JP2001507935A - 非接着細胞への巨大分子の微量注入の方法および器機 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は非接着部位に存在する細胞に対する細胞外物質の取り入れの方法に関する。ある具体例では、微量注入針を接着分子又は物質により非接着位に存在する細胞を固定化し使用できるようにする器機、又は、細胞内に核酸のような要望される注入を細胞接着を支援する表面共に使用して可能にする方法である。一般に、非接着細胞は細胞の染色体ＤＮＡｎｉ前記核酸に命令をくだすことのできる有効部位の核酸配列（ＤＮＡ）を微量注入することにより変性させることが可能である。本発明はまた定義された方法にしたがって細胞の修飾の範囲内で、特に幹細胞のような未分化の細胞に、細胞での異常又は欠乏の置換若しくは正常化を有効にする遺伝子又は断片を含んでつくれれる可能性があり、細胞の注射により患者に使用される遺伝子治療の方法を提供する。正常化された核酸は遺伝的に正常化された未分化細胞を発生させ、その後の生理的病気の治療に有効な手段をあたえる。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 非接着細胞への巨大分子の微量注入の方法及び器機発明の分野 本発明は生細胞への物質の分子的輸送の分野、及びこのこと、特に試験管内で 接着状態に存在するようにされることができる細胞への分子状物質の取り入れを 達成するための改良方法に関する。本発明はさらに、細胞に遺伝物質を導入する 方法として与えられるような、遺伝子治療の分野に関する。本発明はまた、本開 示で示される生細胞への分子状物質の微量注入の機械、改良した細胞生育性及び そこにおける取り入れられた物質の保持／発現を伴った細胞への物質導入のため の器機の分野に関する。発明の背景 生細胞への巨大分子（例えば、抗体、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ）の微量注入は分子レ ベルでの細胞生物学の研究における強力な手引であることが証明されている。マ ニュアル式微量注入法は二人微量注入技術の先駆者DiacumakosとGraessmannによ りそれぞれ独自に開発された（Diacumakos,E(1973)；Graessmann,A(1970)）。そ の方法は生細胞にガラス微量注入針を注入ではマイクロマニュピュレーターをを 使用している。微量注入針は針からサンプルを押し出させるシリンジ集合体に接 続される。生細胞へのサンプル溶液の流れは位相差顕微鏡によって典型的に視角 的にモニターされる。この方法において、 位相差の変化はサンプルが細胞内へ注入されたことを示す。この方法では注入を 行う人の高度なトレーニングが必要とされる；注入が十分に使用に耐えられるも のとなるまでのこのトレーニングの期間には数か月かかる。これらのマニュアル 式微量注入法は時間がかかり、最大注入速度は１時間あたり３００〜５００細胞 である。 半自動（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）及び自動（Ｚｅｉｓｓ）微量注入システムはマ イクロマニュピュレーターと注入システムの間に電気的インターフェースが含ま れることが示されている。これらのシステムには技術者のトレーニング及び技能 をほとんど必要としないので、純粋なマニュアル式微量注入法より好まれている 。加えて、それらはより速い速度での細胞の注入（１時間あたり１，０００細胞 以上）が可能である。 微量注入による程度の成功率（８５〜９５％の短期発現、細胞生育、３０％ま での安定的発現細胞）での接着細胞への遺伝物質の取り入れが記載されている。 大きな接着細胞型（例えば、繊維芽細胞）へのマニュアル式微量注入法満足すべ き生存率（８５〜１００％）を生み出すことが報告されている。 微量注入技術は非接着卵細胞（直径１００ミクロン）のプロヌークレイへの巨 大分子の注入がトランスジェニック動物生産のプロトコールの一部に応用され成 功している。これらの技術はまた、人間の非受精の治療の際の細胞質内精子注入 （ＩＣＳＩ）を行う際の卵への精子への注入に使用されてい る。しかしながら、これらの注入に使用される保持ピペット（１０ミクロン）及 び微量注入針（１〜３ミクロン）の両方は微小な細胞（例えば、〜５−１０ミク ロンの直径の造血幹細胞）への注入の使用には大きすぎる。 小さな通常の非接着細胞（例えば一次造血細胞）マニュアル式微量注入は、一 般に微量注入された細胞は小さなな数字の生存のパーセントしか示さない。例え ば、Graessmannら（PNAS 77:433-436,1980）ではラジヒトＢ細胞系は抗リンパ球 ＩｇＧ、植物性結球凝集素（ＰＨＡ）、又はコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）で 表面を覆われた組織培養プレートに接着することができたが、その小さな大きさ と弱さのため、その細胞系はＤＮＡの有効な微量注入ができなかった。微量注入 は細胞融合により大きなポリカリオンが形成された場合のみに可能であった。 Diacumakosら（Exp.Cell Res.1981,131,73-77）はガラスカバースリップに対 するマウスリスロロイコーマ（ＭＥＬ）細胞の接着の方法について述べている。 このことは、最初にコラーゲンによりカバースリップをコーティングし、続いて カバースリップをコンカナバリンＡ及び１−シクロヘキシル−３−（２−モルフ ォリノエチル）カルボ−ジイミジンｐ−トルエン−スルフォネートメチルエステ ルで順次コーティングすることによって達成された。この手法を使用した、ＭＥ Ｌ細胞への化学薬品の微量注入が報告された。Ｃｏｎ Ａは多様な方式で細胞に 影響を与えることができる（例えば、通 常のリンパ球において低用量で芽の形質転換及び核分裂を誘発する；高用量でリ ンパ球と増殖したリンパ性細胞の両方の成長を阻害する（McC1ain and Edelman ，1976）；マイトティックＨｅＬａ細胞のＣｏｎ Ａ処理カバースリップの植え 付けは細胞周期のＳ期の移行を遅らせる（Brownら，1985））ので、幹／プロジ ェニター細胞への影響を評価しなければならない。 M.Graessmann及びA.Graessmann（Microinjecton and Organella Transplantat ion Techniquues,Academic Press Incorporated,London,1986において）ガラス 微小管を使用した一般的な微量注入手順について記載した（Methodes in Enzymo logy;101:48）。これらのガラス微小管は約０．５ミクロンの外径をもつことが 記載されている。接着状態で成長しない典型的な細胞型である、フレンド白血病 細胞への付着がコンカナバリンＡ及びグルタラルデハイドのようなリンカー分子 を使用することにより達成された。この方法を使用した、プラスチックペトリ皿 への付着が報告されている。 Y．Moriら（ヨーロッパ特許出願ＥＰ０４６３５０８Ａ１は温度応答性重合体 化合物及びプラスチック及びガラスプレートに標的細胞を固定化するための細胞 接着物を使用した細胞内への物質の注入方法について述べている。チップでの直 径が１から２ミクロンのミクロキャピラリーピッペットが使用される。細胞接着 物質には以下の分子が含まれる：ゲラチン、レクチン、架橋オリゴペプチド、接 着タンパク質、正の 荷電重合体、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、グ リコサミノグリカン及びトロンボスポンジン。 造血細胞への微量注入が非常に困難であることには二つの根本的な理由があり 、一次細胞（定義：試験管外環境（例えばヒト、マウス、その他の体内）から試 験管内培養にいからる形質転換作用なしに直接転移できる細胞）及び形質転換細 胞（定義：試験管外（例えば、細胞が白血病である）又は試験管内のいずれかで 起こるさらなる細胞分裂形質転換作用に対する未制限の潜在力をもつ細胞）の両 方が：（１）付着細胞の生物的特性に有意な影響を与えない方法での造血細胞の 固定には非常な困難性がある。例えば、ＰＨＡ、Ｃｏｎ Ａ又はアメリカヤマゴ ボウマイトジェンようなレクチンを使った造血細胞の付着は記載されてはいるが 、上で記載のように、これらの試薬は造血細胞に影響を与えるマイトジェン、い くつかの場合は抑制物として広く知られている。したがって、この固定化細胞は おそらく固定化手段によって生物学的に修飾されいる。（２）造血細胞、特に一 次造血幹細胞（直径５〜７ミクロン）の小さなサイズのためそれらに対する注入 を非常に困難にさせる。市販のもので存在する微量注入針の典型的なものは内径 が約０．５ミクロンで、さらに外径が０．７〜１．０ミクロンの範囲にあるので 、このような針の注入で血液細胞に逆に好作用を及ぼすことは期待できない。外 径が０．１〜０．３ミクロンの微量注入針についていくつかの 報告がなされてきている。 非周期進行血液幹細胞への子孫細胞における長期の発現を許容する遺伝子の輸 送は引き続き遺伝子治療手段における主要な技術的挑戦である。電気穿孔法、リ ポソーム、レトロウイルス、及びアデノ会合ウイルスを含む非常に多くの方法が 記載されてきているが、これらは大きなスケールで型式のきまった巨大及び微小 分子の生細胞への転移を阻害する制限が存在し続けている。電気穿孔法及びリポ ソーム媒介配送の両方ともに細胞の重要な機能についての導入された遺伝子の安 定的な維持が確立できないことにより阻害を受けている、一方、組換えＣタイプ レトロウイルスベクタ−及びアデノ会合ウイルスベクアターは非周期進行細胞へ の形質導入及び長期細胞型特異的遺伝子発現の維持の両方に効果がない。 周期進行ヒト前駆細胞及び長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣＳ）のレトロ媒介 遺伝的修飾がいくつか報告されている。これらの造血幹細胞は報告によれば試験 管内である限定期間（報告では約２から６か月）造血を維持することができる。 遺伝子治療の長期間の有利さのため、この技術は未修飾（形質導入）子孫の未修 飾幹細胞と比較的迅速に置換した修飾前駆細胞由来の子孫細胞のような修飾幹細 胞集団による患者に対して繰り返した治療が必要に思われる。 薬剤耐性遺伝子（例えば、ビンクリスチン、タクソール及びドキソルビシンの ようないくつかの化学療法剤から細胞を保護するヒト多薬剤耐性１遺伝子、ＭＤ Ｒ−１）の髄又は末 梢血液ＣＤ３４+細胞へのレトロウイルス媒介形質導入を含む臨床上の実験が報 告されてきている。ＣＤ３４+抗体はすべての現在試験可能なヒト血液幹細胞及 び前駆細胞に標識する。しかしながら、レトロウイルス（Ｃタイプ）ベクター媒 介形質導入には形質導入を効果あるものにするために細胞が細胞周期を進行して いることを必要とする。処理されるある割合の細胞集団を典型的に構成している 静止、すはわち周期進行していない血液幹細胞は効果的な形質導入ができない。 したがって、レトロウイルス媒介遺伝子転移は幹細胞への転移のためとしては厳 密な意味で効果的な技術ではない。人体実験で移植に対してＣＤ３４+細胞を処 理するこの技術を使用した比較的低頻度（０．１〜１．０％）の遺伝子を標識し た末梢白血球の報告がある。ほかの研究では使用したレトロウイルス形質導入プ ロトコールがヒト再構成活性を失わせることが報告されている。 レトロウイルス導入転移遺伝子の発現が形質導入されたヒト又は霊長類前駆細 胞及び形質導入されたマウス幹／前駆細胞の子孫においてもかなりの頻度で抑え るられる（Challita and Kohn，1994：Akkinaら，1994：Luら，1994）。その結 果、レトロウイルスにより薬剤耐性遺伝子を持つように遺伝的に修飾された造血 幹細胞は薬剤耐性表現型を効力あるものとして示すさない可能性がある。この問 題点は、レトロウイルスベクター（最大８ｋｂ）でも重要だが、アデノ会合ウイ ルス（ＡＡＶ）ベクター（最大４ｋｂ）に対してより緊急の 課題である。 針は外部物質を非接着細胞に導入、特に微量注入法を使用した導入の改良法及 び生理学的病気に対する治療にこれらの方法を使用する際の医学的技術課題とし て存在し続けている。 β1インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）はフィブロネクチン、ラミニン、コラ ーゲン、エピリグリン、インバシン及び血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１； Stuiver & O=Toole Stem Cell13:250-262,October1995）のような特別なリガン ドと認識する細胞接着受容体のインテグリン遺伝子群に属している。β1インテ グリンは細胞−細胞及び細胞細胞外マトリックス相互作用を媒介する（Stuiver & O=Toole,1995）。インテグリンのβサブユニットはリガンド結合及び細胞内シ グナル形質導入の両方に貢献している。β1（α4β1、α5β1及びα6β1）、β2 （α1β2及びαMβ2）及びβ3亜科α Bβ3）由来のいくつかのインテグリンのリ ガンド結合親和性は多種のステムリ（ｓｔｉｍｕｌｉ）よって調節されることが できる（Schwartz,M.A.,Schaller,M.D.,Ginsberg,M.H.(1995)Annu．Rev．Cell D ev．Biol.11:548-599（インテグリン：シグナル形質導入の明らかになる範例） ）順に、インテグリンは別の細胞性機能にもまた影響を与えることができる。例 えば、β1サブユニットに対するモノクローナル抗体はＴ細胞増殖に対して負の シグナル効果誘導する（Schwartzら、1995）。 多くのタイプの細胞が細胞外マトリックス分子及び他の細 胞を含む多くの基質に細胞を接着させることに使用されるインテグリン族の細胞 表面分子を発現する。特定の基質と接着するインテグリンの発現する細胞の活性 化についてのいくつかの方法が報告されている。これらの方法には細胞と抗イン テグリン抗体、サイトカイン、細胞外マトリックスタンパク質（例えば、フィブ ロネクチン）及びペプチド又は断片、さらには脂質、２価陽イオン、及びボルボ ールエステルとのインキュベーションを含む。 多種の一次及び形質転換細胞系はインテグリン活性化抗体によって表面に固定 化されることが報告されている。一次細胞にはＰＨＡ刺激末梢血液Ｔ細胞芽（Wa yner and Kovak,1992）及び静止末梢血液リンパ球が含まれている（Arroyoら） 。固定化されたと報告された形質転換細胞系にはＫ５６２（ヒト赤白血病；Kova chら、1992）、Ｕ９７３（骨髄単球；Wayner and Kovak）、MO７ｅ（Levesque） 、ＴＦ１（ヒト赤白血病；Levesque）、Ａ３７３（メラノーマ細胞；Arroyoら） 、Ｊｕｒｋａｔ（ヒトＴリンパ球芽；Wayner and Kovak,1992）、Ｒａｍｏｓ（ ヒトＢリンパ球芽；Wayner and Kovak,1992）、及びＳＴ−１（ヒトＢリンパ球 芽；Wayner and Kovak,1992）が含まれている。 いくつかの研究では抗インテグリン抗体及びペプチドのような他の試薬が細胞 の接着できるようになり、従って基質に対して接着するように活性化することが 報告されているが、そこには造血幹細胞のような接着状態で成長しない細胞の微 量注入のこの技術は使用されていない。この技術は、ほかのものと比較しても、 造血幹細胞でもっとも顕著であるが、接着状態で成長しない重要なタイプの細胞 への微量注入の使用をさまたげる。造血幹細胞を固定化する細胞表面インテグリ ンの使用はこの困難に打ち勝ち、これらの細胞に微量注入することを可能にする であろう。発明の開示 一つの観点では、本発明は遺伝物質、タンパク質、ペプチド、及び免疫グロブ リンをふくむ巨大及び微小分子を生細胞に対して効果的な導入を十分容易にする ために表面に非接着細胞を固定化する改良法を提供する。本発明は表面に非接着 細胞固定化するためにを使用することができる多くの種類の固定化技術を意図し ている。本発明においては、非接着細胞とは以下のように定義される。１）試験 管内で懸濁培養において定規的に維持される細胞。２）培養において接着状態で 定規的に維持されるが、意識的に分離され実験又は操作の目的で一定の期間件懸 濁液で培養させられる細胞。 ある具体例では、この方法はインテグリンのような表面に対する細胞表面発現 接着分子を保有した非接着細胞の接着が含まれている（図１Ａ及び１Ｂ）。本方 法には次の事が含まれる：前記表面の接着分子による処理、及びインテグリン又 はＣＤ４４のような細胞表面発現接着分子を保有した前記非接着細胞に対する、 細胞表面発現接着分子を接着分子による処理された表面への結合を活性化する抗 体のような活性化分 子による処理。この方法はほかの非接着細胞にも微量注入法を行うために十分有 効な物質表面に接着をもらす（図１Ｂ）。 ある具体例では、非接着細胞は活性化抗体の使用無しで接着分子を含んだ表面 に接着することもできる（図１Ｃ）。このことは細胞タイプと接着物の選択に依 存する。本発明は、特別の観点においては、物質（例えばフィブロネクチン又は プロテアーゼ消化、組換え発現（例えば、レトロネクチン；ＣＨ−２９６）又は 合成ペプチドのいずれかで一部誘導されたフィブロネクチン分子）に対して細胞 表面発現接着分子に対する付加的なステムリなしに固定化する方法、すなわち先 行した活性化作業無しに微量注入を有効にさせることが可能なあるタイプの細胞 の、フィブロネクチンペプチド／断片への接着（例えば、Ｕ９３７、ＨＵＴ−７ ８細胞、造血幹細胞／前駆細胞）の方法の提供である。