JPS6178388A - 植物細胞のマイクロインジエクシヨン技法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 外来性遺伝物質を高等植物に導入するための可能性は、
次の１０年間食物生産を増大するために農学者達に多大
な機会をもたらす見込みである。

現在、高等植物の遺伝操作に興味を持っている農学者の
第１の焦点は、２つの領域、すなわち刀！ロバクテリア
ム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔ＊ｒｌｕｍ！
ｕｍｅｆａｃｊｅｎａ　）のＴ１　−戸ラスミドの使用
及びカウリモビールヌ（Ｃａｕｌ　ｉｍｏｖｌｒｕｓｅ
ｍ　）に基礎を置いているベクターの使用にある。これ
らの方法は、植物のゲノム中に外来性ＤＮＡを組み込む
ための可能性を提供するが、それらは、おのおのの範囲
が制限されていること及び形質転換の効果が制限されて
いることを含む特定の欠点を有する。従って、これらの
欠点が々い植物の遺伝操作のために改良された方法を持
つことが債ましいであろう。

動物細胞において実施するようなりＮＡの直接的ガマイ
クロインソエクション法は、単純であること及び形質転
換率がひじょうに高いことを含む多くの利点を持ってい
る。これらの利点にもかかわらず植物細胞へのＤＮＡの
直接的マイクロインジェクション法の利用性は、制限さ
れた用途のみを有する。植物細胞への直接的マイクロイ
ンジェクション法は、動物細胞に見られない硬い細胞壁
の存在によって複雑化きれる。この細胞壁を欠く原形質
体を、形成することはできるが、植物細胞の原形質体の
マイクロインジェクション法は、それらの極端なもろさ
によって困難にされている。すばらしいマイクロインジ
ェクション法は、固体基質上に植物の原形質体を固定す
ることによって達成されている。しかしながら、そのよ
うな固定化が、注入されている細胞と注入されていない
細胞とを容易に分離することを妨げ、そして注入されて
いる細胞のわずかな割合が２．３日間、追跡することが
できる。形質転換された細胞の同定及び回収を可能にす
るために有力な選択可能マーカーが要求され、そしてそ
のようなマーカーの使用は、形質転換体の重要部分の損
傷をもたらすかも知れない、。

従って、植物原形質体へのＤＮＡ及び他の高分子類の直
接的マイクロインジェクシ目ンのための方法を提供する
ことが好ましく、この方法は注入された原形質体の高い
生存率を伴い、捕物細胞の特定の区画中への注入される
ＤＮＡの高率取り込みをもたらす。

〔従来の技術〕

植物原形質体への高分子類のマイクロインジェクション
法を教示し、この場合、原形質体はまずポリシンを用い
て、顕微鏡のカバーグラスに固定される。機能的ではあ
るが、チリシンによる固定は、原形質体の生存率を減じ
そして核へのマイクロインノエクシ菖ンが、しばしば起
こる。グリエスパ（１９８３）４：３２〜３７　は、寒
天中に自由浮遊しているか又は懸濁されている高等植物
の原形質体への染色体のマイクロインジェクションを開
示している。核への注入は、得られずそして原形質体の
生存率が激しく減した。ホールディング　ピペット及び
マイクロインジェクション　ピペットを用いるマウスの
卵へのＤＮＡのマイクロインジェクション法は、リン、
サイエンス（Ｓｅｌ＠ｎｃ・）（１９６６）１５１：３
３３〜３３７に記載されている。

ｏｆ　５ｃｌａｎｅ＠Ｕ８Ａ）（１９８１）７８　ｇ　
６３７６〜６３８０；プリンスター寿と、ミル（Ｃｅｌ
ｌ）（１９８１）γｎ２２３〜２３１；及びゴートン及
びラドル、サイエンス（Ｓａｌ＠ｎｅｒ）（１９８１）
２１４：　１２４４〜１２４６　（これらの場合、マイ
クロインジェクションによって新生マウスのゲノム中へ
の遺伝物質の成功した注入及び発現が記載されている）
を参照のこと。

〔発明の要約〕

植物細胞の原形質体中にＤＮＡ及び他の高分子類をマイ
クロインジェクションするための改良された方法を提供
する。この方法は、細胞壁を部分的に、再生するために
十分な時間、原形質体をあらかじめ培養することによっ
て特徴づけられている。

