WO2017171092A1 - 植物に物質を導入する方法 - Google Patents

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紀夫 加藤
龍史 岡本
隆敏 木羽
絵梨香 戸田
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日本たばこ産業株式会社
公立大学法人首都大学東京
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01015—Polygalacturonase (3.2.1.15)

Definitions

  • the present invention relates to a method for introducing a substance into a plant.
  • Non-Patent Document 1 describes a method of producing fertilized egg cells by electrofusion of corn egg cells and sperm cells and culturing them into plants.
  • a mixture of enzymes 0.75% pectinase (Serva), 0.25% pectinase, 0.5% hemicellulose, 0.5% cellulase
  • pectinase has a high titer.
  • gene transfer and transformation were performed using a fertilized egg cell prepared using the egg cell.
  • Non-Patent Document 2 describes a method for isolating male and female gametes (egg cells and central cells) of rice. Specifically, after isolating the ovule from the plant body, in 0.3 M mannitol solution, enzyme treatment (mannitol solution (650 mosmol / kg ⁇ H 2 O) + 0.3% pectinase Y-23, 1.5% pectinase, Treatment with 1% cellulose and 1% hemicellulose for 10 to 15 minutes), as in Non-Patent Document 1, the potency of enzymes, particularly pectinase, is high. Furthermore, the subject is not a fertilized egg but a pre-fertilized egg cell, and there is no description that regeneration to a plant, gene introduction into a plant, or transformation has been performed.
  • enzyme treatment mannitol solution (650 mosmol / kg ⁇ H 2 O) + 0.3% pectinase Y-23, 1.5% pectinase, Treatment with
  • Non-Patent Document 3 and Non-Patent Document 4 describe a method of producing a fertilized egg by electrofusion of male and female gametes of rice and culturing it into a plant body. These prior documents indicate that a plant can be derived from a fertilized egg cell artificially fused with a male and female gamete. However, in the above-mentioned document, the points such as gene introduction and transformation are not described at all as in the case of Non-Patent Document 2, and it has been completely unknown whether transformation can be performed using a fertilized egg. Non-Patent Documents 3 and 4 do not describe the enzyme treatment of egg cells.
  • Non-Patent Documents 5 and 12 In seeds such as corn (Non-Patent Documents 5 and 12), rice (Non-Patent Documents 6 and 11), wheat (Non-Patent Document 7), barley (Non-Patent Documents 8 and 10), tobacco (Non-Patent Document 9), etc. Also known is an example in which a fertilized egg is collected and cultured from the embryo sac after fertilization to produce a plant body. Among them, as shown in Non-Patent Documents 5 and 10, there is a report showing that DNA can be introduced into fertilized egg cells by the microinjection method, but the fact that this method has been put to practical use has not been reported. Moreover, there is no knowledge about gene transfer by other methods.
  • Examples of methods for introducing genes into plant cells include the polyethylene glycol method (PEG method) and the electroporation method in addition to the microinjection method.
  • the microinjection method can introduce a gene into a cell having a cell wall, and it is not particularly necessary to remove the cell wall of a plant cell to be introduced by an enzyme treatment or the like.
  • the electroporation method and the PEG method, particularly the PEG method have the advantage that a large number of cells can be handled at a time compared with the microinjection method, but a process of removing the cell wall with an enzyme or the like is required.
  • fertilized egg cells For fertilized egg cells, it was not clear how to remove the cell wall, and how to remove the cell wall while maintaining cell activity so that cell division can continue and grow into a plant after cell wall removal. For this reason, there has been no report of fertilized egg cells that have undergone gene transfer by a method such as the PEG method to reach cell division.
  • fertilized egg cells of rice, wheat, and barley are extracted only by using a glass needle or the like without using an enzyme that removes cell walls such as cellulase. Cell walls remain in fertilized eggs isolated by such a physical technique, and it is assumed that it is difficult to apply the PEG method. In fact, no example in which the PEG method is applied has been reported.
  • Non-Patent Document 5 describes that a fertilized egg was isolated by enzyme treatment in a very short time (2 minutes) on corn, and the gene was introduced by microinjection. Further, Non-Patent Document 9 describes a total of up to 1 hour of enzyme treatment in two stages using macerozyme R10 that exhibits very weak pectinase activity in tobacco. As in the two methods described in Non-Patent Documents 5 and 9, the enzyme treatment is carried out for a very short time or with a very weak enzyme for a long time. This is considered to have a negative effect on the environment, and is presumed to minimize the effect.
  • the treatment with a short-time enzyme treatment or an enzyme with weak activity does not completely remove the cell walls of fertilized egg cells, and is considered unsuitable as a material for the PEG method. For this reason, there has been no example in which the PEG method has been applied to fertilized eggs so far, and it has been unclear whether fertilized egg cells that have been subjected to the PEG method can maintain division ability.
  • An object of the present invention is to provide a method for introducing a substance into a plant and a plant into which a substance has been introduced by the method of the present invention.
  • a fertilized egg is originally a cell that has the ability to grow into a plant body, and is therefore expected not to be affected by the culture efficiency caused by the difference between species and varieties. If a substance is introduced into such fertilized egg cells, transformation and genome editing can be performed on a wider variety of species and crops than in the present situation.
  • the present inventors have discovered a method for protoplasting without losing the activity of the fertilized egg cell, and further combining a method for efficiently isolating the fertilized egg and a method for culturing the isolated fertilized egg cell.
  • the present invention was conceived by introducing a substance into a fertilized egg cell, inducing division, and being capable of transformation.
  • a method for introducing a substance into a plant comprising the following steps: (1-i) A fertilized egg cell is isolated from a tissue containing a fertilized egg cell of a plant, and then the fertilized egg cell is treated with an enzyme solution containing a plant tissue degrading enzyme at a low titer condition.
  • a method for introducing a substance into a plant comprising the following steps: (1-iv) Isolating egg cells and sperm cells from a plant body and fusing them together to produce a fertilized egg, and then subjecting the fertilized egg cell to low titer condition treatment with an enzyme solution containing plant tissue-degrading enzyme Or (1-v) A tissue containing plant egg cells is treated with an enzyme solution containing a plant tissue degrading enzyme at low titer conditions, and then the enzyme-treated egg cells are isolated and further fused with the isolated sperm cells.
  • Embodiment 1 wherein the plant tissue degrading enzyme is selected from the group consisting of pectinase, cellulase, protease, hemicellulases, glucuronidase, zymolidase, chitinase, glucanase, xylanase, galactanase, arabinanase and lignin degrading enzyme, and mixtures thereof Or the method of 2.
  • a method for introducing a substance into a plant comprising the following steps: (1-i) A fertilized egg cell is isolated from a tissue containing a fertilized egg cell of a plant, and then the fertilized egg cell is treated with an enzyme solution containing a plant tissue degrading enzyme at a low titer condition.
  • an enzyme-treated isolated fertilized egg cell and (2) introducing a substance selected from the group consisting of nucleic acid, protein and peptide into the obtained enzyme-treated isolated fertilized egg cell; (3) callus or embryoidization of fertilized egg cells into which the substance has been introduced; and (4) re-differentiating the callus- or embryoid-like tissue in a regeneration medium; Including the above method.
  • a method for introducing a substance into a plant comprising the following steps: (1-iv) Isolating egg cells and sperm cells from a plant body and fusing them together to produce a fertilized egg, and then subjecting the fertilized egg cell to low titer condition treatment with an enzyme solution containing plant tissue-degrading enzyme Or (1-v) A tissue containing plant egg cells is treated with an enzyme solution containing a plant tissue degrading enzyme at low titer conditions, and then the enzyme-treated egg cells are isolated and further fused with the isolated sperm cells.
  • FIG. 1 is a transmission image of a corn (B73) pearl core section after enzyme treatment.
  • FIG. 2 is a light micrograph of an isolated corn (B73) fertilized egg cell.
  • FIG. 3 is an optical micrograph of an embryonic cell mass derived from maize (B73) fertilized egg cells that have started to divide.
  • FIG. 4 is an optical micrograph of a grown embryonic cell mass derived from the corn (B73) fertilized egg cell derived from FIG.
  • FIG. 5 is an optical micrograph of a shoot generated from the embryonic cell mass of maize (B73) in FIGS.
  • FIG. 6 is a corn (B73) fertilized egg cell-derived plant regenerated from the embryonic cell mass of FIGS.
  • FIG. 1 is a transmission image of a corn (B73) pearl core section after enzyme treatment.
  • FIG. 2 is a light micrograph of an isolated corn (B73) fertilized egg cell.
  • FIG. 3 is an optical micrograph of an embryonic cell mass derived from maize (
  • FIG. 7 is a fluorescence micrograph of maize (B73) fertilized egg cells that started dividing after GFP nucleic acid introduction by the PEG method.
  • FIG. 8 shows fluorescence micrographs (top), light micrographs (bottom), and merge (middle) of rice (Yukihikari) fertilized egg cells that have started dividing after introduction of GFP nucleic acid by the PEG method. The bar indicates 20 ⁇ m.
  • the present invention relates to a method for introducing a substance into a plant.
  • the method of the present invention comprises the following steps: (1-i) A fertilized egg cell is isolated from a tissue containing a fertilized egg cell of a plant, and then the fertilized egg cell is treated with an enzyme solution containing a plant tissue degrading enzyme at a low titer condition. (1-ii) treating a tissue containing a fertilized egg cell of a plant with an enzyme solution containing a plant tissue degrading enzyme, and then isolating the fertilized egg cell treated with the enzyme, or (1-iii) A tissue containing a fertilized egg cell of a plant is treated with an enzyme solution containing a plant tissue degrading enzyme at a low titer condition, and at the same time, the fertilized egg cell subjected to the enzyme treatment is isolated. Obtaining an enzyme-treated isolated fertilized egg cell; and (2) introducing a substance selected from the group consisting of nucleic acid, protein and peptide into the obtained enzyme-treated isolated fertilized egg cell; Including that.
  • the method of the present invention also comprises the following steps: (1-iv) Isolating egg cells and sperm cells from a plant body and fusing them together to produce a fertilized egg, and then subjecting the fertilized egg cell to low titer condition treatment with an enzyme solution containing plant tissue-degrading enzyme Or (1-v) A tissue containing plant egg cells is treated with an enzyme solution containing a plant tissue degrading enzyme at low titer conditions, and then the enzyme-treated egg cells are isolated and further fused with the isolated sperm cells. , Obtaining an enzyme-treated isolated fertilized egg cell; and (2) introducing a substance selected from the group consisting of nucleic acid, protein and peptide into the obtained enzyme-treated isolated fertilized egg cell; Including that.
  • the method of the present invention comprises the following steps: (1-i) A fertilized egg cell is isolated from a tissue containing a fertilized egg cell of a plant, and then the fertilized egg cell is treated with an enzyme solution containing a plant tissue degrading enzyme at a low titer condition.
  • an enzyme-treated isolated fertilized egg cell and (2) introducing a substance selected from the group consisting of nucleic acid, protein and peptide into the obtained enzyme-treated isolated fertilized egg cell; (3) callus or embryoidization of fertilized egg cells into which the substance has been introduced; and (4) re-differentiating the callus- or embryoid-like tissue in a regeneration medium; Including that.
  • the method of the present invention in still another embodiment, comprises the following steps: (1-iv) Isolating egg cells and sperm cells from a plant body and fusing them together to produce a fertilized egg, and then subjecting the fertilized egg cell to low titer condition treatment with an enzyme solution containing plant tissue-degrading enzyme Or (1-v) A tissue containing plant egg cells is treated with an enzyme solution containing a plant tissue degrading enzyme at low titer conditions, and then the enzyme-treated egg cells are isolated and further fused with the isolated sperm cells.
  • Plant The type of plant is not particularly limited. Either a dicotyledonous plant or a monocotyledonous plant may be used, and a monocotyledonous plant is preferable. More preferred are corn, wheat, barley, rice, sorghum, rye and the like, and most preferred are corn, wheat and rice.
  • the method of the present invention is not limited, but in particular, it can be used for products or varieties regarded as “difficult to culture”.
  • “Difficult culture” refers to difficult culture, specifically, for example, difficulty in culturing cells isolated from a plant, formation of callus due to treatment such as dedifferentiation, and reconversion from a callus to a plant. It means that differentiation is difficult.
  • a difficult-to-cultivate variety means a variety that is difficult to cultivate compared to a general research variety of the same species (such as A188 for corn), for example, an elite variety of corn derived from B73 and B73 of corn, Examples include wheat elite varieties (for example, AC Barrie and TAM), barley varieties other than GoldenPromise and Igri, sorghum 296B, C401, SA281, P898012, Pioneer 8505, Tx430, and the like.