あるタイプの細胞（例え ば、造血幹細胞／前駆細胞）はフィブロネクチンのカルボキシル末端と微量注入 に十分耐えうる力で接着する。 実施例として含まれる接着分子の実施例は排除されない：フィブロネクチン、 コラーゲン、ラミニン、エピリグリン、インバシン、オステスポンジン、トロン ボスポンジン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ＩＣＡＭ及びＶＣＡ Ｍ−１、並びにそれにつてプロテアーゼ消化又は組換え発現で誘導された断片； 合成ペプチド（化学修飾あり、又はなし）、またはそれについてのオリゴ糖断片 。これらは、前記タンパク質及びペプチド又はそれについての断片は線状と環状 の 両方の断片を含んでいるとも予測される。 別の観点では、本発明は非接着細胞中への物質の輸送方法を提供する。具体的 には、方法は次の事が含まれる：接着表面の非接着細胞の固定化、及び微量注入 針を通した前記固定化非接着細胞への前記外部物質を含んだ溶液の微量注入（図 １２Ｂ）。微量注入針は約０．０５から約１ミクロン、または約０．０５から約 ０．５ミクロン範囲の外径をもつものとして今後記載されるであろう。 別の具体例では、表面に対する非接着細胞の固定化の方法は次のことを含んで いる：末端部分の内部穴の直径が約０．５から約２．５ミクロンの保持ピッペト による非接着細胞の固定化；及び保持ピッペトと一体化したシリンジを真空状態 にして、手動（例えば、EppendorfまたはZandler）又は動力装置（例えば、Worl d Precision Instrument）により、前記保持ピッペトの前記末端部分がが前記非 接着細胞に非常に接近するまで前記保持ピッペトに操作する（図１２Ａ）。ある 具体例では、保持ピッペトはデフォンブルン（ＤｅＦｏｎｂｒｕｎｅ）微小炉を 使用して作製することができる。ピッペト作製の方法にしたがって、吸い口に組 み合わされたつかみに適合させるためにガラス微小管に、熱したフィラメントの 内部に位置する微小管から１〜５グラムの重量を吊すことができる適切な曲げを 作る。このような保持ピッペトを作製する場合、デフォンブルン微小炉には制限 されない。例えば、存在するすべての市販の針プラー（Sntter Instrument,Nari sige,Kopf）が本発明の一部としてここに記載されたようなピッペトを供給する 微小管を引っ張ることに使用できる。本発明の最高の具体例は、チップは微小炉 （デフォンブルン又はナリシゲ）により熱で磨きがかけられるべきである。 本発明の微量注入法は修飾された非接着細胞、特に生細胞又は生物学的機能の 損失なしに要望した分子含む造血幹細胞の集団の提供を導く。遺伝子治療のため の微量注入法を成功させるために必要そされる細胞数は約１５０から５，０００ の幹細胞と見積もられる。 本発明はまたレトロウイルス及びＡＡＶベクターによる輸送よる同様な輸送よ り効果的な、一次コード血液幹細胞の核に直接転移遺伝子又はインテグリンタン パク質のような付属タンパク質をともなった転移遺伝子の微量注入媒介輸送につ いて考慮する（図８）。調節要素及びイントロン／エクソン構造を含有するＤＮ Ａのような大領域のＤＮＡが微量注入法による輸送可能な状態にさせることを考 慮する。このようなことは形質導入された幹細胞の子孫で頻繁に観察される異常 調節発現及び沈黙も回避するであろう。 本発明はまた転移遺伝子又は付属タンパク質をともなった転移遺伝子の輸送の 他の方法についても考慮する。例えば、イオントフォレシス、粒子衝撃、電気穿 孔、陽イオンリポソーム媒介トランスフェクション、ペプチド媒介遺伝子輸送（ 例えば、ポリリシン）、レセプター媒介エンドサイトーシス、赤血球媒介トラン スフェクション、低張膨張、マイクロ プリッキング、及び細胞周辺培地への直接的な核の添加である。 別の観点では、本発明は生理学的病気の治療に用いられる遺伝子治療方法の提 供する（図５、６及び７）。実施例としは、このような生理学的な病気にはサラ シミア及びガンが含まれる。 発明の別の観点は非接着細胞内に外部物質を輸送するために特別に設定された 装置を供給する。ある具体例では、装置には外径が約０．０５から約０．５ミク ロンの範囲の微量注入針が含まれる。 ある具体例では、斜めに切られたチップを持つ外径が約０．０５から約０．５ ミクロンの範囲の微量注入針が含まれる。内部開口の寸法は本発明の具体例で針 の作製で使用されるガラス微小管の壁厚の収容に適応するものが使用できる。特 に、針は針が細胞注入法で使用されるときにプラスチック物質と接触している時 に簡単に分離することのないために十分な厚さの壁を持つチップを持つ針を結果 的に生じさせる注入針の作製に使用される場合の十分な壁厚を持つガラス微小管 を使用して作製されるであろう。 本発明で提供される注入針の具体例では、ガラス微小管はプラスチックよりも より軟弱な物質と接触している時に簡単に分離することのないこのような十分な 厚さ持つこのような針チップには十分な壁厚を持つ。針チップは今後粘着性のな い化合物（例えば、シリコン）で覆われるものとして定義さ れるだろう。 これらの具体例では細胞内化合物を張り付かせず、従って微量注入を通じて細 胞に被害を与える機会を減少させる針を供給す。他の具体例の針は外部と内部の 両方を非粘着物質（例えば、シリコン）覆われているであろう。これらの針は、 特にこれらの針が非常に小さい外径（０．０５〜０．５ミクロン）の場合特に針 から粘性、濃縮した、又は粘着性巨大分子の運搬に有効であろう。 さらに別の観点では、本発明は化学療法から血液幹細胞及びそれらの子孫の保 護する方法を提供する。例として、これらの細胞はアリキルカ剤、アンスラサイ クリン、ビンカアルカロイド、エトポサイド、タクソール及び類似物又はそれら の複合物のような化学療法剤に対してそれらが耐性を獲得するような処理がなさ れる。化学療法から血液幹細胞及びそれらの子孫の保護は前記細胞に対するＭＧ ＭＴ遺伝子及び／又はＭＤＲ−１遺伝子のような多薬剤耐性遺伝子を微量注入に より供給され、これらの修飾された細胞は患者に与えられる。ＭＧＭＴ遺伝子は 分離され、参考文献により、ここで教えられ、効果的に理解される文献に記載さ れている（Wangら、1996；Moritzら1995；Preussら1996）。ＭＤＲ−１遺伝子も また文献、参考文献によりここで効果的に理解されI.Roninsonらに記載されてい る（Kocら、1996）。内部に誘導された核酸物質をもつ修飾ヒト血液幹細胞を豊 富に含んだ細胞集団が含まれる調製もた本発明の別の観点が含まれる。 固定化及び非接着細胞への外部物質の微量注入に有用な道具もまた提供される 。いくつかの具体例でこれらの道具は以下のものが含まれる：２つ以上の容器手 段を含むように調整された運搬手段；容器手段には外径が約０．０５から約１ミ クロンの範囲の微量注入針が含まれる、及び運搬手段にはこれらの特徴をすべて 持った微量注入針が含まれる。道具には固定化表面（未コート及び接着物質コー トの両方が使用できる）、微量注入針、及び任意にクローニングリングを含むこ とができる。必要な場合には、細胞接着の活性化剤（例えば、細胞表面インテグ リンを活性化する抗体）が分離した容器に提供されることができる。前記道具に は微量注入後接着物質から細胞の分離に使用させる試薬（例えば２価陽イオン、 ペプチド、その他）また含んでもよい。 以前の技術により公表されているこれら技術と対照的に、本発明の方法及び器 具の適用ではつぎのことを行うことを理解すべきである、（１）多くの種類の一 次又は形質転換非接着細胞への微量注入を容易にする；及び（２）細胞の生物学 的活性（例えば、試験管内での遺伝的に修飾された造血幹細胞の再構築）に対す る逆効果がほとんどない状態での固定化、微量注入、微量注入された細胞の回収 を可能にする；及び（３）時間当たりのより多くの細胞の注入を可能にする半自 動又は自動微量注入装置による接着細胞の注入を可能にする。 別の観点では、本発明は細胞表面発現インテグリンを持つ非接着細胞内部へ外 部物質の微量注入のための道具を供給し、 この道具は以下のものが含まれる：接着物質で覆われた固定化表面、及び抗イン テグリンモノクローナル抗体（又は、他の同等のインテグリン活性）及び外径が 約０．１から約０．１５ミクロンの範囲の微量注入針。この道具の他の具体例は ここで記載のとおりに、他の外径及び内径を持つ、又は多種の大きさが組合わさ れた微量注入針含んでいる。 ここで記載されている方法及び器機は遺伝子治療及び体細胞治療の手段として ヒト細胞への外部物質の転移に有用であることが予測される。 したがって、本発明のひとつの観点によれば、目的の治療薬剤をコードするＤ ＮＡにより遺伝子工学処理された造血幹細胞、またはもっと一般的な非接着細胞 を含む構成物を提供する。この遺伝子工学処理された細胞は次に治療薬剤として 使用される。 それに沿って、本発明はまた以下の事項が含まれる遺伝子治療に反応性の生理 学的病気に対する治療のための遺伝子治療方法を提供する：遺伝的に修飾された ヒト造血幹細胞が豊富な構成物を注射により患者に与え、幹細胞は微量注入によ り運搬された遺伝物質を含んでいる（図７）。少なくとも約１５０から約５，０ ００の生きた潜在的に短期的な造血幹細胞再構成のために十分な数の遺伝的修飾 された、又は未修飾造血幹前駆細胞により補足された、遺伝的修飾細胞含んだ細 胞の構成物が目的とする病気の処置及び又は治療を提供する。 本発明の別の観点に従うと、コードされている生体内産物を発現する細胞と共 に、標識又は治療薬剤をコードするＤＮＡを含むように微量注入により遺伝子工 学処理された造血幹細胞が提供される。この特別な具体例では、ＤＮＡは細胞の 遺伝的欠如を治し、及び発現産物は細胞から分泌されないもの（例えば、ヘモグ ロビン）か分泌されるもの（例えば、ファクターVIII）のいずれかである。 本発明はまた造血幹細胞（ｈＳＣｓ）の治療効果を増加させる方法を導く。 別の具体例では、患者は、生体内で治療剤を発現することができるような治療 剤をコードするＤＮＡで遺伝子工学処理されたｈＳＣｓを与えられる。上記に述 べたように、これらの遺伝子工学処理細胞はｈＳＣｓ微量注入による生体外での 遺伝子工学処理されたｈＳＣｓを患者に与えることで提供される。 本発明のさらに別の観点によれば、以下の物が含まれる構成物が提供される（ ｉ）治療剤をコードするＤＮＡで遺伝子工学処理されたｈＳＣｓ及び（ii）患者 への投与に適した薬学的に許容される輸送体。 図面の簡単な説明 図１Ａ及び図１Ｂ。図１Ａは多様な非接着細胞の表面に存在するインテグリン を活性化する潜在的な機構を示している。図１Ａでは、ＣＤ３４⁺幹／前駆細胞 は表面のα₅β₁と同じようなα₄β₁の両方の表現で示される。接着分子はここで の 例でフィブロネクチンが使われている。α₄β₁はＬＤＶ含有ペプチド配列と結合 し、一方α₅β₁はＲＤＧ含有ペプチド配列と結合することを示している。フィブ ロネクチンのような物質に接着する場合に「丸型」の懸濁形態を示す細胞は、一 般に弱い結合形で接着する。細胞の物質に対する結合は微量注入針により容易に 離れさせられるため高速方法を採用する細胞の微量注入に対しては有効ではない 。ここで列挙されたものを含む様々な機構によるインテグリンの活性化は、リガ ンドに対する低い親和性状態から高い親和性状態（図１Ａ）にインテグリンを変 更することによりフィブロネクチンに対する非常に強力な接着、及び細胞の伸展 を導く。より強力な親和力で結合する細胞は半自動及び自動微量注入法に耐える 。図１Ｂはある場合の、接着表面上の細胞の接着及び伸展が、細胞接着の以前、 または同時の活性化剤添加なしに起こることができることを示す。図１Ｃはフィ ブロネクチンのカルボキシル末端断片（ＲＤＶ及びＬＤＶ認識部位を含む）対す るいかなる活性化剤の不在下での細胞の接着及び伸展能力を示す（Kimizukaら、 1991）。 図２Ａ及び２Ｂ。表面に固定化された細胞が固定化表面から放出する方法。フ ィブロネクチンにより固定化された細胞（図２Ａ）はペプチドによる競合、カル シウムによるインテグリン媒介接着の阻害、キレート化、トリプシン処理、又は ピッペトによる撹拌を含む多様な方法で放出できる可能性がある。細胞は結局は それらが伸展、接着形態を失った時点で 非接着状態に回復させることができ、より球形の非接着形状に戻る（図２Ｂ）。 図３は活性化されたインテグリン／フィブロネクチンによって固定化されてい るＣＤ３４⁺細胞によるミエロイド及びエリスロイドの両方のコロニー形成活性 の保持能力を示す（前方斜線バー）。ＣＤ３４⁺細胞を固定化されたコンカバリ ンＡによるコロニー形成活性もまた示されている（後方斜線バー）。左側に示さ れるものはエリスロイドバースト（ＢＦＵ−Ｅ）コロニー形成である。両方の接 着方法はコントロールの非接着細胞のそれと有意な差異を示さなかった（白バー ）。ミエロイド（ＣＦＵ−ＧＭ）コロニー形成はコントロールと比較してインテ グリン／フィブロネクチン固定化細胞に対するコロニー形成において有意な減少 を示さない。対して、コンカバリンＡ固定化を伴った場合、ミエロイドコロニー 形成はコントロールに対して約５０％しかなかった。小標準偏差はこのことがコ ントロール及びインテグリン／フィブロネクチンサンプルの両方に対して有意差 となっていいることを示している。 図４は蛍光細胞の数の時間推移を微量注入細胞に対するパーセンテージで示し ている。ＣＤ３４⁺細胞（−■−及び−▼−）又はＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／Ｔｈ ｙ−１^lo細胞（−■−及び−▼−）は実施例で概略が説明されるインテグリン／ フィブロネクチン法で接着している。細胞は０．２ミクロン０．Ｄ．チップ及び 分子量１５０，０００のＦＩＴＣ−デキ ストランを持つ針で注入された。一時間未満の点では注入後直ちに蛍光細胞を生 じさせる成功した注入の割合の査定を示している。これらのサンプルは細胞注入 後４時間、２４時間、４８時間以上の多くの時間まで引き続いて査定が行うわれ 、蛍光細胞の数は成功した全注入細胞数に対するのパーセンテージで示されてい る。この数が減少は次のことを反映している：（１）連続した蛍光顕微鏡による 蛍光の低下；（２）微量注入に伴う傷害による細胞の死亡；及び／又は造血幹／ 前駆細胞に対するＦＩＴＣ−デキストラン毒性の可能性。それぞれの細胞タイプ で２つの典型的な研究結果が示されている。 図５は多能性幹細胞から引き続くすべての造血幹細胞系に対するの複数の系統 図を示す。造血幹／前駆細胞に含まれるＣＤ３４⁺細胞はコード血液又は骨髄の 全単核細胞の０．１から１％を構成する。多能性幹細胞を記載するのに使用され ていた表現型もまた示されている。これらはＣＤ３４⁺、ＣＤ３８^-、ＣＤ４５Ｒ ａ−／^lo、ＣＤ７１−／^loＴｈｙ−１^loのすべての測定可能なヒトである細胞で 、それらの頻度の概算が単核細胞に対するパーセンテージで示されている。 図６は模式図により、染色体ＤＮＡおいて欠陥遺伝子、欠損又は突然変異を持 つ個体の完全な造血幹細胞系を示している（＊は染色体ＤＮＡ配列における突然 変異）。 図７は患者への遺伝的に修飾された幹細胞の導入の概略を示している（＊＝染 色体ＤＮＡ配列における突然変異；■＝ 訂正遺伝子）。もし訂正ＤＮＡが多能性幹細胞に入れ及び導入されたＤＮＡが成 長する事ができる造血組織ような子孫細胞に保持されれば、遺伝的に訂正された 細胞には完全な造血系統が含まれるであろう（すなわち、突然変異のすべての一 族及び段階）。 図８は微量注入法の利点を示している−それは、同一細胞内でのタンパク質（ 丸）と一緒に存在する共運搬ＤＮＡ（長方形）に対する能力である。この実施例 では、タンパク質は染色体ＤＮＡへＤＮＡ配列の融合を容易するものが選択され た。ここで示される実施例では配列及びタンパク質がマウス白血病ウイルス（レ トロウイルス）又はアデノ会合ウイスルのいずれかから選択される。 図９は染色体ＤＮＡで遺伝子欠陥（＊）の訂正を意図するＤＮＡ配列を示し、 この場合には相同組み換えにおいて活性のあるタンパク質（丸）が訂正ＤＮＡ配 列を共に注入されることを提案する。欠損又は突然変異配列を微量注入を通じて 供給された訂正複製物により置換するための目的は、最終的に以前に欠陥のある 対立遺伝子を修正する細胞を生じさせる。 図１０Ａ及び図１０Ｂは抗体が不在の状態（すなわち、単純な培地、図１０Ａ ）及びインテグリン抗体を活性化する抗β₁、ＴＳ２／１６．２．１（図１０Ｂ ）の存在下でフィブロネクチンに接着を通じてフィブロネクチン上の位置さたＣ Ｄ３４⁺幹前駆細胞を示す。図１０Ａで見られるように、抗 体が不在の状態で接着した細胞はゆるしかつながれない。それらは球状の形態を 維持し、細胞の外表面の屈折性質は表面に面で接着するのではなく、むしろ一点 で単につながれることを示している。このことはインテグリン接着細胞の非常な 平らな形状と対比させられる（図１０Ｂ）。これらの細胞は表面に強く結合し、 頻繁に細胞から生じる台を持ち、及び非固定化又はつながれた細胞に比較して高 度に広がっている。 図１１は０．１ミクロンフィルターによるろ過の前後のいずれかのＨｉｎｄｍ ／ＥｃｏＲＩで消化されたラムダ野生型ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動のエチ ジウムブロミド染色結果を示す。