そのよう々細胞壁の部分的再生は、それに続く操作中、
原形質体を強化しそして注入された原形質体の生存率を
ひじょうに高める。ＤＮＡ又は他の高分子類の注入は、
特別に構成されたインソエクションピペットを用いて成
し遂けられ、そしてこの細胞は固定される。好ましい態
様においては、おのおのの原形質体は、ホールディング
ヒヘツ）ｆ用いての吸引によって保たれ、そしてインソ
エクションピペットが原形質体中に挿入される。注入さ
れた原形質体は一緒に集められそして他の原形質体及び
細胞から単離され培養される。この方法においては、注
入されている原形質体の経過を、容易に追跡することが
できる。

〔特定の態様の記載〕

この発明は、高分子類、典型的にはポリヌクレオチド類
、単離された染色体、及び同様のもの、並びにオルガネ
ラ類、たとえば、核を植物の原形質体中に注入するため
の新規方法をもたらす。この方法は、高分子類の注入の
前に、細胞壁を部分的に再生するのに十分な時間、新た
に調製された原形質体を培養することを、特徴とする。

部分的な細胞壁が、注入の間原形質体を保持するために
、十分な機械的支持体をもたらし、そして注入手段、典
型的にはインジェクション　ピペットによる侵入を可能
にする。

このましい態様においては、部分的に再生された原形質
体は、部分的に再生された細胞壁を少し吸引することに
よって原形質体を保つのに適合されるホールディング　
ピペットを用いて、個別的に操作される。使用者は、こ
のホールディング　ピペットを用いて、原形質体が核を
露出するように適応させることができる。次にインノエ
クシ目ンピペットを用いて、原形質体を突き抜いて、そ
して核中に直接的に高分子類を注入することができる。

直接的に核中に注入する可能性は、ＤＮＡの注入によっ
て原形質体の形質転換を可能にするために重要である。

次に、注入されている細胞及びこの結果得られる培養物
を、注入されていない細胞から分離して観察するのを可
能にするために注入されている原形質体を別々に培養す
る。

この発明の方法は、実質上すべての高等植物から形成さ
れる原形質体について有用である。特に、この方法は、
分化全能性を有しそしてこれから完全な植物を再生でき
る高等植物の原形質体について有用である。この方法は
、ソラナセアエ（Ｓｏｌａｎａｃ＠ａ・）のいろいろな
種、たとえばソラナムｚ二りＬｉｈ（Ｓｏハｎｕｍ　　
ｔｕｂｅｒｏｍｕｍ　）　（ポテト）、　リｍ＠ｌｏｇ
ｅｎａ）（ナス）、カブシカム　アンヌアム（９Ｕ叩！
、！凹便）（コシ四つ）、及び種々のペチュニア、たと
えば、ペチュニアこイノユｌ（Ｐ＠ｔｕｎｊａ　ｈｙｂ
ｒｉｄａ）からの原形質体再生のために存在する。これ
らに加えて、他の有益な経済的作物、たとえは穀物類、
木質植物、マメ科植物、及び同様のものが、特定の条件
下で原形質体から再生される。そのよう々再生のための
特定の条件、たとえば、植物ホルモン、原形質体濃度、
…、光、及び同様のものが同定される場合、植物原形質
体から完全な植物を再生するための可能性は、増進する
であろうということが予期される。

この発明の方法は、原形質体の形質転換及び完全な植物
への原形質体の再生による高等植物の変性のために特に
有用である。単離された染色体及び核を含む、広範囲の
種類の遺伝子及び他のＤＮＡが原形質体中に注入さね、
植物ゲノム中に組み込まれるようになる。このＤＮＡは
６裸”であることができ又はベクター系、たとえばＴ１
７’ラスミド又はカウリモビールスに基づく系統中に組
み込まれることができる。挿入される遺伝子は、広範囲
の種類の変性をもたらすことができる。種々の機能を支
配する遺伝子を挿入することによって、植物°の機能を
幅広く変えることができる。植物成長を、抑制又は増進
することができる。栄養要求を改変することができる。

種々の植物生成物の製造を、増加又は減少することがで
きる。高められたタン・！り質及び／又Ｖｉ糖質含有を
もたらすことができる。この植物を、不適合な環境、た
とえば少ない光、低温度、塩性水において生存するよう
に順応せしめることができる。細菌及び害虫感染に対す
る保護をももたらすことができる。これらの及び他の変
性は、これらの特徴の原因である特定のタン・やり質を
生産する遺伝子を供給することによって達成され得る。

