CN101731137A - 一种改良十字花科作物耐盐性状的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种十字花科作物耐盐性状改良的方法，该方法包括用平阳霉素等对所述作物的无菌种子进行处理，在种子萌发期、茎端离体培养期、生根诱导期分别予以NaCl胁迫筛选，层层淘汰，获得株系后，按株系进行扩繁，并在扩繁过程中每三次继代后增加一次NaCl胁迫筛选，增加作物耐盐株系的获得频率，加快了作物耐盐育种的进程。本发明实施方法简便，易于掌握，整个筛选过程都在实验室完全一致的可控条件下进行，使筛选结果真实可靠。筛选所得株系稳定性高。
Description
技术领域
本发明属于农作物育种技术领域，涉及以种子作为繁殖方式的十字花科农作物的耐盐性状的改良方法。
背景技术
我国海岸线漫长，广泛分布着各种滨海盐渍土，总面积约有5×106hm2。随着国民经济和社会的迅速发展，人口增长与耕地减少的矛盾日益突出，海岸带盐土作为一种重要的土地后备资源，亟待开发利用，因此，培育新的耐盐作物、提高作物的耐盐性研究显得日益重要。
以种子作为繁殖方式的十字花科农作物，例如在我国南方沿海各省普遍种植、大众喜食的青菜等农作物，其自身耐盐性低，缺乏耐盐种质。迄今为止，这类农作物栽培品种的选育研究多涉及耐热、耐寒及提高口感品质，对其耐盐性研究较少。
本领域仍需要获得以种子作为繁殖方式的十字花科农作物耐盐性状的种质材料，在我国滨海盐渍土上能够大量种植，有效利用有限资源。
发明内容
本发明针对十字花科现有种质材料中缺乏耐盐品种的不足，提供一种新的十字花科耐盐株系的获得及离体筛选的方法，通过使用平阳霉素并借助离体筛选的方法，获得耐盐株系，缩短耐盐株系耐盐性状的筛选时间，降低劳动强度，且筛选条件易于统一控制，不受外界自然条件的限制。
为实现这样的目的，本发明提供一种改良十字花科作物耐盐性状的方法，该方法包括用平阳霉素等对所述作物的无菌种子进行处理，在种子萌发期、茎端离体培养期、生根诱导期分别予以NaCl胁迫筛选，层层淘汰，获得株系后，按株系进行扩繁，并在扩繁过程中每三次继代后增加一次NaCl胁迫筛选，获得耐盐性状稳定的十字花科作物。
具体而言，本发明的改良十字花科作物耐盐性状的方法包括：
1)将该作物的种子灭菌后，用选自平阳霉素、甲基磺酸乙酯、叠氮钠、硫酸二乙酯、亚硝基乙基脲、5-溴尿嘧啶和马来酰肼的试剂或其组合浸渍10-40小时，取出后用无菌水冲洗；
2)将步骤1)所得种子接种于含NaCl 0.6-1.6％(w/v)的1/2MS培养基上，使其发芽，抽出真叶；
3)将上述抽出真叶的芽切下，接种于1/2MS培养基，待其长至3-6片真叶，遴选正常的芽苗留下；
4)将步骤3)获得的带3-6片真叶的正常芽苗转入含NaCl 0.6-1.6％(w/v)的1/2MS培养基，20-40天后，选取存活的芽苗转入1/2MS培养基进行恢复培养；
5)将经过恢复培养的植株的带3-6片叶的顶芽切下，转入NaCl 0.6-1.6％(w/v)的1/2MS培养基培养20-40天，筛选留下叶色浓绿、茎干健壮的芽苗，转入添加0.1-10mg/L细胞分裂素的1/2MS培养基按株系进行恢复、增殖培养；
6)将经过恢复、增殖培养的耐盐株系的带3-6片叶的顶芽切下，转入添加NaCl 0.6-1.6％(w/v)、0.1-10mg/L细胞分裂素、0.01-5.0mg/L的植物生长素的1/2MS培养基中进行生根培养，20-40天后，观察各株系的生长状况，统计各株系的生根频率，将长势健壮、生根率在70％以上的株系予以保存；和
7)将步骤6)所得株系在添加0.1-10mg/L细胞分裂素的1/2MS培养基增殖、扩繁，以20-30天为一个周期继代培养一次，每2-4个周期后，转入含NaCl0.6-1.6％(w/v)的1/2MS培养基中进行耐盐性筛选，获得耐盐株系。
在一个优选实施方式中，所述十字花科作物是青菜、油菜、白花菜、青花菜、芥蓝或甘蓝。
在一个优选实施方式中，所述步骤1)中所述试剂的浓度为80-200mg/L，以每粒种子0.5-3ml的量使用。
在一个优选实施方式中，所述步骤2)、4)-7)中所述含NaCl的1/2MS培养基中，NaCl的含量为0.8-1.2％。
在一个优选实施方式中，所述步骤5)-7)中所述细胞分裂素选自6-苄氨基腺嘌呤、6-糠氨基嘌呤、2-异戊烯腺嘌呤、唑重氮苯茎脲和玉米素。