少なくとも長さで２１ｋｂまでの大きさの物質 の損失の証拠はない。すべての断片（２１ｋｂ断片を含む）は０．１ミクロンの 大きさのフィルターの穴を問題なく通過するので；このことは長さが２１ｋｂ以 下の線状断片は約０．１ミクロン以上の注入針を問題なく通過することを強力に 示す。 図１２Ａ及び図１２Ｂは微量注入手段。図１２Ａは細胞を安定させる保持ピッ ペトを使用する注入技術を示している。保持ピッペトにより安定させれば、（真 空吸入により）細胞は微量注入針により注入されることができる。微量注入針は ０．１２μの標記の針で示されている。保持ピッペトは２−４μで標記で示され る（これらの直径（すなわち、０．１２μ、２−４μ）実施例の目的のために選 択された）。図１２Ｂは接着分子により培養皿の表面を処理することにより固定 化された細胞の微量注入のための注入技術を示している。この明細書で記載され た方法により接着された細胞は微量注入法に耐える。 図１３−市販のものとして存在する１ｍｇのｍＡＢ ＴＳ２／１６．２．１／ ｍで処理されているフィブロネクチンコート皿でのＵ９３７細胞の接着／分離／ 伸展（−■−＝接着細胞；−◆−＝微小偽台状、突起又は伸展の細胞；−●−＝ ゆるい接着状態細胞）。 図１４−市販のものとして存在するフィブロネクチンコート皿への接着後のＵ ９３７細胞の増殖（−■−＝１ｍｇのｍＡＢ ＴＳ２／１６．２．１／ｍｌで処 理さたれたＵ９３７細胞；−◆−＝未処理Ｕ９３７細胞）ｍＡＢ ＴＳ２／１６ ．２．１／ｍで処理さたれた生存可能Ｕ９３７細胞は９６．４％；未処理Ｕ９３ ７細胞は９５．８％。 図１５−市販のＴＳ２／１６．２．１／ｍ ｍＡＢで処理されているフィブロ ネクチンコート皿のコード血液から分離されたＣＤ３４⁺細胞の接着及び伸展（ −■−＝接着細胞；−◆−＝微小偽台状、突起又は伸展の細胞；−●−＝ゆるい 接着状態細胞）。 図１６−１ｍｇのｍＡＢ ＴＳ２／１６．２．１／ｍｌの存在又は不在下でコ ード血液から分離されたＣＤ３４⁺細胞増殖及び生存性（−■−＝ｍＡＢ存在下 ；−◆−＝コントロールのＩｇＧ ｍＡｂ存在下）。ｍＡＢ ＴＳ２／１６．２ ．１処理さたれたＣＤ３４⁺細胞＝−●−；未処理＝−▲−。 図１７−１ｍＡＢ ＴＳ２／１６．２．１／ｍｌの存在（−■−及び−○−） 又は不在下（−◇−及び−▲−）でレトロネクチン（−〇−及び−▲−）に対し てのフィブロネクチン（−■−及び−◇−）へのＣＤ３４⁺細胞の接着。 図１８−クオート／ホウ素ケイ酸塩針によるＵ９３７細胞。クオート／ホウ素 ケイ酸塩針による注入の２時間、２４時間、及び４８時間後のＵ９３７細胞の生 存パーセント（線影バー＝クオート、白バー＝ホウ素ケイ酸塩）。 図１９−クオート／ホウ素ケイ酸塩針によるＣＤ３４⁺７細胞。注入の２時間 、２４時間、及び４８時間後の生存パーセント（線影バー＝クオート、白バー＝ ホウ素ケイ酸塩）。 図２０−バージョン１．ＯＢのホウ素ケイ酸塩針の大きさ分布データ。ホウ素 ケイ酸塩針外径（ミクロン単位）に対する頻度。 図２１−バージョン１．０Ｑのクオート針の大きさ分布データ。クオート針外 径（ミクロン単位）に対する頻度。 図２２Ａ、図２２Ｂ及び２２Ｂ’−図２２Ａ−シリコン処理された針を組み込 みを示すフローチャート。シリコン処理された針の筒の中にサンプルを運ぶため の圧力装置を使用する。図２２Ｂ及びＢ’−エアー及び他のガス泡はサンプルの 積載後シリコンチップから放出される。このことは、サンプル積載針のチップに ガラス、又は同様な素材のフィラメントを使用することで達成された。 図２３−グリッド細胞皿。エストラマースタンプ又はマニ フォールド器機は接着物質から定義された島状の部分を希望する特別な方向に、 一回分の注入に適した数の細胞を放すことに使用される。実施例では、あらかじ め決められた特別な方向に接着物から定義された島状の部分は約１，０００個の 細胞が適している。それぞれの細胞は約１０から約２０ミクロンごとに配置され る。その例では、スタンプは１ｍｍ×１ｍｍ直径の円形である。それぞれの１ｍ ｍの島の細胞に注入された針と共に、１個以上の針が細胞から細胞を除去するた めに遠心分離される。ある具体例では、接着物質により覆われた幾何学的な表面 部分は細胞機能（例えば、増殖、分化、細胞産物の分泌）を調節するために細胞 の拡散の制限することを調節することができる。 図２４Ａ−２４Ｂ−注入マニフォールド。一つの具体例のマニフォールド上面 図を示している。注入針１はマニフォールド２から伸びている。針の数及び針の 空間配置は使用者の要望する配置に従って変更でき、使用される締めた細胞皿の グリッド配置形式に一致するような針注入の図表を提供する。図２４Ｂは注入マ ニフォールド側面図を示している。挿入３はマニフォールド２に連結している。 針１の１又は多針配置はマニフォールド２から伸びている。 図２５−微量注入組み立てユニット。針１は組織培養皿５に接触するように位 置にする。金属フィラメント２は、逆側に音響システム３連結した抵抗カモニタ ー４と連結する。 図２６−それぞれバージョン１．０及びＢバージョン１． ０Ｑのホウ素ケイ酸塩（斜線バー）又はクオート針（斑点バー）を使用したＵ９ ３７細胞の生存性。 図２７−それぞれバージョン１．ＯＢ及びバージョン１．０Ｑのホウ素ケイ酸 塩（斜線バー）又はクオート針（斑点バー）を使用したＣＤ３４⁺細胞の生存性 。 図２８Ａ及び図２８Ｂ−バージョン１．０Ｂホウ素ケイ酸塩注入針の走査電子 顕微鏡写真Ａ。図２８Ｂ。バージョン１．０Ｑクオート注入針。 発明を実施するための最良の形態 微量注入法は具体例で非接着細胞及び外径が約０．０５ミクロンから０．５ミ クロンの微量注入針を使用した本発明に従って実行される。いくつかの具体例に おける方法では表面上に非接着細胞の固定化、その後要望する外部物質を含ませ るための微量注入の方法が提供される。本発明はさらに細胞生存性の最小の損害 及び／又は損失を伴う培養表面から修飾細胞の除去を提供する。 本発明に従って提供される修飾細胞は以下の事を含む様々なことに応用するこ とができる：（ａ）実験室研究、（ｂ）要望するタンパク質（例えば、モノクロ ーナル抗体の試験管内での生産のため、及び、（ｃ）生理的病気に対する治療。 この点について、ここで開示された技術は遺伝子治療に使用できる。別の観点で は、本発明は遺伝的に修飾された細胞が豊富な細胞の調製を提供する。このよう な調製物は遺伝子治 療応答性生理的病気に苦しむ患者に注射により与えられ、そこにおいては遺伝的 に修飾された非接着細胞及びその子孫は治療剤を発現し、従って患者の生理的病 気を治療する。 微量注入法 ここにおいて使用される場合、「微量注入」および「微量注入すること」とは 非接着細胞内に外部物質を輸送することをについて述べたものである。ある具体 例では、この方法は下記に記載されるように微量注入針を使用する。方法のある 具体例では、発明による微量注入法は一般的に以下のとおりに進められる。クロ ーニングリングが組織培養皿のような固定化表面に付着する、クローニングリン グにより囲まれた皿の表面は、フィブロネクチンのような接着物質で覆われる。 覆われた固定化表面は、固定化表面に対して非接着細胞の固定化させることがで きる十分な時間及び温度で活性化抗インテグリンモノクローナル抗体の存在下で 、非接着細胞の混合物によってさらされる。別の例では、非接着細胞が接着の活 性化抗体又は他の活性化剤が無い状態で前記固定化表面に添加される。理想的な 針に効果的な量及び濃度の外部物質を含むサンプル溶液が積載される。固定化非 接着細胞を含んだ組織培養皿が顕微鏡の掲載台に乗せられ、同じ顕微鏡上に乗っ た、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅが販売しているようなマイクロマニュピュレーター又は Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆにより販売されているような電気制御マニュピュレーターに 微量注入針が設置される。ＳＡＳ １０／２エアースクリュー始動微量注入／吸 引シリンジ又は自動Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆトタンスジェクターのような器機は、サ ンプル溶液（たぶん蛍光標識を含む）を微量注入針から細胞の核への運搬に必要 な圧力を供給する。非接着細胞の核への挿入の後に、必要量のサンプル溶液が細 胞に注入される。運搬は位相差顕微鏡によりモニターできる。しかしながら、細 胞では観察できないようなこのような微量の運搬では光学顕微鏡によって識別さ れることは有効なことかもしれない。微量注入針の引き上げ後、外部蛍光物質の 核への運搬は蛍光検出機能を備えた顕微鏡により確認され、修飾細胞は続いて固 定化表面から分離される。 微量注入法は使用する装置に従って手動、半自動又は自動により行われる。手 動式微量注入手段は、すべてを位相差顕微鏡で観察できる、生きた細胞の核又は 細胞質区画の中にガラスマイクロピッペト（注入サンプルを積載）を導くマイク ロマニュピュレーターを含んでいる。注入針は針からサンプルを連続して押し出 す圧力を与える組合わされたシリンジに連結されている。針のチップは細胞に挿 入され、細胞へのサンプル溶液の流れに由来する位相差の光りは視覚的にモニタ ーされる。位相差の変化は細胞へサンプルの注入を示し、そこで注入針は細胞か ら除去される。半自動微量注入法は以下のように行われる：手動によるセッティ ングにより細胞の核に微量注入針を導かれる。このことは、Ｚバルブが、すはわ ち、自動的注入を実行する時に針が戻る垂直位置に設置することが行われる。Ｚ バルブを設置すれば、針が核から引き抜 かれ、注入される細胞の核の位置の上部に位置する。自動化システムはその後始 動する。針が細胞核の中に導かれると同時に、圧力の律動が核への注入サンプル を放出する。注入が完了後、針が注入する細胞のすぐ上部に戻る。新たな細胞が その後据えられ、手順が繰り返される。 非接着細胞に微量注入される外部物質を含む溶液の容量は記載されるように最 高条件にすることができる。一般に、注入される容量は溶液を受け取る非接着細 胞核の体積当たり約２％から約５％を越えない。外部物質の濃度及び非接着細胞 の中に注入される物理的特性は微量注入の成功をもたらすことができる。発明に 従えば、温度、微量注入針の非接着細胞への貫入及び抜き取りの速度、微量注入 針チップの内径及び外径、針の内部圧力が増加する（注入サンプルの放出のため ）時間の長さ、細胞を貫くときの針の軸、及び注入過程の期間中及びその後の両 方での針の内部圧力のような他の変数はそれぞれの細胞のタイプ他の変数が要求 される最高のものであるものに対しては、最高なものにしなければならない。微 量注入の期間中に使用される温度はおおよそ室温（２２℃）から注入過程で使用 される顕微鏡の一部である過熱段階で使用される約３７℃までの間で変更させる ことができる。非接着細胞の中へ注入される溶液の容量は他の事項の中でも非接 着細胞の容量したがって変化する。 細胞へのサンプル溶液の微量注入で使用される圧力は、微量注入針の内径及び チップの形態（例えば、先細の長さ及び 張り出し）及びサンプル溶液の濃度及び粘度に従って変化する。圧力はサンプル 溶液の流速及び注入法の後に最高の細胞生存性を提供するために決定されるもの を下回る運搬容量を維持するために有効な低い値にすべきである。 ここにおいて使用される場合、「微量注入針」という用語は、非接着細胞への 微量注入に使用されるホウ素ケイ酸塩、アルミナケイ酸塩又はクオーツガラス、 若しくは他のふさわしい素材が含まれる微小管を意味する。本発明の微量注入針 はＳｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製のＰ−８７、Ｐ−９７、又はＰ−２０ ０モデルのような自動ピペットピュラーによって一般のガラス微小管から準備す ることができる。微量注入針は微小炉又は他の同様な器機を使用して手作業で準 備することもできる。本発明の微量注入針は外径が約０．５ミクロン以下、好ま しくは約０．２５ミクロン以下、さらに好ましくは約０．０５ミクロンから約０ ．５ミクロンの範囲である。微量注入針の内部穴は微量注入針を通過して保存器 から非接着細胞へ巨大分子を通過させることができ、一般には約０．０２〜０． ４ミクロンの直系である。 本発明において考慮される微量注入針は一般に使用した適する特別な熱フィラ メント、微小管の型（ガラス化合物及び内／外径）及び設定された器具（例えば 、熱、引っ張り力、及び引っ張りの速度）準備することができる。最終的な微量 注入針の大きさと形状は走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、抵抗測定、泡圧力検査のよ うな様々な方法により決定することがで きる。 微量注入針の最終チップの外径（Ｏ．Ｄ．）、先細の長さ及び張り出しここに おいて記載の方法を使用することによって調整することができる。フィラメント またはレーザーの温度、フィラメントの大きさ、初期微小管内部穴内径（Ｉ．Ｄ ．）、微小管構成物、熱にさらされる時間及びなまし速度のような考慮事項はす べて要望される特徴をもつ微量注入針を生産させるために必要なことに対して最 高の条件にすることができる。 本発明に従って実行される場合、外部物質を含む溶液を微量注入されている非 接着細胞は延長された期間生存し続け、及び外部物質を保有し発現するかもしな い、すなわち外部ＤＮＡを受け取った非接着細胞はＤＮＡを複製しそのＤＮＡに 関係したタンパク質を発現することができるようになる。 本発明の方法は外部物質の非接着細胞の核に対するだけの微量注入に制限され ない。例えば、外部物質は細胞質又は様々な他の細胞器官に注入することができ る。 ここにおいて使用される場合、「外部物質」という用語は、微量注入される非 接着細胞の外部にある完全なビリオン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、小有機分 子、代謝物、巨大分子、細胞器官、プラスミドベクター、酵素、無機物質、染色 体、人工染色体、エピソームプラスミド及びその他の物質のことを述べている。 「非接着細胞」とは組織培養において接着して成長するも のに対して、懸濁培養で成長するものである。本発明で考慮される非接着型細胞 の例には一次及び形質変換Ｂ細胞（Ｂリンパ球）、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）、造血 幹細胞、グラヌロサイト／好中球、骨髄芽球、赤芽球、及びその他を含んでいる 。 本発明でまた考慮される一次幹／前駆細胞はＣＤ３４⁺、ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^- 、ＣＤ３４⁺／ｌｉｎ^-／Ｔｈｙ−１^lo、ＣＤ３４⁺／ＣＤ４５Ｒａ^-lo／ＣＤ７ １^-lo／Ｔｈｙ−１^lo、ＣＤ３４⁺／ｃ−ｋｉｔ^lo、ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／ＣＤ ３３^-／ＣＤ１９^-／ＣＤ４５Ｒａ^-／ｃ−ｋｉｔ^lo、ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／Ｃ Ｄ４５Ｒａ^-lo／ＣＤ７１^-lo／Ｔｈｙ−１^lo、及びＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／Ｔｈ ｙ−１^loが含まれる。本発明で有用な形質変換造血幹細胞はＵ９３７及びＫＧ− １のような多種の細胞が含まれる。一次細胞とは試験管内の供給源から直接移動 させられるもので、すはわち、培養において無限の成長を提供するために操作又 は形質転換を行っていない細胞である。 本発明の微量注入法を実施するにあたり、次の４つの基準を考慮すべきである ：（ａ）微量注入のための駆逐を最小限にするために非接着細胞を十分に接着す べきである、（ｂ）微量注入された非接着細胞は生物学的活性に対する被害又は 減少を最小限に保って、接着した表面から移動できるようにすべきである、（ｃ ）固定化は一般に細胞の活性及び／又は分化の誘導を行うべきではない。このよ うなことは非接着細胞の副次的な生物学的活性に潜在的に干渉する事があるかも しれない。ほかに考慮すべきことは、微量注入法がそれ自身細胞の生存性又は生 物学的活性を逆に損なうことがないようにすべきである。 ここにおいて使用される場合、「固定化表面」とは非接着細胞が固定化又は接 着することができるプラスチック、ガラス、クオーツ又はその他の表面のことを 意味する。このような表面はスライド、ペトリ皿、プラスチック／組織培養板又 は皿、カバースリット、クロマトグラフ用樹脂、多孔性膜、保持ピペット及びそ の類似物を含むことができる。 「固定化すること」又は「固定化」によって非接着細胞が微量注入ができる十 分な力で固定化表面に接着又は結合する過程が意味される。このような過程には 減圧又は真空の保持ピペットにより非接着細胞の保持、レクチン又は結合剤によ る表面への非接着細胞の接着、直接的又は間接的のいずれかの抗原特異的なモノ クローナル抗体による細胞の接着、多種の活性化剤による非接着細胞のインテグ リン又は他の接着タンパク質のような接着分子を発現する細胞表面の活性化、抗 インテグリン抗体の活性化、サイトカイン、又は２価の陽イオン（例えばＭｇ²⁺ ）含む陽イオンの活性化が含まれる。別に、インテグリンのような接着分子を発 現する細胞は強力な接着のための追加的な活性化が必要ではない。固定化表面に 接着または保持された非接着細胞は「固定化非接着細胞」と言及される。 