セルラーゼ、典型的には菌類性セルラーゼを用いて、所
望の植物細胞の細胞壁を酵素的に消化することによって
、原形質体を形成することができる。たとえ汀、植物の
葉を単離し、主葉脈を捨て、そしてその単離物を、浸透
圧溶液及びセルラースにより処理する。この得られる原
形質体を、ベレット化しそして洗浄し、細胞性残骸を取
り除いた。

タバコ　メソフィリス（ｍｅａｏｐｈｙｌｌｇ）を形成
するだめの特定の方法が、この後の実験の部において示
されている。植物の原形質体を形成するための他の方法
は、従来技術においで良く知られている。

細胞壁を部分的に再生するために十分な時間、新たに調
製される原形質体を、適切な栄養培地中で培養し、次の
操作を容易にする。部分的に再生された細胞壁は、原形
質体へのインジェクションピペットによる侵入を妨害し
ないことが見出された。再生のために安水さノしる時間
数は、細胞タイプ、培養条件、及び同様のものに依存し
て変化するであろう。再生された細胞壁は、インジェク
ション　ピペットの侵入をブロックするので、注入は、
細胞壁の完全な再生（第１細胞分裂の前で、直ちに生じ
る）の前に、実施されるべきである。典型的には、再生
時間は、少なくとも１日でありそして５日を越えないで
あろう。さらに典型的には、再生時間は１日及び３日の
間であろう。必要ではないけれども、ナガタ及びタケベ
、グランタ（ｐｌａｎｔａＸベルリン）（１９７０）９
２　：　３０１〜３０８の方法によって細胞壁再生の範
囲を決定することが望ましい。この方法を用いて、特定
の条件下での細胞壁再生のために要求される時間を決定
することができる。次に、細胞壁が、実質的に大部分の
原形質体において再生されたが、しかし第１細胞分裂の
前でのある時点でマイクロインジェクションを、行なう
ことができる。

原形質体インジェクションに先だってインジェクション
　ピペットを、部分的に再生された細胞壁を通し′Ｃ挿
入することができるように、細胞を固定することが必要
である。ホールディング　ピペット（下に記載されてい
るように）を利用して、培養物から個々の原形質体をつ
かむことができ、そして注入中、前記原形質体を操作で
きる。注入は、超微小のインジェクションピペットｔ−
用いて、無菌状態下で実施される。便利には、無菌状態
を維持するために、原形質体懸濁液の小滴及び高分子溶
液、たとえばＤＮＡ溶液の小滴を、お互い隣接して形成
しそして油により被覆する。典型的な態様において、こ
れは、油を収容するためくぼみを有する顕微鏡スライド
を用いて達成される。次にホールディング　ピペット及
びインジェクションピペットは、商業的に入手可能なマ
ニグレータ−を用いて操作され、そして顕微鏡下で観察
される。

原形質体は、核中へのＤＮＡの直接的注入を可能にする
ために核を露出できるように方向づけられるであろう。

ホールディング　ピペットは、通常の方法においてピペ
ットグラ−を用いて商業的に入手可能な毛管、典型的に
は１．０ミリメーターの管から製造することができる。

このホールディング　ピペットは、まずテーパー末端を
形成するために、引張られ、そしてそのチー・母−は、
原形質体の大きさに依存して、特定のオリフィス直径で
折られる。その先端は、アニーリングによシ、典型的に
は、加熱したガラス玉を用いて、次に急速に冷却するこ
とによって折られる０次に折られた表面は、加熱された
フィラメントにそれを近づけ保持することによって燃焼
磨きされる。そのピペットのオリフィス直径は、細胞の
直径の約１／４に等くあるべきである。従って、約４０
ミクロンの直径を有する典型的なタバコ細胞の原形質体
については、ホールディング　ピペットのオリフィスは
、約１０ミクロンであるべきである。ピペットの遠隔末
端を、くほみのスライド内の操作中、観察を容易にする
なめに曲げることができる。

インジェクション　ピペットは、また商業的に入手可能
なピペットプラーで、標牟ガラスの毛細管を引張ること
によって形成される。この管を、最っとも細い点で折れ
るまで引張り、極端に細いテーパー先端を残す。このピ
ペットの先端は、直径で１ミクロンのようである。注入
溶液を保つであろうピペット先端の部分の良さ及び底面
直径を測だすることによって、インジェクション　ピペ
ットの目盛りを定めることができる。次に、注入される
体積の推定は、ＤＮＡ溶液及び油の間のメニスカスの移
動を観察し、そして適切な幾何学公式を適用することに
よってなされる。大きな構成物、たとえば染色体、核、
及び他のオルガネルの導入金谷易にするために、インジ
ェクション　ピペットの先端を内部的に斜めに切り、外
部直径を大きくしないで、内部オリフィスの直径を大き
くすることができる。

