CN101268193A - 通过组3 lea表达的植物产量改良 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过调节编码OsLEA3a多肽或其同源物的核酸在植物中的表达来增加植物产量的方法。此类方法之一包括将OsLEA3a核酸或其变体引入植物。本发明还涉及在其中已经引入了OsLEA3a核酸或其变体的转基因植物，该植物与对照植物相比具有增加的产量和改变的代谢型。本发明还涉及可用于本发明方法中的构建体。

Description

通过组3 LEA表达的植物产量改良
本发明一般涉及分子生物学领域，并且涉及相对于对照植物增加植物产量的方法。更具体的，本发明涉及包括调节编码OsLEA3a多肽或其同源物的核酸在植物中的表达的增加植物产量的方法。本发明还涉及与产量增加相联系的代谢物的组成改变。本发明还涉及具有被调节的编码OsLEA3a多肽或其同源物的核酸表达的植物，该植物相对于对照植物具有增加的产量。本发明还提供了可用于本发明方法的构建体。
不断增长的世界人口和可用于农业的适宜耕种土地面积的缩小，刺激了改善农业效率的研究。作物和园艺改良的常规手段利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而这种选育技术具有若干缺点，即这些技术一般是劳动密集型的，而且产生通常含有异质遗传成分的植物，这并非总是产生自亲本植物传递过来的期望性状。分子生物学的发展已经允许人类修饰动物和植物的种质。植物的遗传工程需要分离和操作遗传物质(一般是DNA或RNA的形式)，随后把该遗传物质引入到植物中。该技术能够使作物或植物具有多种改良的经济学、农艺学或园艺性状。一种具有特殊经济利益的性状是产量，其必涉及特定的作物、面积和/或时间。产量通常定义为作物的可衡量经济价值。这可以从数量和/或质量方面定义。产量直接取决于一些因素，例如，器官的数量和尺寸，植物结构(例如，枝条的数量)，种子产量等等。根的发育、营养吸收和胁迫耐受性也是确定产量的重要因素。优化上述因素之一可以因此有助于提高作物产量。
饲料作物例如紫苜蓿、青贮玉米和干草生产植物生物量。对于产量的许多代用指标(proxy)已被用于谷类作物。其中主要是植物尺寸的估计。根据物种和发育阶段，可以用多种方法测量植物尺寸，包括总植物干重、地上部分干重、地上部分鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座直径、叶长度、根长度、根重量、分蘖数和叶数目。许多物种在给定发育阶段的植物的不同部分的尺寸间维持了稳定的比例。这些比速增长关系被用于从上述尺寸测量之一推断另一个(例如，Tittonell等人，2005，Agric Ecosys&Environ 105：213)。在发育早期阶段的植物尺寸一般与发育晚期阶段的植物尺寸相关。有更大叶面积的大株植物一般可以比小株植物吸收更多的光和二氧化碳，因此在相同的时期可能获得更多重量(Fasoula & Tollenaar2005 Maydica 50：39)。这就是除了微环境或遗传优势潜在的延续外，植物需要在一开始就获得更大的尺寸。植物尺寸和生长速率有很强的遗传成分(例如，ter Steege等人，2005 Plant Physiology 139：1078)，因此，对于一定范围的不同基因型，在一种环境条件下的植物尺寸可能与在另一个环境条件下的尺寸相关(Hittalmani等人，2003Theoretical Applied Genetics107：679)。因此，在本领域中使用标准环境代替作物在野外的不同位置和时间遇到的不同的和动态的环境。