「レクチン」によりＰＨＡ及びＣｏｎ Ａのような物質を 意味する。レクチンは細胞の表面の特異的炭水化物と相互作用し、さらに、接着 を容易にすることで知られる植物及び動物タンパク質である。「結合剤」でグル タルアルデヒド及びコラーゲンのような物質を意味する。 ここにおいて使用される場合、「物質」又は「接着物」はフィブロネクチン、 コラーゲン、ラミニン、ＶＣＡＭｓ、ＩＣＡＭｓ、エピリグリン、インバシン、 オストスポンジン、トロンボスポンジン、ヒアルオン酸、プロテオグリカン、又 はその断片（組み換え分子）またはペプチド（未修飾又は化学的修飾）のような 素材を意味する。非接着細胞のインテグリンを発現する細胞表面は、自然状態ま たは抗インテグリンモノクローナル抗体のような試薬によりインテグリンが活性 化された状態のいずれかで物質または接着物と結合する。物質及び接着物は固定 化表面（又はある場合には特定の表面にマトリックス分子を接着させるのに使用 する結合物）に直接接着し、さらに固定化表面に非接着細胞を固定化させること ができる。接着物が固定化表面に接着した場合、結果生じる物は「接着物−表面 カップル」と名付けられる。 インテグリンは多くの細胞の表面で発現するタンパク様分子で、多種のマトリ ックス／細胞への媒介接着のような多くの生物学的機能を補助する。細胞表面で 発現するインテグリン細胞膜又は細胞表面に結合する細胞によって作られ、少な くともそれ自身の一部を細胞外に配置されるインテグリンである。このような細 胞表面発現インテグリンは例としてＶＬ Ａ−４（α₄β₁）及びＶＬＡ−５（α₅β₁）が含まれる。 N.L.KovackらはJ.Cell Biol.116:499-509,1992で細胞表面発現インテグリンが 抗インテグリン抗体により活性化され、その結果活性化された細胞表面発現イン テグリンは多種の物質に対する細胞性接着を助ける。 ここにおいて使用される場合、「抗インテグリン抗体」はインテグリンに結合 することができる抗体のこと言う。本発明に従えば、抗インテグリン抗体には、 例としてで、制限するものではないが、ポリクローナルと同様に、抗β₁、８Ａ ２、ＴＳ２／１６．２．１、抗β₂、抗β₃、抗β₁モノクローナル抗体が含まれ る。 細胞表面発現インテグリンはまた抗体、サイトカイン、２価の陽イオン及びペ プチドを含む他の方法で活性化できる。発明の固定化方法の一つを実施する場合 、細胞表面接着分子活性化剤及び接着物のふさわしい組み合わせが選択されるべ きである。結合することが知られているインテグリンと接着物の組み合わせは表 １で示される。 上記に記載のように、非接着細胞は、それ自身が表面に直接接触する（すなわ ち、共有結合）抗原特異的Ｍａｂｓを通して表面に接着することができる。この ような抗原特異的Ｍａｂｓには、例えば抗ＣＤ３４、抗ＣＤ４及び抗ＶＬＡ−４ 、抗ＶＬＡ−５が含まれる。 表面から固定化細胞の分離の方法は使用固定化方法に対応して選択される。接 着物で覆われた固定化表面に対し細胞表面インテグリン媒介固定化法が採用され た場合、細胞の分離はペプチド（例えば、フィブロネクチン由来）の競合、プロ テアーゼ処理（例えば、トリプシン）による放出、細胞分離バファーによる放出 、ヘパリン結合部位を阻害する多価陰イオン、インテグリン機能を阻害するＣａ²⁺ のような陽イオン、またはピペットによる単純な撹拌により達成される。細胞 が炭水化物のような固定化表面に直接、すなわち共有結合により結合する抗体へ の結合により固定化される場合は、細胞は上記の方法か抗体結合に対する過剰分 子、若しくは過剰抗体又抗体断片（Ｆａｂｓのような）による競合のいずれかの 方法で分離が達成される。 発明の非接着細胞固定化方法の別の具体例が実行される場合は、保持ピペット が使用される。ここにおいて使用される場合、「保持ピペット」の用語は非接着 細胞表面に穴をあけたり障害を与える事なく非接着細胞の保持が可能になる約０ ．５ミクロンから約２．５ミクロンの内部穴直径（開口）を持 つ微小管について述べられる。保持ピッペトの穴は非接着細胞を引き寄せ、保持 ピッペトの末端に固定化される力を提供する減圧下（真空）に置かれる。本発明 の保持ピッペトは実施例１３に従って作製される。保持ピッペトはデフォンブル ン微小炉を使用して作製することも可能である。ガラス微小管の適切な曲げは組 合わされたホルダーのつかみに適合するように、約１から約５グラムの重りが熱 フィラメントの内側に位置する微小管から吊るされる。熱がガラスを軟化するた めに与えられ、結果として重りが微小管を直径が約１から約３ミクロンになるま で引っ張り、その地点約１から約３ミクロンの直径チップを持つ保持ピッペトか ら吊るされた重りから分離される。チップはその後熱フィラメントに近づき、そ してチップは熱により磨かれ、その結果開口部が約０．５から約２．５ミクロン の滑らかなチップが得られる。この保持ピペットは微量注入の間、細胞を保持す る真空を作り出すことに使用できる組合わされたシリンジに組み込まれることが できる。 このような保持ピッペトを作製する場合、デフォルンのデフォンブルン微小炉 に制限されない。例えば、市販されている針ピュラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔ ｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ、Ｋｏｐｆ）が上記直径を持つまで微小管 の引っ張りに使用することができる。しかしながら、チップは微小炉により（デ フォンブルン又はＮａｒｉｓｈｉｇｅ）によりは熱による磨きが必要である。 一般的に、本発明で使用される保持ピッペトは保持ピッペトによって保持され た非接着細胞がピッペトに吸入されないために約２．５以下のＯ．Ｄ．を持つ。 保持ピッペトによる細胞壁の貫通を最小にするために、保持ピペットチップは火 による磨き又は適した滑らかさを持つようにしなければならない。Ｅｐｐｅｎｄ ｏｒｆ又はＺａｎｄｌｅｒの組合わされたシリンジのいずれかが注入期間中細胞 をその場に保持するするが、この過程で細胞膜を破裂させない保持ピッペトに真 空を作り出すためにデザインされている。 とげはピペットチップから取り除かなければならない。このことは一般的に火 による磨きによって行われる。火による磨き中に保持ピペットをふさがないよう に注意しなければならない。このことはなますのには十分だが保持ピッペトチッ プを融合させない、チップを約０．５から約２．５ミクロンまで熱する間、穏や かな流れの空気（又は挿入ガス）を保持ピペットを通過させることによって達成 することができる。 微量注入後の細胞生存性のモニターを容易にするために、ＤＮＡのような外部 物質を微量注入された非接着細胞は、蛍光染色体（例えば、ＦＩＴＣ、Ｏｒｅｇ ｏｎ ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄｍｉｎｅ）結合デキストラン（多種の分子量分子、 例えば、１５０，０００）、又は活性蛍光ＤＮＡ染色（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ｙｏｙｏ ｄｙｅ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又はＧ ＦＰレポーター遺伝子をコードするＤＮＡのいずれかを共微量注入することがで きる。微量注入の前後使用される細胞培養状況により、微量注入された非接着細 胞は造血サイトカイン又はＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ及びＦｌｔ−３リガンド のような成長因子又は抗ＴＧＦ−β抗体の中和のような他の薬剤により周期に進 入する。代わりに、むしろ周期化及び分化の誘導なしで生存可能な培養条件に細 胞を保っておくことが好まれる。微量注入後、固定化表面から分離した非接着細 胞は非接着特性を再び得て、非接着細胞として再び懸濁液中で増殖できるように なる。 本発明の微量注入の方法及び器機は実施例１に記載されている。 外部物質を含む貯蔵溶液は、表２の「サンプル」でしめしてあり、代表的なも のは緩衝化されている。 外部物質を含む貯蔵溶液は、表２の「サンプル」の典型としては、リン酸緩衝 化塩（ＰＢＳ）、水及びＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）が含まれる。貯蔵溶液は受 け入れ細胞に直接微量注入されるか、または受け入れ細胞に直接微量注入される 前に第２のバファー溶液で希釈される。第２のバファー溶液の典型的なものとし てはＨｅｐｅｓ（５０ｍＭ）、ＫＣ１（１００ｍＭ）及びＮａＨ₂ＰＯ₄（５ｍＭ ）でＰＨが約７．２のものが含まれる。実際に細胞に注入された外部物質「サン プル」のｍｇ／ｍｌでの濃度が表２の「濃度」で示される。サンプルは細胞への 微量注入の前に、典型的にＥｐｐｅｎｄｏｒｆ小型遠心分離機を使用して約１０ ，０００から１５， ０００ｒｐｍで遠心分離、又は０．０２ｍｍまたは０．１ｍｍの膜によるろ過及 び／又は透析された。 微量注入によりサンプル溶液を受け取った細胞には一次細胞又は形質転換細胞 （例えば、Ｕ９３７，ＴＦ−１細胞）（ＣＤ３４⁺、ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-、Ｃ Ｄ３４⁺／ＣＤ３８⁺、及びＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／Ｔｈｙ−１^lo）が含まれる。 ＣＤ３４発現細胞は免疫遺伝学的にへその緒の血液から精製された一次ヒト幹／ 前駆細胞である。ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-及びＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／Ｔｈｙ−１^lo 細胞集団は蛍光活性細胞選別（ＦＡＣＳ）により分離された。ＣＤ３４⁺細胞 のＣＤ３８^-副次集団は接着マウス繊維芽細胞系のＳｗｉｓｓ ３Ｔ３を意味す る３Ｔ３のより原始的な細胞の部分集合が含まれる。 細胞に微量注入されたサンプルの外部物質にはＤＮＡ（ＰＣＭＶ−β、Ｐｈ− ＧＦＰ、ｐＧｒｅｅｎ Ｌａｎｔｅｒｎ（「ｐＧｒｅｅｎ」）、濃度の比率が１ ：１のＣＭＶ−β／Ｐｈ−ＧＦＰ）、蛍光重合体（ＰＥ−ＲＡＭ、ＦＩＴＣ−Ｇ ＡＭ、ラダミン−デキストラン、ＦＩＴＣ−デキストラン）又はそれらの混合物 が含まれる。これら及び以前に記載されている他の外部物質の様々な組み合わせ については、示された細胞系に微量注入できた。 典型的なものとして組織培養皿及びペトリ皿の表面に細胞は「接着」分子（例 えば、フィブロネクチン「Ｆｎ」）により表面を処理する様々な方法によって固 定化された（表２）。 ある場合には、「活性化剤」（例えば、抗β₁、インテグリンモノクローナル抗 体）８Ａ２Ａｂ（Ｎ．Ｋｏｖａｃの８Ａ２）及びＴＳ２液（ＴＳ２／１６．２． １ハイブリドーマ細胞系からの上清状態、Ｔ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ＡＴＴＣ ｎ ｏ．ＨＢ−２４３）はフィブロネクチンコート皿上に固定化するそれぞれの細胞 の細胞表面発現インテグリンを活性化するために使用する抗β₁インテグリンモ ノクローナル抗体である。Ｃｏｎ Ａ（コンカナバリンＡ）はそれぞれの細胞を 最初にグルタルアルデヒドで固定化表面を処理し、その後誘導された表面をまず Ｃｏｎ Ａでさらし、つぎにそれぞれの細胞をさらすことによりそれぞれの細胞 を固定化するために使用した。ビオチンＣＤ３４細胞固定はグルタルアルデヒド 誘導皿をビオチニル化抗ＣＤ３４抗体及びそれぞれの細胞でさらすことで行われ た。 微量注入の前のクローニングリングの中の細胞数は一般的に約３００から約２ ０００の間の範囲である。これらのうちの一つの分画は実際に微量注入される。 実験当たり微量注入された細胞数は表３の「細胞（＃）」で示されるように約２ から約１５０の範囲で、微量注入が「良好（ｇ）」または「不可（ｎａ）」で示 されている。「良好」な微量注入は次の細胞を提供する：（１）微量注入の間、 穏やかな膨張を示す；（２）受け取った溶液の容積が細胞を破壊するほど大きく ない；（３）微量注入針の差し抜きの直後に破壊を起こさない。これらの基準か らはずれた微量注入は「不可」とした。 細胞は、微量注入後、直後、４時間後、１２−１８時間後、４８時間後および ７２時間以上後検定及び視覚によるモニタリングを行った。微量注入した細胞の 数、大きさ、生存状態、及び／または色、蛍光の強度を位相差及び蛍光顕微鏡で 測定した。赤い蛍光がロダマイン微量注入細胞で、緑の蛍光が微量注入細胞でＦ ＩＴＣデキストラン又はＧＦＰ発現から見られた。時に、微量注入によるベータ ゲルの発現がｘゲル染色で測定された。 微量注入は一般に熱した（約３７℃）顕微鏡段階でのこなわれるが、ある場合 には室温（約２０〜２４℃）で行われた。接着物質覆われた固定化表面での一次 細胞又は形質転換組織の固定化に続いて様々な濃度の外部物質を含む貯蔵溶液の アリコートが固定化された細胞に微量注入された。微量注入針の０．Ｄ．の範囲 はは約０．９から約ミクロンから約１．１ミクロン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆでは「 Ｆｅｍｔｏｔｉｐｓ」と示される）、約０．４５から約０．６０ミクロン（「ｆ ｉｎｅ」と示される）又は特別な値（表２で示す）が調製され使用された。結果 の概略は表２及び３に記載する。 結果は非接着細胞及び、特にＣＤ３４⁺幹／前駆細胞集団由来の造血細胞にお いて、本発明の新たな微量注入法及び器機を使用したＤＮＡを含む多種の巨大分 子が問題なく微量注入できる事を示す。遺伝的に修飾された細胞はそれらに微量 注入された遺伝的外部物質のそれぞれの産物を問題なく発現させた。 本発明のある具体例では、有効な量（一般に、微量注入される細胞核の容積の５ −１０％以下）の外部物質核酸を含んだ貯蔵溶液を非接着細胞、より好ましくは 非接着細胞の細胞表面発現インテグリンの活性化及び接着物により固定化表面に 固定された造血幹細胞または他の造血細胞に微量注入した。微量注入は外径が約 ０．２０ミクロン以下、ある具体例では約０．０５から約０．１５ミクロンの間 の微量注入針を使用して完成された。 遺伝子治療 本発明は造血幹細（ｈＳＣ）を形質導入する方法、従って（１）顕微注射によ ってｈＳＣの核にＤＮＡ配列を直接伝達し、（２）ｈＳＣの染色質内への顕微注 射された形質導入遺伝子配列の融合、あるいはエピゾーム性ベクター又は人工ヒ ト染色体上での上記形質導入遺伝子の維持及びそのｈＳＣの後代でそれらの配列 の持続、そして（３）プロモータ、エンハンサ、及び座制御領域（ＬＣＲ）など の調節要素と導入された形質導入遺伝子の適切な長さを有し、細胞タイプに固有 の表現に必要はイントロン／エクソン構造を含んだ十分に大きな（１５−２５Ｋ ｂ）形質導入遺伝子性ＤＮＡ構成物、そして（４）ＤＮＡ／蛋白質混合物で蛋白 質が遺伝子統合及び／又は向標的に寄与する注射サンプル内に含まれている混合 物の顕微注射、によるその直接遺伝子修正のこれまでとは別の方法を提供する（ 図８及び９）。 本発明による方法で調製された遺伝子修正ｈＳＣはその修正されたｈＳＣが長 期的再構成を目的としてヒトに伝達されると遺伝子治療目的に用いることができ る。 本発明によれば、外来物質の顕微注射によって修正された造血幹細胞を、限定 としてではなく例示として示すＡＩＤＳ、癌、地中海貧血、貧血、アデノシン・ デアミナーゼ不全、ファンコーニ貧血、ゴーシェ病、ハーラー症候群、免疫不全 そして代謝性疾患などの種々の生理的不全の治療に用いるこ とができる。 本発明の適用対象として想定される生理的不全は遺伝子治療に対して反応を示 す。『遺伝子治療に反応を示す』という用語は、そうした不全に悩んでいる患者 がより改善された症候群あるいは診断などの治療的又は臨床的利点を得るという 意味である。 上に述べたように、本発明の１つの側面は遺伝子伝達のために細胞性媒体とし ての修正ｈＳＣの利用に関連している。遺伝子、又は形質導入遺伝子は、例えば 、治療法又はマーカー遺伝子や血液細胞の遺伝子欠損（例えば地中海貧血におけ る突然変異性ヘモグロビン遺伝子や鎌形細胞性貧血）を補正する遺伝子など、臨 床的に有用であればどんな遺伝子でも用いることができる。好ましくは、主要な ヒト細胞は血液細胞である。ここで用いられている『血液』という用語は上に述 べたようなすべての形態の血液細胞とその祖先あるいは前駆体を含んでいる。 従って、ひとつの実施の形態において、本発明は（ｉ）患者のｈＳＣへのその ヒト一次細胞の治療効果を増大させる生成物をコード表現するＤＮＡセグメント を顕微注射するステップと、（ｉｉ）その患者への遺伝子修正されたｈＳＣを導 入するステップとを含んだｇＳＣの治療効果を増強する方法に向けられている。 ＤＮＡは患者の体内でその作用因子をつくりだし、そうした実施の形態によれ ば、その作用因子は組織サイト自体に表 現される。同様に、上にも述べたように，遺伝子的に加工されたｈＳＣは特定の サイトに向かわせる必要はなく、本発明によれば、そうした加工ｈＳＣとその子 孫は系統的治療薬として機能し、例えば、望ましい治療薬は細胞から系統的に表 現、分泌される。 より具体的に言えば、（ｉ）血液細胞の治療効果を増大させる生成物をコード 表現するＤＮＡ配列を患者のｈＳＣ内に顕微注射するステップと、（ｉｉ）ステ ップ（ｉ）で得られた細胞をその患者に導入するステップで構成される、患者の 体内に導入されるｈＳＣの治療効果を増大させる方法を提供する。 