このホールディング及びインジェクション　ビ４ットは
、粘性油、典型的にはパラフィン油により満さね、そし
て適切なマイクロマニル−ター中に挿入される。ピペッ
トの遠隔末端もまた、油により満たされているゾラヌチ
ック管によって注射器に接続される。従って、ピ（ット
内の圧力は、注射器を調節することによって操作され得
る。

ＤＮＡ及び原形質体を保持するくほみスライドを、観察
用顕微鏡の下に置きそしてホールディング　ビぺ、ト及
びインジェクシヨン　ピペットの両者に焦点を合わせる
。油層の下にピペットの先端を浸没する前に、インジェ
クタ１ン　ピペットの先端ハ、約１ミクロンの開口を残
し、ホールディング　ピペットに対してそれを接触する
ことによって移される。

次に、このインジェクション　ピペットハ、ＤＮＡ小滴
中に挿入され、そして約１０　ｐｉのＤＮＡを、連結さ
れている注射器を用いて、吸い取る。次、インジェクシ
ョン　ピペットを、ＤＮＡ小滴から取り出し、そしてイ
ンジェクション　ピペット及びホールディング　ピペッ
トの両者を、原形置体溶液中におろす。ホールディング
　ピペットのオリフィスを原形質体に接触して保ちそし
て連結されている注射器を用いて微１、吸引するととＫ
よって、原形質体を、それぞれつかむ。原形質体を引き
上けた後、インジェクション　ピペットを用いて、穏や
かに回転せしめることによって、原形質体の方向を調節
することができる。核を露出するやいなやインジェクシ
ョン　ピペットを核中に挿入することができ、そして所
望のＤＮＡ溶液の体積、典型的に６１〜２９１を注入す
ることができる。

ＤＮＡの注入に続いて、原形質体は、無菌環境において
、植物ホルモン含有の培養培地で培養することによって
カルス組織に再生される。カルスは、短期間、たとえは
１〜３日間、ホルモン、たとえはサイトカイニンによる
刺激によって、幼ＭＩＩ勿に再生促進せしめられる。次
に１遺伝的に変性された幼植物を、殺菌ポットミックス
中に植えそして成長を可能にすることができる。

次に、植物細胞中での所望の遺伝子の存在は、遺伝子の
性質に依存して、広範囲の種類の方法で確立され得る。

外来性生成物を半量する遺伝子の存在は、植物細胞の単
離及び溶解、並びに外来性生成物についての原形質の分
析、又は外来性遺伝子についての核の分析によって検出
することができる。この外囲性生成物は、電気泳動、ク
ロマトグラフィ、イムノアッセイ、又は同様のものによ
って検出され得る。この遺伝子は、ノ・イブリット形成
、たとえばサザン法を用いることによって便利に検出さ
れ得る。

いったん、幼植物又は植物が形質転換されているという
ことが示されたならば、次にこの植物の細胞は、くり返
し組織培養のために使用され、次に幼植物の成長が行わ
れる。従って、変性された植物は、細胞及び組織培養の
使用によってくり返し再生され得る。外来性遺伝子の損
失についてモニターすることが賢明であるけれども、い
くらかの場合、増殖は、種子から維持することができる
。

形質転換された原形質体の同定を促進するためには、注
入されている原形質体が注入されていない原形質体から
単離され培養されることが望ましい。しかしながら、植
物原形質体は、典型的には、１ミリリツターにつき１０
４〜１０６細胞の最少密度を必要とするので、そのよう
にするためにはマイクロカルチャー技法を必要とする。

ひじように少ない培養体積を使用することによって、ひ
じょうに多数の形質転換された原形質体を必要としガい
で、要求範囲内に、注入される細胞の密度を維持するこ
とができる。

原形質体のマイクロカルチャーのための特定の技法は、
適切な培養溶液の上方に逆にして置かれたプレート上に
培譬液の懸濁を形成することによって達成される。便宜
上、ペトリ皿の蓋を用いることができそして培養培地を
含むペトリ皿のに移すことができる。この密封されたシ
ステムは、適切な温度で保持され、そしてこの得られる
湿度は、懸滴から培地の蒸発を抑制する。懸滴のサイズ
は、原形質体の数に依存し、そしてこの懸滴は、約０．
２５〜０５ミリリツターの範囲の推定体積を有し、典型
的には約２０〜４０の原形質体を担持している。

