CN108318697A - 利用免疫组化法检测菠萝胚珠减数分裂蛋白分布的方法 - Google Patents

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侯志敏
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Abstract

本发明提供一种利用免疫组化法检测菠萝胚珠减数分裂蛋白分布的方法，利用拟南芥的减数分裂时期特异表达基因DMC1的抗体，经过精心调整溶液浓度，处理时间，及材料处理方式，利用激光共聚焦显微镜可以在胚珠中检测到DMC1抗体的荧光，以此来观察察菠萝胚珠减数分裂过程重要基因DMC1在染色体上的表达情况。

Description

利用免疫组化法检测菠萝胚珠减数分裂蛋白分布的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用免疫组化法检测菠萝胚珠减数分裂蛋白分布的方法。
背景技术
种子是植物新一代生命的起始，能否正常发育为种子是植物界生命延续的关键（Walbot and Evans 2003）。植物雌配子体的发育直接关系着之后种子的形成，而大部分的种子植株在配子体发育过程中都会经历减数分裂，将二倍体或高倍体的体细胞分裂形成单倍体或染色体数减半的配子体细胞，再经过有丝分裂发育为成熟的八核七细胞结构的胚囊，为之后的有性生殖及双受精作用提供基础（Maheshwari, 1950; Twell, 2011）。因此减数分裂过程是一个特殊且及其重要的过程。减数分裂过程一般发生在植物胚珠发育的早期，这一时期的胚珠基本还没有内外珠被的包裹，一般来说其中远离珠柄端的胚珠中心细胞膨大后进入减数分裂。减数分裂过程能不能完成直接关系雌配子体的能否正常发育（Nonomura et al., 2007）。
植物雌配子是胚珠中心一个细胞特化形成，一般很小，位于子房中，被子房壁所包裹，且数量较少。要对雌配子发育进行观察比较困难，目前只对模式植物或重要农作物等的雌配子发育过程了解的比较多，特别是针对雌配子减数分裂的过程，非常少。常用的观察雌配子减数分裂过程的主要有以下几种方法：（1）染色体展片或压片的方法：取正在进行减数分裂的胚珠，置于FAA（福尔马林：乙醇：乙酸：水=1：0.5：5：3.5）中进行固定。过夜后，水洗3次加入酶解液，37℃反应半小时，水洗3次后，加10µL水后用镊子夹碎后转移至载玻片上，加-20℃预冷的冰醋酸展片，45℃烘干后加DAPI染色液后，盖上盖玻片，显微镜下观察。(2)苯胺蓝染色观察细胞板：取正在进行减数分裂的胚珠，置于FAA（福尔马林：乙醇：乙酸：水=1：0.5：5：3.5）中进行固定。过夜后，换成苯胺蓝染色液，染色过夜，于450%的甘油中制片，显微镜下观察。（3）染色体免疫荧光：取正在进行减数分裂的胚珠，4%多聚甲醛固定1小时，蒸馏水洗3遍，加酶解液37℃反应半小时，蒸馏水洗3遍后，将材料置于载玻片上，轻轻盖上盖玻片，压片后，在液氮中冰冻5分钟后取出，小心快速的揭去盖玻片，45℃烘干载玻片，之后加一抗孵育1小时，1X PBS缓冲液洗3次，每次15分钟，再加二抗孵育1小时，洗1X PBS缓冲液洗3次，每次15分钟，加DAPI染色液后，盖上盖玻片，显微镜下观察。
目前这些方法在研究植物雄配子体发育方面比较顺利，使用的也较多，但是植物雌配子体因本身数量较少，而且每个雌配子均深埋于胚珠中，对于正在进行减数分裂的单个细胞来说获取非常困难，以上的第1和3种方法在镜检时及其耗时间，而第二种方法只能观察到减数分裂过程细胞板的变化，看不到染色体的形态变化，及其染色体上关键蛋白的变化。
发明内容
本发明解决非模式植物雌配子体发育过程中减数分裂相关基因蛋白分布情况，提供一种利用免疫组化法来观察非模式植物菠萝雌配子体进行减数分裂过程相关基因的蛋白分布情况的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
