IT202100023468A1 - Trasfezione di protoplasti di piante di vite con il complesso Cas9/gRNA e rigenerazione di relative piante di vite editate - Google Patents
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Description
TITOLO: TRASFEZIONE DI PROTOPLASTI DI PIANTE DI VITE CON IL COMPLESSO Cas9/gRNA E RIGENERAZIONE DI RELATIVE PIANTE DI VITE EDITATE
CAMPO DELLA TECNICA
L?invenzione riguarda la trasfezione di protoplasti di piante di vite e la successiva rigenerazione delle relative piante di vite editate dai protoplasti trasfettati. I protocolli descritti si inseriscono in particolare nel settore dell?editing genomico per contrastare malattie in piante mantenendo nello stesso momento l?identit? e il profilo organolettico dei frutti della vite.
STATO DELLA TECNICA
Mantenere le caratteristiche qualitative e la grande variet? del patrimonio ampelografico tipico di ogni area vocata alla viticoltura, conferendo ai vitigni pi? pregiati anche caratteri di resistenza, e? una richiesta che emerge da ogni parte del settore viti-vinicolo e che pu? essere affrontata mediante i metodi pi? moderni e veloci di miglioramento genetico. Il genome editing mediato dal sistema CRISPR/Cas9 ha aperto nuove prospettive e la sua applicazione alla vite renderebbe possibile ci? che per il breeding tradizionale e? impossibile: ottenere un clone resistente di un vitigno tradizionale senza modificare la sua identit? e il profilo organolettico dei suoi frutti. Dal punto di vista biotecnologico, l?applicazione del genome editing per la produzione di un clone di vite modificato non e? immediata e richiede il superamento di alcuni ostacoli tecnici. La mutazione che si ottiene mediante genome editing ? infatti condotta dal complesso CRISPR/Cas9 dentro la cellula, nella quale pu? essere inserito in particolare eliminandone la parete, se non si vuole inserirlo mediante modificazione genetica stabile o metodi di bombardamento.
L?eliminazione della parete a partire da cellule embriogenetiche vegetali produce un protoplasto, che deve mantenere la capacit? di rigenerare la pianta. Tale capacit? ? stata dimostrata in un numero limitato di lavori scientifici e in particolare per protoplasti derivanti da materiale embriogenico ottenuto da diversi tessuti
Anche la possibilit? di introdurre il complesso CRISPR/Cas9 all?interno di cellule di protoplasti e la successiva generazione della mutazione nel sito di interesse sono state dimostrate in vite (Malnoy et al., 2016; Osakabe et al., 2018). Tuttavia, ad oggi ? stata dimostrata una sola rigenerazione di piante di vite editate ottenute da protoplasti ai quali ? stato applicato il sistema CRISPR/Cas9 (Scintilla et al. 2021).
ESPOSIZIONE DELL?INVENZIONE
L?invenzione si pone lo scopo di proporre un metodo che permetta di trasfettare protoplasti di piante di vite e di rigenerare le corrispondenti piante di vite editate dai protoplasti trasfettati con il complesso Cas9/gRNA. Ulteriore scopo dell?invenzione e? migliorare la fase di trasfezione di protoplasti per ridurre lo stress ai protoplasti e incrementare la probabilit? di rigenerare le piante dai protoplasti trasfettati. Un altro scopo dell?invenzione e? trovare alternative rispetto allo stato dell?arte per perfezionare anche il metodo per rigenerare le piante dai protoplasti.