懸滴培養の増殖は、顕微鏡下でモニターさ７′Ｌ得、そ
してマイクロカルスとして、添加された培地上で増殖す
る。培地は、小さなピペットを用いて補充されるか又は
、交換される。カルスが十分なサイズ、典型的には直径
約１．０顛に達する場合、適切な培地を含む寒天グレー
トに、それらを移すことができる。下に記載されている
ようにして、通常の技法を用いてマイクロカルスから幼
植物を再生することができる。

次の例は、制限的でなく例示的に提供されている。次の
略語が用いられている： ＢＡＰ−ベンジルアミノプリン ＩＡＡ−インドール酢酸 ＮＡＡ−ナフタリン酢酸 〔実　験〕 材料及び方法 １、　タバコメソフィル原形質体の製造ニコチアナ　タ
パカム（Ｎｌｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）　ＣＶ
。

キサンチア（Ｘａｎｔｈｌｍ）の原形質体供辱植物を、
ファシオット及びビレット、ブランド　サイエンスレタ
ーズ（ＰＩｌｌｎｔ　５ａｌａｎｃｅ　Ｌｅｔｊａｒｓ
　）（１９７９月」＝１〜６によって記載されているよ
うにして、無菌状態下でガラスジャー中で増殖せしめた
。ｉｏｏｍｇの寒天培地（３０，０Ｐ／ｌ　　のスクロ
ース、１．０ｍ９／ｌ　〕ＩＡＡ　及び０．１５ｍ９／
ｌのカイネチンを含む０、６　％　Ｇｉｂｃｏ　Ｐｂｙ
ｔａｇａｒ　ＭＳ培地、　あらかじめオートクレーブの
前にｐｌ（５，７５にｐＨ調節）中に、頂端芽を置いた
。この培養は、１２時間暗／明型下で２３±２℃で維持
された。若葉を２〜３週後の植物から取り、主葉脈を捨
て、そして０．０４％ペクチナーゼ（ペクトリアーゼ　
Ｙ−２３）及び０．４％セルラーゼ（オノデカ　Ｒ８）
を含む６チソビ）　−ル溶液中に、葉身を浸透せしめた
。２〜３時間のインキュベートの後、１４９μのナイロ
ンフィルターを介して単離体全通した。原形質体を、５
０ノで遠心分離するととＫよってペレット化しそして６
％ソルビトール溶液により２度洗浄した。次に、カボッ
チェ、プランタ（Ｐｌａｎｔａ）　（１９８０）Ｌ旦」
；７〜１８によって記載されているようにして、３．０
　”９／ｌ　ノＮＡＡ及び１．　Ｏｙｕｐ／ｌｌ　（Ｄ
　ＢＡＰを含む変性ＭＳ培地（０５のＭＢ２度、Ｇｌｂ
ｃｏ　５１０〜］１１８．５．０９／Ｉｃ）−ｆクロー
ス、７１．０９．／ｌのソルビトール）中に、１〜２Ｘ
１０５／ｉ／の密度でこの原形質体を懸濁した。

注入に先だっての前培養を、暗みの中で２〜５日間、２
３士２℃、・リフインにより密封された９備のベトリ皿
中で実施した。

２、スライドの調製 すべての方法は、層流フード中において実施された。プ
レキシグラス　スライド中を正方形に切り取り、その穴
にカパースリッ′；ｆを接着することによって、くほみ
スライドを作った。裏返しにした時、くぼみが形成され
、そしてここで、すべての操作を実施した。

上に記載されているようにして、調製された培養物から
解剖顕微鏡下で、原形質体を選択した。

マイクロメーター注射器にグラスチック管によって連結
されたガラス性移送ピペ、トにより、原形質体の選択及
び移送を実施した。シンセンバーナー上で１．２龍の外
部１Ｍ径のガラス管を手で引張り、直径約１００〜１５
０μのオリフィスの移送ピペットを作った。