在一个优选实施方式中，所述步骤5)中细胞分裂素是6-苄氨基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤，它们的用量分别是6-苄氨基腺嘌呤0.1-1.0mg/L和6-糠氨基嘌呤0.1-1.0mg/L。在更优选的实施例中，步骤5)中所用的6-苄氨基腺嘌呤的浓度为0.2-0.5mg/L，6-糠氨基嘌呤的浓度为0.2-0.5mg/L。
在一个优选实施方式中，所述步骤6)中所述植物生长素选自吲哚丁酸、吲哚乙酸和萘乙酸。
在一个优选实施方式中，所述步骤6)中的细胞分裂素是6-糠氨基嘌呤，其浓度为0.1-1.0mg/L。在优选的实施例中，所述步骤6)中的6-糠氨基嘌呤的浓度为0.2-0.5mg/L。
在一个优选实施方式中，所述步骤6)中的植物生长素是吲哚丁酸，其浓度为0.4-0.7mg/L。
在一个优选实施方式中：
步骤2)、4)-7)中所述含NaCl的1/2MS培养基中，NaCl的含量为0.8-1.2％；
所述步骤5)中添加的细胞分裂素是6-苄氨基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤，它们的浓度分别为6-苄氨基腺嘌呤0.2-0.5mg/L和6-糠氨基嘌呤0.2-0.5mg/L；
所述步骤6)中添加的细胞分裂素为6-糠氨基嘌呤，其浓度为0.2-0.5mg/L；
所述步骤6)中添加的植物生长素为吲哚丁酸，其浓度为0.4-0.7mg/L；和
所述步骤7)中添加的细胞分裂素是6-苄氨基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤，它们的浓度分别为6-苄氨基腺嘌呤0.2-0.5mg/L和6-糠氨基嘌呤0.2-0.5mg/L。
在一个优选实施方式中，本发明方法包括：
1)挑选籽粒饱满、种皮完整的种子，加入土温-20的0.1％HgCl2灭菌10分钟，以无菌水冲洗干净后吸干水分，用120mg/L平阳霉素以1ml/粒的用药量浸种24小时，取出后用无菌水冲洗干净；
2)将步骤1)获得的种子接种于含NaCl 0.8％的1/2MS培养基上使其发芽，抽出真叶；
3)将步骤2)抽出真叶的芽切下，接种于1/2MS培养基，待其长至4片真叶，去除玻璃苗和畸形苗，留下正常芽苗；
4)将步骤3)所得的带4片真叶的正常芽苗转入含NaCl 0.8％的1/2MS培养基，25～30天后，选取存活的芽苗转入1/2MS培养基进行恢复培养；
5)将经过恢复培养的耐盐株系带3～4片叶的顶芽切下，转入NaCl 0.8％的1/2MS培养基培养20～25天，淘汰叶片变黄、萎蔫或茎干玻璃化、水渍化的芽，留下叶色浓绿、茎干健壮的芽苗，转入添加6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/L、6-糠氨基嘌呤0.2mg/L的1/2MS培养基按株系进行恢复、增殖培养；
6)将步骤5)经过恢复、增殖培养的耐盐株系将带3～4片叶的顶芽切下，转入添加NaCl 0.8％、6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/L、吲哚乙酸0.5mg/L的1/2MS培养基中进行生根培养，20～25天后，观察各株系的生长状况，统计各株系的生根频率，将长势健壮、未出现NaCl毒害现象、生根率在80％以上的株系予以保存并进行繁殖，出现萎蔫、徒长情况或生根率低下的株系则予以淘汰；和
7)将步骤6)所得耐盐株系在添加6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/L、6-糠氨基嘌呤0.2mg/L的1/2MS培养基增殖、扩繁，以25天为一个周期继代培养一次，每3个周期后，转入含NaCl 0.8％的1/2MS培养基中进行耐盐性筛选，获得耐盐株系。
具体实施方式
十字花科(Brassicaceae)为双子叶植物，隶属白花菜目(Capparales)。约300属，3000余种，广布于全世界，主产北温带。最大分布中心为地中海周围至中亚西亚地带。中国96属，约411余种，引种7属，20余种，全国各地均有分布。芸苔属(Brassica)属于为十字花科，包括青菜(Brassica campestris L.ssp.Chinesis L.)、油菜、白花菜、青花菜、芥蓝、甘蓝等以种子繁殖的多种十字花科蔬菜、油料作物。