Lo scopo viene raggiunto da un metodo di trasfezione di protoplasti di piante di vite che comprende le seguenti fasi:
(I) preparazione di un complesso Cas9:gRNA con un rapporto molare di 1:3 - 3:1, in particolare con un rapporto di peso tra 1:1 e 3:1, ed incubazione del complesso ribonucleoproteico al buio;
(II) aggiunta ai protoplasti del complesso di Cas9:gRNA preparato nella fase precedente;
(III) aggiunta di una soluzione PEG 3000 ? PEG 5000, preferibilmente PEG 4000, alla miscela ottenuta nella fase (II) ed incubazione, preferibilmente a temperatura ambiente, al buio;
(IV) aggiunta di una soluzione salina contenente MES, in particolare una soluzione W5, mescolando ed incubazione, preferibilmente a temperatura ambiente, e preferibilmente al buio;
(V) almeno una volta ripetizione della fase (IV), in particolare con il volume raddoppiato di soluzione salina;
(VI) centrifugazione dei protoplasti trasfettati e lavati nelle fasi precedenti preferibilmente per 2 - 4 minuti a 80 - 120 giri/min, pi? preferibilmente 3 min a 100 giri/min ed eliminazione del surnatante;
(VII) procedere con la coltivazione dei protoplasti senza ulteriori incubazioni con periodi di incubazione che superano la durata di 10 min, in particolare senza alcuna incubazione.
Il protocollo sopra esposto permette una trasfezione delicata dei protoplasti in modo da stressarli poco e renderli idonei alla successiva coltivazione di piante. Con gRNA si intende qualsiasi tipo di RNA guida che funziona come guida per l?enzima Cas9 che mira all'RNA o al DNA, con cui forma dei complessi. Sono ipotizzabili gRNA di una o pi? componenti, come il sistema cr/tracrRNA. Se dovessero essere eseguite incubazioni nella fase (VII) queste avvengono preferibilmente senza l?aggiunta di ulteriori soluzioni di lavaggio. Molto vantaggiosamente, nella fase (VII) non avviene nessuna ulteriore incubazione riducendo notevolmente lo stress per i protoplasti.
Le varie fasi eseguite al buio riducono ulteriormente lo stress per i protoplasti, un effetto che li rende pi? ?disponibili? alla coltivazione di piante.
In una variante preferita dell?invenzione, il volume finale della miscela della fase (I) ? di 15-25 ?L e/o il tempo di incubazione nella fase (I) ? di 10 min. Preferibile ? evitare volumi superiori. Preferibilmente, i protoplasti per l?aggiunta del complesso di Cas9-gRNA sono stati risospesi in una concentrazione di 2 x 10<5 >protoplasti in 200 ?L di una soluzione MMG e nella fase (III) sono aggiunti 200 - 225 ?L, preferibilmente 200 ?L di soluzione PEG 3000 ? PEG 5000, preferibilmente PEG 4000, preferibilmente al 40% in peso sul volume.
La concentrazione di cui sopra ? da intendersi come concentrazione e pu? quindi essere espressa in concentrazioni riferiti ad altri volumi di soluzione (ad esempio: 1 x 10<5 >protoplasti in 100 ?L di una soluzione MMG), corrispondentemente varia il volume di soluzione PEG aggiunta. Il PEG 4000 ha dato i migliori risultati, anche se il protocollo funziona altrettanto con PEG di diverso peso molecolare.
Vantaggiosamente, sotto queste condizioni particolari, nella fase (IV) viene aggiunto un volume di soluzione salina contente MES, in particolare una soluzione W5, che ? il doppio del volume della soluzione MMG e che il tempo di incubazione ? di circa 8 - 12 min, in particolare 10 min.
In una variante dell?invenzione, nella fase (VII) si usa una concentrazione di 1x10<5 >ppt/mL su petri.
L?ottenimento dei protoplasti stessi permette l?applicazione di diversi metodi noti anche nello stato dell?arte. Ipotizzabili sono diversi fonti di cellule, come ad esempio anche stami floreali. In una variante preferita del metodo secondo l?invenzione detti protoplasti vengono ottenuti dalle seguenti fasi:
(0-1) ottenimento di calli embriogenici da foglie apicali di piante cresciute in vitro; (0-2) proliferazione dei calli embriogenici e rigenerazione di embrioni somatici;
(0-3) opzionalmente trasformazione degli embrioni con Agrobacterium tumefaciens, al fine di introdurre un gene reporter, in particolare il gene reporter codificante la green fluorescent protein (GFP);
(0-4) dagli embrioni, eventualmente dagli embrioni transgenici, induzione del callo embriogenico e l?isolamento dei protoplasti.