修正ｈＳＣを『向標的』させないとは、それらの遺伝子が修正されたｈＳＣの 子孫であるその患者の形質導入された血液細胞がその患者の体内でその作用因子 をつくりだすように挿入されることを意味する（図７）。 修正されたｈＳＣの子孫であり、本発明において用いることができる一次ヒト 血液細胞は、例えば、白血球、顆粒球、モノサイト、マクロファージ、リンパ球 、そして胎児性赤芽球などである。例えば、地中海貧血あるいは鎌状赤細胞性貧 血の患者から取り出して、適切なヘモグロビン遺伝子で遺伝子修正された幹細胞 は遺伝子的に補正された赤い血液細胞をつくりだす。 ｈＳＣによって伝達されるＤＮＡは、例えば、その細胞の治療効果を直接的、 あるいは間接的に増強させるものであれ ば、どのＤＮＡでもよい。また、ｈＳＣによって運ばれるＤＮＡはそのｈＳＣが 通常であれば発揮しないような治療効果を発揮させるものであればいずれのＤＮ Ａであってもよい。例えば血液細胞を遺伝子的に加工するために用いることがで きる適切なＤＮＡの例としては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（ インターロイキン１−１２など）、グロビン遺伝子、ＤＮＡ修繕遺伝子、薬品抵 抗性遺伝子、ファルコーニ貧血遺伝子及び抗ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）抵 抗性遺伝子などである。 ヒト細胞に形質導入するために用いられるＤＮＡはその表現生成物がその細胞 から分泌されるものであればどんなものでも用いることができる。さらに、それ はその細胞内で保持される遺伝子生成物をコード表現するものであってもよい。 ヒト細胞はまた、後で詳細に述べるようなマーカーとして機能するＤＮＡで遺伝 子的に加工することもできる。 １つの側面で、挿入される遺伝子はイン・ビボで形質導入された細胞のトラフ ィック及び生残の判定を可能にするマーカー遺伝子である。そうしたマーカー遺 伝子の実例としてはネオマイシン抵抗性（ｎｅｏＲ）遺伝子、複数薬剤抵抗性遺 伝子、β−ガラクトシダーゼ、ジヒドロフォレート・リダクターゼ（ＤＨＦＲ） 及びクロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼなどである。 ｈＳＣはイン・ビトロで遺伝子的に加工される。例えば、細胞を患者から取り 出して幹細胞を単離し、治療因子をコー ド表現するＤＮＡでイン・ビトロで遺伝子的に加工され、そうした遺伝子加工さ れたｈＳＣをその患者に対して薬学的に受け入れ可能な基剤と共に再投与される 。こうした治療手順はイクス・ビボ処置と呼ばれる場合もある。 いくつかの実施の形態で、修正ｈＳＣの子孫は一次ヒト細胞であり、より好ま しくは適切な後代細胞内で親のｈＳＣ内に顕微注射された遺伝子的に異質な物質 の生成物を表現するヒト一次核形成血液細胞である。 薬学的に受け入れ可能な基剤は液体基剤（例えば、食塩水溶液）、あるいは期 待基剤、例えば生物学的に共存可能な、及び非免疫遺伝性物質の移植片である。 液体基剤を用いる場合、加工される細胞は系統的に導入されてよく、例えば、静 脈、皮下、腹膜内、患部内への直接投与、あるいは骨髄への直接投与などの方法 で導入されてよい。 マウス、大型動物、及びヒトを用いた調査結果から長期的再構成を目的として ヒトに伝達する必要がある多数の幹細胞の合理的な推測が可能になる。考慮され ている遺伝子治療は子供に対して実施されることが多いから、ここでの予測は体 重が小さい場合を想定して行われる。さらに、急速な移植と生残を確実に行うよ うにするために、かなりの数のマークされない、短期間再構成細胞を同時に伝達 する必要が生じる場合もあるが、ここでは少数の遺伝子修正、長期間再構成幹細 胞に重点を置いて説明する。 これら独立のマウスを用いた調査では１００程度の骨髄 細胞を例（Ｓｐａｎｇｒｕｄｅら、１９８８）、１０個程度の骨髄細胞（Ｊｏｎ ｅら、１９９６）、あるいはたった１個の細胞（マウス細胞の２０％再構成）（ Ｏｓａｗａら、１９９６）など少数の細胞を使った事例しかない。重量だけを手 がかりとする直接測定が適切であるなら、マウスの場合に５個程度の細胞が平均 的再構成に必要であるとすれば、ヒトの子供の場合は５，０００個程度の骨髄細 胞が必要となる。増大した寿命の測定も必要かどうかはまだ明らかにされていな い。 ヒトの骨髄移植の場合、通常伝達される最低量は体重１ｋｇあたり１ｘ１０³ 個の核形成細胞で、これは体重２５Ｋｇの子供に対しては２．５ｘ１０⁹個の細 胞に相当する。報告されている実験データとネコにおける造血のモデル化は幹細 胞頻度が１．７ｘ１９⁶骨髄細胞でほぼ１であることを示している（Ａｂｋｏｗ ｉｔｚら、１９９６）。この同じ頻度はヒトの骨髄の場合にもあてはまり、２． ５ｘ１０⁹個の細胞の提供は１４５０個の幹細胞の提供に相当する。 子供は３０ｍｌ程度の移植脊髄血液で再構成を示すと報告されており、これは 本来の造血性脊髄血液細胞の増殖能力が極めて高いことに起因するらしい（Ｋｕ ｒｔｓｂｅｒｇら、１９９６）。この体積にほぼ１．３−３ ｘ１０⁹個の核形 成細胞であり、幹細胞頻度が１０⁵−１０⁶と仮定すると、これは１５０−３，０ ００個の幹細胞があれば移植は成功することを意味している。 ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへのヒト脊髄血液細胞の移植から報告されている証拠 はＮＯＤ／ＳＩＣＤ再構成細胞（ＳＲＣ）とヒト幹細胞との間には非常に密接な 関係があることを示唆している。ＳＲＣは１０⁴個のＣＤ３４細胞内に最大１ま での頻度で存在している（Ｓｅｒｒａｎｏら、１９９６）。従って、３０ｍｌの 脊髄血液（３ｘ１０⁷個の単核細胞を含んでおり、その１％はＣＤ３４である） は約３０個のＳＲＣを含んでいる。ＮＯＤ／ＳＩＤマウスへのＳＲＣの移植効果 は１０％程度であるが、これは５００個のＳＲＣに相当する。 従って、上に述べた４つの計算例のすべては、幹細胞の必要数が約１５０−約 ５，０００個の範囲であることを示唆している。再構成が成功するかどうかは幹 細胞の提供ばかりでなく、短期後代細胞による急速な移植にも依存しているから 、幹細胞の必要量はこれらの計算値より低くなるであろう。 遺伝子性疾患に対する臨床効果を挙げるためには、一般的にはイン・ビボで存 在する幹細胞のかなりの部分の補正が必要になるであろう。このことは（うまく 形質導入された細胞だけが患者に移植されるように）移植の前に修正されたｈＳ ｃをイン・ビトロで選択し、及び／又はその後で（内発性で未修正のｈＳＣを犠 牲にして修正されたｈＳＣをより多くするように）修正ｈＳＣをイン・ビボで選 択することによって達成されるであろう。このためには同じＤＮＡ構成物上に存 在する２つの独立した調節遺伝子：幹／後代細胞内で表現させるために対象とな る選択可能な遺伝子と必要な細胞タイプでの表現のために対象となる治療用遺伝 子（例えば、ＡＤＡやグロブリン）と共にｈＳＣを移植する必要性を示唆してい る。 ヒト０⁶メチルグアニンＤＮＡメチルフェラーゼ（ＭＧＭＴ）遺伝子と共にｈ ＳＣを形質導入すると、含窒素尿素タイプのアルキル化剤（例えば、１，３−ｂ ｉｓ（２−クロロエチル）−１−含窒素尿素；ＢＣＮＵ）で患者を簡単に処理す ることによって生き残った修正ｈＳＣのイン・ビボでの選択が可能になるかも知 れない。ほとんどの抗腫瘍形成剤（例えば、Ｔａｘｏｌ）は循環性造血後代細胞 に対して毒性を示して休止している造血性幹細胞を損なってしまうが、ＢＣＮＵ などの含窒素尿素などの使用も幹細胞に対してＤＮＡ破損性及び毒性効果を直接 発揮する。種々のアルキル化剤によってＤＮＡ内に誘発される０⁶−アルキルグ アニンを取り除くことができると報告されている（Ｍｉｔｒａら、１９９３）Ｍ ＧＭＴは造血性幹／後代細胞においては非常に低いレベルで表現されることが報 告されている（Ｗａｎｇら、１９９６；Ｍｏｎｉｔｚら、１９９５）。しかしな がら、細胞内で外発的に誘導されると、ＭＧＭＴはＢＮＣＵ、ＣＣＮＵ、デカル バジン、Ｎ−メチル−Ｎ＝ニトロ−Ｎ’−含窒素グアニジン及びストレプトゾト シンに対して細胞抵抗性を付与すると報告されている（Ｐｒｅｕｓｅら、１９９ ６；Ｓｐａｎｉｎら 、１９９２）。例えば、マウスの幹細胞でＭＧＭＴを表現するとＢＣＮＵ誘発造 血抑制に対して抵抗性を示すことが報告されている（Ｍａｚｅら、１９９６）。 ヒト多薬剤抵抗性遺伝子’ＭＤＲ−１）が形質導入された幹細胞のイン・ビボで の選択のために使用することが提案されているが、ヒト幹細胞がすでに構成的に ＭＤＲ−１を表現することが報告されている（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９１ ）事実はＭＤＲ−１抵抗性薬剤（例えば，Ｔａｘｏｌ）によって形質導入された 細胞の増大が後代細胞のレベルで起きるのであって、幹細胞上でではないことを 示唆している。マークされた造血細胞に対するどの提案されたイン・ビボ選択（ 例えば，ＣＣＮＵ）の場合もそうであるが、他の器官及び細胞に対して薬剤毒性 を最小限化することが必要である。最後に、ＭＧＭＴ形質導入遺伝子の表現自体 は、これまでにも報告されているように乳癌及びその他の癌に対する高容量ある いは反復的化学療法において用いられるＢＣＮＵなどの薬剤に対して造血細胞で の抵抗性を付与するはずである（Ｃｈａｂｕｎｅｒら、１９９３）。 他の側面で、遺伝子的に修正された造血性幹細胞を用いる遺伝子治療は以下の様 な要素を含む場合がある。１−１０ｘ１０³個の高度に増強された造血性幹細胞 をヒト脊髄血液から得て、一時的に不動態化する。これらの細胞の顕微注射によ って、細胞１個あたり１−３個のＤＮＡがうまく融合するようにＤＮＡと可能で あれば消化酵素を含んだ再生可能な体 積を伝達する。顕微注射された２つの調節された形質導入遺伝子を含むサイズが １５−２５ｋｂのＤＮＡはそのまま融合される。幹細胞での表現を目的とする１ つの形質導入遺伝子はイン・ビトロでも（例えば、ｒｓＧＦＰ、あるいは先頭が 切断された神経成長因子受容体；ｔＮＧＦ−Ｒ）、イン・ビボでも（例えば，Ｍ ＧＭＴ）形質導入された幹細胞の選択を行う。治療用形質導入遺伝子（例えば、 ＡＤＡ ＳＣＩＤのためのＡＤＡ、ヘモグロビン病変に対するグロブリン、化学 抵抗性に対するＭＤＲ−１）などが適切な造血性細胞内での表現の対象とされる 。 本発明は比較的大きな核酸の断片を細胞に導入するために用いることができる 。例えば、分子量が２０ｋｂから２４ｋｂのＤＮＡの核酸配列が０．１ミクロン の開口部を通じて導入されている。従って、０．１ミクロンの開口部を有する本 発明の微細針がそうちた比較的大きな分子と共に用いられてきている。 比較的大型のＤＮＡを０．１ミクロン・フィルターを通じてろ過することがで きる。加えて、現在の研究ではこれら比較的大きな分子の通過はその分子の一体 性を失わないまま達成されることが実証されている（図ＩＩ）。 本開示では以下の略語が用いられている。 ｐＣＭＶ−β シトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ／エンハンサ 配列の制御の下 でβ−ガル・レポータ遺伝子を表現するＤＮＡプラスミ ド ＰＥ−ＲＡＭ フィコクリスリン（フルオロクロムの一種）でラベルし たウサギ抗マウス免疫グロブリン ＦＩＴＣ ＧＡＭ 蛍光イソチオシアネート（フルオロクロムの一種）でラ ベルしたヤギ抗マウス免疫グロブリン ｐｈＧＦＰ ＣＭＶプロモータ／エンハンサ配列（Ｃ１ｏｎ Ｔｅｃ ｈから入手）の制御下でヒト化赤変移緑蛍光蛋白質（Ｇ ＦＰ）を表現するＤＮＡ ｐＧｒｅｅｎ ＣＭＶプロモータ／エンハンサ配列（ＧＩＢＣＯ−ＢＲ Ｌ提供）の制御下でヒト化赤変移ＧＦＰを表現するＤＮ Ａプラスミド（ｐＧｒｅｅｎ／ランタン） ローダミン−デキス デキストランに結合されたローグミン（フルオロクロム トラン の一種） ＦＩＴＣデキストラ デキストランに結合されたＦＩＴＣ ン ＣＤ３４＋ＣＤ３８ ＦＡＣＳによって単離されたＣＤ３４^-細胞のＣＤ３８ −Ｔｈｙ−１＋ −Ｔｈｙ−1^-（実際にはＴｈｙ−１）サブポピュ レーション ３Ｔ３ スイス３Ｔ３線維芽腫−着生マウス線維芽腫細胞株 Ｕ９３７ ヒト骨髄腫単核細胞株、通常着生しない ８Ａ２Ａｂ及びＴＳ フィブロネクチン被覆プレートへの抗βｉインテグリン ２ｓｕｐ 媒介取り付け。８Ａ２（Ｎ．Ｋｏｖａｃｈ）とＴＳ２／ １６．２．１（Ｔ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＡＴＣＣ）はヒ トβｉインテグリンに固有のマウス・モノクローナル抗 体 ｈＳＣ 造血性幹細胞 ここで用いられている物質は以下のようにして入手され た。ＰＥ−ＲＡＭ（Ｂ−Ｄ、Ｂｅｃｈｔｏｎ Ｄｉｃｈｉｎｓｏｎ）、ｐｈＧＦ Ｐ（Ｃｌｏｎ Ｔｅｃｈ）、ｐＧｒｅｅｎ （Ｇｉｂｃｏ）、ローグミン−デキ ストラン（Ｍｏｌｅｃｕ１ａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ＦＩＴＣ−デキストラン（Ｓ ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ１ Ｃｏ．及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ） 。ｐＣＭＶ−β及びＦＩＴＣ ＧＡＭは本開示に述べられているように調製され 、そして発明者の実験室で得られたものである。いつくかの物質はＳｉｇｍａＣ ｈｅｍｉｃａ１ Ｃｏｍｐａｎｙから得られたものであ る。ここで述べられている細胞タイプはＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから得られたものである。 上に述べたことは、本発明による一定の手順を詳細に述べた以下の実施例を参 照することによってより理解できるであろう。これらの実施例は説明のためのも のである。それらは本発明の範囲や性格の限定を意図するものではない。 実施例１ 不動態化ＣＤ３４細胞へのＦＩＴＣ−デキストランの伝達 本実施例は比較的小さなサイズの分子を、成長可能性を有し、その分子の導入 中は不動体化されている生きた細胞に導入する上での本発明に利用可能性を示し ている。ＣＤ３４細胞の精製と培養 単核骨髄及び臍帯血液細胞に０．５−１．０％の範囲で存在しているＣＤ３４ 抗原はそべての測定可能なヒト造血幹及び後代細胞のすべてをマーキングする（ 図５）。臍帯血液細胞は正常なヒト胎児伝達から得られ、単核細胞はＰｉｃｏｌ ｉ−ｈｙｐａｑｕｅ上での遠心分離によって精製される。ＣＤ３４細胞はＭｉｌ ｔｅｎｙｉ ＭｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ３４ Ｍｕ１ｔｉｓｏｒｔ Ｉｓｏ１ａｔ ｉｏｎ Ｋｉｔ（デキストランを介して免疫磁性粒子に結合されている抗ＣＤ３ ４抗体による細胞の培養、（２）磁石に取りつけられたカラ ムを通じて通過させることによって磁性体でラベルされた細胞の単離、（３）デ キストラナーゼによる切断による磁性粒子からの細胞の放出、及び（４）磁石に 取りつけられたカラムを通じて通過させることによる磁性粒子からの細胞の単離 などのステップを含む）による免疫磁性選択によって分離された。その後に行わ れた異なったＣＤ３４エピトープを識別する別の抗ＣＤ３４抗体を用いてのＦＡ ＣＳ分析は、それらの細胞がＣＤ３４表現細胞に対して８５−９５％程度純水で あることを示した。精製された細胞は仔ウシ血清アルブミン（２％、ＳｔｅｍＣ ｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、インシュリン（１０マイクログラム／ｍｌ） 、トランスフェリン（２００マイクログラム／ｍｌ、ＩＣＮ）、２−メルカプト エタノール（０．０５ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、低密度リポプロテイン（４０マイク ログラム／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、及び２０ｎｇ／ｍｌヒトＦｌｔ−３リガンド（ Ｐｅｐｒｏｔｅｓｈ）、２０ｎｇ／ｍｌヒト・インタ−ロイキン−３［ＩＬ−３ 、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及び２０ｎｇ／ｍｌヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｐｅｐ ｒｏｔｅｃｈ）［ＩＭＤＭ／Ｆ−３−ｓ］を含むペン−ストレップ（それぞれ１ ００単位及び５０ｍａｉｋｕｒｏｇｕｒａｍｕ／ｍｌ）で補強された血清を含ま ない培養液（修正ダルベッコ培養液（ＩＭＤＭ，Ｇｉｂｃｏ））によって３７度 、６０％ＣＯ₂の条件下で保持された。フィブロネクチン被覆表面の調製 ６ｍｍガラス・クローニング・リングをＶａｓｅｌｉｎｅ（Ｒ）を介して３５ ｍｍ組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に取りつけた。このクローニング・リングに よって囲まれた皿の表面をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，Ｓｉｇｍａ）に５０マイ クログラム／ｍｌフィブロネクチン溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ，＃１０５１−４０７）に混ぜたものを３０−５０マイクロリッターを付加 して、４℃の温度で一昼夜（あるいは、室温で４５分間でもよい）で培養するこ とによってフィブロネクチンで被覆した。