CN101536673B - 栽培水稻成熟胚高频植株再生方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种栽培水稻成熟胚高频植株再生方法，其特征在于：水稻的愈伤组织诱导培养基、继代的基本培养基、分化培养基和幼苗壮根培养基中的复合碳源为白砂糖；在愈伤诱导培养的前7天全暗培养，之后转入光下培养，获得愈伤组织；选取浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织转入继代培养基光下培养；然后选取蓬松状愈伤组织转入分化培养基上光下培养；再选取含绿芽的颗粒状愈伤组织再转入幼苗壮根培养基继续培养，形成健壮试管植株。

Description

栽培水稻成熟胚高频植株再生方法

技术领域

本发明涉及一种栽培水稻成熟胚高频再生植株的技术方法，属于生物技术领域，普遍适用于不同的籼稻、粳稻和杂交稻等基因型栽培水稻成熟胚的组织培养、体细胞突变体筛选及农杆菌介导法基因转化。

背景技术

近年来，由于人口的增加，耕地的减少，对作为全球一半以上为主食的水稻单产增加的需求更加迫切，但实际上，我国由于矮杆基因和杂种优势利用的广泛应用，水稻育种已取得了很大成就，再通过常规育种改良水稻的空间越来越小。今后迫切需要采用更高效新技术新思路来创造新种质。

20世纪80年代以来，水稻愈伤组织培养技术在单倍体育种，远缘杂交育种和离体受精等方面得到了广泛的应用[章志宏，胡中立.水稻单倍体不定芽超低温保存和植株再生及其遗传稳定性研究[J].武汉植物研究，2000，18(3)P.169-173；王爱云，陈冬玲，蔡得田.远缘杂交和异源多倍体化技术在水稻育种中的应用[J].武汉植物研究，2005，23(5)P.491-495；王忠安禾本科植物离体受精技术[J]生物学通报，2005，40(10)P.1-2]，它可以打破物种的界限进行基因转移，增加遗传多样性。从1988年获得第一批转基因水稻至今，已将大量的水稻基因库中不具有的抗除草剂、抗虫、抗病、抗病毒、耐盐、改善稻米品质等基因引入水稻细胞中，获得系列新的种质资源，可见水稻生物技术越来越成为现代水稻育种的新兴的重要的技术手段。