Un?alternativa alla fase (0-3) opzionale per verificare rapidamente la funzionalit? ed efficacia del metodo e? l?uso di proteine Cas9 fuse alla GFP. La fase (0-3) viene omessa durante l?applicazione del sistema per introdurre mutazioni che rendono le piante resistenti a certe malattie, aumentano la qualit? dei loro frutti ecc. Senza l?applicazione della fase (0-3) la pianta ne ottenibile non ? geneticamente trasformata, ma si tratta di una pianta editata.
La possibilit? di ottenere piante da protoplasti trasfettati pu? essere ulteriormente perfezionata, intervenendo sulle fasi del metodo che riguardano la preparazione dei protoplasti alla coltivazione di piantine. A tal proposito, in una variante preferita del metodo secondo l?invenzione, per la rigenerazione di piante di vite dai protoplasti trasfettati si aggiungono le seguenti fasi preparatorie:
(VIII) ai protoplasti trasfettati viene aggiunto un terreno di coltura, preferibilmente del tipo Nitsch, in cui il terreno liquefatto viene aggiunto preferibilmente ad una temperatura superiore ai 35?C ed inferiore a 48?C;
(IX) al terreno di coltura viene aggiunto dopo la solidificazione il medesimo volume di terreno di coltura, preferibilmente del tipo Nitsch, allo stato liquido;
(X) incubazione dei protoplasti, preferibilmente a 27-28?C, al buio fino alla rigenerazione di embrioni allo stadio cotiledonare;
(XI) germinazione degli embrioni e successivamente sviluppo delle piantine.
Un ruolo non indifferente giocano le concentrazioni e quantit? applicate. Preferibilmente, nella fase (VIII) si aggiungono 2 mL di terreno di coltura a 800-?L della soluzione di protoplasti e il terreno viene separato in due met?, dopo la solidificazione viene aggiunta la stessa quantit? di terreno di coltura come riserva, e dal fatto che in fase (VIII) e (IX) il terreno di coltura ? preferibilmente del tipo Nitsch integrato con 2 mg/L di acido 1-naftalenacetico (NAA), 0,5 mg/L di 6-benzilaminopurina (6-BAP), 0,3 M di glucosio, 0,09 M di saccarosio e 2 g/L di gellano (pH 5,7) in cui nella fase (IX) il terreno ? stato integrato con lo 0,3% di carbone attivo o simile, ad esempio glutatione; che durante la fase (X) il mezzo liquido ? stato sostituito ogni 10-20 giorni, preferibilmente ogni 12-18 giorni con terreno fresco come definito sopra ma senza glucosio, che dopo 3-4 mesi di cultura, gli embrioni somatici allo stadio cotiledonare derivati da protoplasti, sono stati trasferiti in un solido preferibilmente del tipo Nitsch integrato con 30 g/L di saccarosio e 2 g/L gomma di gellano (pH 5,7) e mantenuti al buio per 3-5 settimane, preferibilmente 4-5 settimane per permettere una germinazione completa. L?indicazione della quantit? di terreno e della soluzione di protoplasti non ? solo da intendersi come valore assoluto, ma pi? da rapporto che viene mantenuto: 2 mL di terreno/800-?L della soluzione di protoplasti equivale ad esempio a 1 mL di terreno/400 ?L della soluzione di protoplasti.
Un secondo aspetto dell?invenzione riguarda una cellula vegetale editata di pianta di vite da tavola o da vino, in particolare di qualsiasi variet? di Vitis vinifera, ottenuta con il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti.
Un terzo aspetto dell?invenzione concerne una pianta di vite comprendente la cellula editata di cui sopra.