本发明一方面涉及一种十字花科作物耐盐性状改良的方法，尤其是涉及芸苔属作物耐盐性质的改良。该方法包括用平阳霉素等对所述作物的无菌种子进行处理，在种子萌发期、茎端离体培养期、生根诱导期分别予以NaCl胁迫筛选，层层淘汰，获得株系后，按株系进行扩繁，并在扩繁过程中每三次继代后增加一次NaCl胁迫筛选，获得耐盐性状稳定的株系。
在本发明中，可采用任何合适的灭菌技术对做为起始材料的种子进行灭菌。例如，在一个优选实施例中，可使用HgCl2的吐温-20溶液进行灭菌，HgCl2的浓度可以为0.05-0.2％(w/v)，优选为0.1％。灭菌时间可根据实际情况而定，例如可以是5-20分钟，例如10、15分钟等。较佳挑选粒籽饱满、种皮完整的种子作为起始材料。灭菌后，用无菌水冲洗种子，然后吸干水分，用平阳霉素处理该种子一段时间，例如10-40小时，通常可以为24小时或更长，例如30小时。平阳霉素的浓度为80mg/L以上，例如可以为80-200mg/L，优选可以为100-150mg/L，更优选为120-150mg/L。平阳霉素通常以每粒种子0.5-3ml的量使用，例如每粒种子用1-2ml的平阳霉素处理。经平阳霉素处理后取出种子，用无菌水冲洗干净。除平阳霉素外，也可使用甲基磺酸乙酯(EMS)、叠氮钠(NaN3)、硫酸二乙酯、亚硝基乙基脲、5-溴尿嘧啶和马来酰肼等其它试剂，其用量可根据本领域周知的用量进行选择。
将上述处理后的种子接种于含NaCl的1/2MS(大量元素为原用量1/2的Murashige and Skoog)培养基上待其发芽。添加到1/2MS培养基中的NaCl的浓度通常为0.6％以上，例如0.6-1.6％(w/v)，优选为0.8-1.2％，更优选为0.8-1.0％。统计能发芽且能正常抽出真叶的种子占所有种子数的比例。MS为一种培养基，其配方为(单位：mg/L)：
大量元素：
NH4NO4 1650
KNO3 1900
CaCl2·2H2O 440
MgSO4·7H2O 370
KH2PO4 170
KI 0.83
微量元素：
H3BO3 6.2
MnSO4·4H2O 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025
铁盐：
Na2EDTA 37.3
FeSO4·7H2O 27.8
甘氨酸 2.0
有机元素：
盐酸硫胺素 0.1
盐酸吡多辛 0.5
烟酸 0.5
肌醇 100.0
MS培养基可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化学试剂公司购买成品。1/2MS培养基则是将MS培养基的大量元素减半，而微量元素、铁盐和有机元素不变，须自行配制。1/2MS培养基的pH通常在5.4-6的范围内，例如可以是5.6-5.8。
将抽出真叶的芽切下，接种到1/2MS培养基上，待其长至3-6片真叶后，去除玻璃苗和真叶不正常的畸形苗，统计正常芽苗的比例，留下正常的芽苗以备耐盐筛选。本文中，“玻璃苗”指在进行植物组织培养时，经常发生的试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透明、水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。玻璃苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低、角质层、栅栏组织等发育不全，表现为光合能力和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；生根困难，移栽后也很难成活。“正常芽苗”指除玻璃苗和真叶不正常的畸形苗之外的芽苗。通常在长出4-5片真叶后进行统计和筛选。
然后，将上述遴选获得的带3-6片真叶的正常芽苗转入含NaCl的1/2MS培养基，20-40天、优选25-30天后，选取存活的芽苗转入1/2MS培养基进行恢复培养。添加到1/2MS培养基中的NaCl的浓度通常为0.6％以上，例如为0.6-1.6％，优选为0.8-1.2％，更优选为0.8-1.0％。恢复培养指在进行NaCl胁迫培养后，将存活的芽苗转入不含NaCl的培养基中培养，目的是为了防止培养物因长期处于高NaCl环境中产生生理性适应而导致最后的筛选产物并非耐NaCl株系。恢复培养的时间通常为20-40天，例如可以是30天左右。