利用水稻成熟胚进行组织培养具有水稻品种来源广，取材不受季节和地理环境限制，而且接种操作方便，不易染菌等很多优点，因而水稻成熟胚是水稻组织培养首选的外植体。影响水稻胚性愈伤组织形成和植株再生能力的因素包括基因型、外源激素、渗透压、外植体来源、固化剂、培养基其它成份以及温度、光周期和继代时间等多个方面，其中材料的基因型、外源激素的种类、浓度和配比是最主要的因素[李霞，陈婷，周月兰.籼粳稻成熟胚愈伤组织培养力的比较[J].南京师大学报，2005，28(4)P.103-108]。现阶段，水稻成熟胚组织培养技术还是利用不同品种对外源激素的敏感性的不同而研制出一一对应的愈伤组织诱导的独特培养基配方，才可能进一步用于水稻的生物技术育种和基因工程研究，而通常这个培养基研制的过程需要半年甚至更长的研制时间[陈璋，继代培养对水稻胚性愈伤组织染色体变异及体细胞无性变异的影响福建农学院学报1993，22(3)P.274-279]。现在所报道的培养方法和配方都是不同的，而且是选用的试剂都比较昂贵，应用到大规模水稻改良还有相当距离。如王萍等[王萍，徐大勇，王罡等粳籼稻两个亚种成熟胚组织培养与再生能力的比较研究[J].种子P.66-67]研究了8个生产上大面积栽培的粳稻基因型和5个杂交籼稻亲本基因型进行愈伤诱导率与苗分化率的研究，采用以N6为基本培养基，附加2，4-D 1～2mg/L的诱导培养基，结果粳型水稻愈伤诱导率变化在85.71～100％，苗分化率为20～63.33％，籼型水稻愈伤诱导率在85.71～91.43％之间，但5种籼型水稻基因型苗分化率较低，仅为0～26.42％，而恢056没有诱导分化苗。张玲等[张玲，谢崇华，李卫锋水稻成熟胚组织培养研究[J].杂交水稻.2002，17(2)P.44-46]以粳稻品种H1493和中花11以及籼稻品种珍汕97B和明恢63为研究对象，在只加2mg/L 2，4-D.蔗糖4.5％、琼脂粉O.75％；分化培养基为MS培养基附加KT 2mg/L、NAA O.5ml/L、蔗糖3％、琼脂粉0.75％。其粳稻再生率分别为90.0％和66.7％，籼稻再生率几乎为0，李霞等[李霞，陈婷，周月兰.籼粳稻成熟胚愈伤组织培养力的比较[J].南京师大学报，2005，28(4)P.103-108]用粳稻9908和籼稻扬稻6号进行研究，以M8为基本培养基，激素配比为1mg/L 2，4-D、2mg/L ABA、2mg/L6-BA的培养基可以使籼稻扬稻6号的成愈率达到90.5％；激素配比为1mg/L 2，4-D的培养基可以使粳稻9908的成愈率达到88.2％；以MS为基本培养基，激素配比为0.2mg/L 2，4-D、2mg/L 6-BA、2mg/L KT的培养基使扬稻6号和粳稻9908愈伤组织的植株再生分别达到65.4％和62.7％；黄赛麟等[黄赛麟，李东宣，甘树仙，朱建荣，李娟，梁晶，陈丽娟，水稻成熟胚培养高效再生系统的创新分子植物育种，2008，6(4)P.801-806]在改良培养基N6I愈伤诱导、MSR绿苗分化和MSC生根条件下，籼稻滇屯502、粳稻日本睛、籼粳杂种F1(滇屯502/日本晴)和非洲栽培稻(RG105)诱导率分别为96％、100％、98％和100％，成苗率也非常高，但是否适合其他水稻类型还不清楚。实际上，上述报道的水稻成熟胚再生技术从水稻的品种、基本培养基，激素的比率，碳源的种类和浓度等都不同，甚至相同的水稻材料在不同的培养方法中所得结果的差异也非常大，可见，现有水稻成熟胚再生技术对基因型的依赖仍较强，实际上目前很难参照一套通用的完整组织培养系统来得出理想的再生效果。尤其是上述研究所使用的碳源都是选择蔗糖、葡萄糖和麦芽糖等单一碳源，成本普遍偏高，应用于规模化的水稻生物技术育种还有一定距离，而使用廉价的市售的复合碳源白砂糖作为碳源可以得到和单一碳源相同效果的研究报道尚未见到。而且上述报道中整个诱导愈伤组织的诱导多在暗箱中培养，虽然诱导率很高，但是多生成浸润的白色的愈伤组织，不利于胚性愈伤组织的生成，造成不同水稻品种分化率差异很大，严重影响其后分化的效果稳定性。

发明内容

本发明的目的在于：针对栽培水稻成熟胚再生技术中对基因型的高度依赖，一种水稻材料只有一种特定的最适培养基配方，而且每种培养基配方和培养技术的的研制都需要半年，甚至更长的时间，对现有大量水稻栽培品种的改良不相适应，且也不宜用于规模化试管苗繁殖和未来水稻基因工程的筛选等缺陷。通过培养条件的改进尤其是通过激素和理化因子的调优，在同类型中寻求适用于多种水稻材料的愈伤组织诱导培养基，为公众提供一种通用型栽培水稻高频成熟胚可育植株再生技术。

本发明的目的是这样实现的：一种栽培水稻成熟胚高频植株再生方法，水稻的愈伤组织诱导培养基、继代的基本培养基、分化培养基和幼苗壮根培养基均在高压灭菌前调整pH值为5.8～6.1；愈伤组织诱导、继代、分化和幼苗壮根均在试管中完成，培养过程中的环境温度为28℃～30℃，其特征在于：