Le caratteristiche descritte per un aspetto dell?invenzione possono essere trasferite, mutatis mutandis, su ogni altro aspetto dell?invenzione.
Riassumendo si pu? constatare che l?invenzione raggiunge gli scopi prefissati, e in particolare l?invenzione propone un metodo che permette di trasfettare protoplasti di piante di vite e di rigenerare le corrispondenti piante di vite editate dai protoplasti trasfettati con il complesso Cas9/gRNA, questo tramite il perfezionamento della fase di trasfezione di protoplasti per ridurre lo stress ai protoplasti e incrementare la probabilit? di rigenerare le piante dai protoplasti trasfettati e in una variante preferita tramite il miglioramento del metodo per rigenerare le piante dai protoplasti.
Le fasi del metodo come descritte nella rivendicazione 7 possono essere applicate anche indipendentemente dalle fasi precedenti da (I) a (VII), in particolare indipendentemente dalle fasi che riguardano l?applicazione del sistema CRISPR/Cas9 sostituendo questo con altri sistemi, come ZNF (proteine dito di zinco) e TALEN (Transcription activator-like effector nucleases).
Gli scopi e i vantaggi detti verranno ulteriormente evidenziati durante la descrizione di preferiti esempi di esecuzione dell'invenzione data a titolo indicativo, ma non limitativo.
Varianti dell?invenzione sono oggetto delle rivendicazioni dipendenti. La descrizione degli esempi preferiti di esecuzione secondo l?invenzione viene data a titolo esemplificativo e non limitativo, in particolare ? possibile sostituire caratteristiche descritte con caratteristiche equivalenti.
DESCRIZIONE DI PREFERITI ESEMPI DI ESECUZIONE
La Fig. 1 mostra la foglia apicale della cultivar Thompson Seedless (A), il relativo callo embriogenico (B), i relativi embrioni somatici trasformati con il gene della GFP (D), il relativo callo embriogenico ottenuto dagli embrioni somatici transgenici (E).
La Fig. 2 mostra protoplasti isolati da calli embriogenici di Thompson Seedless sovraesprimenti la proteina GFP a luce bianca (A) e a luce UV (B).
La Fig. 3 mostra l?embrione allo stato cotiledonare in luce Bianca (A), l?embrione allo stadio cotiledonare in luce UV (B), la pianta rigenerata in luce bianca (C), e un particolare della pianta in luce UV (D).
La Fig. 4 mostra la mutazione indotta da Cas9/gRNA1 (RNP1) sulla sequenza del gene GFP.
La Fig. 5 mostra la mutazione indotta da Cas9/gRNA2 (RNP2) sulla sequenza del gene GFP.
Di seguito viene riportato un protocollo applicato alla variet? Thompson Seedless. Sono stati ottenuti calli embriogenici da giovani foglie apicali di piante cresciute in vitro (Figura 1A, B), seguendo il protocollo riportato nel lavoro di Dhekney et al. (2009). Dopo proliferazione del callo embriogenico sono stati rigenerati embrioni somatici (Figura 1C). La persona esperta del ramo conosce altri modi per produrre embrioni somatici.
Gli embrioni sono stati successivamente trasformati stabilmente con Agrobacterium tumefaciens, al fine di introdurre il gene reporter codificante la green fluorescent protein (GFP, in italiano: proteina fluorescente verde) (Figura 1D). Il protocollo utilizzato per effettuare la trasformazione genetica stabile ? quello descritto da Li et al. (2008), gi? applicato con successo alla cultivar in esame. La persona esperta del ramo con le sue conoscenze generali individua facilmente altri protocolli per introdurre il gene reporter anche in altri tipi di viti. Un gene reporter ? un gene la cui attivit? ? facilmente monitorabile mediante istochimica o metodi immunologici; esso codifica per un prodotto genico che pu? essere utilizzato per studiare l'attivit? di sequenze regolatrici di un altro gene di interesse.