将经过恢复培养的植株带3-6片、优选3-4片叶的顶芽切下，转入含NaCl的1/2MS培养基培养20-40天、优选20-25天，进行二次离体筛选。添加到1/2MS培养基中的NaCl的浓度通常为0.6％以上，例如为0.6-1.6％，优选为0.8-1.0％。观察这些芽在含NaCl培养基上的生长状况，淘汰叶片变黄、萎蔫或茎干玻璃化、水渍化的芽，留下叶色浓绿、茎干健壮的芽苗，转入添加了细胞分裂素的1/2MS培养基按株系进行恢复、增殖培养。细胞分裂素选自6-苄氨基腺嘌呤、6-糠氨基嘌呤、2-异戊烯腺嘌呤、唑重氮苯茎脲和玉米素等，其用量通常在0.1-10mg/L，例如可以是0.1-8.0mg/L、0.1-5.0mg/L、0.1-3.0mg/L、0.1-1.0m/L等。在优选实施例中，此步骤使用6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和6-糠氨基嘌呤(KT)。6-BA的添加量通常为0.1-1.0mg/L，例如可以是0.2-0.5mg/L，更优选为0.2-0.3mg/L。KT的添加量通常为0.1-1.0mg/L，例如可以是0.2-0.5mg/L，更优选为0.2-0.3mg/L。恢复、增殖培养的时间通常为20-40天，例如可以为30天左右。
将经过恢复、增殖培养的耐盐株系带3-6片、优选3-4片叶的顶芽切下，转入添加NaCl、细胞分裂素、植物生长素的1/2MS培养基中进行生根培养，20～25天后，观察各株系的生长状况，统计各株系的生根频率，将长势健壮、未出现严重的NaCl毒害现象、生根率在70％以上的株系予以保存并进行繁殖，出现萎蔫、徒长情况或生根率低下的株系则予以淘汰。添加到1/2MS培养基中的NaCl的浓度通常为0.6％以上，例如为0.6-1.6％，优选为0.8-1.2％，更优选为0.8-1.0％。细胞分裂素选自6-苄氨基腺嘌呤、6-糠氨基嘌呤、2-异戊烯腺嘌呤、唑重氮苯茎脲和玉米素，其用量通常在0.1-10mg/L，例如可以是0.1-8.0mg/L、0.1-5.0mg/L、0.1-3.0mg/L、0.1-1.0m/L等。在优选实施例中，此步骤使用6-BA，6-BA的添加量通常为0.1-1.0mg/L，例如可以是0.2-0.5mg/L，优选为0.2-0.3mg/L。植物生长素选自吲哚丁酸(IBA)、吲哚乙酸(IAA)和萘乙酸(NAA)，其用量通常为0.01-5.0mg/L，例如可以是0.01-4mg/L、0.01-2mg/L、0.1-1.0mg/L、0.2-0.8mg/L等。在优选实施例中，使用吲哚丁酸做为植物生长素，其添加量通常为0.2-1.0mg/L，例如可以是0.4-0.7mg/L。在一优选实施例中，IBA的添加量为0.5mg/L。在本文中，生根率指经生根培养后能生出正常根系的植株数占培养开始时接种的芽苗总数的百分比。在优选的实施例中，选择生根率在80％、85％、90％、95％或更高的株系。
将前述所得耐盐株系在添加了细胞分裂素的1/2MS培养基增殖、扩繁，以20-30天、通常25天为一个周期继代培养一次，每2-4个周期后，转入含NaCl的1/2MS培养基中进行耐盐性筛选，选取耐盐性保持良好的芽继续繁殖。添加到1/2MS培养基中的NaCl的浓度通常为0.6％以上，例如为0.6-1.6％，优选为0.8-1.2％，更优选为0.8-1.0％。细胞分裂素可以选自6-苄氨基腺嘌呤、6-糠氨基嘌呤、2-异戊烯腺嘌呤、唑重氮苯茎脲和玉米素等，其用量通常在0.1-10mg/L，例如可以是0.1-8.0mg/L、0.1-5.0mg/L、0.1-3.0mg/L、0.1-1.0m/L等。在优选实施例中，此步骤使用6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和6-糠氨基嘌呤(KT)。6-BA的添加量通常为0.1-1.0mg/L，例如可以是0.2-0.5mg/L，优选为0.2-0.3mg/L。KT的添加量通常为0.1-0.5mg/L，例如可以是0.2-0.5mg/L，优选为0.2-0.3mg/L。
与传统育种方法相比，本发明方法简便，易于掌握、实施；耐盐株系的获得和耐盐性状的筛选都在实验室完全一致的条件下进行，不受外界条件的影响；利用无菌种子作为起始材料，可获得大量的无菌苗，用于耐盐性状离体筛选，可严格筛选，大胆淘汰；整个过程都在组培室中进行，处理的种子量大，同时又降低了劳动力和农田的使用，且可周年重复试验，不断提供筛选材料，既缩短了育种时间，又能获得大量的种质材料；采用在发芽、茎段和生根三个阶段分别进行离体耐盐筛选，并结合株系扩繁过程中的回复筛选，筛选结果真实可信。