過剰なフィブロネクチンを含んだ溶液 は細胞付加の直前にクローニング・リングから除去された。フィブロネクチンで被覆した皿へのＣＤ３４細胞の付着 一昼夜培養した後、細胞をＩＭＤＭ／Ｆ−ｓ−Ｓ内で８ｘ１０⁴細胞／ｍｌの 濃度で調製した。この細胞含有培養液（約２０００個の細胞を含む２５マイクロ リッター）をＴＳ１２／１６．２．１ハイブリドーマ細胞株（インテグリンβ₁ −ヒトＣＤ２９をつくりだすＡＴＣＣ♯ＨＢ−２４３）で２日間調節した２５マ イクロリッターの培養液（ＩＭＤＭ）と混ぜ合わせた。細胞／抗体混合物の５０ マイクロリッターをフィブロネクチンで被覆した表面を取り囲む６ｍｍガラス・ クローニング・リング内に入れた。細胞を抗体の存在下で６％のＣＯ₂の存在下 で３７℃の温度で３０分間以上フィブ ロネクチンに取り付けさせた。図１０Ａは活性化ＴＳ２／１６．２．１抗体を追 加せずにフィブロネクチン表面上で培養された細胞の一例を示している。細胞は ゆるやかに取り付いていたが、顕微注射には耐えられないであろう。図１０Ｂは 活性化ＴＳ２／１６．２．１の存在下でフィブロネクチン表面で培養された細胞 の一例を示している。これらの細胞は多数のマイクロスパイクの存在下でより拡 散し、顕微注射プロセスに耐えることができるようである。その後、１ｍｌのＩ ＭＤＭ／Ｆ−３−５をクローニング・リング外で付加して、細胞とクローニング ・リングを含む３５ｍｍプレートを６００ｒｐｍの回転速度で５分間（Ｂｅｃｋ ｍａｎ低速ＧＳ−６Ｒ遠心分離装置、振動バケット・ロータ、ブレーク・オフ） で回転させた。ＦＩＴＣ−デキストランと共にＣＤ３４⁺細胞の顕微注射 薄壁ホウケイ酸・ガラス毛管（Ｓｕｔｔｅｒ、１２ｍｍＯ．Ｄ．、０．９４ｍ ｍ Ｉ．Ｄ）から自動化ピペット・プーラー（Ｓｕｔｔｅｒ、Ｐ−８７，３ｍｍ ボックス・フィラメント）を用いて作成した。走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用い て同じ条件で引き出された顕微注射針の外径を判定したが、その外径は０．１７ −０．２２ミクロンの範囲であった。 （以下の文章は完結しておらず、ｐ４２は欠落しています）実施例２ 不動態化ＣＤ３４⁺／ＴＨＹ−１^lo原細胞へのＦＩＴＣ−デキストランの伝達 この実施例は外来分子の細胞、特に未成熟、未分化細胞への安定した組み込み のための本発明の有用性を実証するものである。原ＣＤ３４⁺／ＴＨＹ−１^lo細胞の精製 ＣＤ３４⁺／ＴＨＹ−１^lo細胞はほぼ１−４％のＣＤ３４⁺細胞でを含んでおり 、高度に原始的な造血細胞（長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）を多量に含んだ 細胞）の性質と同様の性質を示す。従って、それらは幹細胞の候補ポピュレーシ ョンである。これらの細胞を最初にＣＤ３４⁺細胞を免疫磁性分離し（Ｍｉｌｔ ｅｎｙｉ Ｍｉｎｉｍａｃｓ、実施例１参照）、その後ＰｅｒＣＰ−ＣＤ３４（ Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＰＥ−ＣＤ３８（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄ ｉｃｋｉｎｓｏｎ），及びＩＦＴＣ−Ｔｈｙ−１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体 を用いての蛍光活性細胞選別によって精製した。細胞の選別は自動細胞沈殿装置 を有するＢｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅを用い て行われた。これらの細胞の原始的な性質はＣＤ４５Ｒａ^-／ＣＤ７１^-フェノタ イプを表現するものが圧倒的過半数存在していることでさらに確かめられた。 細胞の培養、フィブロネクチン被覆皿の取り付け、ＦＩＴ Ｃデキストランと共に細胞の顕微注射、モニタリング及びその後の培養は実施例 １に述べたのと同様に行われた。細胞をフィブロネクチンに取り付けて、その状 態でそれらの細胞は顕微注射中にはがれなかった。それぞれ推定２−１０フェム トリッターの０．２５％ＦＩＴＣ−デキストランによって顕微注射された３２Ｃ Ｄ３４⁺／ＣＤ３８^-／Ｔｈｙ−１^lo細胞（実験８４、表２−３、図４）のうち、 ９個の細胞は顕微注射３９分後に蛍光陽性を示した。３つの蛍光性細胞は顕微注 射２４時間後にも存在していた。 実施例３ 顕微注射された不動態ＣＤ３４⁺細胞による赤変移緑色蛍光蛋白質の表現 本実施例は蛋白質をコード表現する外来核酸配列の安定した細胞への組み込み と、その修正された細胞によるその蛋白質の表現のための本発明の有用性を示す ものである。これを行うにあたって、本実施例はまた、遺伝子治療技術としての 本発明の有用性についても実証する。 ０．４５ミクロン顕微注射針を用いることによって、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ ）レポータ遺伝子表現が顕微注射から２４−２８時間後に不動体化されたＣＤ３ ４⁺細胞（６−８ミクロン直径）の５−１５％に達成できた。細胞はシトメガロ ウイルス（ＣＭＶ）プロモータ／エンハンサの制御下で不動態化された赤変移緑 色蛍光蛋白質を表現する５０ｍｇ／マイ クロリッターｐＧｒｅｅｎ ＬａｎｔｅｒｎＤＮＡプラスミド（Ｇｉｂｃｏ Ｂ ＲＬ）を２０−４０フェムトリッターと共に顕微注射された。それらの細胞の残 りは顕微注射ーピペット誘発細胞損壊あるいは過剰量の伝達によって死んだ。 外径が０．２ミクロンの顕微注射針を用いることによって、不動態化されたＣ Ｄ３４⁺細胞の５−１５％で顕微注射後２４−２８じかんにＧＦＰ表現が達成さ れた。 実施例４ 不動体化ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／Ｔｈｙ^lo細胞の顕微注射による赤変移緑色蛍光 蛋白質の表現 ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／Ｔｈｙ−１^lo細胞を単離して実施例２で述べた手順に 従ってフィブロネクチンに取りつけた。７０個の細胞を１０ｎｇ／マイクロリッ ターのｐＧｒｅｅｎ Ｌａｎｔｅｒｎ ＤＮＡを顕微注射緩衝液に溶かした溶液 の推定２−１０フェムトリッターと共に顕微注射した（実験９３、表２−３）。 ０．１７−０．２２ミクロン外径の顕微注射針を用いた。ＧＦＰ表現は顕微注射 から５時間後に８個の細胞で観察された。顕微注射から２４時間後には、５個の 細胞がＧＦＰ表現に陽性反応を示した。 実施例５ インテグリン／フィブロネクチン、コンカナバリナの比較と及び打ＣＤ３４に媒 介された取り付け 上に述べた不動態化の方法を、その強力にではあるが可逆的に非着生細胞、特 にＣＤ３４⁺を不動態化し、顕微注射に耐えられるようにする能力を比較した。 この調査では４つの条件を設定した。 （１）ＩＣＨ−３（ビオチネート化）抗ＣＤ３４ｍＡＢ［１００マイクログラ ム／ｍｌ］（非常に弱い取り付け、相互顕微注射は困難） （２）ＣｏｎＡ［１００マイクログラム／ｍｌ］（強力、取り付け、相互顕微 注射可能、自動顕微注射に耐える能力） （３）ポークウィード・ミトゲン［１００マイクログラム／ｍｌ］（弱い取り 付け） （４）フィブロネクチンへの抗ｂ１インテグリンの取り付け（強力な取り付け 、相互顕微注射可能、自動化顕微注射に耐える能力） ２つの調査で、ＣＤ３４⁺細胞のビオチニル化抗ＣＤ３４モノクローナル抗体 で被覆したプレートへの取り付けについて調べた。これら２つの調査で、プレー トは最初にビオチニル化抗ＣＤ３４ｍＡｂを加える前にグルタルアルデヒドで予 備被覆した（１００マイクログラム／ｍｌをＰＢＳに溶かしたもｎｏ、ＩＣＨ− ３構造体，ＣａｌＴａｇ）。１つの実験ではグルタルアルデヒドによる予備被覆 は行われなかった。細胞は最低限しか取りつかず（Ｂ）、『つばぎなわ』と呼ば れるタイプの取り付けであることを示した。これらの細胞は顕微注射には向かな かった。 同様の実験を（Ｃｏｎ Ａについて以下に述べるように）グルタルアルデヒド で予備的に被覆したレクチン・フィトロアッカ・アメリカーナ（ポークウィード ・ミトゲン、１００マイクログラムをＰＢＳに溶かしたもの、Ｓｉｇｍａ）につ いて行い、同様の結果を得た。ＣＤ３４⁺細胞は最低のレベルでしか取りつかず 、顕微注射は不可能であった。 Ｃｏｎ Ａで被覆したプレートにはＣＤ３４⁺細胞が強力に取りついた。Ｃｏ ｎ Ａで被覆したプレートは以下のように作成した。 １．グルタルアルデヒドで予備的に被覆 ２．組織培養皿に取り付けたクリーニング・リングに２．５％グルタルアルデヒ ドを加えて、４℃の温度で一昼夜沈着させる。 ３．消毒水で４回洗浄 ４．Ｃｏｎ Ａ、９０００マイクログラム／ｍｌをＰＢＳに溶かしたものを皿に 加えて３７℃で１時間放置してから、ＣＯｎ Ａを取り出す。 ５．細胞をクローニング・リングに加えて、３７℃で３０分間培養してからプレ ートを回転するか、あるいは抗ベータ１インテグリン活性化抗体（ＴＳ２／１６ ．２．１ハイブリドーマ細胞株、ＡＴＣＣ♯ＨＢ−３４、インテグリンβ₁−ヒ トＣＤ２９と反応する）の存在下でフィプロネクチンで被覆したプレートに入れ る。ビオチニルヒ化ＩＣＨ−３ 結果はＣＤ３４⁺細胞の不動体化表面への弱い取り付きを示し、顕微注射は困 難ではあるが、可能であることが示された。Ｃｏｎ Ａ 結果はＣＤ３４⁺細胞が不動態化表面への強力な取り付きを示し、相互及び自 動化顕微注射は実行可能であった。ポークウィード・ミトゲン 不動態化表面へのＣＤ３４⁺細胞の弱い取り付きを示した。抗ｂ₁インテグリン抗体 結果はＣＤ３４⁺細胞の不動態化表面への強力な取り付きを示し、相互及び顕 微注射共に可能であった。 実施例６ ９３７骨髄腫単核細胞の不動態化 本実施例では、形質導入細胞株、特にヒトＵ９３７骨髄腫単核細胞株を取り付 ける上での上に述べたインテグリン／フィブロネクチン不動態化方法の能力につ いて示す。これらの細胞は培養では懸濁細胞として継続的に成長する。Ｕ９３７ 細胞をフィブロネクチンで被覆したプレート（我々の標準的な手順で作成したフ ィブロネクチン・プレート）に抗体の存在下で単に付加した場合は、フィブロネ クチンに細胞が多少取り付き、一定程度の相互顕微注射は可能であった。フィブ ロネクチンで被覆したプレートでの培養中、Ｕ９３７細胞を８Ａ２あるいはＴＳ ２／１６．２．１のいずれかで培養した場合、取り付き量でのかなりの改善が認 められた。この場合も相互顕微注射はうまく行うことができた。 実施例７ ＴＳ２／１６．２．１モノクローナル抗体の存在化での完全なヒト・フィブロネ クチンへの懸濁液培養細胞の取り付きと拡散 活性化抗インテグリンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＴＳ２／１６．２．１が 存在している場合と存在していない場合の完全なヒト・フィブロネクチン（Ｆｎ ）への３つの懸濁液成長細胞の取り付きとその後の拡散のメカニズムについて調 べた。これまでに調べられた細胞タイプはＵ９３７、ヒト骨髄腫単核細胞株、Ｃ ＥＭ、ヒトリンパ芽腫白血病細胞株、及びｈＳＣ，ヒト一次造血性ＣＤ３４⁺脊 髄血液幹細胞である。 この一連の実験のためにヒトＦｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，製 品＃４０４５７）で予備的に被覆した市販されている培養皿を用いた。用いられ たＦｎはその基質が皿上で乾燥されたので変性されたものである。Ｕ９３７細胞 をｎＡｂの存在下で３７℃の温度で皿に入れて、種々の期間での取り付きと拡散 を調べた。取り付いた細胞の数はクローニング・リング内の細胞を数を直接数え ることで判定し た。ｍＡｂの存在下で、Ｕ９３７細胞はＦｎに急速に取り付いた。ほぼ１００％ の細胞がｍＡｂを添加してから２０分以内に取り付いた。細胞突起、拡大、そし てマイクロシュートポディアがすぐ認められた（図１３）。細胞拡張はしっかり した取り付きと関連しており、単純なつなぎなわではなかったので、顕微注射は うまく行えた。 ＣＥＭ細胞及びｈＳＣ（図１５）をＴＳ２／１６．２．１ｍＡｂの存在下でＦ ｎで被覆した皿に取り付けると、ほぼ１００％の細胞がそれぞれ３０分及び９０ 分以内に取り付いた。 これまでのところ、これらの細胞は活性化ｍＡｂが不在の場合はＦｎに対して 簡単には取り付かなかった。これはＦｎが立体的に存在していてもそうであった 。例えば、上にも述べたように、乾燥された変性Ｆｎで予備被覆した皿について も調べられた。変性されてはいないが団粒化した状態でのＦｎもＦｎをＰＢＳに 溶かしたもので皿を被覆して調製した。Ｆｎの天然の立体配座を保持した被覆手 順も用いられ、この場合Ｆｎは炭酸緩衝液内で被覆された。 実施例８ 市販されているＦＮ配列に基づくペプチドへの懸濁液成長細胞の取り付きと拡散 本発明は細胞の損壊を減らして表面への細胞の取り付きを促進するペプチド及 びペプチドの混合物（『カクテル』）の 使用のための本発明の有用性を実証するものである。着生分子（例えばフィブロ ネクチン）全体を使うかわりに、その分子の一部（遺伝子組換え表現あるいはプ ロテアーゼ消化でつくりだされたもの）、細胞表面着生分子を結合させる合成着 生ペプチドのカクテル（混合物）を用いて細胞が取り付くプレートの表面を被覆 することができる。 懸濁液成長細胞と取り付ける能力に関連してＦｎの種々の断片をテストした。 レトロネクチン（分子量＝６２，６１３；Ｒｎ）は市販されている（Ｐａｎ Ｖ ｅｒａ Ｃｏｒｐ；製品＃ＴＡＫＴ１００Ａ）遺伝子組換えヒトＦｎ断片でＲＧ Ｄ細胞結合領域（タイプＩＩＩ反復）、高親和性結合サイト、及びＣＳ−１サイ トをＬＤＶアミノ酸配列を含んだ交互スプライスＩＩＩＣＳ領域内に含んでいる （Ｋｉｍｉｚｕｋａ，Ｆら、１９９１）。ＲＧＤ及びＬＤＶアミノ酸配列はα₄ β１及びα₅β１インテグリンをそれぞれ結合させることは知られている。Ｒｎ はレトロウイルス遺伝子転移の効率を促進するために用いられている（Ｈａｎｅ ｎｂｅｒｇら、１９９６）。 培養皿をＰＢＳか炭酸緩衝液のどちらかで被覆した。Ｕ９３７をクローニング ・リング内の着生表面上に入れて、取り付き、拡散及び（ｍＡｂ取り出し後の） 脱着を完全Ｆｎの実験で述べたのと同じ手順で測定した。Ｕ９３７細胞はＴＳ２ ／１６．２．１ｍＡｂの存在下でＲｎに結合し、完全なＦｎの場合より急速な取 り付きと拡散を示した。Ｒｎでの細胞取 り付き及び拡散は活性化ｍＡｂが存在しない場合に起きた。本研究はＲｎでの取 り付きと拡散がｍＡｂの不在化でより効率的に行われることを示した。同様の結 果はｈＳＣをＲｎで取り付き拡散させた場合も得られた（図１７）。 α₄β₁あるいはα₁／β₁インテグリンを表現する細胞の取り付きを行わせるた めに、皿を取り付きの標的となるアミノ酸配列（例えば、フィブロネクチン結合 α₄／β₁のＣＳ−１領域からのアミノ酸のＬＤＶ配列を含む配列や、フィブロネ クチン結合α₅／β₁のＲＧＤアミノ酸配列を含んだ配列）を含むペプチド（未修 正、あるいは細胞表面着生分子に対する親和性を増大させるため、あるいは培養 皿の被覆を容易にするために化学的に修正したもの）で被覆することも可能であ る。 実施例９ インテグリン／フィブロネクチン不動態化ＣＤ３４⁺細胞による造血性コロニー 形成活性の保持 本実施例はＣＤ３４⁺などの未分化細胞タイプを遺伝子的に修正するための有 効なメカニズムを提供する上での本発明の有用性を示すものである。こうした方 法で、本実施例は動物に提供される細胞を用い、その細胞がその動物に対して未 分化の状態で提供され特定の遺伝子やあるいはその遺伝子の断片を含む状態で提 供される遺伝子治療を行う方法のための本発明の有用性を示すものでもある。 ＣＤ３４⁺細胞を実施例１で述べたように免疫磁性的に精製した。第一の研究 では、インテグリン／フィブロネクチン不動態化ＣＤ３４⁺細胞（不動態化状態 で一昼夜保持され、その後コロニー・アッセイのために取り出されたもの）のコ ロニー形成能力を細胞がインテグリン／フィブロネクチンで不動態化されなかっ た場合の培養条件と同様の条件下で保持されたＣＤ３４⁺と比較された（図３） 。インテグリン／フィブロネクチン不動態化のために、ＩＭＤＭ／Ｆ−３−Ｓ内 の２０００個のＣＤ３４⁺細胞を等量のＴＳ２／１６．２．１ハイブリドーマ細 胞株で２日間調製したＩＭＤＭ培養液と混合して、フィブロネクチンで予め被覆 した９６ウェル・プレートに入れた。比較対象のウェルにはＩＭＤＭ／Ｆ−３− Ｆだけに２０００個のＣＤ３４⁺を入れた。翌日、細胞（不動態化された、ある いは比較対象）をウエルから回収して、１ｍｌのＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培養液（０ ．９％メチルセルロース、３０％仔ウシ胎児血清、１％仔ウシ血清アルブミン、 １０−４Ｍ２−メルカプトエタノール、２ｍＭのグルタミン、５０ｎｇ／ｍｌヒ トＳＣＦ、１０ｍｇ／ｍｌヒトＣＭ−ＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−３及び ３単位／ｍｌエリスロポエチン（ＳｔｅｍＣｅ１１ Ｔｅｃｈｎｏ１ｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を含む）の入った３５ｍｍ皿に二組づつ入れ、その１６日後に、Ｃ ＦＵ誘導コロニーの数を調べた。ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｇ及びＣＦＵ−Ｍの総 数を合計してＡｍｙｅｌｏｉｄコロニーの数を調べ、不動態化細胞からのエリス ロイド・コロニー（ＢＦＵＥ−Ｅ）及びミエロイド・コロニーの両方の結果とも 非不動態化比較対象に対する割合として示した（図３）。第二の実験で、９６ウ ェル・プレートの３ウェルを４℃で一昼夜培養して、その後水で４回洗浄して、 そして、１００マイクログラム／コンカナバリン Ａで２時間、３７℃の温度で 被覆した。その後、過剰なフィブロネクチン及びＣｏｎＡを取り除いた。２５マ イクロリッターＩＭＤＭ／Ｆ−３−Ｓ内に２０００個の細胞を入れたものを３つ のフィブロネクチンで被覆したウェルのそれぞれに加えた。また、５０マイクロ タイターＩＭＤＭ／Ｆ−３−Ｓ内に２０００個の細胞を入れたものを未処理の３ つのウェル（比較対象）のそれぞれに加えた。一昼夜培養した後、細胞を各条件 （つまりインテグリン／フィブロネクチン、ＣｏｎＡ、比較対象）のそれぞれの ２つのウェルの内の一方から取り出して、インテグリン／フィブロネクチン不動 態化細胞：１８３ＢＦＵ−Ｅ，１９ＣＦＵ−ＧＭ、１１ＧＦＵ−ＧＥＭＭ、１３ ＣＦＵ−Ｇ、２４ＣＦＵ−Ｍを含んだ１ｍｌのメチルセルロース内に入れた。Ｃ ｏｎ Ａ不動態化細胞の場合、１５５ＢＦＵ−Ｅ、１１ＧＦＵ−ＧＭ、８ＣＦＵ −ＧＥＭＭ、１５ＣＦＵ−Ｇ、１７ＣＦＵ−Ｍ。比較対象の細胞の場合：１６９ ＢＦＵ−Ｅ、２０ＣＦＵ−ＧＭ、８ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、２０ＣＦＵ−Ｇ、２７Ｃ ＦＵ−Ｍ。 第三の実験は第二の実験と同様の手順で行われた。不動態化されていない細胞 をインテグリン／フィブロネクチン及び Ｃｏｎ Ａ取り付け細胞：インテグリｎｎ／フィブロネクチン：５０ＢＦＵ−Ｅ ，３５ＣＦＵ−Ｇ、ＭＧ又はＭ、１．５ＣＦＵ−ＧＥＭＭ；Ｃｏｎ Ａ：６５Ｂ ＦＵ−Ｅ、２６ＣＦＵ−Ｇ、ＧＭ又はＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ；比較対象：５２Ｂ ＦＵ−Ｅ，５０ＣＰＵ−Ｇ，ＧＭ、又はＭ、０．５ＣＦＵ−ＧＥＭＭと比較した 。 これら３つのインテグリン／フィブロネクチン不動態化研究の結果は不動態化 細胞と非不動態化細胞からそれぞれ誘導されたコロニーの数やサイズには大した 影響（抑制的にも刺激的にも）は認められなかった。Ｃｏｎ Ａを介して不動態 化された細胞では顆粒球／マクロファージ・タイプのコロニーが比較対象の非不 動態化細胞に対して５０％程度減少した（図３）。実施例１０ 特定の細胞機能に対するＴＳ２／１６．２．１の影響 ３つの異なった細胞パラメータ（成長可能性、増殖、そして原始的な幹細胞活 性の保持）に対するｍＡｂ露出の影響について調べた。Ｕ９３７細胞をｍＡｂの 存在している場合と不在の場合の両方で市販されているＦｎ被覆皿を播種した。 成長可能性はトリパン・ブルー排出で判定し、増殖についてはヘモサイトメータ で直接細胞を数えることによって判定した。ｍＡｂでの措置は細胞の成長性には 影響を及ぼさなかった。Ｕ９３７細胞の成長性はｍＡｂが存在している場合（９ ６．４％）と不在の場合（９５．８％）との間に有意差はなかった。ＣＥＭとｈ ＳＣでも同様の結果が得られた（図１６）。Ｕ９３７細胞及びＣＥＭ細胞の増殖 はｍＡｂ露出には影響を受けなかった。細胞数増加の割合はｍＡｂが存在する場 合と不在の場合とで同様であった（図１４）。予備的な研究ではｈＳＣは適切な サイトカイン・カクテルで刺激を与えた場合、ｍＡｂが存在していても比較対象 と同じ速度で増殖できることが示された（図１６）。 ＮＯＤ／ＳＣＩＤ再構成アッセイを用いてｈＳＣ内の原始的造血性幹細胞での ｍＡｂ露出及びその後のＦｎ及びＲｎへの取り付け、放出の影響を調べた。本研 究は活性化ｍＡｂへの露出後のＦｎに対する取り付けも活性化ｍＡｂなしでのＲ ｎへの取り付きのいずれもＮＯＤ／ＳＣＩＤ再構成活性の保持を可能にすること を示した。実施例１１ 着生基質からの細胞の切り離しのための種々の薬剤の使用 細胞切り離し手順のための必要条件 １）細胞に対して毒性がなく、細胞を損壊しないこと、２）分化やその他の生 物学的効果を開始させて細胞に幹細胞活性を失わせないこと、３）急速で効率的 に反応を行い、短時間に細胞の大部分を放出させること（図２）。これは治療的 作用の可能性を有する核酸配列を含むように修正された幹細胞を細胞プレートか ら動物に移す必要がある時に特に重要である。物理的及び／又は化学的破壊作用 による損壊効果をできるだけ少なくすることによって、成長性を保持した細胞の 数を最適化されるので、措置に提供される細胞の数が増大される。細胞の自発的な離脱 細胞の損壊をできるだけ少なくするようにして細胞を切り離すことが必要であ るから、活性化抗体を取り除いた後で細胞離脱のメカニズムについて調べた。市 販されているＦｎで被覆された皿（変性Ｆｎ）からのＵ９３７細胞の離脱は緩衝 液で洗浄することによってｍＡｂを取り除いた後、自発的に起きた（図１３）。 細胞のほぼ５０％はｍＡｂ除去から２４時間に離脱し、４３時間後までにはほぼ １００％が離脱した。緩衝液流をピペットを介して細胞上にゆっくりと直接か けることによってより急速な放出が行われるであろう。Ｕ９３７細胞を天然の、 あるいは団粒化されたＦｎ上に入れると、離脱はよりゆっくり起きた。 ｍＡｂの単純に除去した後、Ｕ９３７細胞及びｈＳＣの離脱は起きなかった。 この効果はＲｎを炭酸緩衝液かＰＢＳ内のいずれで被覆するかには関係なく認め られた。 ｈＳＣはｍＡｂの除去後の自発的離脱にはより抵抗性を示した。細胞の４０％ 程度だけがｍＡｂ除去後４８時間以内にＦｎから自発的に離脱した（図１５）。 しかしながら、これらの細胞は、上にＵ９３７に関して述べたのと同様にピペッ ティングによって効率的に放出することができた。フィブロネクチン配列に基づくペプチド配列を用いての細胞の切り離し 接着剤（例えばＬＤＶ又はＲＧＢ配列を含むペプチド類）内の標的とされるア ミノ酸配列に対応するペプチド配列（未修正あるいは細胞表面に表現された着生 分子に対する親和性を増大するために化学的に修正したもの）を不動態化状態か ら切り離すための放出剤として用いることができるのではないかと予想される。 この場合も、いくつかの着生／着生的相互作用を伴う細胞不動態化がペプチドの カクテルで最もうまく行われるのではないかと予想される。レトロネクチンが細 胞の取り付きを促進するために用いられる例として、以下の組成物を単独あるい は組み合わせで細胞を離脱させるために 用いることができる：つまり、１）ＬＤＶ配列はフィブロネクチンに結合するα₄ β₁に影響を及ぼし、２）ＲＧＤ配列はフィブルネクチンに結合するα₅β₁に干 渉する。 発明者による研究の結果では、ＬＤＶ又はＲＧＤ配列を含んだペプチドはＦｎ 及びＲｎからのｈＳＣの離脱を促進することが示された。抗体を用いた細胞の切り離し 着生表面からの細胞の切り離しは着生分子と接着剤（例えば抗β₁、抗α₄、抗 −ＶＬＡ−４、抗−ＣＳ−１抗体）との間の正常な相互作用を妨害する抗体によ って達成することができる。切り離しは着生分子と接着剤との間の正常な相互作 用に影響を与える可能性があるモノ−又はポリ−サッカロイド類（又は他の荷電 分子、例えば脂質、ポリアニオン及びポリカチオン）によって達成することがで きる。種々の薬剤を用いた細胞の切り離し 着生表面から細胞を切り離すために種々の薬剤を用いることができる。例えば 、１：ポリアニオンはヘバリン結合サイトへのヘパリン結合サイト（例えば、ヘ パリン、ヘパリン・スルフェート、他のポリサッカロイドなど）を破壊する可能 性がある、２：ある種の二価カチオン（例えば、カルシウム）−インテグリン機 能を破壊することが知られている、３：ある種のキレート化剤（例えば、ＥＤＴ Ａ又はＥＧＴＡ）− インテグリン機能を破壊することが知られている、４：ディスインテグリン−最 初ヘビ毒から得られた天然発生可溶性蛋白質（Ｓｌｏｂｅｌ，Ｃ．Ｐ．、１９９ ７）で、インテグリン結合配列を含んでいる、５：上の組み合わせ。 実施例１２ 顕微注射針作成の方法 本実施例は本発明による顕微注射針作成に用いられる方法の概要を示すもので ある。当業者であれば容易に分かるように、この手順は多大な実験を繰り返さな くても異なった直径の針を作成するために用いることができる。 外形が０．２＋／−０．０２ミクロン程度のファイン・ガラス製顕微注射針を 自動ピペット・プーラー（Ｓｕｔｔｅｒ、ｐ−８７、３ｍｍボックス・フィラメ ント）を用いて薄壁ホウケイ酸・ガラス毛管から作成した。平均外径が０．１２ ミクロン、０．１５ミクロン、あるいは０．１７ミクロンのより細かなガラスに よる顕微注射針を薄壁ホウケイ酸・ガラス毛管（Ｓｕｔｔｅｒ、１．２．．外径 、０．６ｍｍ内径）からＳｕｔｔｅｒｐ−８７ピペット・プラーを用いて作成し た。温度、引っ張り速度、及び圧力などのパラメータは各針サイズに合わせて最 適化した。引っ張り後の針の外径を迅速に制御するために、電解質を充填したサ ンプル針上で抵抗性の測定を行った。測定された抵抗性を較正曲線と比較して、 針先端の直径の妥当な推定値を得ることができる。ＳＥＭに よって検証が行われ、自動的に引き出された針が構造的な一体性と統一の取れた 先端形状を有していることが確認された。 実施例１３ 保持ピペットの作成 保持ピペットはＤｅＦｏｎｂｒｕｎｅファイクロファージを用いて作成した。 ガラス毛管に適当な曲げをつけて、加熱フィラメント内側に位置する毛管から１ −５グラムを吊り下げることができるようなチャック・アセンブリ・ホルダーに 適合させるようにした。熱を加えてガラスを軟化させたところ、ガラス毛管を１ −３ミクロン直径にするような重りが形成され、その時点でそこから上記の重り が吊り下げられているガラス毛管の部分が破断して、後に１−３ミクロン径の先 端直径を有する保持ピペットが形成されて残った。その後先端を加熱フィラメン トに近付けて先端を加熱研磨したところ、開口部が０．５−２．５ミクロンの滑 らかな先端がもたらされた。この保持ピペットを注射針の先端に取り付けて、細 胞を顕微注射手順のための場所に保持する真空をつくりだすのに用いることがで きる。 そうした保持ピペットを作成する際、ＤｅＦｏｎｂｒｕｎｅマイクロファージ だけに限られない。例えば、毛管を上に述べた寸法に引っ張るために、いずれの 市販の針プーラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎａｒｉｓｈｉｇ ｅ，Ｋｏｐｆ）を用いてもよい。しかしながら、先端は加熱研磨して、マイクロ フアージ（Ｄｅｆｏｒｂｒｕｎｅ又はＮａｒｉｓｈｉｇｅ）を用いて保持ピペッ トに適度の曲げをつけなければならない。 実施例１４ 顕微注射及び保持ピペットを用いた顕微注射方法 本実施例は核酸を細胞のクロモソームＤＮＡ値遺伝子に導入するために本発明 による顕微注射技術を用いる方法を詳述するものである。特に、この技術は真空 を用いて細胞を安定させる保持ピペットを用いる。いくつかの実施の形態では、 ここで述べられる技術及びその変形例は遺伝子的に修正された細胞をより急速に 生産するために自動化することができる。 また、背後に物質を有し、さらに後で注入するために一定の場所に多数の細胞 を保持するのに十分なポートを有する注射チェンバーを用いることもできる。い くつかの実施の形態ではこのチェンバーは位相対照顕微鏡を用いた反転顕微鏡と 組み合わせて用いられる。 実施例１５ ホウケイ酸又は石英針を用いた顕微注射後のＵ９３７細胞の成長可能性 １．石英針 実施例１６ ボロオシリケート又は石英針を用いての骨髄液注入後の幹ＣＤ３４⁺の成長可能 性 本実施例は骨髄液注入による成長可能な遺伝子的に修正された細胞を提供する 上での本発明の有用性を実証するものである。 １．石英針 ２．ホウケイ酸針 石英注射針（バージョン１．０ Ｑ−ｈＳＣ：０．０７ミクロン外径）及びホ ウケイ酸注射針（バージョン１．０Ｂ−ｈＳＣ：０．２５ミクロン外径）を用い て得られた成長性％データ。そうした針を用いてＵ９３７（図１６及び２６）と 一次ヒト造血性ＣＤ３４⁺脊髄血液幹細胞（図１９及び２７）を注入した。そう した細胞は実施例１で述べたように注射用に調製された。幹細胞はデキストラン （検出可能な蛍光分子）と接合されたオレゴン・グリーンと共に核内部に注入さ れ、２、２４及び４８時間後の成長性％について調べた。成長性に関する研究に ついては図１８及び１９を、そして実験を行うために用いられた針の先端の外径 （走査電子顕微鏡）に関するデータについては図２０と２１をそれぞれ参照のこ と。図２６と２７に示すグラフを作成するために用いたデータに関しては表４、 ５、６及び７を参照。図１８と１９は最初の実験で得られたデータを示している 。図２６と２７はこれらの実験と、同じ条件で行われたその後の研究との累積デ ータを示している。 バージョン１．０Ｂ及びバージョン１．０Ｑ針は表２及び３に示すデータより かなり高い成長性を一貫して示す。なおこれらの新しいデータは表２及び３に示 すデータを裏付け、 拡張するするものである。表２と３に示すすべてのデータはＣＤ３４⁺細胞への 手作業による核注入を実行する際に集められたものであり、新しいデータはＣＤ ３４⁺及びＵ９３７細胞の両方への半自動核注入を行いながら得られたものであ る。細胞を損壊したり、細胞の成長可能性に重大な影響を及ぼすことなしに半自 動あるいは自動顕微注射方式を用いるのに十分に細胞を取りつけることが重要で 、そうすれば多数の細胞が短時間に注入されるからであろう。図１８と図１９に 示すデータは我々の従来の研究と、ＤＮＡ及び蛋白質を遺伝子治療手順の一部と してＣＤ３４⁺の核内に伝達するために半自動及び自動的注入方式を用いること ができるという我々のこれまでの主張を裏付けるものである。 バージョン１．０Ｂ及びバージョン１．０Ｑ針は、表２及び３に示すデータを 作成するために用いられたホウケイ酸針と比較して（ＤｅＦｏｎｂｒｕｎｅマイ クロフォージを用いてか、あるいは新しい針を引くために開発された別の針引っ 張りプログラムのいずれかを用いてつくられた従来のプロトタイプ針）と比較し て流れの点での改善が認められた。表２と３に示されるデータに示されるように 、従来のプロトタイプ針を用いて細胞を注入することはできるが、５０回の注射 を行うために通常５本程度の針が必要であった。このプロトタイプ針は流動性に 関する問題を持っており、非常に簡単に差し込むことができる。バージョン１． ０Ｂとバージョン１．０Ｑ針の場合、流動性は改善されるが、バージョン１．０ Ｂ針は通常針１本あたり５０個以上の細胞を注入するために用いることができる 。バージョン１．０Ｑ針は通常針１本あたり２５個程度の細胞を注入するために 用いることができる。 実施例１７ 走査電子顕微鏡用の針の作成 針先端はＳＣＤ００４Ｂａｌ−Ｔｅｃスパッター・コーターを用いて１ｍＡで １２０秒間金−パラジウムでスパッター・コーティングされた。この針先端をそ の後走査してＰｈｉｌｌｉｐｓ５２５Ｍ走査電子顕微鏡を用いて１５ＫＶで写真 を撮った。外径測定を行い、０．０４６ミクロン・コート値を補正値として差し 引いた。図２８は１．０Ｂ（２８Ａ）と１．０Ｑ（２８Ｂ）針の走査顕微鏡画像 の写真を示す。 上の測定値から得られた統計は以下の通りである。 実施例１８ 顕微注射技術の改良 うまく行く注射のモニタリング Ａ．注射手順全体を通じての抵抗性測定は注射手順全体で針からの流れを観察 して、図５に示すような針ホルグーを調節することで行われた。 針内の流れが順調であれば、針先端直径に基づいて、針が細胞に入り込むまで 比抵抗性測定を行うべきである（図Ｂｒｏｗｎ Ｋ．Ｔ及びＤ．Ｇ．Ｆｌａｍｉ ｎｇ：Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｐｈｉｓｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９２，ｐ．１５７） Ｂ．核注入をモニターするためには、核に注入されるとその細胞を傷つけず、 細胞機能を損なわずに生きた細胞内で検出できる表現ベクターを入れる（例えば 、ｐＣＭＶ−ＧＥＰ表現ベクター）。 Ｃ．核あるいは細胞質注入をモニターするためには、検出可能な分子（例えば 、デキストランと接合されたオレゴン・グリーン）を注入して、経時変化を追跡 する。 Ｄ．注射の成功を示す可聴信号を発生する音響装置をアセンブリに組み込むこ とも可能（図２５）。注射針の改良 Ａ．いくつかの場合、注射サンプルは石英やホウケイ酸にくっつきやすかった り、針がつまってしまったり、あるいは針を被覆して細胞内に注入したり分子を 希釈してしまう場合がある。平均外径が０．７ミクロンの石英バージョンも含め てこれら小さな針をシリコン化できるようにする手順を開発した。我々は形質導 入動物を発生させるために用いられるずっと大型の針のシリコン化の手順に従う ものである（ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ，Ｍ．Ｌ，ＨｅｒｍａｎｓＳ．Ａ．，ＭＡ ｒｔｉｎｅｓ−Ｓａｌａｓ，Ｅ．，Ｃｈａｌｉｆｏｕｒ，Ｌ．Ｅ．，Ｄ．Ｏ．， Ｃｕｐｏ，Ｄ．Ｙ．