L'espressione di questi geni ? facilmente identificabile e quantificabile mediante semplici saggi, per questo motivo sono usati come marcatori selezionabili.
I geni reporter sono quindi spesso usati come indicatori per valutare il successo della trasfezione ovvero mettono in evidenza se un determinato gene ? stato acquisito dalle cellule prese in considerazione e se il suddetto gene viene espresso correttamente. ? importante quindi che il gene reporter usato non sia naturalmente espresso nelle cellule d'interesse.
Da embrioni transgenici sovra-esprimenti la GFP ? stato indotto con metodi standard callo embriogenico (embriogenesi secondaria) (Figura 1E) per l?isolamento dei protoplasti e la successiva applicazione della mutagenesi sito-specifica mediata dal sistema CRISPR/Cas9. Per l?isolamento e la successiva coltivazione dei protoplasti transgenici sovra-esprimenti la proteina GFP (Figura 2A, B) viene utilizzato il protocollo riportato in Bertini et al. (2019) che ? stato perfezionato in alcuni punti dagli inventori. Il protocollo modificato ? applicabile a qualsiasi tipo di protoplasto, sia esso modificato con il sistema CRISPR/Cas9 oppure con altri sistemi noti nello stato dell?arte, come sistemi ZFN (Zinc finger nuclease = nucleasi a dita di zinco), TALEN (Transcription activator-like effector nucleases) ecc.
Da 0,15 - 0,3 g di callo embriogenico vengono estratti 5?10<5 >? 1?10<7 >protoplasti (ppt). Al fine di calcolare l?efficienza di rigenerazione, i protoplasti di Thompson Seedless sovra -esprimenti la GFP sono successivamente coltivati alla concentrazione di 1?10<5 >ppt/mL. L?efficienza di rigenerazione ? di 50-100 embrioni allo stadio cotiledonare ogni 5?10<5 >? 5?10<6 >ppt dopo circa 3 mesi dall?isolamento (Figura 3A, B). L?efficienza di rigenerazione dell?intera pianta da embrioni allo stadio cotiledonare ? del 20-35% dopo circa 6 mesi dall?isolamento (Figura 3C, D).
I protoplasti di Thompson Seedless sovra-esprimenti la GFP sono utilizzati per l?applicazione del sistema CRISPR-Cas9 al fine di mutare la sequenza del gene codificante la GFP.
Per il design delle sequenze di RNA guida (gRNA) viene utilizzato il software Cas-Designer (http://rgenome.net/). Per la sintesi degli RNA guida ? utilizzato il kit GeneArtTM Precision gRNA Synthesis Kit (Invitrogen, catalogo A29377).
Le sequenze disegnate sulla sequenza del gene GFP ed utilizzati per la trasfezione sono (la sequenza PAM ? evidenziata in grassetto):
RNA guida 1: 5?-CGAGGGCGACGCCACCTA CGG -3? (SEQ.1)
RNA guida 2: 5?-TCGCCGTCCAGCTCGACC AGG -3? (SEQ.2)
La trasfezione dei protoplasti viene effettuata con ribonucleoparticelle (RNP) Cas9-gRNA. La letteratura scientifica conosce diversi protocolli per effettuare la trasfezione di protoplasti, come quelli descritti da Woo et al. (2015), ottimizzati per Arabidopsis, riso, lattuga e tabacco, oppure Osakabe et al. (2018), ottimizzati per melo e vite. Nello specifico, per vite gli autori non descrivono la rigenerazione di piante dai protoplasti trasformati con CRISPR/Cas9. Con il protocollo secondo l?invenzione l?efficienza di rigenerazione di protoplasti di vite ? stata aumentata notevolmente.
In un primo passo, ? stato preparato il complesso Cas9:gRNA con un rapporto di 1:1 - 3:1 (p/v) in un volume finale di 20-25 ?L ed ? stato incubato il complesso ribonucleoproteico a temperatura ambiente per 10 minuti al buio.