申请人的实验表明，利用本发明可在不到一年的时间内完成青菜耐盐株系筛选和离体扩繁，获得耐盐性状稳定的材料用于进一步的田间检测。本发明可大大缩短育种时间。所得材料是经过三步筛选并以无性繁殖方式扩繁而来，是同一株的无性后代，表现统一，且有一定的数量，可防止在田间筛选时由于一些意外情况(如虫害等)而导致株系材料的损失。利用本发明，在一年时间内，已离体筛选获得8份耐盐株系。
因此，本发明另一方面还包括采用本发明方法获得的各步骤所产生的植株、最后所获得的耐盐株系等。
下文将以青菜为例对本发明进行描述。应理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下可对本发明做出各种修改和变动。且也可采用本发明的方法用于其它十字花科作物，尤其是本文所列出的那些芸苔属作物，并能产生相同的效果。以下实施例仅仅是阐述性的，本发明的范围由本申请的权利要求加以限定。如无特别说明，本发明所用的百分比为重量体积百分比。此外，应理解，上述各数值范围，包括各优选数值范围，如试剂的优选浓度范围等，可任意组合，只要其能实现本发明的发明目的即可。
实施例
实施例1：青菜种子的耐盐处理及萌发筛选
仔细选取籽粒饱满、种皮完整的青菜种子，以加入一滴土温-20的0.1％HgCl2灭菌10分钟后，以无菌水冲洗干净后吸干水分，用120mg/L平阳霉素以1ml/粒的用药量在25℃的暗培养箱中浸种24小时，取出后用无菌水冲洗干净，接种于含NaCl 0.8％，添加蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，PH为5.6的1/2MS培养基上，在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下培养，5～7天后选取能正常发芽并有真叶抽出的种子作为耐盐萌发的初选株系。
实施例2：耐盐株系的初次离体筛选
将上述抽出真叶的芽切下，接种于添加蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，PH为5.6的1/2MS培养基，在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下培养20～25天，待其长至4～5片真叶，除去玻璃苗和真叶不正常的畸形苗，将生长正常的芽连同4片真叶切下，转入含NaCl 0.8％，添加蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，PH为5.6的1/2MS培养基，在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下胁迫培养25～30天后，选取存活的芽作为首次离体筛选耐盐株系，转入添加蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，PH为5.6的1/2MS培养基，在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下进行25～30天的恢复培养。
实施例3：耐盐株系的二次离体筛选
将经过恢复培养的初次离体筛选耐盐株系带3～4片叶的顶芽切下，转入含NaCl 0.8％，添加蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，PH为5.6的1/2MS培养基，在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下胁迫培养25～30天后，进行二次离体筛选：观察这些芽在含NaCl培养基上的生长状况，淘汰叶片变黄、萎蔫或茎干玻璃化、水渍化的芽，留下叶色浓绿、茎干健壮的芽苗，转入添加6-BA 0.2mg/L、KT 0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，PH为5.6的1/2MS培养基，在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下按株系进行恢复、增殖培养，每25～30天继代培养一次，共进行3次。
实施例4：耐盐株系的耐盐生根筛选