  • a fertilized egg cell is a fertilized egg cell that is isolated from a tissue (eg, ovary, ovule, pearl core) containing a plant embryo sac, that is, pollinated and fertilized at the plant stage, and isolated from the plant body. It may be a fertilized egg cell. Or after isolating an egg cell and a sperm cell from the plant body before pollination and fertilization, they may be united and a fertilized egg cell may be produced and acquired.
  • a tissue eg, ovary, ovule, pearl core
  • the enzyme-treated isolated fertilized egg cell is (1-i) A fertilized egg cell is isolated from a tissue containing a fertilized egg cell of a plant, and then the fertilized egg cell is treated with an enzyme solution containing a plant tissue degrading enzyme at a low titer condition. (1-ii) A tissue containing a fertilized egg cell of a plant is treated with an enzyme solution containing a plant tissue degrading enzyme at a low titer condition, and then the fertilized egg cell subjected to the enzyme treatment is isolated.
  • a tissue containing a fertilized egg cell of a plant is treated with an enzyme solution containing a plant tissue degrading enzyme at a low titer condition, and at the same time, the fertilized egg cell subjected to the enzyme treatment is isolated.
  • (1-iv) Isolating egg cells and sperm cells from a plant body and fusing them together to produce a fertilized egg, and then subjecting the fertilized egg cell to low titer condition treatment with an enzyme solution containing plant tissue-degrading enzyme
  • a tissue containing plant egg cells is treated with an enzyme solution containing a plant tissue degrading enzyme at low titer conditions, and then the enzyme-treated egg cells are isolated and further fused with the isolated sperm cells. , Can be obtained by either.
  • a tissue (eg, ovule) containing an embryo sac can be cut in a solution having an appropriate osmotic pressure, and (eg fertilized) egg cells emerging from the cut surface can be isolated using a glass capillary or the like under a microscope.
  • the enzyme treatment is carried out by treating the isolated (fertilized) egg cells with an enzyme solution for a certain period of time to obtain a fertilized egg that has been subjected to the enzyme treatment.
  • the tissue containing an embryo sac such as an ovule after treating a tissue containing an embryo sac such as an ovule for a certain period of time with an enzyme solution, the tissue such as a pearl can be dissected and mechanically removed and isolated under a microscope using a glass needle or the like.
  • an enzyme-treated (fertilized) egg can be obtained without subsequent enzyme treatment.
  • the enzyme treatment for obtaining a fertilized egg by fusion of the isolated egg cell and sperm cell may be at any stage before the egg cell isolation, at the same time or after the fusion with the sperm cell.
  • Enzyme treatment The method of the present invention is characterized by treating (fertilized) egg cells from a tissue containing plant (fertilized) egg cells with an enzyme solution containing plant tissue-degrading enzyme at low titer conditions.
  • the enzyme treatment may be performed before, simultaneously with, or after the isolation of (fertilized) egg cells, but preferably simultaneously with or after the isolation. It is.
  • the polysaccharides that make up the substrate are divided into pectin, which is traditionally extracted with hot water or acidic buffer, and hemicellulose, which is an alkali-soluble component, but recently, matrix polysaccharides ( matrix polysaccharide).
  • the cell wall of many angiosperms is called type I, which is rich in cellulose and xyloglucan, and includes pectin, arabinoxylan, glucomannan, galactoglucomannan and the like.
  • type II the cell wall of a part of monocotyledons (rice eyes)
  • type I cell walls structural proteins (such as extensin) play a major role
  • type II cell walls protein content is low
  • cross-linking of phenolic acid (such as ferulic acid) plays a role.
  • Plant tissue-degrading enzyme is a general term for enzymes that act directly or indirectly on pectin, cellulose, hemicellulose, other matrix polysaccharides, phospholipids, proteins, etc. around plant tissues and cells. Examples include, but are not limited to, protoplast preparation enzymes, phospholipases that degrade cell membranes, tannase, which is thought to be useful for tissue degradation, ferulic acid esterase, protease, etc. that degrade components contained in type II cell walls such as rice. included. In particular, various protoplast preparation enzymes used to lyse plant cell walls and prepare protoplasts can be used.
  • pectinase cellulase, protease, hemicellulases
  • hemicellulase generally refers to enzymes that hydrolyze hemicellulose
  • glucuronidase zymolydase
  • chitinase glucanase
  • xylanase galactanase
  • arabinanase arabinanase
  • lignin degrading enzyme Alternatively, a mixture thereof (a mixture of two or more of these enzyme groups) is included.
  • Pectinases include, for example, polygalacturonase (galacturonase), pectin lyase, and pectin methylesterase.
  • the titer of pectinase is the sum of the titres of these three enzymes, or the sum of the titers of two enzymes, polygalacturonase and pectin lyase. Means.
  • the plant tissue degrading enzyme comprises pectinase.
  • Pectinase alone may be included, or pectinase and one or more other enzymes selected from the group described above may be included.
  • Cellulase and pectinase are preferable.
  • Pectin is a kind of complex polysaccharide whose main component is polygalacturonic acid in which galacturonic acid is ⁇ -1,4 linked.
  • Pectinase which is a degrading enzyme, is a general term for an enzyme group that catalyzes an enzyme reaction system that degrades pectin.
  • A Polygalacturonase that hydrolyzes ⁇ -1,4 bonds of pectin or polygalacturonic acid
  • Pectin lyase polygalacturonic acid lyase
  • Pectin methyl esterase that hydrolyzes pectin methyl ester.
  • Pectinase is an enzyme that acts on the junctions (middle layers) of individual cells in plant tissues, and has the effect of breaking the tissues down to single cells, especially maceration and plants that release plant cells without destroying them. It is an important enzyme in cell engineering.
  • the pectinase include those containing polygalacturonase such as trade name Macerozyme R10 (trademark) (manufactured by Yakult Honsha), Sumiteam AP2 (Sumiteam) (manufactured by Shinnippon Chemical Co., Ltd.), and pectinase Y23 (Pectolase Y23).
  • pectin lyase such as pectinase (manufactured by Sigma).
  • Preferred examples include mixed use of macerozyme R10 and pectinase Y23, or single use of pectinase Y23.
  • Cellulase is an enzyme that hydrolyzes the glycoside bond of ⁇ -1,4-glucan of cellulose, which is a cell wall component of plants.
  • Examples of the cellulase include Cellulase Onozuka RS (trademark) (Cellulase OnozukaRS) (manufactured by Yakult Honsha), Cellulase Onozuka R10 (Cellulase Onozuka R10) (manufactured by Yakult Honsha), Driselase (Driselase) (manufactured by Kyowa Hakko), etc. Used. Cellulase Onozuka RS (trademark) and cellulase (Worthington) are preferable, and cellulase (Worthington) is more preferable.
  • the “low titer condition” is a condition in which an enzyme does not function more than a condition generally used when using each enzyme for degrading plant tissue (in the present invention, it is a degrading enzyme, so the target substance is degraded. Meaning low enzyme activity), specifically, short processing time and / or low enzyme concentration (low enzyme activity: low Unit / mL). In particular, shorter processing times and / or lower concentrations than normal protoplast preparation conditions are preferred. Conditions corresponding to the “low titer conditions” can be appropriately changed depending on the type of enzyme used, the type of plant, and the like.
  • the unit can be measured by a known method.
  • the activity of pectin lyase can be measured according to the method of Ishii et al. (Non-Patent Document 14), and 1 unit of pectin lyase activity (1 Unit) is an unsaturated polygallium equivalent to 1 ⁇ mol of unsaturated digalacturonide per minute. It can be set as the quantity which produces cullonide.
  • the polygalacturonase activity can be measured according to the Somogyelson method (Non-patent Documents 15 and 16).
  • One unit of galacturonase activity (1Unit) is 1 ⁇ mol of galacturonic acid (or The amount of the derivative or modified product).
  • pectinase which has been considered to act on cell-to-cell binding in plant tissues, has a significant impact on not only the isolation of fertilized eggs that are single cells, but also the ability to regenerate the plant. It was found to give. It has been found that when the concentration of pectinase contained in the enzyme solution when fertilized egg cells are enzymatically treated is low, the isolated fertilized egg cells can be regenerated up to the plant body and / or a substance such as a nucleic acid can be introduced. .
  • the unit / mL of pectinase contained in the enzyme solution is 60 or less, and the unit / mL ⁇ time is 310.
  • the nucleic acid can be introduced by the PEG method and that the plant can be regenerated.
  • the plant tissue-degrading enzyme is pectinase
  • the unit / mL of pectinase in the system during the enzyme treatment in step (1) that is, the low-titer condition treatment in the present invention is not limited.
  • the unit / mL of pectinase in the enzyme solution is 60 or more, damage to (fertilized) egg cells occurs, which is not preferable.
  • the lower limit of Unit / mL is not particularly limited. Preferably, they are 0.1 or more, 0.2 or more, 0.4 or more, 0.5 or more, 0.6 or more, 0.65 or more.
  • Unit / mL ⁇ time is preferably 310 or less, 300 or less, 250 or less, 200 or less, 100 or less, 90 or less, 50 or less, 30 or less.
  • the lower limit of Unit / mL ⁇ time is not particularly limited. Preferably, they are 1 or more, 2 or more, 3 or more, 3.3 or more, 5 or more, 10 or more, 15 or more, 20 or more.
  • the enzyme treatment time is preferably, but not limited to, 3 minutes or more, more preferably 5 minutes or more. Preferably they are 60 minutes or less, 50 minutes or less, and 45 minutes or less. More preferably, they are 3 minutes or more and 60 minutes or less, 5 minutes or more and 50 minutes or less, and 5 minutes or more and 45 minutes or less.
  • the difference in the enzyme treatment results between individuals is not preferable.
  • a part of the ovary or ovule containing the embryo sac of the plant is first cut out with a razor or the like.
  • the distance from the (fertilized) egg cell to the (fertilized) egg cell can be varied depending on the ovule. In particular, when the distance from the cut end to the (fertilized) egg cell is long, it takes time for the enzyme solution to penetrate and contact the (fertilized) egg cell.
  • the preparation of protoplasts generally requires a long time (4 hours or more).
  • the enzyme treatment of the present invention is obviously performed in a shorter time than the enzyme treatment time for protoplast preparation.
  • an osmotic pressure is not specifically limited, For example, it is performed by addition of osmolite. Specifically, it is performed by adding a polyhydric alcohol or an amino acid. A polyhydric alcohol is preferably added, and, without limitation, mannitol, maltose, glucose, sorbitol, raffinose, trehalose, oligosaccharide, and the like can be preferably used.
  • a preferable osmotic pressure can be appropriately selected according to the type of plant used.
  • the lower limit 380mosmol / kg H 2 O or more rice more preferably, to 390mosmol / kg H 2 O or more, and even more preferably to a 400mosmol / kg H 2 O or more.
  • the upper limit 470mosmol / kg H 2 O or less more preferably, to less 460mosmol / kg H 2 O, still more preferably to less 450mosmol / kg H 2 O.
  • the 600mosmol / kg H 2 O or the lower limit and even more preferably to a 630mosmol / kg H 2 O or more.
  • less 700mosmol / kg H 2 O limit it is more preferably not more than 680mosmol / kg H 2 O.
  • the pH is not particularly limited as long as the protoplast can be produced.
  • the pH is preferably 5.0 or more and 7.0 or less.
  • About the temperature which performs an enzyme process it is possible to set suitably with the enzyme to be used. However, 10 ° C. or higher is preferable because many enzymes are not capable of obtaining the expected enzyme activity under conditions of less than 10 ° C.
  • the substance introduced into the plant is selected from the group consisting of nucleic acids, proteins and peptides.
  • the nucleic acid is not particularly limited, and may be RNA, DNA, a conjugate of both, or a mixture.
  • Preferred are circular DNA such as vectors, linear DNA, circular RNA or linear RNA.
  • the thing of arbitrary length according to the transformation method used can be used.
  • the length of the nucleic acid is preferably 100 kb or less, more preferably 50 kb or less. More preferably, it is 30 kb or less, Most preferably, it is 20 kb or less.
  • Zinc finger nuclease Zinc Finger Nuclease, ZFN
  • TALEN Transcribing Activator-Like Effector Nuclease
  • proteins such as modified enzymes, antibodies, and their complexes can also be introduced.
  • the size of the protein is preferably, but not limited to, a molecular weight of 300 kDa or less, more preferably 200 kDa or less.
  • Peptide is a general term for molecules in which various amino acids are linked in an order by amide bonds (also referred to as “peptide bonds”), and is generally shorter than proteins.
  • amide bonds also referred to as “peptide bonds”
  • 50a. a. It is as follows.
  • nucleic acids Two or more types of nucleic acids, proteins and peptides may be introduced. Different types of substances such as nucleic acids and proteins may be introduced.
  • the method for introducing a substance into a plant is not particularly limited as long as it is a known method capable of introducing a desired substance into a plant, and can be appropriately selected according to the type of plant.