水稻的愈伤组织诱导培养基、继代的基本培养基、分化培养基和幼苗壮根培养基中的复合碳源为白砂糖；

在愈伤诱导培养的前7天全暗培养，之后转入光下培养，获得愈伤组织；选取浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织转入继代培养基光下培养；然后选取蓬松状愈伤组织转入分化培养基上光下培养；再选取含绿芽的颗粒状愈伤组织再转入幼苗壮根培养基继续培养，长成3片叶且根系发达后，形成健壮试管植株。

在本发明中：愈伤组织诱导培养耗时28～35天；继代培养、分化培养和幼苗壮根培养分别耗时14～21天；在愈伤组织诱导、继代、分化和幼苗壮根期间的光下培养期间，光照时间为12～14h/d，光强为1800～2100Lux。

在本发明中：愈伤诱导培养基以M8的大量元素、有机成分、微量元素的基本成分为基础，分别添加质量比3％的白砂糖、0.8％的琼脂条、0.5％的山梨醇、1～2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(又称为2，4-D，下同)、1mg/L的脱落酸，0.3～2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(又称为6-BA，下同)和0.2mg/L的激动素(又称为KT，下同)。

在本发明中：所述的水稻为籼稻，愈伤诱导培养基中的2，4-二氯苯氧乙酸的添加量为1mg/L，6-苄基腺嘌呤的添加量为1.5～2mg/L。

在本发明中：所述的水稻为粳稻，愈伤诱导培养基中的2，4-二氯苯氧乙酸的添加量为2mg/L，6-苄基腺嘌呤的添加量为0.3～0.6mg/L。

在本发明中：所述的水稻为杂交稻，愈伤诱导培养基中的2，4-二氯苯氧乙酸的添加量为1～2mg/L，6-苄基腺嘌呤的添加量为0.6～1.5mg/L。

在本发明中：所述的继代的基本培养基以M8的大量元素、有机成分、微量元素的基本成分为基础，分别添加质量比3％的白砂糖、0.8％的琼脂条、0.5～1mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸和0.1～0.2mg/L的激动素；所述的分化培养基以MS的大量元素、有机成分、微量元素的基本成分为基础，添加1g/L的活性炭、8g/L的琼脂条、30g/L的白砂糖、0.5mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸和1mg/L的苯基脲类细胞分裂素；所述的幼苗壮根培养基以1/2MS基本成分为基础，添加15g/L的白砂糖、10g/L的琼脂条、0.2mg/L的萘乙酸和0.4mg/L的多效唑。

本发明的优点在于：与现有技术相比具有如下优点和积极效果：本发明在整个愈伤组织诱导和继代培养中采用接种后7天暗培养，之后全部在光下培养替代原有的暗箱培养方法，有效地解决了水稻成熟胚诱导产生的愈伤组织水渍化或因形成大量毛状根而丧失植株分化能力的难题，大幅度地提高了愈伤组织的分化率；本发明将原有水稻组织培养常用的单一碳源如蔗糖全部改为市面上可售的廉价的复合碳源-白砂糖，获得了与蔗糖类似的诱导效果，而且大大地降低了水稻组织培养的成本；通过激素的调控，找到了适合同类水稻如籼稻、粳稻和杂交水稻的愈伤组织高频诱导的通用激素范围，使得不同类型的水稻材料的成熟胚采用本发明的激素范围，其愈伤组织的诱导率和分化率≥60％，而且均可以在水稻正季室外栽培获得可育的再生植株，大大地降低了水稻组织培养中专一培养基研制的时间，缩短了水稻生物技术育种周期；使用本发明方法对继代和分化培养基中愈伤组织的形态也做了明确的描述，即选择浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织，不仅使继代21天后能始终保持胚性，并在分化培养基中获得高频率植株再生的能力，克服了以往水稻组织培养中的愈伤组织继代培养的盲目性或者单纯靠培养者经验的现状，从而增加了水稻成熟胚高频再生技术的精准性，可见，本发明的方法使水稻组织培养再生体系突破了对原有基因型的依赖，大大减低了研究成本，拓宽了通过生物技术改良栽培水稻基因型的范围，尤其是籼型水稻，节省了水稻组织培养的时间，提高了水稻生物技术育种的效率，而且诱导愈伤组织高继代能力的保持也可为开展栽培水稻细胞生物学和分子生物学育种提供了重要的基础条件，并将可能配组或育成新的高产、优质、多抗的水稻新品种，从而拓宽水稻杂交优势的利用范围。