收获指数，即种子产量和地上部分干重的比例，在多种环境条件下是相对稳定的，而且通常可以获得植物尺寸和谷类产量间的强烈相关性(例如，Rebetzke等人，2002 Crop Science 42：739)。这些过程本质上是相关联的，因为大多数谷类生物量取决于植物叶和茎的现有或储存的光合成生产力(Gardener等人，1985Physiology of Crop Plants.Iowa State UniversityPress，第68-73页)。因此，即使在发育的早期阶段，选择植物尺寸已经作为将来潜在产量的指示(例如，Tittonell等人，2005 Agric Ecosys &Environ 105：213)。当检测遗传差异对胁迫耐受性的影响时，与野外相比，温室或植物生长室环境的内在优势是将土壤性质、温度、水和营养物可利用性以及光强度标准化的能力。然而，由于缺少风或昆虫导致授粉不足，或缺乏空间供成熟的根或株冠生长，造成对产量的人为限制，这可以限制上述受控环境在检查产量差异中的应用。因此，在生长室或温室的标准化条件下测量发育早期的植物尺寸，是提供指示潜在遗传产量优势的标准实践。
种子产量是特别重要的性状，因为许多植物种子对人和动物的营养是重要的。通过直接消费种子自身，或通过消费用加工种子饲养的肉制品，作物例如玉米、稻、小麦、油菜籽和大豆，占人的总卡路里摄入的一半以上。它们也是糖、油和在工业加工中使用的多种代谢物的来源。种子包含胚(新生枝条和根的来源)和胚乳(在萌发和幼苗早期生长中胚生长的营养物来源)。种子的发育涉及许多基因，并需要从根、叶和茎中将代谢物转移到生长中的种子。特别是胚乳吸收糖类、油和蛋白质的代谢前体，并将其合成为储存大分子填充到谷粒中。增加植物产量的能力在例如农业领域，包括在生产观赏植物、树木栽培、园艺和林业中，具有多种应用。在生产用于生物反应器(用于生物技术生产物质例如药物、抗体或疫苗、或生物转化有机废物)的藻类以及其它同类领域中增加产量也是有用的。
OsLEA3a是被分类到LEA蛋白质3a组的稻蛋白质((Wise &Tunnacliffe，Trends Plant Sci.9，13-17，2004)。LEA蛋白质(胚胎发育后期富集蛋白)在高等植物种子胚的胚胎发育后期的不同阶段和脱水胁迫条件下表达。也可以被脱落酸诱导。通常，这些蛋白质的功能是未知的。最近的分类将LEA蛋白质划分为7个组；其中若干组特征在于典型的序列基序，计算机分析能够对其功能预测(Wise & Tunnacliffe，2004)。组3Lea蛋白质包括LEA超家族2和5，特征是存在11-mer氨基酸基序，该基序可以大致定义如下：位置1、2、5和9是疏水残基，位置3、7和11是带负电的或酰胺残基，位置6和8是带正电的残基，位置4和10可以存在任意氨基酸(Wise & Tunnacliffe，2004，Dure III，L.，Protein and Peptide Letters 8，115-122，2001)。推测组3LEA蛋白质具有分子伴侣的功能，在干燥耐受中发挥作用(Goyal等人，Biochem.J.388，151-157，2005)。由于水胁迫条件下诱导植物中的LEA蛋白质，假设LEA蛋白质可用于使植物更抗盐和干旱。Xu等人(Plant Physiol.110，249-257，1996)证实，转化了大麦LEA3a的稻更耐受缺水和盐胁迫，Rohila等人(Plant Sci.163，525-532，2002)描述了组成型或胁迫诱导型表达大麦LEA3a的转基因印度香米(Basmati rice)，其表现出增加的干旱和高盐度耐受。类似的，转化了组成型启动子控制的大麦LEA3a的小麦比对照植物对干燥有更高的抗性(Bahieldin等人，Physiol.Plant.123，421-427，2005)。然而，上述研究也显示，当植物生长在非胁迫条件下时，与对照植物相比没有产量增长。WO97/13843描述了使用大麦HVA1增加对干燥和盐胁迫的抗性，但未表明表达大麦HVA1的植物在非胁迫条件下具有改良的生长性质。
现在令人惊讶的发现，与对照植物相比，调节编码稻LEA3a多肽(OsLEA3a)或其同源物的核酸在植物中的表达使植物具有增加的产量。当植物栽培在没有胁迫的条件(非胁迫条件)下时，也令人惊奇的发现了这一产量的增加。优选的，OsLEA3a的同源物是植物来源的，更优选的，OsLEA3a的同源物源自单子叶植物，条件是OsLEA3a的同源物不是SEQID NO：22(大麦(Hordeum vulgare))。最优选的，该同源物源自稻(Oryzasativa)。