  • physicochemical methods such as polyethylene glycol method (PEG method), electroporation method, particle gun method, microinjection method, whisker method, or biological methods such as Agrobacterium method ( The indirect introduction method of DNA) can be preferably used.
  • the method of the present invention is characterized by treating fertilized egg cells from a tissue containing fertilized egg cells of a plant with an enzyme solution containing a plant tissue degrading enzyme at a low titer condition.
  • the method used in the step of introducing the substance is preferably a method using a state in which the plant cell wall is decomposed by an enzyme (protoplast).
  • the PEG method or the electroporation method is preferred, and the PEG method is most preferred.
  • the PEG method is a method in which polyethylene glycol (polyethyleneglycol, PEG) is allowed to act on protoplasts to incorporate DNA into plant cells.
  • the mechanism of this DNA uptake is not well understood.
  • the PEG method can be performed according to a known protocol as described in Non-Patent Document 13, for example.
  • the electroporation method is a method for transformation by applying an electric pulse to the cell suspension to form a minute hole in the cell membrane and sending the DNA in the cell suspension into the cell.
  • an electric pulse When plant cells are used as materials, it is common to use protoplasts obtained by decomposing and removing cell walls. However, it is also possible to transform using cells having cell walls, which is called electroinjection.
  • co-transformation can be performed by dissolving two or more kinds of DNAs in a suspension and applying an electric pulse in the presence of plant cells.
  • An egg cell has a cell wall in a state different from that of a normal somatic cell before fertilization, and a complete cell wall is formed only when an egg cell and a sperm cell are fused.
  • it is generally essential to convert plant cells into protoplasts by enzymatic treatment, and the protoplasts thus obtained regenerate their cell walls over time, so that the complete cell wall can be recovered. It may return to the plant cell it has. Therefore, also when using an enzyme when isolating a fertilized egg cell from an ovule etc., it is preferable to perform a substance introduction
  • the time until the introduction of the substance is preferably within 120 minutes, within 60 minutes, within 40 minutes, or within 20 minutes after the enzyme treatment.
  • the time until the substance introduction is preferably within 120 minutes, within 60 minutes, within 40 minutes, or within 20 minutes after cell fusion.
  • the method of introducing a substance into a plant according to the present invention further comprises (3) introducing a substance after the substance introducing step (step (2)). Fertilized egg cells that have been callus or embryoid (embryonic cell mass); and (4) Re-differentiating the callus or embryoid tissue with a regeneration medium may be included.
  • the callus or embryoid body forming step in step (3) and the redifferentiation step in step (4) are not particularly limited, and a known method for regenerating a plant from fertilized egg cells can be used. .
  • the obtained substance-introduced fertilized egg cells are cultured to form embryoid bodies or callus.
  • the process of inducing fertilized egg cells to divide and proliferate to form callus or embryoid bodies is not particularly limited because the optimum conditions differ depending on the plant, but the nurse culture method with the addition of Feeder cells is preferred. For example, it can be performed as follows.
  • Cultivation of fertilized egg cells in a liquid medium The substance-introduced fertilized egg cells are transferred to the medium, allowed to stand overnight, and then cultured with gentle shaking.
  • the shaking speed is preferably 30 to 50 rpm, more preferably 35 to 45 rpm.
  • the culture temperature is preferably 24 to 28 ° C, more preferably 25 to 27 ° C. Cultivation is preferably performed in the dark.
  • feeder cells to the medium and perform co-culture (nurse culture method). This culture period is preferably 4 to 14 days, and more preferably 5 to 10 days.
  • Non-patent Document 17 liquid MS medium (Non-patent Document 17), B5 medium (Non-patent Document 18), N6 medium (Non-patent Document 19), etc., to which auxins such as 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and naphthalene acetic acid are added .
  • auxins such as 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and naphthalene acetic acid are added .
  • auxins such as indole-3-acetic acid, 2,4-D and dicamba are added to the medium.
  • the auxin concentration is 0.1 to 3.0 mg / L, preferably 0.1 to 0.3 mg / L, and more preferably 0.15 to 0.25 mg / L.
  • Feeder cells can be used. Examples include rice floating cell culture (Line Oc, manufactured by Riken BioResource Center), maize nurse cells (Non-patent Document 20), non-morphogenic cell suspension (Non-patent Document 21), and the like. .
  • a spherical embryoid body having a diameter of about 50 to 200 ⁇ m is formed 4 to 14 days after the start of culture of fertilized egg cells.
  • the redifferentiation step can also be performed according to a known redifferentiation step. For example, it can be performed as follows as an example.
  • Embryoid body culture Spherical embryoid bodies are transferred to the medium without added feeder cells, and further cultured for about 10 to 14 days. Thereafter, the cells are cultured in an arbitrary medium to which no auxin is added, for example, MS medium, to form plants.
  • the culture is preferably performed by irradiating light, and the light is preferably, for example, 50 to 180 ⁇ mol / m 2 ⁇ sec, and more preferably 70 to 150 ⁇ mol / m 2 ⁇ sec.
  • MS medium MS medium, B5 medium, N6 medium, for example, a solid medium using agarose, agar, gellan gum, gellite or the like.
  • Substance-introduced plant The present invention further includes a substance-introduced plant obtained by the method of the present invention.
  • Substance-introduced plants are, for example, transformed plants in which part or all of the introduced nucleic acid has been incorporated into the plant genome, or transiently introduced nucleic acids and proteins such as Cas9 nuclease into the plant.
  • a plant into which a substance has been introduced transiently or permanently, such as a plant whose genome has been edited Prior to the present invention, it was difficult or impossible to obtain a substance-introduced plant particularly for plants and varieties that were considered “difficult to culture”. According to the present invention, it has become possible to efficiently obtain a substance-introduced plant for such plants and varieties by a simple method.
  • Example 1 Isolation of Fertilized Egg Cells of Corn Corn pollen collected from the ears of corn was pollinated at the stigma of the ears of the mating suitable time of corn (variety: B73) grown in a greenhouse. The mating time was around 10:30 am. After mating, the ears were covered with a bag made of paraffin paper to prevent other pollen from flying.
  • a pearl core section containing an embryo sac was removed and placed in a 1 mL 10% mannitol solution (650 mosmol / kg H 2 O) in a 3.5 cm plastic petri dish.
  • a 3.5 cm plastic petri dish 0.5 mL of the enzyme mixture was added to obtain a 1.5 mL enzyme solution, which was allowed to stand at room temperature for 5-45 minutes. The following were used about the enzyme.
  • the enzyme solution was removed with a pipette, washed twice with 10% mannitol solution, and the enzyme-treated pearl slice was placed in 1.5 mL of the same concentration mannitol solution.
  • the container was used for isolation work.
  • Isolation was performed using two glass needles.
  • the ovum slice was fixed with one glass needle so as not to move, and the fertilized egg cell was isolated by scraping the tissue in the region where the fertilized egg cell was presumed to exist with the other glass needle.
  • the region was estimated as a marker because the one that entered the pollen tube out of two auxiliary cells was denatured and dark browned.
  • Isolated fertilized egg cells migrated into droplets on a cover glass using a micropipette.
  • the droplet on a cover glass was created with the following method. 1) The periphery of the cover glass is immersed in a 1,1,1-trichloroethane solution containing 5% dichloromethylsilane and dried; 2) Put 0.2-0.3 mL of mineral oil (Embryo Culture-tested Grade, Sigma Aldrich, 1001279270) on the center of the cover glass; and 3) 1-2 ⁇ L of 10% mannitol solution (650 mosmol / kg H 2 O) is inserted into the mineral oil with a micropipette.
  • the medium for fertilized cells is a modified N6Z medium (Kumlehn J. et al. (1998) Plant 205: 327-333) with the following modifications: 2 g / L CHU (N6) basal salt mixture (Sigma Aldrich).
  • the osmotic pressure was prepared by adjusting to 450 mosmol / kg H 2 O with glucose (pH 5.7).
  • the prepared medium for fertilized cells was placed in a Millicell CM insert (manufactured by Millipore) having a diameter of 12 mm and placed in a 3.5 cm plastic petri dish containing 2 mL of the medium.
  • 40-60 ⁇ L of rice floating cell culture was added to the petri dish as feeder cells.
  • the isolated fertilized egg cells are placed in a fresh 10% mannitol solution droplet (650 mosmol / kg H 2 O), and then the membrane in the CM insert containing the medium for fertilized cells Moved up.
  • a fresh 10% mannitol solution droplet 650 mosmol / kg H 2 O
  • the fertilized egg cells were allowed to stand in the dark at 26 ° C. for 1 day, and then cultured with shaking for 20 days.
  • Table 1 shows the results of the formation of embryoid bodies (embryonic cell mass) after culture.
  • embryoid bodies embryoid bodies (embryonic cell mass) after culture.
  • sections with high enzyme titers, especially pectinase Unit / mL or Unit / mL ⁇ time test section 8-10
  • embryoid bodies were not obtained, but Unit / mL or Unit / mL ⁇ time was low.
  • embryoid bodies could be obtained.
  • the growth of the embryoid body in test group 7 was slightly inferior to the other groups.
  • Example 3 Regeneration of plant body
  • the embryoid body (embryonic cell mass) obtained in Examples 1 and 2 was subjected to regeneration medium (modified MS medium; MS salt, MS vitamin, 100 mg / L myo-inositol, 2 g / L casamino acid, 30 g / L sucrose, 30 g / L sorbitol, 0.2 mg / L 1-naphthalene acetic acid (NAA), 1 mg / L kinetin and 0.3% Gelrite).
  • Culturing was performed for 12 to 30 days with continuous light irradiation at 30 ° C. As a result, a plant body could be obtained (FIG. 6). From these results, it was shown that corn B73, which is said to be the most difficult to culture, can be cultured from cells and regenerated.
  • Example 4 Nucleic Acid Introduction into Fertilized Egg Maize (variety: B73) was used as a plant, the enzyme solution concentration was 0.3% cellulase (manufactured by Worthington), 0.1% macerozyme R10, 0.017% pectolase Y23. The fertilized eggs were isolated in the same manner as in Example 1 except that the treatment time was 15 minutes. In this enzyme treatment condition, the pectinase concentration was 0.67 Unit / mL, and Unit / mL ⁇ treatment time was 10.05.
  • the isolated fertilized egg cell is transferred to a droplet (about 2 ⁇ L) of an MMG solution (15 mM MgCl 2 , 4 mM MES (pH 5.7), 10% mannitol (650 mosmol / kg H 2 O)) and then introduced into MMG Sequence, 35S promoter :: signal sequence :: GFP :: endoplasmic reticulum retention signal (HDEL) :: moved to a droplet to which a plasmid containing nosterinator (Non-patent Document 11) was added.
  • MMG solution 15 mM MgCl 2 , 4 mM MES (pH 5.7), 10% mannitol (650 mosmol / kg H 2 O)
  • a drop containing fertilized egg cells and a PEG solution (12.5 mL 10% mannitol solution (650 mosmol / kg H 2 O)) are added with 7.5 g of PEG 4000 and 2.5 mL of 1 M calcium chloride to 25 mg with distilled water.
  • the liquid droplets (about 2 ⁇ L) were mixed and stirred with a glass capillary 30 to 50 times.
  • the fertilized egg cells that had been subjected to the nucleic acid introduction treatment were transferred to a fertilized cell medium in the same manner as in Example 3, and then statically cultured in the dark. Twelve to 16 hours after PEG treatment, fertilized egg cells were observed with a fluorescence microscope, and the expression status of the introduced nucleic acid and the cell division status were confirmed with or without GFP fluorescence.
  • Example 5 Plant Regeneration from Nucleic Acid-Introduced Fertilized Egg Cells
  • an embryoid body embryoid body (embryonic cell mass) was obtained according to Examples 2 and 3 Further culture was performed.
  • the medium was renewed to a modified N6Z medium not containing rice floating cell culture, and further cultured for 2 weeks.
  • the cell mass grown to about 2 mm is placed on the corn slice of corn A188 that has passed 10 days after mating, and the redifferentiation medium RMS1 medium (Non-Patent Document 22) containing 5 ⁇ M CuSO 4 .5H 2 O is used for 2 days.
  • the cells were cultured in a bright place at 25 ° C. Thereafter, the cell mass was transferred to a regeneration medium RMS1 medium containing 5 ⁇ M CuSO 4 .5H 2 O, and redifferentiation culture was performed at 25 ° C. for 2 weeks in a light place.
  • the cell mass was divided and cultured in a redifferentiation medium RMS2 medium (Non-Patent Document 22) until further rooting in a light place at 25 ° C.
  • the cells were transferred to the regeneration medium RMS3 medium and cultured in a light place at 25 ° C. until the shoots reached about 10 cm.
  • Individuals whose shoots were reddish brown were cultured in an RMS3 medium containing 10 g / L ascorbic acid.