選択された原形質体を含む培地の小滴を、スライド上の
くほみ中に形成した。注入されるべきＤＮＡ浴液を含有
する第２小滴もまたくぼみ中に形成した。種々のＤＮＡ
構Ｊ戎物を、水性溶液中に注入した。次に、・リフイン
油によりそのくを了みを満たし、原形質体及びＤＮＡ溶
液の両者を抜機し、続いての操作のｎす、蒸兄及び汚染
を紡いだ。偽注入及び対照（注入されていない）のため
に用いられるスライドは、ＤＮＡ小滴を除いて同じ方法
で調製された。

３　ピペット調製 あらかじめシリコン処理した毛細管（Ｉ）ｒｕｍｍｏｎ
ｃｌＳｃｌ、　Ｃｏ、それぞれ１．０龍の直径のＲ６ガ
フス。

及び１．０ｉｎ＋の１ム径のＬａ１ｔｚ）　　から、イ
ンジェクション及びホールディング　ピペットを製造し
た（Ｓｉｇｍａｃｏｔ＊、　Ｓｉｇｍａ　ｃｂａｍｌｃ
ａｌ　Ｃｏ、　）。この毛細管を、ピペットプラー（Ｕ
ｌｔｒａｆｌｎｅ　、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｈｅａｒａ
ｎｄＣｏ、）　　上で引張り、テーノ９−先端を形成し
た。

マイクロフォージのフィラメントに付けられている加熱
されたガラス玉に、ホールディングピペットのテーノ量
−先端をアニールし、次に急速に冷却することによって
、２０〜３０μの直径で、それを折シ離した。この折ら
れた表面を、加熱されたフィラメントに近づけ、保持す
ることによって燃焼磨きする。マイクロフオージ（Ｄ＠
ｆｏｎｂｒｕｍ・ＭＦ−８０）上で加熱されたフィラメ
ントにそれを近づけ、保持することによって、約１５０
°の曲げ管を形成した。この曲げ管は、顕微鏡の焦点面
にひじょうに長い先端を導ひくことによってピペットの
操作を容易にする。

インジェクション　ピペットは、同様に曲げられたが、
しかしインジェクタ１ン先端は、手順中もっと後まで折
シ離さなかった。

４、マイクロインノエクシ日ン方法 マイクロインノエクシ璽ンは、Ｌ＠１ｔｚ　Ｄｉａｖ＠
ｒｔ顕微鏡下で、Ｌｅｉｔｚマイクロマニゲレータ−に
よシ実施された。ホールディング及びインジェクション
　ピペットは、パラフィン油により満たされているグラ
スチック管によって、ハミルトン注射器に連結されてい
る継ぎ輪用具に挿入された。この２つのピペットを、共
に焦点に合わせ、そしてインジェクション　ピペットの
先端は、１．０μの開口を残し、ホールディング　ピペ
ットに対してそれを接触することによって移された。

インジェクシヨン　ピペットをＤＮＡ小滴中におろし、
そして約１０９ｇのＤＮＡ溶液をピペット中に吸い取っ
た。この体積は、下に記載しているようにして推定した
。次にこのインジェクション　ピペットをＤＮＡ小滴か
ら取り出し、そして両方のピペットを原形質体培地小滴
中におろした。原形質体は、ホールディング　ビちトに
基づく吸引によって個々に、取り上げられ、そして核に
容易に接近できるまで、インジェクション　ピペットに
よりつつくこトニヨって回転せしめられた。このインジ
ェクション　ピペットは、植生に挿入され、そして約１
〜２　ｐｌのＤＮＡ溶液が注入された。

接眼マイクロメーターを用いて、インジェクション溶液
を保つピペット先端の部分の長さ及び底面直径を測定す
ることによって、インジェクション　ピペットの目盛り
を定めた。その体積は、円錐の体積であると仮定された
。注入されるｌの推定は、ＤＮＡ溶液及び油の間のメニ
スカスを観察することによって行なわれた。

マイクロインジェクション法に従って、インジエクシヨ
ン　ピペットは取り除かれ、そして原形質体ハ、ホール
ディング　ピペットの吸引を逆にすることによって培地
小滴の底に置かれた。

偽注入は、上記のようにして実施されたが、しかし液体
は、インジェクシヨン　ピペットかう注入されなかった
。すべての原形質体が注入された後、そのピペットを＜
／Ｊみから上げ、そしてスライドを、層流フードに移し
た。