附图说明

图1不同的培养基对武育粳3号愈伤诱导率的影响；

图2是杂交稻品种两优培九的初始愈伤组织；

图3是籼稻品种9311的初始愈伤组织；

图4是粳稻品种扬辐粳7号的初始愈伤组织；

图5是扬辐粳7号的继代培养中出现的白色、半透明、粘状的愈伤组织；

图6是扬辐粳7号的继代培养中出现的蓬松状愈伤组织；

图7是扬辐粳7号的继代培养中出现的水渍状愈伤组织；

图8是扬辐粳7号分化7天后的绿色丛芽；

图9是扬辐粳7号分化14天后绿色丛芽；

图10是扬辐粳7号的完整试管苗植株-绿芽分化出叶片；

图11是扬辐粳7号的完整试管苗植株-试管苗长出根；

图12是扬辐粳7号的试管苗移栽前在培养室炼苗。

具体实施方式

实施例1愈伤组织诱导培养基的选择

愈伤组织诱导培养基的选择：

M8大量元素、微量元素和有机成分、铁盐为基本组分，添加的2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸；

N6大量元素、微量元素和有机成分、铁盐为基本组分，添加的2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸；

MS大量元素、微量元素和有机成分、铁盐为基本组分，添加的2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸；

水稻：武育粳3号当年收获的种子为外植体材料。

试验方法：

将武育粳3号的成熟种子去壳，经75％乙醇处理5min，用0.1％氯化汞溶液浸泡15min，再用无菌水漂洗4-5次，放入26℃±2℃培养过夜，次日再用75％乙醇处理5min，之后用0.1％氯化汞溶液浸泡5min，再用无菌水漂洗4-5次。将消毒的稻种分别接种到50ml的三角瓶中，每瓶接种6粒种子，每个材料做100瓶。首先在不同的诱导培养基28℃±2℃全黑暗条件下培养7d，然后转入光下培养，光照时间为12～14h/d，光强为1800～2100Lux。接种不同的天数分别记录出愈的数目。计算愈伤组织诱导率：愈伤组织诱导率＝(产生的愈伤组织米粒数/接种的米粒数)×100％。

结论：试验结果纪录在图1的图表中，由图1可见，在M8作为基本培养基时，在相同时间内，其出愈率始终最大，且最后最大可达到66.7％。其次是在N6培养基上，虽然出愈最晚，但是其出愈率最终也可达到64.2％。在MS培养基上，武育粳3号的最大出愈率仅为41.7％。

本发明选用M8作为愈伤组织诱导培养基的基本培养基。

实施例2市售的白砂糖对不同单一碳源的替代效果

碳源的选择

M8大量元素、微量元素和B₅维生素为基本组分，分别添加质量比8％琼脂条、0.5％的山梨醇、2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤，选择质量比3％的市售的白砂糖作为碳源(白砂糖购自江苏南京苏果超市，3.5元/500g)；

M8大量元素、微量元素和B₅维生素为基本组分，分别添加质量比8％琼脂条、0.5％的山梨醇、2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤，选择质量比3％的蔗糖作为碳源(购自上海开米化学有限公司，价格：82元/500g)；

M8大量元素、微量元素和B₅维生素为基本组分，分别添加质量比8％琼脂条、0.5％的山梨醇、2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤，选择质量比3％的麦芽糖作为碳源(购自楚和生物公司的美国原装，137.59元/250g)；