  • Fully rooted individuals were transplanted into pots containing soil and cultivated in a greenhouse. As a result, a regenerated individual could be obtained from one fertilized egg into which nucleic acid had been introduced.
  • Example 6 Acquisition of Rice Egg Cells Unflowered flowers obtained from rice spikes were disassembled and ovaries and pupae were collected. The ovary and pupae were placed in a 3.5 cm plastic petri dish containing 3 mL of 6% mannitol solution (370 mosmol / kg H 2 O).
  • the ovary from which the stigma was removed was submerged in 3 mL of 6% mannitol solution (370 mosmol / kg H 2 O) in a new 3.5 cm plastic petri dish, and a laser blade (Feather Safety Razor Co., FA-10) was placed at the bottom of the petri dish. ) To cut the lower part of the ovary. The egg cells emerging from the cut portion were confirmed by microscopic observation, and the egg cells were isolated with a microcapillary. Approximately 10 to 15 egg cells were obtained from 30 to 40 ovaries. The diameter of each egg cell was 40-50 ⁇ m.
  • the fertilized egg is produced by fusing the isolated sperm cell to the obtained unfertilized egg cell. Thereafter, the fertilized egg cell is treated with an enzyme solution containing a plant tissue degrading enzyme at a low titer condition.
  • Example 7 Nucleic acid introduction and plant regeneration into corn-derived fertilized eggs of different varieties
  • fertilized eggs of corn varieties A188 were isolated.
  • the enzyme treatment method was carried out for 10 minutes with an enzyme solution containing 0.33% cellulase, 0.1% macerozyme R10, 0.017% pectinase Y23 (pectinase concentration in the enzyme solution was 4.17 Unit / mL), and further 0.1.
  • An enzyme solution containing 165% cellulase, 0.05% macerozyme and 0.008% pectinase (pectinase concentration in the enzyme solution was 2.08 Unit / mL) was set to 20 minutes.
  • the total of Unit / mL ⁇ treatment time in the enzyme treatment was 83.4.
  • a DNA fragment consisting of a base sequence encoding a corn ubiquitin promoter :: corn ubiquitin intron :: GFP :: nostarminator was introduced into the isolated fertilized egg.
  • nucleic acid was introduced by the method described in Example 4 using a PEG solution in which the content of PEG 4000 was modified to 10 g / 25 mL.
  • the fertilized egg subjected to the nucleic acid introduction treatment was cultured by the method of Example 2. After 2 weeks, the medium was renewed to a modified N6Z medium not containing rice floating cell culture, and further cultured for 2 weeks.
  • a cell mass grown to about 2 mm is placed on a corn A188 fruit slice 10 days after mating, in a regeneration medium RMS1 medium containing 5 ⁇ M CuSO 4 .5H 2 O for 6 days at 25 ° C. in the light. Cultured. Thereafter, the cell mass was transferred to a regeneration medium RMS1 medium containing 5 ⁇ M CuSO 4 .5H 2 O, and redifferentiation culture was performed at 25 ° C. for 2 weeks in the dark. In order from the rooted individual, the cells were transferred to the regeneration medium RMS3 medium and cultured in a light place at 25 ° C. until the shoots reached about 10 cm.
  • Example 8 Nucleic acid introduction and plant regeneration into rice-derived fertilized eggs Fertilized eggs were isolated from rice grown in a greenhouse (variety: Yukihikari). Fertilized eggs were isolated according to Example 7 and Non-Patent Document 11 (Abiko, et al., (2013)) except that ovary was collected 2 to 3 hours after flowering.
  • the obtained rice fertilized egg cells were subjected to enzyme treatment in the same manner as in Example 1 for 20 minutes.
  • the enzyme treatment was performed using an enzyme solution in which each enzyme was dissolved in a 7.5% mannitol solution (450 mosmol / kg H 2 O) so as to have each concentration shown in Table 2.
  • a pMON30049 vector containing a DNA fragment consisting of a base sequence encoding 35S promoter :: HSP70 intron :: SP :: GFP :: HDEL was introduced into a fertilized egg subjected to enzyme treatment.
  • Nucleic acid was introduced by the method described in Example 4 using an MMG solution containing the vector at a concentration of 130 ⁇ g / mL. Thereafter, 16-24 hours after PEG treatment, rice fertilized egg cells were observed with a fluorescence microscope, and the expression of the introduced nucleic acid was confirmed by the presence or absence of GFP fluorescence. The result is shown in FIG. Moreover, it was confirmed that the rice fertilized egg cells started to divide.
  • the fertilized rice subjected to the nucleic acid introduction treatment was cultured and redifferentiated for 18 to 19 days according to Non-Patent Document 3.
  • redifferentiated individuals were able to be obtained from the fertilized rice with the nucleic acid introduced.

Abstract

本発明は、植物に物質を導入する方法に関する。本発明の方法は、以下の工程：（１－ｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離し、その後、当該受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、（１－ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された受精卵細胞を単離する、（１－ｉｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理すると同時に、酵素処理された受精卵細胞を単離する、（１－ｉｖ）植物体から卵細胞および精細胞を単離し、それらを融合することで受精卵を作出し、その後、当該受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、あるいは、（１－ｖ）植物の卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された卵細胞を単離、さらに、単離した精細胞と融合させる、ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する、ことを含む。

Description

植物に物質を導入する方法
　本発明は植物に物質を導入する方法に関する。
　植物、特に単子葉植物への遺伝子組換え技術は、１９９０年代にアグロバクテリウムを利用した方法がイネ、トウモロコシで開発されたことを契機に急速に利用が普及し、現在までに様々な形質転換方法が開発されてきている。しかしながら、それらの多くは、植物組織の脱分化と再分化を経由することが必要であるが故に、種や品種間で形質転換の効率が大きく異なることが知られている。種や品種によっては形質転換の効率が低く、再現性をもって形質転換植物を得ることができない。例えば、トウモロコシにおいて育種上非常に重要な系統であるＢ７３では、再現性を持った形質転換法はいまだ開発されていない。
　また、近年効率的にゲノム編集を行うことが可能になりつつあるが、これも作物種、品種ごとに組織培養の容易性が異なる点が、ゲノム編集効率に大きな影響を与えるため、植物におけるゲノム編集実用化の妨げとなっている。
　一方、１９９０年代に、植物体から精細胞と卵細胞を単離し、それらを人工的に融合させる人工受精が試みられ、植物体の作出に成功している。非特許文献１には、トウモロコシの卵細胞及び精細胞を電気融合して受精卵細胞を作出し、それを植物体にまで培養する方法が記載されている。非特許文献１では卵細胞の分離に酵素の混合物（０．７５％　ペクチナーゼ（Ｓｅｒｖａ）、０．２５％　ペクトリアーゼ、０．５％　ヘミセルロース、０．５％　セルラーゼ）を用いているが、用いた酵素、特にペクチナーゼの力価が高い。また、その卵細胞を用いて作製した受精卵細胞を用いて遺伝子導入、形質転換を行った旨の記載もない。
　また、非特許文献２には、イネの雌雄配偶子（卵細胞と中心細胞）の単離方法が記載されている。具体的には植物体から胚珠を単離後、０．３Ｍマンニトール溶液中で、酵素処理（マンニトール溶液（６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ）＋０．３％　ペクトリアーゼ　Ｙ−２３、１．５％　ペクチナーゼ、１％　セルロース、１％　ヘミセルロースで１０~１５分処理）を行っているが、非特許文献１と同様に、酵素、特にペクチナーゼの力価が高い。さらに、対象は受精卵でなく受精前卵細胞であり、植物までの再生、植物への遺伝子導入、形質転換を行った旨の記載もない。
　非特許文献３及び非特許文献４には、イネの雌雄配偶子の電気融合により、受精卵を作出し、それを植物体にまで培養する方法が記載されている。これら先行文献には、人工的に雌雄配偶子を融合させた受精卵細胞から植物体の誘導が可能であることが示されている。しかしながら、上記文献においても、非特許文献２と同様に遺伝子導入や形質転換といった点は全く記載されておらず、受精卵を用いて形質転換が行えるかどうかは全く不明であった。なお、非特許文献３および４には、卵細胞を酵素処理することの記載もない。
　トウモロコシ（非特許文献５、１２）、イネ（非特許文献６、１１）、コムギ（非特許文献７）、オオムギ（非特許文献８、１０）、タバコ（非特許文献９）などの種においては、受精後の胚嚢から受精卵を採取・培養し、植物体を作出した例も知られている。その中には非特許文献５、１０のように、受精卵細胞にＤＮＡをマイクロインジェクション法により導入できることを示した報告もあるが、この方法が実用化された事実は報告されていない。また、そのほかの方法による遺伝子導入については全く知見がない。
　植物細胞に遺伝子を導入する方法は、マイクロインジェクション法以外にポリエチレングリコール法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ法）やエレクトロポレーション法などがある。この中でもマイクロインジェクション法は細胞壁を有する細胞にも遺伝子導入が可能であり、導入対象の植物細胞の細胞壁を酵素処理等により除去する必要は特にない。しかし、一回の導入操作で一細胞しか扱えないという欠点がある。それに対しエレクトロポレーション法やＰＥＧ法、特にＰＥＧ法は、マイクロインジェクション法に比べ一回に多数の細胞を扱える利点があるが、細胞壁を酵素等により除去する過程が必要である。受精卵細胞については、細胞壁を除去する方法であって、細胞壁除去後に細胞分裂を継続し植物体に成長できるような、細胞活性を維持した状態で細胞壁を除去する方法、が不明であった。そのため、受精卵細胞について、ＰＥＧ法等の方法により遺伝子導入を行い、細胞分裂にまで至らせた報告はなされていなかった。上記報告の中でも、イネ、コムギ、オオムギの受精卵細胞は、セルラーゼ等の細胞壁を取り除く酵素を利用せずガラス針等を用いることのみによって受精卵細胞を摘出している。このような物理的手法で単離した受精卵には細胞壁が残存しており、ＰＥＧ法を適用することは困難であると推察され、事実ＰＥＧ法が適用された例も報告されていない。