５、　８滴培養 層流フードにおいて、解剖顕微鏡下で、移送ビペッ）Ｋ
より、できるだけ少量の培地を含み、注入される原形質
体を取り出した。次にそれらをペトリ皿の蓋の上に醍き
、初めの原形質体培養物上に、−上記の蓋を逆にするこ
とによって層温を形成した。移送ピペットからの培地の
流れが、最後の原形質体が置かれた時、終結されるので
、層温のサイズは、原形質体の数に依存１７た。対照層
温は、くほみスライドからのおよそ同じ数の注入されて
いない原形質体を用いて、同じ方法で、おのおのの実験
のために調製された。次に層温培養物は暗みの中で２３
±２℃で培養された。

解剖顕微鏡下でその小滴を観察することによって、懸濁
培養の増殖をモニターした。マイクロカルスが増殖する
につれて、栄養供給物を補充するために移行ピペットを
用いて培地が添加され又は浸透圧を減少するために完全
に交換された。最初の１〜２週間の培養の間、マイクロ
カルスは、それらがあらかじめ培養された培地中に維持
された。

マイクロカルスが急速に増殖する場合、追加培地をとき
おり添加した。１〜２週間後、０．２ｗｖ１のみのＮＡ
Ａを含む同じ培地と、前記培地を交換した。１〜２週間
ごとに、この培地を、同じ培地〔ただし、低浸透圧（２
０９／ｌのソルビトール、次に５６９／ｌのソルビトー
ル）である〕により交換した。このカルスが、直径約１
．０１１ｒｓに達した場合（普通、培養から１．５〜２
ケ月後）、それらは、同じ培地（０，６％のＧ　１ｂｃ
ｏ　Ｐｈｙｔａｇａｒ）を含む寒天プレートに移された
。

結果 新たに単離されたタバコ　メソフィル原形質体はこわれ
やすくそしてホールディング　ピペット技法で操作する
のに難しい。しかしながら、２〜５日間、原形質体をあ
らかじめ培養することによってその細胞壁を部分的に再
生することが、マイクロインジェクションに生き残るた
めのそれらの回復力及び能力をひじょうに増進せしめる
ということが見出された。スライド調製中、原形質体の
選択は、壁の再生及び核の位置に関して、均一の細胞集
団をもたらす。

偽注入及びＤＮＡ注入実験における原形質体の生存率の
比較が、ＤＮＡ溶液の注入が原形質体の生存率を低下せ
しめ、さらにインジェクション　ピペットの物理的浸入
によって、原形質体の生存率の低下を引き起すかどうか
を示すはずである。

３日後、注入されている細胞の生存率は、一般的に注入
されていない対照の生存率の８０〜９０チであった。注
入されて（八かい細胞と比較する場合、偽注入されてい
る細胞は平均して８２．０９６の生存率（第１表）にな
シ、一方、ＤＮＡを注入されている細胞は、平均して８
９．９％の生存率（第２表）になった。注入されている
細胞及び対照細胞における平均生存率の比較（第１及び
第２表）は、インジェクシヨン　ピペットによる細胞へ
の侵入によって引き起こされる生存率の減少が存在する
ということを示している。しかし外から、この減少率は
１０〜２０チだけである。偽注入（第１嚢）及びＤＮＡ
注入（第２表）実験の平均生存率は、ひじょうに類似し
ている。このことは、ピコリッターの水性ＤＮＡ溶液の
注入は、さらに生存率を減少しないということを示して
いる。

一般的に、原形質体の状態に依存して、１時間につき１
５〜２５細胞を注入することができる。

これは、核への注入が必要とされない場合、容易に２倍
にされる。

層温における原形質体の好結果をもたらす培養のために
は、細胞密度の維持、たとえば正常な原形置体培養の密
度（１０４〜１０６細胞力りが好ましい。適切な密度の
層温の形成は、解剖顕微鏡による観察によって確かめら
れた。０２５〜２０μＩの懸濁中１０〜２００細胞の培
養が、マイクロカルスをもたらした。懸濁において培養
する場合、マイクロインジェクションされている原形質
体は、対照である注入されていない原形質体と同じ方法
において、マイクロカルスを形成するために分裂した。

以下余白 ことに報告されている注入された細胞を培養した結果は
、タバコ原形質体へのインノエクションピペットの侵入
がより低い生存率をもたらすということを示す（第１及
び第２表を参照のこと）。

しかしながら、ピコリッター１の水性ＤＮＡ溶液の注入
は、さらに生存率を減少させない。ただ１０〜２０％の
生存率の減少が、植物についてのマイクロインノエクシ
ョン技法の有用さを大きく制限するように見えない。