M8大量元素、微量元素和B₅维生素为基本组分，添加与M8质量比8％琼脂条，与M8质量比0.5％的山梨醇，2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸，以及0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤，选择与M8质量比3％的葡萄糖作为碳源。(国产无水葡萄糖13.9元/500g)

水稻：扬辐粳7号当年收获的种子为外植体材料。

试验方法：

将扬辐粳7号的成熟种子去壳，经75％乙醇处理5min，用0.1％氯化汞溶液浸泡15min，再用无菌水漂洗4-5次，放入28℃±2℃培养过夜，次日再用75％乙醇处理5min，之后用0.1％氯化汞溶液浸泡5min，再用无菌水漂洗4-5次。将消毒的稻种分别接种到50ml的三角瓶中，每瓶接种6粒种子，每个材料做100瓶。首先在不同的诱导培养基26℃±2℃全黑暗条件下培养7d，然后转入光下培养，光照时间为12～14h/d，光强为1800～2100Lux。接种35天记录不同碳源条件下水稻成熟胚出愈的数目。计算愈伤组织诱导率：愈伤组织诱导率＝(产生的愈伤组织米粒数/接种的米粒数)×100％。

试验结果列于表1，由表1可见：水稻籼粳亚种对单一碳源蔗糖，麦芽糖，葡萄糖与市售的白砂糖的反应基本一致，用白砂糖代替培养基中的蔗糖或麦芽糖或葡萄糖，也可以达到类似的诱导效果，降低培养基成本。

表1 不同碳源对扬辐粳7号成熟胚出愈率的影响

实施例3不同水稻成熟胚愈伤组织的诱导

试验组愈伤组织诱导培养基：

籼稻愈伤诱导培养基：以M8的大量元素、有机成分、微量元素的基本成分为基础，分别添加质量比3％的白砂糖、0.8％的琼脂条、0.5％的山梨醇、1mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、1mg/L的脱落酸、1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤和0.2mg/L的激动素；

粳稻愈伤诱导培养基：以M8的大量元素、有机成分、微量元素的基本成分为基础，分别添加质量比3％的白砂糖、0.8％的琼脂条、0.5％的山梨醇、2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、1mg/L的脱落酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤和0.2mg/L的激动素；

杂交稻愈伤诱导培养基：以M8的大量元素、有机成分、微量元素的基本成分为基础，分别添加质量比3％的白砂糖、0.8％的琼脂条、0.5％的山梨醇、2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、1mg/L的脱落酸，1mg/L的6-苄基腺嘌呤和0.2mg/L的激动素；

上述各愈伤诱导培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH5.8。

对照组愈伤诱导培养基：以N6基本成分为基础，添加2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、3g/L的蔗糖、6g/L的琼脂，pH 5.8[黄赛麟等(2008年)报道的适合不同类型的改良培养基N6I的配方]。