　酵素処理による細胞壁除去については、従来から細胞壁分解酵素であるセルラーゼ及びペクチナーゼ等による処理が、植物細胞のプロトプラスト化に有効であることが知られている。しかしながら、高濃度もしくは長時間に及ぶ処理は、植物細胞に害作用を与えることもある。一方、低濃度もしくは短時間による処理では細胞壁の除去が不完全で、プロトプラスト化の所望の目的が果たせない場合もある。そのため、植物において卵細胞や受精卵細胞の単離、培養が比較的に多く研究されているトウモロコシでさえ、受精卵細胞をプロトプラスト化し、ＰＥＧ法で遺伝子導入された例がなく、そのようなことが可能か否かも不明であった。
　実際に、非特許文献５には、トウモロコシに対するごく短時間（２分間）での酵素処理によって受精卵を単離し、マイクロインジェクションによる遺伝子導入を行った旨が記載されている。また、非特許文献９では、タバコを材料に非常に弱いペクチナーゼ活性を示すマセロザイムＲ１０を用い、２段階で合計最大１時間の酵素処理が記載されている。非特許文献５および９に記載の２法のように、極めて短時間の酵素処理もしくは、非常に弱い酵素で長時間の酵素処理を行っているのは、酵素処理が受精卵細胞の活性及び発生能に負の効果をもたらすと考えられ、その影響を最小限にするためと推察される。しかし、短時間の酵素処理あるいは弱い活性を有する酵素での処理では受精卵細胞の細胞壁が完全に除去されず、ＰＥＧ法の材料としては不向きだと考えられる。そのため今まで受精卵に対しＰＥＧ法を適用した例はなく、また、ＰＥＧ法を行った受精卵細胞が分裂能を維持することができるか否かは不明であった。
Ｋｒａｎｚ，Ｅ．ａｎｄ　Ｌｏｒｚ，Ｈ．，（１９９３），Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　５：７３９−７４６． Ｕｃｈｉｕｍｉ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，（２００６），Ｓｅｘ．Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｐｒｏｄ．１９：３７−４５． Ｕｃｈｉｕｍｉ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，（２００７），Ｐｌａｎｔａ　２２６：５８１−５８９． Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｔ．，（２０１１），Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７１０：１７−２７． Ｌｅｄｕｃ，Ｎ．ｅｔ　ａｌ．，（１９９６），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１７７：１９０−２０３． Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，（１９９９），Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１９：１２８−１３２． Ｋｕｍｈｅｈｎ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，（１９９７），Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１６：６６３−６６７． Ｈｏｌｍ，Ｐ．Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，（１９９４），Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　６：５３１−５４３． Ｙｕｃｈｉ，Ｈ．Ｅ．ｅｔ　ａｌ．，（２００４），Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　４９：　８１０−８１４． Ｈｏｌｍ，Ｐ．Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，（２０００），Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　９：２１−３２． Ａｂｉｋｏ，ｅｔ　ａｌ．，（２０１３），Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂｏｔａｎｙ　６４：　１９２７−１９４０． Ｌｅｄｕｃ，ｅｔ　ａｌ．，（１９９５），Ｓｅｘ　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｐｒｏｄ．８：３１３−３１７． Ｙｏｏ，ｅｔ　ａｌ．，（２００７），Ｎａｔ　Ｐｒｏｔｏｃ．２（７）：１５６５−７２． Ｉｓｈｉｉ，Ｓ．，（１９７６），Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｒｙ，６６，２８１−２８９ Ｎｅｌｓｏｎ，Ｎ．，（１９４４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１５３，３７５−３８０ Ｓｏｍｏｇｙｉ，Ｍ．，（１９５２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５，１９−２３ Ｍｕｒａｓｈｉｋｅ，Ｔ．，ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ，Ｆ．，（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：　４７３−４９７． Ｇａｍｂｏｒｇ，Ｏ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，（１９６８）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．５０：１５１−１５８ Ｃｈｕ，ｅｔ　ａｌ．，（１９７５）Ｓｃｉ．Ｓｉｎｉｃａ　１８：　６５９−６６８． Ｍｏｌ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔａ　１８９：　２１３−２１７． Ｋｒａｎｚ，ｅｔ　ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｘ．Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｐｒｏｄ．４：　１２−１６． Ｋｒａｎｚ，Ｅ．，（１９９９），Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１１：２５９−６７．
　本発明は、植物に物質を導入する方法、本発明の方法によって物質が導入された植物を提供することを目的とする。
　受精卵は本来、植物体へと成長する能力を保有した細胞であり、それゆえ、種、品種間差によって生じる培養効率の影響を受けないことが期待される。このような受精卵細胞を対象に物質の導入を行えば、現状より幅広い種、作物に形質転換及びゲノム編集が行える。本発明者らは鋭意検討の結果、受精卵細胞の活性を失わずプロトプラスト化する方法を発見し、さらには受精卵を効率よく単離する方法、単離した受精卵細胞を培養する方法を組み合わせることにより、受精卵細胞に対し物質を導入し、分裂を誘導し、形質転換が可能であることを見出し、本発明を想到した。
　限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
　植物に物質を導入する方法であって、以下の工程：
　（１−ｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離し、その後、当該受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、
　（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された受精卵細胞を単離する、あるいは、
　（１−ｉｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理すると同時に、酵素処理された受精卵細胞を単離する、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
　（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する、
ことを含む、上記方法。
［態様２］
　植物に物質を導入する方法であって、以下の工程：
　（１−ｉｖ）植物体から卵細胞および精細胞を単離し、それらを融合することで受精卵を作出し、その後、当該受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、あるいは、
　（１−ｖ）植物の卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された卵細胞を単離、さらに、単離した精細胞と融合させる、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
　（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する、
ことを含む、上記方法。
［態様３］
　植物組織分解酵素が、ペクチナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、ヘミセルラーゼ類、グルクロニダーゼ、ザイモリダーゼ、キチナーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ，ガラクタナーゼ，アラビナナーゼおよびリグニン分解酵素、並びに、これらの混合物からなる群から選択される、態様１又は２に記載の方法。
［態様４］
　植物組織分解酵素がペクチナーゼを含む、態様１−３のいずれか１項に記載の方法。
［態様５］
　植物が、単子葉植物である、態様１−４のいずれか１項に記載の方法。
［態様６］
　植物が、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ及びソルガムからなる群から選択される、態様５に記載の方法。
［態様７］
　植物が、トウモロコシＢ７３又はＢ７３由来のトウモロコシ品種である、態様１−６のいずれか１項に記載の方法。
［態様８］
　卵細胞を、植物の卵細胞を含む組織から単離した後に、精細胞融合によって、受精卵細胞とする、態様１−６のいずれか１項に記載の方法。
［態様９］
　酵素処理時間が３分以上６０分以下である、態様１−８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１０］
　酵素処理後、１２０分以内に工程（２）の物質導入を行う、態様９に記載の方法。
［態様１１］
　精細胞融合の後、１２０分以内に工程（２）の物質導入を行う、態様８又は９に記載の方法。
［態様１２］
　植物組織分解酵素がペクチナーゼを含み、そして、工程（１）の酵素処理時の系におけるペクチナーゼのＵｎｉｔ／ｍＬが、６０以下である、態様９に記載の方法。
［態様１３］
　植物組織分解酵素がペクチナーゼを含み、そして、工程（１）の酵素処理時の系におけるペクチナーゼのＵｎｉｔ／ｍＬ×処理時間が、３１０以下である、態様１−１２のいずれか１項に記載の方法。
［態様１４］
　工程（２）の物質導入が、ＰＥＧ法又はエレクトロポレーション法を用いて行われる、態様１−１３のいずれか１項に記載の方法。
［態様１５］
　植物に物質を導入する方法であって、以下の工程：
　（１−ｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離し、その後、当該受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、
　（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された受精卵細胞を単離する、あるいは、
　（１−ｉｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理すると同時に、酵素処理された受精卵細胞を単離する、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
　（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入し；
　（３）物質を導入した受精卵細胞をカルス化又は胚様体化し；そして、
　（４）上記カルス化又は胚様体化した組織を再分化培地で再分化させる、
ことを含む、上記方法。
［態様１６］
　植物に物質を導入する方法であって、以下の工程：
　（１−ｉｖ）植物体から卵細胞および精細胞を単離し、それらを融合することで受精卵を作出し、その後、当該受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、あるいは、
　（１−ｖ）植物の卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された卵細胞を単離、さらに、単離した精細胞と融合させる、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
　（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入し；
　（３）物質を導入した受精卵細胞をカルス化又は胚様体化し；そして、
　（４）上記カルス化又は胚様体化した組織を再分化培地で再分化させる、
ことを含む、上記方法。
［態様１７］
　態様１−１６のいずれか１項に記載の方法で得られた、物質導入植物。
　本発明により、従来培養困難であった植物、例えばトウモロコシＢ７３、であっても、培養、物質の導入及び形質転換を行うことが可能となった。これにより、形質転換が困難であったため有用形質を付与することできなかった植物体であっても、安定して再現性良く形質転換体を得ることが可能となる。
図１は、酵素処理後のトウモロコシ（Ｂ７３）珠心切片の透過像である。 図２は、単離されたトウモロコシ（Ｂ７３）受精卵細胞の光学顕微鏡写真である。 図３は、分裂を開始したトウモロコシ（Ｂ７３）受精卵細胞由来の胚性細胞塊の光学顕微鏡写真である。 図４は、成長した図３由来のトウモロコシ（Ｂ７３）受精卵細胞由来の胚性細胞塊の光学顕微鏡写真である。 図５は、図３及び４のトウモロコシ（Ｂ７３）の胚性細胞塊から発生したシュートの光学顕微鏡写真である。 図６は、図３−図５の胚性細胞塊から再生したトウモロコシ（Ｂ７３）受精卵細胞由来植物体である。 図７は、ＰＥＧ法によるＧＦＰ核酸導入後、分裂を開始したトウモロコシ（Ｂ７３）受精卵細胞の蛍光顕微鏡写真である。 図８は、ＰＥＧ法によるＧＦＰ核酸導入後、分裂を開始したイネ（ユキヒカリ）受精卵細胞の蛍光顕微鏡写真（上段）、光学顕微鏡写真（下段）及びそれらのｍｅｒｇｅ（中段）である。なお、バーは２０μｍを示す。
　本発明は、植物に物質を導入する方法に関する。
　本発明の方法は、以下の工程：
　（１−ｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離し、その後、当該受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、
　（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された受精卵細胞を単離する、あるいは、
　（１−ｉｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理すると同時に、酵素処理された受精卵細胞を単離する、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
　（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する、
ことを含む。
　本発明の方法は、また、別の態様において、以下の工程：
　（１−ｉｖ）植物体から卵細胞および精細胞を単離し、それらを融合することで受精卵を作出し、その後、当該受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、あるいは、
　（１−ｖ）植物の卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された卵細胞を単離、さらに、単離した精細胞と融合させる、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
　（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する、
ことを含む。
　本発明の方法は、また、さらに別の態様において、以下の工程：
