处理的分离受精卵细胞，然后进行下述工序(2)，
(1-i)从包含植物的受精卵细胞的组织中分离受精卵细胞，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；
(1-ii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的受精卵细胞分离；
(1-iii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，同时将经过酶处理的受精卵细胞分离；
(2)将选自核酸、蛋白质及肽的物质导入得到的经过酶处理的分离受精卵细胞。
2.一种将物质导入植物的方法，该方法包括：
通过以下工序(1-iv)或(1-v)获得经过酶处理的分离受精卵细胞，然后进行下述工序(2)，
(1-iv)从植物体中分离卵细胞及精细胞，使它们融合，从而制备受精卵，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；
(1-v)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的卵细胞分离，并进一步使其与分离后的精细胞融合；
(2)将选自核酸、蛋白质及肽的物质导入得到的经过酶处理的分离受精卵细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，植物组织分解酶选自果胶酶、纤维素酶、蛋白酶、半纤维素酶类、葡糖醛酸糖苷酶、酵母裂解酶、几丁质酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶及木质素分解酶、以及它们中2种以上的混合物。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，植物组织分解酶包含果胶酶。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，植物为单子叶植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，植物选自玉米、小麦、大麦、稻及高粱。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，植物为玉米B73或来源于B73的玉米品种。
8.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，从包含植物的卵细胞的组织中将卵细胞分离后，通过精细胞融合，形成受精卵细胞。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，酶处理时间为3分钟以上且60分钟以下。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，在酶处理后120分钟以内进行工序(2)的物质导入。
11.根据权利要求8或9所述的方法，其中，在精细胞融合后120分钟以内进行工序(2)的物质导入。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，植物组织分解酶包含果胶酶，且工序(1)的酶处理时体系中的果胶酶的Unit/mL为60以下。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，植物组织分解酶包含果胶酶，且工序(1)的酶处理时体系中的果胶酶的Unit/mL×处理时间为310以下。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的方法，其中，工序(2)的物质导入使用PEG法或电穿孔法进行。
15.一种将物质导入植物的方法，该方法包括：
通过以下工序(1-i)、(1-ii)或(1-iii)获得经过酶处理的分离受精卵细胞，然后进行下述工序(2)～(4)，
(1-i)从包含植物的受精卵细胞的组织中分离受精卵细胞，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；
(1-ii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的受精卵细胞分离；
(1-iii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，同时将经过酶处理的受精卵细胞分离；
(2)将选自核酸、蛋白质及肽的物质导入得到的经过酶处理的分离受精卵细胞；
(3)使导入了物质的受精卵细胞愈伤组织化或胚状体化；
(4)利用再分化培养基使所述愈伤组织化或胚状体化后的组织再分化。
16.一种将物质导入植物的方法，该方法包括：
通过以下工序(1-iv)或(1-v)获得经过酶处理的分离受精卵细胞，然后进行下述工序(2)～(4)，
(1-iv)从植物体中分离卵细胞及精细胞，使它们融合，从而制备受精卵，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；
(1-v)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的卵细胞分离，并进一步使其与分离后的精细胞融合；
(2)将选自核酸、蛋白质及肽的物质导入得到的经过酶处理的分离受精卵细胞；
(3)使导入了物质的受精卵细胞愈伤组织化或胚状体化；
(4)利用再分化培养基使所述愈伤组织化或胚状体化后的组织再分化。
17.一种导入了物质的植物，其是通过权利要求1～16中任一项所述的方法得到的。
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