经过恢复、增殖培养的耐盐株系，将其带3～4片叶的芽切下，转入添加NaCl 0.8％、6-BA 0.2mg/L、IBA0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，PH为5.6的1/2MS培养基中，在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下进行胁迫生根培养，20～25天后，观察各株系的生长状况，统计各株系的生根频率，将长势健壮、未出现严重的NaCl毒害现象、生根率在80％以上的株系予以保存并进行繁殖，出现萎蔫、徒长情况或生根率低下的株系则予以淘汰。
实施例5：耐盐株系的保存、繁殖及日常筛选
取耐盐生根变异体株系带3～4片叶的芽，转入添加6-BA 0.2mg/L、KT 0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，PH为5.6的1/2MS培养基，在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下进行增殖、扩繁，以25天为一个周期继代培养一次，每3个周期后，转入含NaCl 0.8％的1/2MS培养基中进行一次耐盐性筛选，选取耐盐性保持良好的芽，继续进行扩繁培养。
实施例6
将获得的耐盐株系种植于大田，抽苔后套袋自交，待自交结实后收获种子。将收获的自交一代种子如实施例1进行无菌耐盐萌发试验，并以非耐盐株系的种子作为对照，同时进行无菌耐盐萌发。实验证明，在含NaCl 0.8％，添加蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，PH为5.6的1/2MS培养基上，在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下培养，7天后，8份株系自交1代种子正常萌发并抽出真叶的频率可达92％～98％，而其对照的正常萌发并抽出真叶的频率仅为64％～78％。将芽切下，转入添加蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，PH为5.6的1/2MS培养基，在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下培养，待其长出3～6片真叶，统计去除玻璃苗和真叶不正常的畸形苗后的正常芽苗百分率，耐盐株系自交1代可达94％～97％，而对照仅为36％～45％。由此可见，耐盐株系的耐盐性状稳定。
Claims (10)
1.一种改良十字花科作物耐盐性状的方法，该方法包括：
1)将该作物的种子灭菌后，用选自平阳霉素、甲基磺酸乙酯、叠氮钠、硫酸二乙酯、亚硝基乙基脲、5-溴尿嘧啶和马来酰肼的试剂或其组合浸渍10-40小时，取出后用无菌水冲洗；
2)将步骤1)所得种子接种于含NaCl0.6-1.6％(w/v)的1/2MS培养基上，使其发芽，抽出真叶；
3)将上述抽出真叶的芽切下，接种于1/2MS培养基，待其长至3-6片真叶，遴选正常的芽苗留下；
4)将步骤3)获得的带3-6片真叶的正常芽苗转入含NaCl0.6-1.6％(w/v)的1/2MS培养基，20-40天后，选取存活的芽苗转入1/2MS培养基进行恢复培养；
5)将经过恢复培养的植株的带3-6片叶的顶芽切下，转入NaCl0.6-1.6％(w/v)的1/2MS培养基培养20-40天，筛选留下叶色浓绿、茎干健壮的芽苗，转入添加0.1-10mg/L细胞分裂素的1/2MS培养基按株系进行恢复、增殖培养；
6)将经过恢复、增殖培养的耐盐株系的带3-6片叶的顶芽切下，转入添加NaCl0.6-1.6％(w/v)、0.1-10mg/L细胞分裂素、0.01-5.0mg/L的植物生长素的1/2MS培养基中进行生根培养，20-40天后，观察各株系的生长状况，统计各株系的生根频率，将长势健壮、生根率在70％以上的株系予以保存；和
7)将步骤6)所得株系在添加0.1-10mg/L细胞分裂素的1/2MS培养基增殖、扩繁，以20-30天为一个周期继代培养一次，每2-4个周期后，转入含NaCl0.6-1.6％(w/v)的1/2MS培养基中进行耐盐性筛选，获得耐盐株系。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述十字花科作物是青菜、油菜、白花菜、青花菜、芥蓝或甘蓝。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述试剂的浓度为80-200mg/L，以每粒种子0.5-3ml的量使用。