　（１−ｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離し、その後、当該受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、
　（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された受精卵細胞を単離する、あるいは、
　（１−ｉｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理すると同時に、酵素処理された受精卵細胞を単離する、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
　（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入し；
　（３）物質を導入した受精卵細胞をカルス化又は胚様体化し；そして、
　（４）上記カルス化又は胚様体化した組織を再分化培地で再分化させる、
ことを含む。
　本発明の方法は、また、さらに別の態様において、以下の工程：
　（１−ｉｖ）植物体から卵細胞および精細胞を単離し、それらを融合することで受精卵を作出し、その後、当該受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、あるいは、
　（１−ｖ）植物の卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された卵細胞を単離、さらに、単離した精細胞と融合させる、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
　（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入し；
　（３）物質を導入した受精卵細胞をカルス化又は胚様体化し；そして、
　（４）上記カルス化又は胚様体化した組織を再分化培地で再分化させる、
ことを含む。
　植物
　植物の種類は特に限定されるものではない。双子葉植物および単子葉植物のいずれでもよく、好ましくは単子葉植物である。さらに好ましくは、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ソルガム、ライムギ等であり、最も好ましくは、トウモロコシ、コムギ、イネである。
　本発明の方法は、限定されるわけではないが、特に、「難培養」とされる物あるいは品種に用いることが可能である。「難培養」とは、培養が困難、具体的には、例えば、植物体から単離された細胞の培養が困難、脱分化等の処理によるカルスの形成や、カルスからの植物体への再分化が困難である、ことを意味する。
　一般的に双子葉植物よりも単子葉植物の方が培養困難だが、「難培養」の植物は、例えば、大豆、インゲンマメ、トウガラシ等を含む。難培養品種とは、同じ種の一般的な研究用品種（トウモロコシならＡ１８８など）と比べ、培養が困難である品種を意味する、例えば、トウモロコシのＢ７３およびＢ７３を由来に持つトウモロコシのエリート品種、コムギのエリート品種（例えばＡＣ　ＢａｒｒｉｅやＴＡＭなど）、オオムギのＧｏｌｄｅｎＰｒｏｍｉｓｅ及びＩｇｒｉ以外の品種、ソルガムの２９６Ｂ、Ｃ４０１、ＳＡ２８１、Ｐ８９８０１２、Ｐｉｏｎｅｅｒ　８５０５、Ｔｘ４３０以外の品種などが挙げられる。
　受精卵細胞
　本発明において、物質を導入する細胞は、接合子、即ち、受精卵細胞であることが好ましい。受精卵細胞は、植物の胚嚢を含む組織（子房、胚珠、珠心等）から単離される受精した卵細胞である、即ち、植物体の段階で受粉・受精させ、該植物体から単離した受精卵細胞、であってもよい。あるいは、受粉・受精前の植物体から卵細胞および精細胞を単離したのち、それらを融合させて受精卵細胞を作出および取得してもよい。即ち、酵素処理された単離受精卵細胞は、
　（１−ｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離し、その後、当該受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、
　（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された受精卵細胞を単離する、
　（１−ｉｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理すると同時に、酵素処理された受精卵細胞を単離する、
　（１−ｉｖ）植物体から卵細胞および精細胞を単離し、それらを融合することで受精卵を作出し、その後、当該受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、あるいは、
　（１−ｖ）植物の卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された卵細胞を単離、さらに、単離した精細胞と融合させる、
ことのいずれによって取得されうる。
　適切な浸透圧の溶液中において胚嚢を含む組織（例えば胚珠）を切断し、その切断面から出て来た（受精）卵細胞を顕微鏡下においてガラスキャピラリー等を用いて単離することができる。なお、この場合、酵素処理は単離した（受精）卵細胞に対し酵素溶液で一定時間処理することで酵素処理された受精卵を得る。
　あるいは、酵素溶液で胚珠等の胚嚢を含む組織を一定時間処理した後に、例えば、ガラス針等を用いて顕微鏡下において珠心等の組織を解剖し機械的に摘出、単離することもできる。この場合、その後の酵素処理を行うことなく酵素処理（受精）卵が得られる。なお、単離した卵細胞と精細胞の融合によって受精卵を得る場合の酵素処理は、卵細胞単離の前、同時あるいは精細胞との融合後のいずれの段階であってもよい。
　酵素処理
　本発明の方法は、植物の（受精）卵細胞を含む組織から、（受精）卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理することを特徴とする。酵素処理は、（受精）卵細胞を組織から単離する前、単離と同時、あるいは、単離の後、のいずれの時期に行ってもよいが、好ましくは単離と同時あるいは単離の後である。
　（ｉ）酵素の種類
　植物の細胞壁は、セルロースからなる基本骨格が他の多糖やタンパク質からなる基質（マトリックス、基質ゲル）の中に埋め込まれている。基質を構成する多糖は、伝統的に熱水や酸性緩衝液で抽出されるペクチン（ｐｅｃｔｉｎ）と、アルカリに可溶な成分であるヘミセルロース（ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）に分けられているが、最近ではマトリックス多糖（ｍａｔｒｉｘ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）としてまとめられることが多い。
　多くの被子植物の細胞壁はタイプＩと呼称され、セルロースとキシログルカンが多く、ペクチン、アラビノキシラン、グルコマンナン、ガラクトグルコマンナンなどが含まれる。一方、単子葉類の一部（イネ目）の細胞壁はタイプＩＩと呼称され、セルロースとキシラン（グルクロノアラビノキシラン）、１，３−１，４−β−Ｄ−グルカンが多く、ペクチンやキシログルカンが少ない。またタイプＩの細胞壁では、構造タンパク質（エクステンシンなど）が大きな役割を果たしているが、タイプＩＩ細胞壁ではタンパク質含量が低く、フェノール酸（フェルラ酸など）の架橋がその代わりを果たしている。
　本発明の方法に用いる酵素は、植物組織分解酵素であれば、特に限定されない。「植物組織分解酵素」とは、植物組織および細胞周辺のペクチン、セルロース、ヘミセルロース、そのほかのマトリックス多糖、リン脂質、タンパク質等に直接あるいは間接的に作用して分解する酵素の総称である。例えば、非限定的に、プロトプラスト調製用酵素、細胞膜を分解するフォスフォリパーゼ、組織分解に役立つと考えられているタンナーゼ、イネなどタイプＩＩ細胞壁に含まれる成分を分解するフェルラ酸エステラーゼ、プロテアーゼ等が含まれる。特に、植物細胞の細胞壁を溶解してプロトプラストを調製するために使用される、種々のプロトプラスト調製用酵素が使用されうる。
　例えば、ペクチナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、ヘミセルラーゼ類（ヘミセルラーゼとは、一般的にヘミセルロースを加水分解する酵素の総称を指す）、グルクロニダーゼ、ザイモリダーゼ、キチナーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ，ガラクタナーゼ，アラビナナーゼおよびリグニン分解酵素、あるいは、これらの混合物（これら酵素群のうち２種以上の混合物）が含まれる。ペクチナーゼは、例えば、ポリガラクツロナーゼ（ガラクツロナーゼ）、ペクチンリアーゼおよびペクチンメチルエステラーゼを含む。本明細書において、特に言及しない場合、ペクチナーゼの力価は、これらの３種類の酵素の力価を足したもの、又はポリガラクツロナーゼ及びペクチンリアーゼの２種類の酵素の力価を足したものを意味する。
　好ましくは、植物組織分解酵素はペクチナーゼを含む。ペクチナーゼ単独であっても、あるいは、ペクチナーゼと上記記載の群から選ばれる別の一種以上の酵素を含んでもよい。好ましくは、セルラーゼおよびペクチナーゼである。
　ペクチンとは、ガラクツロン酸がα−１，４結合したポリガラクツロン酸が主成分である、複合多糖類の一種である。その分解酵素であるペクチナーゼは、ペクチンを分解する酵素反応系を触媒する酵素群の総称であり、（ａ）ペクチン又はポリガラクツロン酸のα−１，４結合を加水分解するポリガラクツロナーゼ、（ｂ）脱離反応により主鎖を分解するペクチンリアーゼ（ポリガラクツロン酸リアーゼ）、（ｃ）ペクチンのメチルエステルを加水分解するペクチンメチルエステラーゼに分類されている。ペクチナーゼは、植物の組織における個々の細胞同士の結合部（中層）に作用し、組織を単細胞にまでバラバラにする作用がある酵素であり、特に植物細胞を破壊せずに遊離させるマセレーションや植物細胞工学上重要な酵素である。ペクチナーゼとしては、例えば、商品名マセロザイムＲ１０（商標）（Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ）（ヤクルト本社製）、スミチームＡＰ２（Ｓｕｍｉｔｅａｍ）（新日本化学工業社製）等のポリガラクツロナーゼを含むもの、ペクトリアーゼＹ２３（Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ　Ｙ２３）（盛進製薬製）、及びペクチナーゼ（Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ製）等のペクチンリアーゼを含むものがある。好ましくはマセロザイムＲ１０とペクトリアーゼＹ２３の混合使用、もしくはペクチナーゼＹ２３の単独使用等があげられる。
　セルラーゼは、植物の細胞壁成分であるセルロースのβ−１，４−グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素である。セルラーゼとしては、例えば、商品名セルラーゼ・オノズカＲＳ（商標）（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ＯｎｏｚｕｋａＲＳ）（ヤクルト本社製）、セルラーゼ・オノズカＲ１０（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ＯｎｏｚｕｋａＲ１０）（ヤクルト本社製）、ドリセラーゼ（Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ）（協和発酵製）等が用いられる。好ましくは、セルラーゼ・オノズカＲＳ（商標）及びセルラーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）でさらに好ましくはセルラーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）である。
　（ｉｉ）酵素の力価（Ｕｎｉｔ）
　本発明の方法において、植物の受精卵細胞を処理する植物組織分解酵素は「低力価条件」で用いる。
　「低力価条件」とは、植物組織を分解するために各酵素を用いる際に一般に使用する条件よりも、より酵素が機能しない条件（本発明においては分解酵素であるため、対象物質を分解する酵素活性が低い条件）、具体的には、短い処理時間、および／又は、低い酵素濃度（低い酵素活性：低Ｕｎｉｔ／ｍＬ）、を意味する。特には、通常のプロトプラスト調製条件よりも短い処理時間、および／又は、低い濃度が好ましい。「低力価条件」に相当する条件は、用いる酵素の種類、植物の種類等によって、適宜変更しうる。
　なお、Ｕｎｉｔの測定は、公知の方法を用いることができる。例えば、ペクチンリアーゼの活性測定は、Ｉｓｈｉｉらの方法（非特許文献１４）に従って測定することができ、ペクチンリアーゼ活性１単位（１Ｕｎｉｔ）は、１分間に１μｍｏｌの不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和ポリガラクツロニドを生成する量とすることができる。また、ポリガラクツロナーゼ活性測定は、ソモギーネルソン法（非特許文献１５、非特許文献１６）に従って測定することができ、ガラクツロナーゼ活性１単位（１Ｕｎｉｔ）は、１分間に１μｍｏｌのガラクツロン酸（又はその誘導体、修飾物）を生成する量とすることができる。
　本明細書の実施例において、今まで植物組織における細胞間の結合に作用すると考えられてきたペクチナーゼが、単細胞である受精卵の単離のみならずその後の植物体までの再生能に大きな影響を与えることが見出された。受精卵細胞を酵素処理する際の酵素溶液に含まれるペクチナーゼ濃度が低いとき、単離した受精卵細胞が植物体まで再生できる、或いは／並びに、核酸等物質導入が可能である、ことが見出された。特に、従来方法では培養が難しく、とりわけカルス化及び植物体再生が困難であったトウモロコシＢ７３において、酵素溶液に含まれるペクチナーゼのＵｎｉｔ／ｍＬが６０以下であり、そして、Ｕｎｉｔ／ｍＬ×時間が３１０以下である場合に、胚性細胞塊が取得できることが確認できた。さらに、ＰＥＧ法により核酸を導入できること及び植物体までの再生が可能であることが確認できた。
　よって、本発明において、植物組織分解酵素がペクチナーゼの場合、そして、工程（１）の酵素処理時の系におけるペクチナーゼのＵｎｉｔ／ｍＬ、すなわち、本発明における低力価条件処理とは、非限定的に、好ましくは６０以下、４０以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、１以下、０．７以下である。酵素溶液のペクチナーゼのＵｎｉｔ／ｍＬが６０以上である場合には、（受精）卵細胞へのダメージが起きるため、好ましくない。Ｕｎｉｔ／ｍＬの下限は特に限定されない。好ましくは、０．１以上、０．２以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．６５以上である。Ｕｎｉｔ／ｍＬ×時間は、好ましくは３１０以下、３００以下、２５０以下、２００以下、１００以下、９０以下、５０以下、３０以下である。Ｕｎｉｔ／ｍＬ×時間の下限は特に限定されない。好ましくは、１以上、２以上、３以上、３．３以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上である。
　（ｉｉｉ）酵素処理の時間
　酵素処理の時間は、非限定的に、好ましくは３分以上、より好ましくは５分以上である。好ましくは６０分以下、５０分以下、４５分以下である。より好ましくは、３分以上６０分以下、５分以上５０分以下、５分以上４５分以下である。
　濃い（高Ｕｎｉｔ／ｍＬである、あるいは高力価条件である）酵素液で短時間処理の場合、個体による酵素処理結果の差異が生じ好ましくない。これは具体的には、例えば、（受精）卵細胞の単離のために最初に植物の胚嚢を含む子房又は胚珠の一部をカミソリ等で切り出すが、切端（機械的処理の場合は、例えば胚珠を押す等の処理により切端より（受精）卵細胞を押し出すことが可能である）から（受精）卵細胞までの距離はその胚珠により様々である。特に、切端から（受精）卵細胞までの距離が遠い場合、酵素液が浸透して（受精）卵細胞に接するまでに時間がかかる。このようなタイムロスにより、濃い酵素液で短時間処理を行う場合、実際に（受精）卵細胞を酵素処理している時間は短くなるため、胚珠ごとに酵素処理の効き目が異なり、いわゆるムラになる。ほとんど酵素処理されていないような胚珠由来の（受精）卵は、（薄い酵素濃度×長時間処理と比べると）物質導入効率が低下し、結果として形質転換効率は落ちる。
　これに対し、薄い酵素液で長時間処理の場合、切端から（受精）卵の距離が多少異なっていても、酵素液が十分（受精）卵まで浸透する時間がとれるため、酵素処理が十分に行われる。よって、胚珠ごとの酵素処理の程度にムラが低くなり、物質導入が効率が向上するために、結果として形質転換効率の向上につながる。よって、一定時間以上処理を行うことは重要である。また、長時間処理も受精卵の細胞活性を低下させることにつながるため、好ましくない。