根据本发明的一个实施方案，提供了增加植物产量的方法，包括调节编码OsLEA3a多肽或其同源物的核酸在植物中的表达。
有利的，实施根据本发明的方法，得到了相对于对照植物，具有增加产量，特别是种子产量的植物。
对照植物的选择是实验设计的常规部分，可以包括对应的野生型植物或对应的没有目的基因的植物。对照植物通常是待比较植物的同种植物，甚至是相同品种。对照植物还可以是待比较植物的失效合子。失效合子是由于分离而缺失转基因的个体。本文中使用的“对照植物”不仅指全株植物，而且还指植物的部分，包括种子和种子的部分。
“参照”、“参照植物”、“对照”、“对照植物”、“野生型”或“野生型植物”特别是细胞、组织、器官、植物或其部分，它们不是根据本发明的方法生产的。相应的，术语“野生型”、“对照”或“参照”是可互换的，并且可以是细胞或植物的一部分例如细胞器或组织，或者植物，它们都没有根据发明在本文中描述的方法进行修饰或处理。因此，用作野生型、对照或参照的细胞或植物的部分(例如细胞器)或植物，尽可能的对应于其细胞、植物或其部分，在除了本发明过程的结果之外的其它一切性质上，尽可能的与发明的主题一致。因此，对野生型、对照或参照进行相同的或尽可能相同的处理，只有不影响被检测性质的质量的条件或性质才可以有差异。这意味着换句话说，野生型是指(1)植物，其带有基因或等位基因的未改变或未调节的形式，或(2)初始的材料/植物，从中衍生出用本发明的过程或方法生产的植物。
优选的，在野生型植物和用本发明的方法生产的植物之间进行的任何比较都是在可比拟的条件下进行的。术语“可比拟的条件”指所有的条件例如，培养或生长条件、分析条件(例如缓冲液组成、温度、底物、病原体菌株、浓度等等)在进行比较的实验之间都保持一致。
“参照”、“对照”或“野生型”优选的是没有根据发明在本文中描述的过程调节、修饰或处理的对象，例如细胞器、细胞、组织、植物，并且在其它任何性质上尽可能与本发明的主题相似。参照、对照或野生型在其基因组、转录物组、蛋白质组或代谢物组中与本发明的主题尽可能的相似。优选的，术语“参照-”、“对照-”或“野生型-”的-细胞器、-细胞、-组织或植物，是指这样的细胞器、细胞、组织，其与本发明的细胞器、细胞、组织或植物或其部分几乎是遗传同一性的，优选的95％，更优选的98％，甚至更优选的99.00％，特别的99.10％、99.30％、99.50％、99.70％、99.90％、99.99％、99.999％或更多。最优选的“参照”、“对照”或“野生型”是这样的对象(例如细胞器、细胞、组织、植物)，除了根据本发明的方法改变、调节或修饰的核酸分子或其编码的基因产物之外，该对象与根据本发明的方法使用的植物、细胞、细胞器是遗传同一性的。
术语“表达”或“基因表达”意指由于一个或多个特定的基因转录导致的表型性状的出现。术语“表达”或“基因表达”特别指一个或多个基因转录成结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，后者随后翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录，加工获得的mRNA产物，及其翻译成活性蛋白质。
术语“调节”意指涉及表达或基因表达的过程，其中与对照植物相比，所述基因表达改变了表达水平，优选的表达水平是增加的。初始的、未调节的表达可以是任何种类的结构RNA(rRNA、tRNA)或具有后续翻译的mRNA的表达。术语“调节活性”应该意指发明的核酸序列或编码的蛋白质的表达的任何改变，其导致增加的产量和/或增加的植物生长。
术语“产量”一般意指具有经济价值的可测量产出，其必然与特定的作物、面积和时间段相关。个别植物部分对产量的直接贡献基于其数量、尺寸和/或重量，但是实际产量是每英亩作物一年的产量，其由总产量(包括收获的和估计的产量)除以种植的英亩数确定。
术语“增加”、“改进”或“改良”是可互换的，并且在本申请中应该意指，与本文中定义的野生型植物相比，至少5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选的至少15％或20％，更优选的25％、30％、35％或40％的更高的产量和/或生长。