及びＭｉｒａｎｄａ：”Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｎｇ Ｄ ＮＡ ｉｎｔｏ Ｍｏｕｓｅ ＯＶａ ｔｏ Ｓｔｕｄｙ ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉ ｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｏ Ｐｒｏｄｕｃｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ”：Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：６：６６２−６８０，１ ９８８）。 注入ピペットはメキサメチルジシラザン（Ｐｉｅｃｅ）の小さなビーカーから 蒸気を満たしたデシケータ内で２−４日の時間をかけてシリコン化される。これ らの手順は注射針全体を被覆するシリコンの単分子層を作り出す。残念なことに 、現在我々が用いている小さな針の場合、この手順は注射針の毛管充填を不可能 にし、針の末端に気泡を発生させ、これらの気泡は追い出すことができない。我 々は、小さなガラス・フィラメントをつくることによって、この気泡を追い出し 、流れのよい針をつくりだすことができることを発見した（図２２）。 Ｂ．Ｓｕｔｔｅｒマイクロピペット・ビベラーを用いて、 これらの針にビベルをつけることで、小さな幹細胞を注入するのに用いられた場 合にその成長率を改良することができる。 Ｃ．小さな針：バージョン１．０Ｑ及び１．０Ｂ（下図参照）を使ったいくつ かの実験で、針のフレアが針の装填と針からのフローの両方にとって重要な役割 を演じる。石英針を引くためにＰ２０００針プーラーを用いた。これは大きなフ レアを有する小型の針点端部をつくりだした。 バージョン１．０Ｂ（外径０．２５ミクロン）針からの抵抗性測定値はバージ ョン１．０Ｑ針（外径、０．０７ミクロン）とほぼ同様であった。１．０Ｑ針は 外径がずっと小さい。バージョン１．０Ｑ針はバージョン１．０Ｂより大きなフ レアを有しており、適切な圧力が加えられた場合に流れも良いが、小さな外径（ ０．０７ミクロン）を有するホウケイ酸針はこの特定の注入装置でつくりだすこ とができる圧力を越えた圧力を必要とする。 １：フレア先端 ２：バージョン１．０Ｑ ３：形成されるフレア領域 ４：バージョン１．０Ｂ フレアは針の流動性を決める重要な特性である。表１０と１２を参照して分か るように、石英注射針（バージョン１． ０Ｑ）はホウケイ酸針（バージョン１．０Ｂ）より大きなフレアを有している。 ホウケイ酸針の場合のＤ１：Ｄ２の比率はいくつかの実施の形態では１：１．８ から約１：３の範囲である。石英針（バージョン１．ｏＱ）はいくつかの実施例 で１：３から約１：１８の範囲のＤ１：Ｄ２比率を有している。Ｌは図に置いて はフレア先端Ｄ１と直径Ｄ２との間の距離（長さ）を示している。表２で測定さ れた実際の針では、Ｄ１とＤ２との間の長さは１．３ミクロンであった。 約１：約２０、あるいは約１：約２から約１：約１０の範囲のＤ１：Ｄ２比率 は本発明のいくつかの実施の形態によるＤ１：Ｄ２幅比を提供する。他の面で、 本発明は幅が約１；約７、又は約１：約６、又は約１：約５、又は約１：約４、 又は約１：約３、又は約１：約２．５の比率を提供し、約１：１．５から約１： ２．５の範囲の比率は本発明の範囲内であろう。 Ｄ．顕微注射針の作成に用いられた毛管は内部フィラメントを有している。こ の内部フィラメントはとりわけ装填手順中の針の先端へのサンプルの流れを促進 する。装填プロセスは毛管の動きを増大させるフィラメントによっても助けられ る。小さな外形の注射針の装填時、その針はゆっくりと装填する必要がある。こ れによって、針の先端に気泡が生ずるのをできるだけ減らすことができる。気泡 が導入されると、それらは針から外に追い出すことができず、その針を取り替え る必要が生じる。D1:D2比率が生じると、有効に装填される針の数が増え、気泡の 導入頻度は減る。 Ｅ．小さな針の水和化も針の適切な装填を考える場合のひとつのファクターで ある。最適には、針はそれが液抜きされたのと同じ日に使われるべきである。針 の液抜きの準備にあたっては、毛管を真空に露出させて、その毛管から溶液を引 き出すようにしてもよい。例として、以下の流体を毛管を通じて引き出してもよ い。 １．ガラスを親水性にするためのＤｒｉＣｏｔｅ（Ｆｉｓｈｅｒ） ２．アセトン ３．ろ過７０％エタノール−脱水 当業者に知られているその他の溶液を用いて毛管の液抜きを行ってもよく、ま たそれらの溶液を本発明の針の作成時に持ちいてもよい。 毛管をその後２００℃で最大１時間焼成して、その後Ｐ９８プーラーあるいは Ｐ２０００プラー（両方ともＳｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて 液抜きする。液抜きされたのと同じ日に用いられる針が流れに関しては最も良好 な性能を発揮する。時間が経つと、針の有用性が低下する。針は二日間保存した 後では流れが止まる。これは静電作用を通じて時間が経つと引き寄せられる特殊 な物質が原因であり、針を詰まらせてしまう。いくつかの例ではこれがあてはま るが、針の大部分は少なくとも部分的には（特に湿った状態で）水和化されるこ とによって、その性能を失ってしまうものと考えられる。時間が経つと、針に注 入サンプルを装填しようとすると、針の先端に気泡が多数発生する。これによっ て注入サンプルが流れない針が生じることになる。この技術では、気泡を追い出 すのに必要な圧力をつくりだすことはできない。しかしながら、針を２００℃の 温度で１時間焼成することで、針の気泡をできるだけ少なくして、流動性を回復 することができる。実施例１９ 細胞注入ワーク・ステーション 本実施例は細胞の顕微注射で用いるための本発明のワーク・ステーションを定 義する。ここで述べられるものから多数の異なった構成のワーク・ステーション を考えることができるが、ここでは本発明から考えられる１つの具体的な構成に ついて説明する。１つの実施の形態で提供されるワーク・ステーションを図２５ に示す。このワーク・ステーションは顕微鏡台を含んでいる。 自動注入装置を用いた顕微注射技術のひとつの必要条件はその注入装置はその 針をその細胞内にその細胞をつきでないで、さらに硬い組織培養プラスチックに 接触せずにどの程度の深さまで差し込むかについて決めなければならない。場合 によっては、組織培養皿の表面の不均一性から、針が組織培養プラスチックに触 れて、針を壊してしまう。こうした問題を回避するためにいくつかの方法が可能 である。 １．針が細胞より大きな何かに触れたことを示す圧力センサーをマイクロマニ ピュレータ内に配置する。 ２．針の先端の組織培養皿に対する位置をモニターして、先端が組織培養皿の 表面と近づく度にマイクロマニピュレータの動作を停止させるレーザー、ソナー 、あるいはレーグー装置を設置する。 ３．針が破壊しないで突き刺さることができる組成物で組織培養皿を一時的に 被覆する。この一時的なコーティングの 一部として細胞取り付け分子を用いることもできる。 実施例２０ 顕微注射プレート 実例Ａ：Ｓｉｎｇｈｖｉ，Ｒ．Ａ．Ｋｕｍａｒ，Ｇ．Ｐ．Ｌｏｐｅｚ、Ｇ．Ｎ ．Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｉ．Ｃ．Ｗａｎｇ，Ｇ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅ ｓｉｄｅｓ及びＤ．Ｅ．Ｉｎｇｂｅｒ：”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＣｅｌｌＳ ｈａｐｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：６９６−２ ５ ６８９（１９９４）。 この技術は金の表面を予め決めたアルカンチオールの自己集合単層をインプリ ントするためにエラストマー性スタンプ（ポリエチル−シロキサン）を用いる。 スタンプを透明にすることができないと、こうした方式に関連した問題が発生す る可能性がある（実例Ｃ、図２３参照）。 実例Ｂ：注射針を含んだマニフォルドの場合と同じパターンで構成された外径 ５０１０ミクロンの針を含むマニフォルドを着生分子を含む溶液の液滴を培養面 に滴下させるために用いる（図２４）。その後、細胞を着生アイランド上に入れ てから、注射針を含んだマニフォルドを用いて細胞を注入する。 実例Ｃ：Ｍｒｋｓｉｃｋ，Ｍ．，Ｌ．Ｅ．Ｄｉｋｅ，Ｇ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉ ｄｅｓ：”Ｕｓｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｃｏｎｔａｃｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｔｏ Ｐａｔｔｅｒｎ ｔ ｈｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｓｅｌｆ Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ ｏｆ Ａｌｋａｎｅｔ ｈｉｏｌａｔｅｓ ｏｎ Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ ｏｆ Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒ”Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２３５：３０５（１９９７）。 この技術は金及び銀の透明な薄膜を用いて注入をモニターするために位相対照 顕微鏡を用いることができるようにすることを除いて、実例Ａの場合と同じ原理 を用いる。 実施例２１ 遺伝子療法 本実例は上に述べられた注射組成物と顕微注射技術を用いての遺伝子治療手順 で使用する上での本発明の有用性を実証するものである。同じ技術を用いて、レ トロウイルス、アデノウイルス、あるいはその他の基剤を用いないで細胞の核酸 内に核酸を導入するための別の方法が提供される。 幹細胞顕微注射の遺伝子治療への応用は以下の要素を含む。１−１０ ｘ １ ０³の高度に増強された幹細胞を血液から入手して、一時的に不動態化する。こ れらの細胞の顕微注射によって再生可能な量を含んだＤＮＡと場合によっては融 合酵素−１−３個のＤＮＡのコピーを細胞に融合させる。サイズが１５−２５ｋ ｂで２つの独立した調節形質導入遺伝子を含んだ顕微注射されたＤＮＡが再構成 なしで融合され る。幹細胞内での表現を目標とする１つの形質導入遺伝子はイン・ビトロ（例え ば、ｒｓＧＦＰ、又は先端が切断された成長因子レセプタ；ｔＮＧ−Ｒ）あるい はイン・ビボ（例えばＭＧＭＴ）での形質導入された幹細胞選択を行う。治療用 形質導入遺伝子（例えばＡＤＡ ＳＣＩＤ用のＤＮＡ、ヘモグロビン病態のため のグロビン、化学抵抗性に対するＭＤＲ−Ｉ）が適切な造血性細胞での表現の対 象とされる。 上記は本発明の具体的な実施の形態の詳細な説明である。本開示の分野の当業 者は本発明の範囲と精神を逸脱しないでここに開示された実施の形態の修正を行 うことが可能であることは容易に分かるであろう。ここで開示、権利請求されて いる組成物のすべては本開示に照らして過度の実験を行うことなしに作成、実行 できるものである。本発明の全範囲を添付する特許請求の範囲に詳述する。従っ て、これらの請求項と軽鎖移動床は本発明の権利が適用されるすべての範囲を不 当にせばめないように解釈されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 35/12 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 非ウイルス媒介の細胞への巨大分子の取り込みの以下の方法を含む方法： 幹細胞又は前駆細胞を幹細胞又は前駆細胞が提供する表に細胞の接着を支え ることができる接着タンパク質断片を含むを含む表面への固定化。 修飾された幹細胞及び前駆細胞が豊富な群を提供するために固定化細胞に対 する分子の導入。 ２． 細胞に造血幹細胞が含まれる請求項１の方法。 ３． 表面がフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、エピリグリン、インバ シン、オストスポンジン、トロンボスポンジン、プロテオグリカン、グリコサミ ノグリカン、ＵＣＡＭ、ＩＣＡＭ及びＶＣＡＭ−１で構成される群から選択され た接着分子で処理されている請求項１の方法 ４． 接着分子断片がフィブロネクチン断片である請求項３の方法 ５． 細胞接着促進フィブロネクチン断片がレトロネクチン分子の請求項４の方 法。 ６． 細胞に核酸が微量注入によって導入される請求項１の方法。 ７． 分子が核酸で豊富な細胞群ががさらに遺伝的に修飾された細胞と定義され た請求項１の方法。 ８． 核酸が治療剤をコードする配列を含む請求項１の方法。 ９． 巨大分子がフレアー領域を持ち、前記フレアー領域が直径Ｄ１及び直径Ｄ ２のフレアーチップを所有し、Ｄ１：Ｄ２の比率が約１：２から約１：２０で、 Ｄ１とＤ２の間の距離がＬである微量注入針を使用する微量注入法により細胞に 誘導される請求項１の方法。 １０． 集団の細胞への分子の取り込みの方法で以下の含む方法。 処理表面に供給される細胞接着分子又は断片を含む調製物による細胞の接着 に適する表面の処理； 前記処理表面に対する微量注入によって分離に抵抗することができる細胞の 接着を促進するのに十分な時間での非接着細胞の露出；及び 修飾細胞群を供給するための接着細胞への分子の導入１ １１． 細胞に造血幹細胞が含まれる請求項１０の方法。 １２． 処理された細胞の表面に対する接着を可能にする発現したインテグリン を持つ処理細胞を提供するように処理された前記非接着細胞群である請求項１０ の方法。 １３． 前記処理表面がのフィブロネクチンの接着分子又は細胞接着断片で処理 された表面である請求項１２の方法。 １４． フィブロネクチンの細胞接着断片がレトロネクチンである請求項１３の 方法。 １５． 非接着細胞が治療剤遺伝子を含んだ造血幹細胞である請求項１０の方法 。 １６． 細胞注入の器機で、以下を含む器機。 フレアー領域及びフレアーチップを所有し、前記フレアーチップの外 径が約０．０５ミクロンから約０．５ミクロンである微量注入針；及 び 生物接着分子の形式が固定化されている、細胞接 着可能な皿。 １７． 固定化された形式が生物接着分子がない皿内の地域を含む請求項１５の 器機。 １８． 多数の微量注入針が安全に保持することができる多微小針マニフォール ドを含む請求項１６の方法。 １９． 次の物が含まれるキット。 ２つ以上の容器手段を持った運搬手段。 第一の容器手段にはフレアーチップの穴の外径が約０．０５ミクロン から約０．５ミクロンであるフレアー領域を持つ微量注入針を含む。 第２の容器手段には細胞接着分子又はその断片が含まれる。 ２０． 微量注入針のフレアーが外径が約０．０５ミクロンから約０．１５ミク ロンと定義される請求項１９のキット。 ２１． 個々細胞の含有に適した直径を持つグリッド形式を含む細胞接着に適し た皿を含む請求項１９のキット。 ２２．皿が壁に細胞の接着を可能にする接着分子を含んだ一連の壁を含むと定義 される請求項２１のキット。 ２３． 分離剤を含んだ第３の保持手段を含む請求項１９のキット。 ２４． 接着分子断片がフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、エピリグリ ン、インバシン、オストスポンジン、トロンボスポンジン、プロテオグリカン、 グリコサミノグリカン、ＵＣＡＭ、ＩＣＡＭ及びＶＣＡＭ−１で構成される群か ら選択された分子の断片である請求項２１のキット。 ２５． 以下のものを含む多微量注入器機： 頭部を持つ微量注入針；及び フレアーチップの穴の外径が約０．０５ミクロンから約０．５ミクロン であるフレアー領域を持つ多数の微量注入針。 ここにおいて前記多数の微量注入針はお互いに等間隔に配置され、前記微量注入 針頭部はグリッド方向に存在する。 ２６． 微量注入針が外穴径が約０．０５ミクロンから約０．２ミクロンと定義 される請求項２５の多微量注入器機。 ２７． 内部穴の直径が約０．５から約２．５ミクロンのチップを持つ保持ピペ ットが多数含まれる請求項２５の多微量注入器機。 ２８． ９６本の微量注入針を含む請求項２５の多微量注入器機 ２９． グリッドの形状した、細胞の接着に適した細胞接着物質を含む請求項２ ５の多微量注入器機 ３０． 細胞接着面に多数の穴が含まれる請求項２９の多微量注入器機。 ３１． 多数の穴に接着分子が含まれる請求項３０の多微量注入器機。 ３２． 接着分子がフィブロネクチンである請求項３１の多微量注入器機。 ３３． フレアーチップＤ１及びレアー領域の末端Ｄ２を持 ち、Ｄ１：Ｄ２の比率がが約１：１．５から約１：２０であるフレアー領域を持 つ針。 ３４． Ｄ１：Ｄ２の比率がが約１：２から約１：１０である請求項３３の針。 ３５． Ｄ１：Ｄ２の比率がが約１：２から約１：５である請求項３３の針。 ３６． クオーツ針またはホウ素ケイ酸塩と定義される請求項３３の針。 ３７． 細胞の生存性を副次的に失わせることなく、物質表面での接着細胞群の 方法で以下の事が含まれる。 前記細胞が分離できるのに十分な時間、前記表面の接着部位で接着細胞と 競合できるペプチドを含む調製物に対し接着物上の接着細胞群の露出；及び 物質からの前記接着細胞の分離、 ここで分離細胞の生存率は接着細胞群に対して約５０％から約９５％である。 ３８． 調製物がＲＧＤ、ＬＤＶ又はそれらの複合した配列を持つペプチド又は ペプチドの混合物を含む請求項３７の方法。 ３９． 接着細胞群が造血細胞である請求項３８の方法