（1）溶液的配制：
PBS溶液配制：
采用去离子水、KH2PO4和Na2HPO4·2H2O配制PBS溶液，按以下步骤进行：
(1) 配制1/15mol/L KH2PO4，即每升水中溶解9.078克KH2PO4；
(2) 配制1/15mol/LNa2HPO4·2H2O，即每升水中溶解11.876克Na2HPO4·2H2O；
(3) 将体积分数18.2%KH2PO4溶液和81.8%Na2HPO4·2H2O混合；
固定液：含4wt.%多聚甲醛的PBS溶液；
包埋液：30wt.% 聚丙烯酰胺200μl，25wt.%过硫酸铵2μl ，水197μl，TEMD 1μl，
酶解液：含1wt.% driselase、0.5wt.% cellulose、1wt.% pectolyase、1% BSA的PBS溶液；
（2）材料的获得
取正在进行减数分裂的胚珠；
（3）材料固定
剥出花苞，用镊子小心挑出，置于固定液中固定3-5小时；
（4）包埋
胚珠1×PBS溶液洗3遍，在载玻片上加1×PBS，再将胚珠置于其中，然后在解剖镜下将包在胚珠外的组织去掉，换成包埋液，盖上盖玻片，轻轻压散胚珠；室温静置20分钟后，小心揭去盖玻片；
（5）酶解
加50μl酶解液，盖上封口膜，37℃湿盒中反应1小时；
（6）加一抗
揭膜后，用含0.2wt.%Triton-100的1×PBS溶液洗3次，每次15分钟，按1:500体积比，用1×PBS稀释一抗，加50μl一抗稀释液，盖上封口膜，4℃，8小时或者过夜孵育；
（7）加二抗
揭膜后，含0.2wt.%Triton-100的PBS溶液洗3次，每次15分钟，按1:1000体积比，用1×PBS稀释二抗，加二抗稀释液，盖上封口膜，4℃，8小时或者过夜孵育；
（8）制片后，Confocal显微镜拍照
揭膜后，含0.2wt.%Triton-100的PBS溶液洗3次，每次15分钟，加PI染液，盖上封口膜，室温孵育20分钟， PBS溶液洗2次，每次15分钟；加防淬灭剂，盖上盖玻片，Confocal显微镜下观察。
所述的一抗为DMC1兔多克隆抗体；二抗为羊抗兔 IgG抗体。
本发明的优点在于：
本发明方法利用拟南芥的减数分裂时期特异表达基因DMC1的抗体，经过精心调整溶液浓度，处理时间，及材料处理方式，如图2所示利用激光共聚焦显微镜可以在胚珠中检测到DMC1抗体的荧光，以此来观察察菠萝胚珠减数分裂过程重要基因DMC1在染色体上的表达情况。
附图说明
图1菠萝花的结构。
图2 是本发明方法处理之后观察到的菠萝胚珠减数分裂过程重要基因DMC1在染色体上的表达情况，A为DMC1在拟南芥胚珠中的免疫荧光，B和C为DMC1在菠萝胚珠中的免疫荧光，通过对比，我们可以发现，由于DMC1的保守性高，其在染色体上的分布和形态均是一致的。说明本发明成功的观察到了菠萝减数分裂过程中DMC1的表达情况。
具体实施方式
实施例1
（1）溶液的配制：
PBS溶液配制：
采用去离子水、KH2PO4和Na2HPO4·2H2O配制PBS溶液，按以下步骤进行：
(1) 配制1/15mol/L KH2PO4，即每升水中溶解9.078克KH2PO4；
(2) 配制1/15mol/LNa2HPO4·2H2O，即每升水中溶解11.876克Na2HPO4·2H2O；
(3) 将体积分数18.2%KH2PO4溶液和81.8%Na2HPO4·2H2O混合；
固定液：含4wt.%多聚甲醛的PBS溶液；
包埋液：30wt.% 聚丙烯酰胺200μl，25wt.%过硫酸铵2μl ，水197μl，TEMD 1μl，
酶解液：含1wt.% driselase、0.5wt.% cellulose、1wt.% pectolyase、1% BSA的PBS溶液；
（2）材料的获得
取正在进行减数分裂的胚珠；
（3）材料固定
剥出花苞，用镊子小心挑出，置于固定液中固定4小时；