Per la trasfezione sono stati utilizzati 2 x 10<5 >protoplasti, risospesi in 200 ?L di soluzione MMG. La soluzione MMG comprende preferibilmente 0,5 M mannitolo, 4 mM MES (acido 2-N-morfolino etanosolfonico) e 15 mM MgCl2 in H2O distillata. Ai protoplasti si aggiunge la RNP1 (gRNA1) e la RNP2 (gRNA2), preparate nella fase precedente.
Successivamente sono stati aggiunti 200 ?L di soluzione PEG 4000 al 40% (p/v) alla miscela protoplasti-RNP. Il mescolamento ? avvenuto pipettando con delicatezza, ad esempio con puntali con la punta tagliata per non rompere le cellule, seguito dall?incubazione a temperatura ambiente per 20 minuti al buio.
In un primo lavaggio sono stati aggiunti 400 ?L di soluzione W5, si ? mescolato e poi incubato a temperatura ambiente per ulteriori 10 minuti al buio. Una soluzione W5 comprende 5 mM di glucosio, 2 mM MES (pH 5,7), 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, and 5 mM KCl in H2O distillata. Vantaggiosamente, la soluzione e? preparata fresca prima dell?uso.
In un secondo lavaggio, sono stati aggiunti 800 ?L di soluzione W5, si ? mescolato e poi incubato di nuovo 10 minuti a temperatura ambiente al buio.
Al termine dei lavaggi, i protoplasti trasfettati sono stati centrifugati per 3 minuti a 100 giri/min ed il surnatante ? stato eliminato. Per ridurre ulteriormente lo stress, Dopo la centrifugazione, la posizione di riposo ? stata raggiunta per inerzia e non fermando bruscamente la macchina centrifuga.
Procedendo subito con la coltivazione dei protoplasti, ad esempio ad una concentrazione di 1x10<5 >ppt/mL, senza un?incubazione, in particolare senza un?incubazione durante la notte, ? stata osservata una maggiore efficienza di rigenerazione.
Per la successiva coltivazione dei protoplasti e la rigenerazione degli embrioni viene utilizzato in forma modificata il protocollo descritto in Bertini et al. (2019). In particolare, sono stati individuati le seguenti modifiche che possono essere applicate in genere alla rigenerazione di qualsiasi tipo di pianta da un qualsiasi tipo di protoplasto, in particolare di Vitis vinifera L. L?intero metodo secondo l?invenzione, in particolare la trasfezione di protoplasti, ? trasferibile ad altri tipi di viti o piante.
Una particolare attenzione viene posta alle quantit? di terreno di coltura. Ai protoplasti trasfettati, coltivati con il metodo della disc-culture, sono addizionati 2 mL di terreno di coltura. Per raggiungere la massima omogeneit? dei protoplasti nel terreno di coltura allo stato solido il terreno liquefatto viene aggiunto ad una temperatura superiore ai 35?C ed inferiore a 48?C. I 2 mL vengono divisi in due piastre petri posizionando in ognuna una goccia di coltura da 1 mL, aggiungendo in ogni petri dopo la solidificazione, il medesimo volume di terreno di coltura allo stato liquido. Mettendo una sola goccia le cellule hanno un maggior contatto con il terreno nutritivo liquido.
Le piastre vengono poi incubate a 28?C al buio fino alla rigenerazione di embrioni allo stadio cotiledonare.
Per le fasi successive di rigenerazione degli embrioni germinati fino allo sviluppo delle piante intere ? stato seguito il protocollo descritto da Bertini et al. (2019), ma qui sono applicabili anche altri protocolli noti dallo stato dell?arte trattandosi di passi anche meno delicati e critici. Dall?analisi di sequenza del DNA estratto dalle due piante si dimostra che in entrambi i casi il complesso RNP ? stato in grado di generare la mutazione esattamente nel sito bersaglio a quattro nucleotidi dalla sequenza PAM all?interno della sequenza del gRNA. Nel caso di RNP1 la mutazione ha riguardato l?inserzione di una adenina (A), mentre nel caso di RNP2 la mutazione ha riguardato l?inserzione di una timina (T), causando in entrambi i casi un frame shift. La SEQ.3 indica la sequenza DNA di partenza e la SEQ.4 la sequenza con la mutazione per il caso RNP1, mentre la SEQ.5 indica la sequenza DNA di partenza e la SEQ.6 la sequenza con la mutazione per il caso RNP2.