实验材料：

籼稻选择：籼稻1号、R14、070057、9311、明恢63、协青早B、粤泰B、滇屯502和扬辐籼6号；

粳稻选择：南京41、南京17111、淮稻9702、水晶3号、扬辐粳7号、扬辐粳8号、武运粳、日本晴和武育粳3号；

杂交稻中两系杂交稻选择：两优培九、淮两优和红莲优6号；三系杂交稻选择：汕优63和协优9308。

试验方法：

取上述不同类型的每种水稻种子去皮，分别将籼稻接种在籼稻愈伤诱导培养基上，将粳稻接种在粳稻愈伤诱导培养基上；将杂交稻接种在杂交稻愈伤诱导培养基上，同时将不同类型的水稻种子去皮接种在对照组愈伤诱导培养基上。同步愈伤诱导，首先7天的暗培养，大部分成熟胚均生出短小的胚芽，明显形变，然后转入光下培养，光照时间14h/d，光强为2000Lux，10～15天在水稻的盾片处陆续产生白色或浅黄色颗粒状愈伤组织，与其他的暗诱导相比，一周后转入光下，愈伤组织增殖快，而且浅黄色颗粒状愈伤组织较多。21天后少量非胚性的白色水化愈伤组织分化出毛状根、愈伤组织呈蓬松状或褐化，其他仍保持浅黄色颗粒状愈伤组织，诱导培养35天后记录其出愈率，培养过程的培养室温度为28℃～30℃。从表2中可以看出，相比较而言，粳稻出愈最快，籼稻出愈较慢，而杂交稻则处于两者之间，取决于杂交稻的偏籼还是偏粳稻特性。但是使用对照的改良培养基N6I，虽然报道的水稻品种如粳稻日本晴和滇屯502，可以达到类似的诱导效果，但是其他供试材料的诱导效果则差异很大；而使用本发明的培养基基配方可以使不同类型的水稻材料成熟胚的出愈率均可以达到≥60％，适应性很好，具有通用性。

表2 不同水稻品种成熟胚的愈伤诱导率

杂交稻、籼稻和粳稻的愈伤组织分别参见图2、图3和图4。

实施例4愈伤组织的继代培养

继代培养基：M8大量元素、微量元素和有机成分、铁盐为基本组分，白砂糖浓度为30g/L，琼脂条8g/L，附加0.5～1mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸，0.1～0.2mg/L激动素。

实验方法

将实施例3中试验组诱导培养基中培养35天后的愈伤组织转移至继代培养基，愈伤组织的质量随继代时间而形态上有明显变化：在光下培养，水渍状愈伤组织在所有继代培养基中5～7天全部死亡；蓬松状愈伤组织(图6)转移至继代培养基生长迅速，但7～10天后，部分蓬松状愈伤组织产生大量的毛状结构和不定根，大部分蓬松状愈伤组织15天以后逐渐恶化，丧失绿苗分化的能力；而只有从诱导培养基中选择色泽鲜亮、颗粒状愈伤组织继代后，愈伤组织增殖快，10天后，部分愈伤组织开始变为蓬松状(图6)，开始分化出绿芽点或毛状根，而且水稻成熟胚诱导白色、半透明、粘状(图5)或水渍化愈伤组织(图7)经过继代培养后易丧失植株分化能力，绿苗分化率也很低，培养过程的培养室温度均为28℃～30℃，光照时间14h/d，光强为2000Lux。

本实施例还发现，本实施例重点选用实施例3中通过试验组获得的扬辐粳7号的愈伤组织，研究继代培养基组分与继代能力的关系，结果表明：最适继代培养基激素组成还与成熟胚初始诱导愈伤组织的培养基激素组分有关。从表3可见，当继代培养基中施用的2，4-二氯苯氧乙酸浓度与初始诱导的浓度相等的时候，可以保持70％的继代率，而当比初始诱导愈伤的浓度降低，可以显著增加继代率，达到80％以上，而且胚性愈伤组织的增殖较快，并获得较高的分化能力，在继代培养基中增加一些激动素，有利于愈伤组织的增殖和保持胚性的颗粒状态。

表3 不同2，4-D浓度对诱导的愈伤组织继代能力的比较

实施例5愈伤组织的成苗和移栽

分化培养基：以MS的大量元素、有机成分、微量元素的基本成分为基础，添加1g/L的活性炭、8g/L的琼脂条、30g/L的白砂糖、0.5mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸和1mg/L的苯基脲类细胞分裂素；

幼苗壮根培养基：以1/2MS基本成分为基础，添加15g/L的白砂糖、10g/L的琼脂条、0.2mg/L的萘乙酸和0.4mg/L的多效唑。

将实施例4中继代培养基诱导的培养基中蓬松状愈伤组织接种到分化培养基光下培养，光照时间14h/d，光强为2000Lux，14天后，带绿芽点的愈伤组织(图8)在本发明的分化培养基上即可分化成植株，分化绿芽点(图9)甚至可一步成苗。采用本发明所述的分化培养基，考察不同水稻类型材料均可以获得≥60％的分化率(表4)。