（4）包埋
胚珠1×PBS溶液洗3遍，在载玻片上加1×PBS，再将胚珠置于其中，然后在解剖镜下将包在胚珠外的组织去掉，换成包埋液，盖上盖玻片，轻轻压散胚珠；室温静置20分钟后，小心揭去盖玻片；
（5）酶解
加50μl酶解液，盖上封口膜，37℃湿盒中反应1小时；
（6）加一抗
揭膜后，用含0.2wt.%Triton-100的1×PBS溶液洗3次，每次15分钟，按1:500体积比用1×PBS稀释一抗，加50μl一抗稀释液，盖上封口膜，4℃，8小时或者过夜孵育；
（7）加二抗
揭膜后，含0.2wt.%Triton-100的PBS溶液洗3次，每次15分钟，按1:1000体积比用1×PBS稀释二抗，加50μl二抗稀释液，盖上封口膜，4℃，8小时或者过夜孵育；
（8）制片后，Confocal显微镜拍照
揭膜后，含0.2wt.%Triton-100的PBS溶液洗3次，每次15分钟，加PI染液，盖上封口膜，室温孵育20分钟， PBS溶液洗2次，每次15分钟；加防淬灭油，盖上盖玻片，Confocal显微镜下观察。
所述的一抗为DMC1兔多克隆抗体；二抗为羊抗兔 IgG抗体。
通过对比，我们可以发现，由于DMC1的保守性高，其在染色体上的分布和形态均是一致的。说明本发明成功的观察到了菠萝减数分裂过程中DMC1的表达情况。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1.一种利用免疫组化法检测菠萝胚珠减数分裂蛋白分布的方法，其特征在于：所述方法包括如下：
（1）溶液的配制：
PBS溶液配制：
采用去离子水、KH2PO4和Na2HPO4·2H2O配制PBS溶液，按以下步骤进行：
(1) 配制1/15mol/L KH2PO4，即每升水中溶解9.078克KH2PO4；
(2) 配制1/15mol/LNa2HPO4·2H2O，即每升水中溶解11.876克Na2HPO4·2H2O；
(3) 将体积分数18.2%KH2PO4溶液和81.8%Na2HPO4·2H2O混合；
固定液：含4wt.%多聚甲醛的PBS溶液；
包埋液：30wt.% 聚丙烯酰胺200μl，25wt.%过硫酸铵2μl ，水197μl，TEMD 1μl，
酶解液：含1wt.% driselase、0.5wt.% cellulose、1wt.% pectolyase、1% BSA的PBS溶液；
（2）材料的获得
取正在进行减数分裂的胚珠；
（3）材料固定
剥出花苞，用镊子小心挑出，置于固定液中固定3-5小时；
（4）包埋
胚珠1×PBS溶液洗3遍，在载玻片上加1×PBS，再将胚珠置于其中，然后在解剖镜下将包在胚珠外的组织去掉，换成包埋液，盖上盖玻片，轻轻压散胚珠；室温静置20分钟后，小心揭去盖玻片；
（5）酶解
加50μl酶解液，盖上封口膜，37℃湿盒中反应1小时；
（6）加一抗
揭膜后，用含0.2wt.%Triton-100的1×PBS溶液洗3次，每次15分钟，按1:500的体积比，用1×PBS溶液稀释一抗，加50μl一抗稀释液，盖上封口膜，4℃，8小时或者过夜孵育；
（7）加二抗
揭膜后，含0.2wt.%Triton-100的PBS溶液洗3次，每次15分钟，按1:1000的体积比，用1×PBS稀释二抗，加50μl二抗稀释液，盖上封口膜，4℃，8小时或者过夜孵育；
（8）制片后，Confocal显微镜拍照
揭膜后，含0.2wt.%Triton-100的PBS溶液洗3次，每次15分钟，加PI染液，盖上封口膜，室温孵育20分钟， PBS溶液洗2次，每次15分钟；加防淬灭剂，盖上盖玻片，Confocal显微镜下观察。
2.根据权利要求1所述的一种利用免疫组化法检测菠萝胚珠减数分裂蛋白分布的方法，其特征在于：所述的一抗为DMC1兔多克隆抗体；二抗为羊抗兔 IgG抗体。
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