Utilizzando il protocollo secondo l?invenzione, in particolare la parte che riguarda la trasfezione dei protoplasti e opzionalmente anche la parte che riguarda la coltivazione dei protoplasti modificata secondo Bertini, l?efficienza di rigenerazione dei protoplasti trasfettati e? risultata confrontabile con quella riportata per protoplasti non trasfettati. Dall?analisi con luce UV allo stadio cotiledonare, per entrambe le trasfezioni (RNP1 e RNP2), un embrione su circa 30, ha mostrato la perdita del segnale di fluorescenza che si ? mantenuta anche a livello dell?intera pianta rigenerata.
Il materiale biologico di origine vegetale utilizzata ? una vite da tavola della specie Vitis vinifera subsp. vinifera con nome Sultanina o Thomson Seedless ampiamente presente e disponibile sui mercati, visto che ? una delle pi? importanti uve da tavola. Il suo numero nel catalogo Vitis International Variety Catalogue (VIVC) ? 12051:
https://www.vivc.de/index.php?r=passport%2Fview&id=12051
Nel caso presente, le piante da cui ? stato preso il materiale biologico sono state coltivate in Italia.
In fase esecutiva, al metodo dell?invenzione e le cellule e piante ne ottenibili, potranno essere apportate ulteriori modifiche o varianti esecutive non descritte. Qualora tali modifiche o tali varianti dovessero rientrare nell?ambito delle rivendicazioni che seguono, si dovranno ritenere tutte protette dal presente brevetto.
Il testo libero nella lista delle sequenze (sequence listing) SEQ. 1: DNA bersaglio per RNA guida per GFP
SEQ. 2: DNA bersaglio per RNA guida per GFP SEQ. 3 e 5 riportano DNA di Vitis vinifera.
SEQ. 4 e 6 riportano DNA di Vitis vinifera CRISPR/Cas9 editato.
Claims (10)
1) Metodo di trasfezione di protoplasti di piante di vite comprendente le seguenti fasi:
(I) preparazione di un complesso Cas9:gRNA con un rapporto molare di 1:3 - 3:1, in particolare con un rapporto di peso tra 1:1 e 3:1, ed incubazione del complesso ribonucleoproteico al buio;
(II) aggiunta ai protoplasti del complesso di Cas9:gRNA preparato nella fase precedente;
(III) aggiunta di una soluzione PEG 3000 ? PEG 5000, preferibilmente PEG 4000, alla miscela ottenuta nella fase (II) ed incubazione, preferibilmente a temperatura ambiente, al buio;
(IV) aggiunta di una soluzione salina contenente MES, in particolare una soluzione W5, mescolando ed incubazione, preferibilmente a temperatura ambiente, e preferibilmente al buio;
(V) almeno una volta ripetizione della fase (IV), in particolare con il volume raddoppiato di soluzione salina;
(VI) centrifugazione dei protoplasti trasfettati e lavati nelle fasi precedenti preferibilmente per 2 - 4 minuti a 80 - 120 giri/min, pi? preferibilmente 3 min a 100 giri/min ed eliminazione del surnatante;
(VII) procedere con la coltivazione dei protoplasti senza ulteriori incubazioni con periodi di incubazione che superano la durata di 10 min, in particolare senza alcuna incubazione.
2) Metodo secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che il volume finale della miscela della fase (I) ? di 15-25 ?L e/o che il tempo di incubazione nella fase (I) ? di 10 min.
3) Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2 caratterizzato dal fatto che i protoplasti per l?aggiunta del complesso di Cas9-gRNA sono risospesi in una concentrazione di 2 x 10<5 >protoplasti in 200 ?L di una soluzione MMG e che nella fase (III) sono aggiunti 200 ? 225 ?L, in particolare 200 ?L di soluzione PEG 3000 ? PEG 5000, preferibilmente PEG 4000, preferibilmente al 40% in peso sul volume.
4) Metodo secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che nella fase (IV) viene aggiunto un volume di soluzione salina contente MES, in particolare una soluzione W5, che ? il doppio del volume della soluzione MMG e che il tempo di incubazione ? di circa 8 - 12 min, in particolare 10 min.
5) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che nella fase (VII) si usa una concentrazione di 1x10<5 >ppt/mL su petri.
6) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detti protoplasti vengono ottenuti dalle seguenti fasi:
(0-1) ottenimento di calli embriogenici da foglie apicali di piante cresciute in vitro; (0-2) proliferazione dei calli embriogenici e rigenerazione di embrioni somatici;
(0-3) opzionalmente trasformazione degli embrioni con Agrobacterium tumefaciens, al fine di introdurre un gene reporter, in particolare il gene reporter codificante la green fluorescent protein (GFP);
(0-4) dagli embrioni, eventualmente dagli embrioni transgenici, induzione del callo embriogenico e l?isolamento dei protoplasti.
7) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che per la rigenerazione di piante di vite dai protoplasti trasfettati si aggiungono le seguenti fasi preparatorie:
(VIII) ai protoplasti trasfettati viene aggiunto un terreno di coltura, preferibilmente del tipo Nitsch, in cui il terreno liquefatto viene aggiunto preferibilmente ad una temperatura superiore ai 35?C ed inferiore a 48?C;
(IX) al terreno di coltura viene aggiunto dopo la solidificazione il medesimo volume di terreno di coltura, preferibilmente del tipo Nitsch, allo stato liquido;
(X) incubazione dei protoplasti, preferibilmente a 27-28?C, al buio fino alla rigenerazione di embrioni allo stadio cotiledonare;
(XI) germinazione degli embrioni e successivamente sviluppo delle piantine.
8) Metodo secondo la rivendicazione 7 caratterizzato dal fatto che in fase (VIII) si aggiungono 2 mL di terreno di coltura a 800-?L della soluzione di protoplasti e il terreno viene separato in due met?, dopo la solidificazione viene aggiunta la stessa quantit? di terreno di coltura come riserva, e dal fatto che in fase (VIII) e (IX) il terreno di coltura ? preferibilmente del tipo Nitsch integrato con 2 mg/L di acido 1-naftalenacetico (NAA), 0,5 mg/L di 6-benzilaminopurina (6-BAP), 0,3 M di glucosio, 0,09 M di saccarosio e 2 g/L di gellano (pH 5,7) in cui nella fase (IX) il terreno ? stato integrato con lo 0,3% di carbone attivo o simile, ad esempio glutatione; che durante la fase (X) il mezzo liquido ? stato sostituito ogni 10-20 giorni, preferibilmente ogni 12-18 giorni con terreno fresco come definito sopra ma senza glucosio, che dopo 3-4 mesi di cultura, gli embrioni somatici allo stadio cotiledonare derivati da protoplasti, sono stati trasferiti in un solido preferibilmente del tipo Nitsch integrato con 30 g/L di saccarosio e 2 g/L gomma di gellano (pH 5,7) e mantenuti al buio per 3-5 settimane, preferibilmente 4-5 settimane per permettere una germinazione completa.
9) Una cellula vegetale editata di pianta di vite da tavola o da vino, in particolare di qualsiasi variet? di Vitis vinifera, ottenuta con il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti.
10) Una pianta di vite comprendente la cellula secondo la rivendicazione 9.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4151084A1 (en) | 2023-03-22 |
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