分化培养21天后，选取含绿芽的颗粒状愈伤组织的小苗(图10)转入壮根培养基光下培养，光照时间14h/d，光强为2000Lux，生长14～21天，长成3片叶且根系发达，形成健壮试管植株根系发达茁壮(图11)。健壮试管植株在培养室中培养3天(图12)，冬季和早春试管苗移栽至简易大棚经7天温室炼苗后，活棵快，移栽至大田成活率达95％以上，生长健壮的小苗15天左右长出新的分蘖；其它生长季节可直接移栽至大田，即可发育成熟，结出饱满的种子。

在分化、壮根、培养室中培养和练苗过程中的环境温度均为28～30℃。表4不同水稻品种成熟胚的愈伤分化率

以上各实施例不是对本发明的具体限制，具体实施时可以在权利要求规范的范围内调整各种培养基，选择不同阶段的培养期，完成栽培水稻成熟胚高频植株再生。

Claims (5)

1.一种栽培水稻成熟胚高频植株再生方法，水稻的愈伤组织诱导培养基、继代培养基、分化培养基和幼苗壮根培养基均在高压灭菌前调整pH值为5.8～6.1；愈伤组织诱导、继代、分化和幼苗壮根均在试管中完成，培养过程中的环境温度为28℃～30℃，其特征在于：

外植体为水稻种子；

愈伤组织诱导培养基以M8的大量元素、有机成分、微量元素的基本成分为基础，再分别添加质量比为3％的白砂糖、0.8％的琼脂条、0.5％的山梨醇、1～2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、1mg/L的脱落酸，0.3～2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤和0.2mg/L的激动素；

继代培养基以M8的大量元素、有机成分、微量元素、铁盐为基本组分，添加质量比3％的白砂糖、0.8％的琼脂条、0.5～1mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸和0.1～0.2mg/L的激动素；

分化培养基以MS的大量元素、有机成分、微量元素的基本成分为基础，添加1g/L的活性炭、8g/L的琼脂条、30g/L的白砂糖、0.5mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸和1mg/L的苯基脲类细胞分裂素；

幼苗壮根培养基以1/2MS基本成分为基础，添加15g/L的白砂糖、10g/L的琼脂条、0.2mg/L的萘乙酸和0.4mg/L的多效唑；

在愈伤诱导培养的前7天全暗培养，之后转入光下培养，获得愈伤组织；选取浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织转入继代培养基光下培养；然后选取蓬松状愈伤组织转入分化培养基上光下培养；再选取含绿芽的颗粒状愈伤组织转入幼苗壮根培养基继续培养，长成3片叶且根系发达后，形成健壮试管植株。

2.根据权利要求1所述的栽培水稻成熟胚高频植株再生方法，其特征在于：愈伤组织诱导培养耗时28～35天；继代培养、分化培养和幼苗壮根培养分别耗时14～21天；在愈伤组织诱导、继代、分化和幼苗壮根期间的光下培养期间，光照时间为12～14h/d，光强为1800～2100Lux。

3.根据权利要求1所述的栽培水稻成熟胚高频植株再生方法，其特征在于：所述的水稻为籼稻，愈伤组织诱导培养基中的2，4-二氯苯氧乙酸的添加量为1mg/L，6-苄基腺嘌呤的添加量为1.5～2mg/L。

4.根据权利要求1所述的栽培水稻成熟胚高频植株再生方法，其特征在于：所述的水稻为粳稻，愈伤组织诱导培养基中的2，4-二氯苯氧乙酸的添加量为2mg/L，6-苄基腺嘌呤的添加量为0.3～0.6mg/L。

5.根据权利要求1所述的栽培水稻成熟胚高频植株再生方法，其特征在于：所述的水稻为杂交稻，愈伤组织诱导培养基中的2，4-二氯苯氧乙酸的添加量为1～2mg/L，6-苄基腺嘌呤的添加量为0.6～1.5mg/L。

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