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)、4)-7)中所述含NaCl的1/2MS培养基中，NaCl的含量为0.8-1.2％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)-7)中所述细胞分裂素选自6-苄氨基腺嘌呤、6-糠氨基嘌呤、2-异戊烯腺嘌呤、唑重氮苯茎脲和玉米素。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中的细胞分裂素是6-苄氨基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤，它们的浓度分别为6-苄氨基腺嘌呤0.1-1.0mg/L和6-糠氨基嘌呤0.1-1.0mg/L。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤6)中所述植物生长素选自吲哚丁酸、吲哚乙酸和萘乙酸。
8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤6)中植物生长素是吲哚丁酸，其浓度为0.4-0.7mg/L。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤2)、4)-7)中所述含NaCl的1/2MS培养基中，NaCl的含量为0.8-1.2％；
所述步骤5)中添加的细胞分裂素是6-苄氨基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤，它们的浓度分别为6-苄氨基腺嘌呤0.2-0.5mg/L和6-糠氨基嘌呤0.2-0.5mg/L；
所述步骤6)中添加的细胞分裂素为6-糠氨基嘌呤，其浓度为0.2-0.5mg/L；
所述步骤6)中添加的植物生长素为吲哚丁酸，其浓度为0.4-0.7mg/L；和
所述步骤7)中添加的细胞分裂素是6-苄氨基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤，它们的浓度分别为6-苄氨基腺嘌呤0.2-0.5mg/L和6-糠氨基嘌呤0.2-0.5mg/L。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法为：
1)挑选籽粒饱满、种皮完整的种子，加入土温-20的0.1％HgCl2灭菌10分钟，以无菌水冲洗干净后吸干水分，用120mg/L平阳霉素以1ml/粒的用药量浸种24小时，取出后用无菌水冲洗干净；
2)将步骤1)获得的种子接种于含NaCl0.8％的1/2MS培养基上使其发芽，抽出真叶；
3)将步骤2)抽出真叶的芽切下，接种于1/2MS培养基，待其长至4片真叶，去除玻璃苗和畸形苗，留下正常芽苗；
4)将步骤3)所得的带4片真叶的正常芽苗转入含NaCl0.8％的1/2MS培养基，25～30天后，选取存活的芽苗转入1/2MS培养基进行恢复培养；
5)将经过恢复培养的耐盐株系带3～4片叶的顶芽切下，转入NaCl0.8％的1/2MS培养基培养20～25天，淘汰叶片变黄、萎蔫或茎干玻璃化、水渍化的芽，留下叶色浓绿、茎干健壮的芽苗，转入添加6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/L、6-糠氨基嘌呤0.2mg/L的1/2MS培养基按株系进行恢复、增殖培养；
6)将步骤5)经过恢复、增殖培养的耐盐株系将带3～4片叶的顶芽切下，转入添加NaCl0.8％、6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/L、吲哚乙酸0.5mg/L的1/2MS培养基中进行生根培养，20～25天后，观察各株系的生长状况，统计各株系的生根频率，将长势健壮、未出现NaCl毒害现象、生根率在80％以上的株系予以保存并进行繁殖，出现萎蔫、徒长情况或生根率低下的株系则予以淘汰；和
7)将步骤6)所得耐盐株系在添加6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/L、6-糠氨基嘌呤0.2mg/L的1/2MS培养基增殖、扩繁，以25天为一个周期继代培养一次，每3个周期后，转入含NaCl0.8％的1/2MS培养基中进行耐盐性筛选，获得耐盐株系。
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