与对照、参照或野生型相比，涉及多肽的活性的增加在细胞、组织、细胞器、器官或生物体或其部分中优选的共计至少5％，优选的至少10％或至少15％，特别优选的至少20％、25％、30％或更多，非常特别优选的至少40％、50％或60％，最优选的至少70％或更多。
本文定义的术语“增加的产量”意指在植物的一个或多个部分增加的生物量(重量)，可以包括地上(可收获)部分和/或(可收获的)地下部分。
特别的，该可收获的部分是种子，相对于对照植物的种子产量，实施本发明的方法获得具有增加的种子产量的植物。
增加的种子产量可以表现为以下一个或多个方面：a)种子生物量(总种子重量)的增加，其可以基于单个种子和/或每株植物和/或每公顷或英亩；b)增加的每株植物的花的数目；c)增加的(饱满)种子数；d)增加的种子饱满率(用饱满种子数除以种子总数的比例来表示)；e)增加的收获指数，其表示为可收获的部分如种子的产量，除以总生物量的比例；和f)增加的千粒重(TKW)，其根据计数的饱满种子数目及其总重量推算。增加的TKW可源于增加的种子尺寸和/或种子重量，也可源于胚胎和/或胚乳尺寸的增加。
种子产量的增加还可以表示为种子尺寸和/或种子体积的增加，它还影响种子的组成(包括油、蛋白质和糖类的总含量和组成)。此外，种子产量的增加还可以表示为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。增加的产量还可以产生改变的构造，或作为改变的构造的结果发生。
以谷类为例，产量增加可以表现为下列一种或多种：每公顷或英亩植物数量增加、每株植物穗数量的增加、畦数、每畦籽粒(kernel)数、粒重、千粒重、穗的长度/直径、种子饱满率的增加(其是饱满种子数除以种子总数并乘以100)等。
以稻为例，产量增加可以表现为下列一种或多种的增加：每公顷或英亩植物数量、每株植物的圆锥花序数量、每个圆锥花序的小穗数量、每个圆锥花序花(小花)的数量(其表示为饱满种子数占初级圆锥花序数的比例)，种子饱满率的增加(其是饱满种子数除以种子总数并乘以100)、千粒重的增加等。产量的增加还可产生改变的构造或可以作为改变的构造的结果发生。
根据优选的特征，实施本发明的方法获得具有增加的产量，特别是增加的种子产量的植物。因此，根据本发明提供了增加植物产量的方法，该方法包括调节编码OsLEA3a多肽或其同源物的核酸在植物中的表达。
由于根据本发明的转基因植物具有增加的产量，因此，相对于在其生活周期对应阶段的对照植物的生长速度，这些植物很可能表现出增加的生长速度(至少是在其生活周期的一部分)。具有增加的生长速度的植物可以具有更短的生活周期。植物的生活周期意指从干的成熟种子生长到植物产生干的成熟种子(类似于起始物质)的阶段所需的时间。此生活周期可以受到如早期活力、生长速度、开花时间和种子成熟速度等因素的影响。生长速度的增加可以发生在植物生活周期的一个或多个阶段或者基本遍布整个植物生活周期期间。在植物生活周期的早期阶段增加的生长速度反映了增强的活力。生长速度的增加可以改变植物的收获周期，这使得植物可以比可能的情形更晚播种和/或更早收获(可得到具有提前的开花时间的类似的效果)。如果生长速度充分增加，可以允许更多播种相同植物物种的种子(例如在播种和收获稻植物后，接着播种和收获更多的稻植物，所有这些都在一个常规生长期内)。类似的，如果生长速度充分增加，可以允许更多播种不同植物物种的种子(例如在播种和收获稻植物后，例如接着播种和任选收获大豆、马铃薯或任何其他适当的植物)。在一些作物植物的情形下，从同一根状茎收获多次也是可能的。改变植物的收获周期可以使得每英亩每年生物量的产出增加(由于任何特定植物可以生长和收获次数(指在一年中)的增加)。生长速度的增加还使得转基因植物可以比它们的野生型对应物在更广的地域栽培，这是因为生长作物的区域性限制通常决定于种植时(初期)或收获时(晚期)的不利环境条件。如果收获周期缩短，那么可以避免此类不利条件。可以通过生长曲线，得到多个参数来确定生长速度，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其最大尺寸的50％时所用的时间)以及T-90(植物达到其最大尺寸的90％时所用的时间)等。