ゲノムＤＮＡの組み込みを、次の研究において確立した
。上に記載の方法に従って、タバコ　メソフィル原形質
体の核又は原形質中にシラスミドを注入した。シラスミ
ドｐｃＧＮ５６１（２９，３ｋｂ）が、約１０３コピー
／ｐＬ（ピコリッター）で約１〜２ｐＬ　　挿入された
。プラスミドｐｃＧＮ５６１は、ＲＫ２９０　　中に挿
入されるＨＩｎｄｌｌ１７ラグメント構成物を持つ。こ
の構成物は、次の制限パターン及び機能配列を持つ。

以下余白 シラスミドｐｃＧＮ１６９（６，９ｋｂ）は、約１０〜
１０コピー／ｐＬで約２９Ｌ挿入された。　シラスミド
ｐｃＧＮ１６９Ｖｉ、ｐＵＣ１９中に挿入されるシ便旧
構成物を持つ。この構成物は、次の制限・ヤターン及び
機能配列を持つ。

以１−ｉＴ白 次に注入さｔｌている原形質体が、マイクロカルスに増
殖せしめられそしてそのカルスは、注入さｔｌているＤ
ＮＡフラグメントの存在についてプザン法によってスク
リーンされた。

以下余白 この発明に従えば、新規方法は、植物原形質体の原形質
及び植生への高分子の染色体、核、オルガネラ、及び同
様のもののマイクロインノエクシ函ンを提供する。原形
質体の細胞壁を部分的に再生するのに十分な時間それを
培養することによって、こわれやすい原形質体膜の破壊
を引き起こすことなしにその原形質体を操作することが
できる。

細胞壁が実質的に再生されるまでマイクロインジェクシ
田ンを遅らせることができるが、しかし第１細胞分裂の
前にあらかじめそれを完了すべきであるということが見
出された。この技法を用いるマイクロインジェクション
法は、ひじょうに高められた注入されている原形質体の
生存率をもたらす。

前述の発明は、明確に理解するために例示的及び測的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で修飾及び変更を行うことかで（Ａ９）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、植物原形質体への高分子類のマイクロインジェクシ
   ョン法であって、 あらかじめ選択された植物材料から植物細胞原形質体を
   調製し； 原形質体が次の操作中、損傷に対して耐性になるように
   、原形質体の囲りの細胞壁を部分的に再生するのに十分
   な時間、適切な栄養培地において原形質体を前培養し； このプリカルチャーリングが完結した後、この原形質体
   を固定し；そして この原形質体中に高分子を注入することを含んで成る方
   法。 ２、前記原形質体を固定する前に、少なくとも約１日間
   前培養する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記注入されている原形質体を、注入後、懸滴培養
   において培養する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ４、前記原形質体を、部分的に再生された細胞壁を吸引
   することによって固定する特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 ５、前記高分子類がポリヌクレオチド類である特許請求
   の範囲第１項の方法。 ６、植物原形質体への高分子類のマイクロインジェクシ
   ョン法であって、オリフィスを通しての吸引によって単
   一の原形質体に接触することができるホールディングピ
   ペット、及び原形質体中へ挿入することができ、そして
   原形質体の内部へ高分子類を注入することができるテー
   パー末端を有するインジェクションピペットを使用し、
   ホールディングピペットを用いて、原形質体（これは、
   次の操作中、損傷に対して耐性になるように、原形質体
   の囲りの細胞壁を部分的に再生するのに十分な時間、あ
   らかじめ培養された）を吸引することによっておのおの
   の原形質体を固定し； インジェクションピペットのテーパー末端を部分的に再
   生された細胞壁に侵入せしめ；そして固定された原形質
   体中にインジェクションピペットから高分子類を注入す
   ることを含んで成る方法。 ７、前記原形質体を、固定する前に、少なくとも約１日
   間前培養する特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ８、前記原形質体を、注入に続いて懸滴培養において培
   養する特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ９、前記高分子類がポリヌクレオチド類である特許請求
   の範囲第６項に記載の方法。 １０、植物原形質体中への高分子類の改良されたマイク
   ロインジェクション法であって、細胞壁を部分的再生す
   るのに十分な時間であるが、しかし第１細胞分裂の前で
   適切な栄養培地中において原形質体を培養し、そして部
   分的に再生された細胞壁を吸引することによっておのお
   のの原形質体を固定している間に、それぞれ注入するこ
   とを特徴とする方法。