　なお、プロトプラストの調製の場合には、一般に長時間（４時間以上）を要する。本発明の酵素処理は、プロトプラスト調製の酵素処理時間よりも明らかに短時間で行う。
　（ｉｖ）酵素処理のその他の条件
　酵素処理を行う際、浸透圧を調整するのが好ましい。浸透圧の調整方法は特に限定されないが、例えば、オスモライトの添加により行われる。具体的には、多価アルコールや、アミノ酸などの添加により行われる。好ましくは多価アルコールの添加であり、非限定的に、好ましくはマンニトール、マルトース、グルコース、ソルビトール、ラフィノース、トレハロースやオリゴ糖などを利用できる。
　好ましい浸透圧は、用いる植物の種類に応じて適宜選択可能である。例えば、イネでは下限を３８０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以上とすることが好ましく、３９０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以上とすることがより好ましく、４００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以上とすることがさらに好ましい。また、上限を４７０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以下とすることが好ましく、４６０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以下とすることがより好ましく、４５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以下とすることがさらに好ましい。トウモロコシでは、下限を６００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以上とすることが好ましく、６３０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以上とすることがさらに好ましい。また、上限を７００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以下とすることが好ましく、６８０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以下とすることがさらに好ましい。
　ｐＨは、プロトプラストが製造できるｐＨ範囲であれば特に制限はない。ｐＨ５．０以上７．０以下が好ましい。
　酵素処理を行う温度については、使用する酵素により適宜設定することが可能である。ただし１０℃未満の条件では、期待される酵素活性が十分に得られない酵素が多いので、１０℃以上が好ましい。
　物質の導入
　本発明の植物に物質を導入する方法は、得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する工程（工程（２））を含む。
　本発明において、植物に導入される物質は、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される。核酸は特に限定されず、ＲＮＡ、ＤＮＡ、両者の結合体、混合物であってもよい。好ましくはベクターのような環状ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、環状ＲＮＡ又は直鎖ＲＮＡである。使用される形質転換方法に応じた任意の長さのものを使用可能である。例えば、ＰＥＧ法を用いる場合、核酸の長さは、好ましくは１００ｋｂ以下、より好ましくは、５０ｋｂ以下である。さらに好ましくは３０ｋｂ以下、もっとも好ましくは２０ｋｂ以下である。
　ゲノム編集のためのジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ）や、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ等のヌクレアーゼや、修飾酵素、抗体等のタンパク質及びそれらの複合体も導入しうる。タンパク質の大きさは、非限定的に、好ましくは分子量３００ｋＤａ以下、より好ましくは、２００ｋＤａ以下である。なお、コエンザイムのような、植物に導入されるタンパク質が細胞内で機能するために必要な化学物質も含んでよい。
　ペプチドは、決まった順番で様々なアミノ酸が、アミド結合（「ペプチド結合」ともいう）つながった分子の総称で、一般にタンパク質よりも長さが短い。好ましくは、１００ａ．ａ．以下、より好ましくは、５０ａ．ａ．以下である。
　２種類以上の核酸、タンパク質及びペプチドを導入してもよい。核酸とタンパク質など異なる種の物質を導入してもよい。
　物質を植物に導入する方法は、植物に所望の物質を導入することのできる公知の方法ならば特に限定されず、植物の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法などの物理化学的方法（ＤＮＡの直接導入法）あるいはアグロバクテリウム法などの生物学的方法（ＤＮＡの間接導入法）を好ましく用いることができる。本発明の方法は、植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理することを特徴とする。よって、物質を導入する工程に用いる方法は、植物の細胞壁が酵素により分解された状態（プロトプラスト）を用いる方法が好ましい。好ましくは、ＰＥＧ法又はエレクトロポレーション法であり、最も好ましくはＰＥＧ法である。
　ＰＥＧ法とは、プロトプラストにポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）を作用させて、ＤＮＡを植物細胞内部に取り込ませる方法である。このＤＮＡ取り込みの仕組みはまだ良く分かっていない。ＰＥＧ法については、例えば、非特許文献１３などに記載されているように、公知のプロトコールに従って実施することができる。
　エレクトロポレーション法は、細胞懸濁液に電気パルスをかけることで細胞膜に微小な穴を空け、細胞懸濁液中のＤＮＡを細胞内部に送り込むことで、形質転換する方法である。植物細胞を材料とする場合には、細胞壁を分解除去したプロトプラストを用いるのが一般的である。しかし、細胞壁を有する細胞を用いて形質転換をすることも可能であり、これはエレクトロインジェクション法と呼ばれている。エレクトロポレーション法やエレクトロインジェクション法では、２種類以上のＤＮＡを懸濁液中に溶解し植物細胞存在下で電気パルスをかけることにより、共形質転換を行うことができる。
　卵細胞は、受精前は通常の体細胞とは異なる状態の細胞壁を有し、卵細胞と精細胞とが融合するとはじめて完全な細胞壁が形成される。特にＰＥＧ法による遺伝子導入では、一般的に植物細胞を酵素処理しプロトプラスト化することが必須であり、またそのようにして得られたプロトプラストは、時間が経過すると細胞壁が再生し、完全な細胞壁を有する植物細胞に戻ることがある。そのため、受精卵細胞を胚珠等から単離する際に酵素を用いる場合も、単離後速やかに物質導入操作を行うことが好ましい。
　よって、物質導入を行うまでの時間は、好ましくは、酵素処理後１２０分以内、６０分以内、４０分以内、２０分以内である。あるいは、酵素処理後に精細胞融合を行う場合は、物質導入を行うまでの時間は、好ましくは、細胞融合後１２０分以内、６０分以内、４０分以内、２０分以内である。
　カルス又は胚様体（胚性細胞塊）化・再分化
　本発明の、植物に物質を導入する方法は、物質を導入する工程（工程（２））の後に、さらに、（３）物質を導入した受精卵細胞をカルス化又は胚様体（胚性細胞塊）化し；そして、
　（４）上記カルス化又は胚様体化した組織を再分化培地で再分化させる、ことを含んでもよい。
　工程（３）のカルス化又は胚様体化工程、および工程（４）の再分化工程は特に限定されず、受精卵細胞から植物体を再生するための公知の方法を利用することが可能である。
　カルス化又は胚様体化工程において、得られた物質導入受精卵細胞を培養して、胚様体又はカルスを形成させる。受精卵細胞を分裂誘導し細胞増殖させ、カルス又は胚様体を形成させる工程は、植物によって最適条件が異なるため特に限定されないが、Ｆｅｅｄｅｒ細胞を加えた、ナースカルチャー法が好ましい。例えば、次のように行うことができる。
　受精卵細胞の液体培地での培養：培地に物質導入受精卵細胞を移し、一晩静置した後、穏やかに振とう培養する。振とう速度は、３０~５０ｒｐｍが好ましく、３５~４５ｒｐｍがより好ましい。培養の温度は、２４~２８℃が好ましく、２５~２７℃がより好ましい。培養は暗下で行うことが好ましい。この時、培地にはフィーダー細胞を加え共培養（ナースカルチャー法）を行うことが好ましい。この培養期間は、４~１４日が好ましく、５~１０日がより好ましい。
　培地：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸などのオーキシンを添加した、液体のＭＳ培地（非特許文献１７）、Ｂ５培地（非特許文献１８）、Ｎ６培地（非特許文献１９）等である。
　培地にはインドール−３−酢酸、２，４−Ｄやダイカンバ等のオーキシン類が添加されることが好ましい。オーキシンの添加濃度は、０．１~３．０ｍｇ／Ｌが挙げられるが、０．１~０．３ｍｇ／Ｌが好ましく、０．１５~０．２５ｍｇ／Ｌがより好ましい。
　フィーダー細胞：公知のフィーダー細胞を用いることが可能である。例えば、イネ浮遊細胞培養物（Ｌｉｎｅ　Ｏｃ、理研バイオリソースセンター製）や、トウモロコシのナース細胞（非特許文献２０）、非形態形成型細胞培養物（ｎｏｎｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ　ｃｅｌｌ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ：非特許文献２１）などが挙げられる。
　この工程によって、受精卵細胞の培養開始から４~１４日後、直径５０~２００μｍ程度の球状の胚様体が形成される。
　再分化工程も公知の再分化工程に従い実施することができる。例えば、一例として、以下のように行うことが可能である。
　胚様体の培養：球状の胚様体を、フィーダー細胞を加えていない前記培地に移し、さらに１０~１４日程度培養する。その後、オーキシンを添加しない任意の培地、例えばＭＳ培地に入れて培養し植物体を形成させる。この際、培養は光を照射して行うことが好ましく、光は、例えば、５０~１８０μｍｏｌ／ｍ２・秒が好ましく、７０~１５０μｍｏｌ／ｍ２・ｓｅｃがより好ましい。
　培地：例えばＭＳ培地、Ｂ５培地、Ｎ６培地であって、アガロース、寒天やゲランガム、ゲルライト等を使用した固体培地。
　物質導入植物
　本発明はさらに、本発明の方法によって得られた、物質導入植物も含む。物質導入植物とは、例えば、導入した核酸の一部又は全部が、植物ゲノムに組み込まれた形質転換植物や、一過的に核酸及びＣａｓ９ヌクレアーゼ等のタンパク質が植物に導入され、ゲノム編集技術により、ゲノムが編集された植物など、物質が一過的又は永続的に導入された植物を指す。本発明以前は、特に「難培養」とされる植物や品種について、物質導入植物を得ることは困難あるいは不可能であった。本発明により、このような植物、品種についても簡便な方法で効率良く物質導入植物を得ることが可能になった。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
　実施例１　トウモロコシの受精卵細胞の単離
　温室内で育成したトウモロコシ（品種：Ｂ７３）の交配適期の雌穂の柱頭に、トウモロコシの雄穂から採取した花粉を受粉させた。交配時間は午前１０時３０分前後に行った。交配後雌穂をパラフィン紙でできた袋で覆い、他の花粉が飛来するのを防止した。
　交配後２４時間経過した雌穂の胚珠から、胚嚢を含む珠心切片を摘出し、３．５ｃｍプラスチックシャーレ中の１ｍＬの１０％マンニトール溶液（６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）に入れた。３．５ｃｍプラスチックシャーレに、酵素混合液０．５ｍＬを入れ、１．５ｍＬ酵素溶液とし、５−４５分間室温で放置した。酵素については、以下のものを用いた。セルラーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）、マセロザイムＲ１０（ヤクルト本社製；ポリガラクツロナーゼ活性　０．５Ｕｎｉｔ／ｍｇ）、ペクトリアーゼＹ２３（盛進製薬製；ペクチンリアーゼ活性　１Ｕｎｉｔ／ｍｇ）又はスミチームＡＰ２（新日本化学工業社製；ポリガラクツロナーゼ活性　１２．４Ｕｎｉｔ／ｍｇ）を用い、表１に記載の各濃度になるように１０％　マンニトール溶液（６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）に溶解した。なお、すべての画分においてセルラーゼは０．３％とした。なお、表における酵素溶液中ペクチナーゼ（Ｕｎｉｔ／ｍＬ）とは、ポリガラクツロナーゼ及びペクチンリアーゼのＵｎｉｔ／ｍＬの合算値を示す。
　後述の表１に記載した各時間で処理した後、酵素溶液をピペットで除去し、１０％マンニトール溶液で２度洗浄し、酵素処理した珠心切片を１．５ｍＬの同濃度のマンニトール溶液中に入れ単離作業に供した。
　単離は、２本のガラス針を用い行った。片方のガラス針で珠心切片を固定し動かないようにし、もう一方のガラス針で、受精卵細胞が存在すると推定される領域の組織を掻き出すことにより受精卵細胞を単離した。領域の推定は、受精が行われると、２個存在する助細胞のうち花粉管が侵入した方が変性し、暗褐色化するのでそれを目印とした。単離した受精卵細胞は、マイクロピペットを用いカバーグラス上の液滴中に移動した。
　なお、カバーグラス上の液滴は以下の方法で作成した。
　１）カバーガラスの周囲を、５％ジクロロメチルシランを含む１，１，１−トリクロロエタン溶液に浸し、乾燥させる；
　２）当該カバーガラス中央部分に０．２−０．３ｍＬのミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ　Ｃｕｌｔｕｒｅ−ｔｅｓｔｅｄ　Ｇｒａｄｅ，シグマアルドリッチ社製、１００１２７９２７０）を載せる；そして、
　３）当該ミネラルオイル内に１~２μＬの１０％マンニトール溶液（６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）をマイクロピペットで挿入する。
　実施例２　胚様体（胚性細胞塊）の取得
　０．２ｍＬの受精細胞用培地を用意した。受精細胞用培地は、改変型Ｎ６Ｚ培地（Ｋｕｍｌｅｈｎ　Ｊ．ｅｔ．ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔａ　２０５：３２７−３３３）に以下の改変を加えたもの；２ｇ／Ｌ　ＣＨＵ（Ｎ６）　ｂａｓａｌ　ｓａｌｔ　ｍｉｘｔｕｒｅ（シグマアルドリッチ社製）、０．０２５ｍｇ／Ｌ　Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２５ｍｇ／Ｌ　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０２５ｍｇ／Ｌ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１ｍｇ／Ｌ　レチノール、０．０１ｍｇ／Ｌ　カルシフェロール、０．０１ｍｇ／Ｌビオチン、１ｍｇ／Ｌ　チアミン・Ｈ２Ｏ、１ｍｇ／Ｌ　ニコチン酸、１ｍｇ／Ｌ　ピリドキシン・ＨＣｌ、１ｍｇ／Ｌ　塩化コリン、１ｍｇ／Ｌ　Ｃａ−パントテン酸、０．２ｍｇ／Ｌ　リボフラビン、０．２ｍｇ／Ｌ　２，４−Ｄ、０．０２ｍｇ／Ｌ　コバラミン、０．０２ｍｇ／Ｌ　ｐ−アミノ安息香酸、０．４ｍｇ／Ｌ　葉酸、２ｍｇ／Ｌ　アスコルビン酸、４０ｍｇ／Ｌ　リンゴ酸、４０ｍｇ／Ｌ　クエン酸、４０ｍｇ／Ｌ　フマル酸、２０ｍｇ／Ｌ　Ｎａ−ピルビン酸、１，０００ｍｇ／Ｌ　グルタミン、及び２５０ｍｇ／Ｌ　カゼイン加水分解物、１００ｍｇ／Ｌ　ミオイノシトール。浸透圧はグルコースで４５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏに調整（ｐＨ５．７）し作成した。作成した受精細胞用培地を直径１２ｍｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＣＭインサート（ミリポア社製）内に入れ、２ｍＬの培地の入った３．５ｃｍプラスチックシャーレの中に入れた。さらに、４０~６０μＬのイネ浮遊細胞培養物（Ｌｉｎｅ　Ｏｃ、理研バイオリソースセンター製）をフィーダー細胞としてシャーレに加えた。
　洗浄・滅菌したミクロキャピラリーを用い、単離した受精卵細胞を新鮮な１０％マンニトール溶液液滴（６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）中に投入し、その後、受精細胞用培地の入ったＣＭインサート内のメンブレン上に移した。
　受精卵細胞は、暗所に２６℃で１日間静置したのち、２０日間振盪培養した。
　培養後の胚様体（胚性細胞塊）の形成結果を表１に記載する。酵素の力価、特にペクチナーゼのＵｎｉｔ／ｍＬ又はＵｎｉｔ／ｍＬ×時間、が高い区分（試験区８−１０）では胚様体が得られなかったが、Ｕｎｉｔ／ｍＬ又はＵｎｉｔ／ｍＬ×時間が低い区分（試験区１−７）では胚様体を得ることができた。ただし、試験区７の胚様体は、他の区と比べ少し生育が劣った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例３　植物体の再生
　実施例１および２で得られた胚様体（胚性細胞塊）について、再分化培地（改変したＭＳ培地；ＭＳ塩、ＭＳビタミン、１００ｍｇ／Ｌ　ミオイノシトール、２ｇ／Ｌ　ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ、３０ｇ／Ｌ　スクロース、３０ｇ／Ｌ　ソルビトール、０．２ｍｇ／Ｌ　ｌ−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、１ｍｇ／Ｌ　カイネチン及び０．３％　Ｇｅｌｒｉｔｅ）に移した。培養は３０℃で持続的に光照射しながら、１２~３０日間行った。その結果、植物体を得ることができた（図６）。この結果より、培養が最も困難と言われているトウモロコシのＢ７３でも、細胞からの培養、植物体の再生が可能であることが示された。
　実施例４　受精卵への核酸導入
　植物としてトウモロコシ（品種：Ｂ７３）を用い、酵素溶液濃度を０．３％セルラーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）、０．１％マセロザイムＲ１０、０．０１７％ペクトリアーゼＹ２３を用い、処理時間を１５分にする以外は実施例１と同様に受精卵の単離を行った。なお、この酵素処理条件において、ペクチナーゼ濃度は０．６７Ｕｎｉｔ／ｍＬであり、Ｕｎｉｔ／ｍＬ×処理時間は１０．０５であった。
　単離した受精卵細胞をＭＭＧ溶液（１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、４ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ５．７）、１０％マンニトール（６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ））の液滴（約２μＬ）に移動し、その後ＭＭＧに導入する塩基配列、３５Ｓプロモーター：：シグナル配列：：ＧＦＰ：：小胞体残留シグナル（ＨＤＥＬ）：：ノスターミネーターを含むプラスミド（非特許文献１１）を加えた液滴に移動した。次に受精卵細胞を含む液滴とＰＥＧ溶液（１２．５ｍＬ　１０％マンニトール溶液（６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）に、７．５ｇのＰＥＧ４０００、２．５ｍＬの１Ｍ塩化カルシウムを加え蒸留水で２５ｍｇになるように調整）の液滴（約２μＬ）を混ぜ、ガラスキャピラリーで３０~５０回撹拌した。
　核酸導入処理を行った受精卵細胞は、実施例３と同様に受精細胞用培地に移し、暗所で静置培養した。ＰＥＧ処理から１２−１６時間後に、受精卵細胞を蛍光顕微鏡で観察し、ＧＦＰの蛍光の有無で導入した核酸の発現状況及び細胞の分裂状況を確認した。
　その結果を図７に示す。核酸導入処理を行った受精卵は、確かにＧＦＰによる発光が観察されたため、核酸導入が確認できた。さらに、分裂を開始したことを確認できた。
　実施例５　核酸導入受精卵細胞からの植物体再生
　実施例４で得られた核酸導入受精卵細胞（トウモロコシ（品種：Ｂ７３））について、実施例２および３に従って胚様体（胚性細胞塊）を取得し、さらに培養を行った。２週間後、イネ浮遊細胞培養物を含まない改変型Ｎ６Ｚ培地に培地を更新し、さらに２週間培養した。２ｍｍ程度に増殖した細胞塊を、交配後１０日経過したトウモロコシＡ１８８の頴果切片上に置き、５μＭ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを含む再分化培地ＲＭＳ１培地（非特許文献２２）にて、２日間、２５℃の明所で培養した。その後、細胞塊を５μＭ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを含む再分化培地ＲＭＳ１培地に移動し、明所で２５℃にて２週間再分化培養を行った。
　結果、緑化した細胞塊から複数の個体が再分化したため、細胞塊を分割し、再分化培地ＲＭＳ２培地（非特許文献２２）にて、さらに２５℃の明所で発根するまで培養した。発根した個体から順に、再分化培地ＲＭＳ３培地に移動し、２５℃の明所でシュートが１０ｃｍ程度になるまで培養した。シュートが赤褐色を呈している個体は、１０ｇ／Ｌ　アスコルビン酸を含むＲＭＳ３培地で培養を行った。十分に発根した個体を土を入れたポットに移植し、温室で栽培した。この結果、核酸導入を行った受精卵１つから再生個体を得ることができた。
　実施例６　イネの卵細胞の取得
　イネの穂から得た未開花の花を解体して子房と葯を採取した。３ｍＬの６％マンニトール溶液（３７０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏが入った３．５ｃｍプラスチックシャーレの中に子房と葯を入れた。
　新しい３．５ｃｍプラスチックシャーレ中の３ｍＬの６％マンニトール溶液（３７０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）に柱頭を除去した子房を沈めて、シャーレの底でレーザーブレード（フェザー安全カミソリ（株）、ＦＡ−１０）により子房の下部を切断した。顕微鏡観察により切断部から出てくる卵細胞を確認し、ミクロキャピラリーで卵細胞を単離した。３０~４０個の子房からおよそ１０~１５個の卵細胞が得られた。各卵細胞の直径は４０~５０μｍであった。
　得られた未受精卵細胞に、単離された精細胞を融合させることで受精卵を作出する。その後、受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する。
　実施例７　品種の異なるトウモロコシ由来受精卵への核酸導入及び植物体再生
　実施例１と同様の方法で、トウモロコシ品種Ａ１８８の受精卵を単離した。ただし、酵素処理方法を、０．３３％セルラーゼ、０．１％マセロザイムＲ１０、０．０１７％ペクトリアーゼＹ２３を含む酵素溶液（酵素溶液中ペクチナーゼ濃度は４．１７Ｕｎｉｔ／ｍＬ）で１０分、さらに０．１６５％セルラーゼ、０．０５％マセロザイム、０．００８％ペクトリアーゼを含む酵素溶液（酵素溶液中ペクチナーゼ濃度は２．０８Ｕｎｉｔ／ｍＬ）で２０分とした。なお、当該酵素処理におけるＵｎｉｔ／ｍＬ×処理時間の合計は８３．４であった。
　単離した受精卵に、トウモロコシユビキチンプロモーター：：トウモロコシユビキチンイントロン：：ＧＦＰ：：ノスターミネーターをコードする塩基配列からなるＤＮＡ断片を導入した。ＤＮＡ断片を１５０μｇ／ｍＬの濃度で含むＭＭＧ溶液を用いて、ＰＥＧ４０００の含有量を１０ｇ／２５ｍＬに改変したＰＥＧ溶液を使用した実施例４に記載の方法で核酸導入した。その後、核酸導入処理を行った受精卵を、実施例２の方法で培養を行った。２週間後、イネ浮遊細胞培養物を含まない改変型Ｎ６Ｚ培地に培地を更新し、さらに２週間培養した。２ｍｍ程度に増殖した細胞塊を、交配後１０日経過したトウモロコシＡ１８８の頴果切片上に置き、５μＭ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを含む再分化培地ＲＭＳ１培地にて６日間、２５℃の明所で培養した。その後、細胞塊を５μＭ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを含む再分化培地ＲＭＳ１培地に移動し、暗所で２５℃にて２週間再分化培養を行った。発根した個体から順に、再分化培地ＲＭＳ３培地に移動し、２５℃の明所でシュートが１０ｃｍ程度になるまで培養した。シュートが赤褐色を呈している個体は、１０ｇ／Ｌアスコルビン酸を含むＲＭＳ３培地で培養を行った。十分に発根した個体を土を入れたポットに移植し、温室で栽培した。結果、核酸導入を行ったトウモロコシＡ１８８受精卵から、再分化個体を得ることができた。
　実施例８　イネ由来受精卵への核酸導入及び植物体再生
　温室内で育成したイネ（品種：ユキヒカリ）から、受精卵を単離した。受精卵の単離は、開花後２~３時間後の子房を採取したこと以外は、実施例７及び非特許文献１１（Ａｂｉｋｏ，　ｅｔ　ａｌ．，（２０１３））に従って行った。
　得られたイネ受精卵細胞を、実施例１と同様の方法で、２０分間酵素処理を行った。ただし、酵素処理方法として、各酵素を表２に記載の各濃度になるように７．５％　マンニトール溶液（４５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）に溶解した酵素溶液を用いて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　酵素処理を行ったイネ受精卵に、３５Ｓプロモーター：：ＨＳＰ７０イントロン：：ＳＰ：：ＧＦＰ：：ＨＤＥＬをコードする塩基配列からなるＤＮＡ断片を含むｐＭＯＮ３００４９ベクターを導入した。当該ベクターを１３０μｇ／ｍＬの濃度で含むＭＭＧ溶液を用いて、実施例４に記載の方法で核酸導入した。その後、ＰＥＧ処理から１６−２４時間後に、イネ受精卵細胞を蛍光顕微鏡で観察し、ＧＦＰの蛍光の有無で導入した核酸の発現を確認した。その結果を図８に示す。また、当該イネ受精卵細胞が分裂を開始したことを確認できた。
　その後、核酸導入処理を行ったイネ受精卵を、非特許文献３に従って１８−１９日間培養及び再分化処理を行った。結果として、核酸導入を行ったイネ受精卵から再分化個体を得ることができた。

Claims (17)

  1. 　植物に物質を導入する方法であって、以下の工程：
    　（１−ｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離し、その後、当該受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、
    　（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された受精卵細胞を単離する、あるいは、
    　（１−ｉｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理すると同時に、酵素処理された受精卵細胞を単離する、
    ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
    　（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する、
    ことを含む、上記方法。
  2. 　植物に物質を導入する方法であって、以下の工程：
    　（１−ｉｖ）植物体から卵細胞および精細胞を単離し、それらを融合することで受精卵を作出し、その後、当該受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、あるいは、
    　（１−ｖ）植物の卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された卵細胞を単離、さらに、単離した精細胞と融合させる、
    ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
    　（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する、
    ことを含む、上記方法。
  3. 　植物組織分解酵素が、ペクチナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、ヘミセルラーゼ類、グルクロニダーゼ、ザイモリダーゼ、キチナーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ，ガラクタナーゼ，アラビナナーゼおよびリグニン分解酵素、並びに、これらの混合物からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　植物組織分解酵素がペクチナーゼを含む、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　植物が、単子葉植物である、請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　植物が、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ及びソルガムからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 　植物が、トウモロコシＢ７３又はＢ７３由来のトウモロコシ品種である、請求項１−６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　卵細胞を、植物の卵細胞を含む組織から単離した後に、精細胞融合によって、受精卵細胞とする、請求項１−６のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　酵素処理時間が３分以上６０分以下である、請求項１−８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　酵素処理後、１２０分以内に工程（２）の物質導入を行う、請求項９に記載の方法。
  11. 　精細胞融合の後、１２０分以内に工程（２）の物質導入を行う、請求項８又は９に記載の方法。
  12. 　植物組織分解酵素がペクチナーゼを含み、そして、工程（１）の酵素処理時の系におけるペクチナーゼのＵｎｉｔ／ｍＬが、６０以下である、請求項９に記載の方法。
  13. 　植物組織分解酵素がペクチナーゼを含み、そして、工程（１）の酵素処理時の系におけるペクチナーゼのＵｎｉｔ／ｍＬ×処理時間が、３１０以下である、請求項１−１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　工程（２）の物質導入が、ＰＥＧ法又はエレクトロポレーション法を用いて行われる、請求項１−１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　植物に物質を導入する方法であって、以下の工程：
    　（１−ｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離し、その後、当該受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、
    　（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された受精卵細胞を単離する、あるいは、
    　（１−ｉｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理すると同時に、酵素処理された受精卵細胞を単離する、
    ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
    　（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入し；
    　（３）物質を導入した受精卵細胞をカルス化又は胚様体化し；そして、
    　（４）上記カルス化又は胚様体化した組織を再分化培地で再分化させる、
    ことを含む、上記方法。
  16. 　植物に物質を導入する方法であって、以下の工程：
    　（１−ｉｖ）植物体から卵細胞および精細胞を単離し、それらを融合することで受精卵を作出し、その後、当該受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、あるいは、
    　（１−ｖ）植物の卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された卵細胞を単離、さらに、単離した精細胞と融合させる、
    ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
    　（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入し；
    　（３）物質を導入した受精卵細胞をカルス化又は胚様体化し；そして、
    　（４）上記カルス化又は胚様体化した組織を再分化培地で再分化させる、
    ことを含む、上記方法。
  17. 　請求項１−１６のいずれか１項に記載の方法で得られた、物質導入植物。
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