在植物的一个或多个部分具有增加的生长速度的植物表现出改变的新陈代谢(由改变的代谢物水平所反映)。改变的代谢物水平与转基因的存在相关。因此，代谢型可用作诊断工具来表征或鉴定具有增加产量的植物，预测产量增加所涉及的新蛋白质，或鉴定产量增加所涉及的途径。
术语“代谢物”指中间物，优选的指那些在植物或植物细胞的合成代谢或分解代谢中产生的低分子量的物质，换言之，在代谢中产生或消耗的物质，例如氨基酸。术语代谢物的“改良的组成”指这些代谢物浓度的所需改变。根据代谢物的类型，浓度的改变可以是增加或降低的。优选的，代谢物浓度/水平的改变是相对于合适的对照植物测量的。本发明中优选的代谢物包括来自例如氨基酸代谢、类胡萝卜素代谢、辅因子代谢、脂肪酸代谢、有机酸代谢、酚类(phenolics)代谢、植物激素代谢、植物固醇代谢、糖代谢、生育酚和相关化合物代谢、蜡化合物代谢、脂类代谢的代谢物。不同代谢物的水平一般在某些范围内变动(见例如实施例6中的数据)，一个或多个代谢物水平的改变可用于定义代谢型。该代谢型可以包括关于特定代谢物和/或代谢物类型(例如氨基酸代谢、类胡萝卜素代谢、辅因子代谢、脂肪酸代谢、有机酸代谢、酚类代谢、植物激素代谢、植物固醇代谢、糖代谢、生育酚和相关化合物代谢、蜡化合物代谢、脂类代谢)的改变水平的数据。由于目的基因(如LEA3a)被调节的表达，基本上可以在全株植物或在某些植物部分、器官、组织或细胞中改变代谢物的水平。在优选的实施方案中，改变了种子中的代谢物水平。
根据本发明的优选的特征，与对照植物相比，实施本发明的方法使植物具有了增加的生长速度或增加的产量。因此，根据本发明，提供了在植物中增加产量和/或生长速度的方法，该方法包括调节编码OsLEA3a多肽或其同源物的核酸在植物中的表达。
与对照植物相比，无论植物是否在非胁迫条件下或植物是否接触多种胁迫，产生产量和/或生长速度的增加。特别观察到当植物处于非胁迫条件下时，产量和/或生长速度的增加。植物一般通过生长更加缓慢来应答所接触的胁迫。在严重的胁迫条件下，植物甚至完全停止生长。另一方面，本文将中等胁迫定义为植物所接触的不引起植物完全停止生长且没有能力恢复生长的任何胁迫。与非胁迫条件下的对照植物相比，本发明所指的中等胁迫导致被胁迫植物的生长降低少于40％、35％或30％，优选的少于25％、20％或15％，更优选的少于14％、13％、12％、11％或10％或更少。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的发展，在栽培的作物植物中通常不会遇到严重胁迫。因而，中等胁迫诱导的受损生长通常是农业所不希望的特征。中等胁迫是植物所接触的典型胁迫。这些胁迫可以是植物所接触的日常生物和/或非生物(环境)胁迫。典型的非生物或环境胁迫包括由反常的热或寒冷/冻结温度引起的温度胁迫；盐胁迫；水胁迫(干旱或过量的水)。化学制剂也可以引起非生物胁迫。生物胁迫通常是那些由病原体，如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的胁迫。
特别的，本发明的方法可以在非胁迫条件下实施，使植物相对于对照植物具有增加的产量。根据Wang等人的报道(Planta(2003)218：1-14)，非生物胁迫产生一系列形态学、生理学、生物化学和分子上的改变，负面的影响植物生长和生产力。已知干旱、盐度、极端温度和氧胁迫是相互联系的，并可以通过相似的机制诱导生长和细胞损伤。Rabbani等人(PlantPhysiol(2003)133：1755-1767)描述了在干旱胁迫和高盐度胁迫间特别高度的“交叉对话”。例如，干燥和/或盐化作用主要表现为渗透压，导致细胞体内稳态和离子分布的破坏。氧胁迫通常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫，可以导致功能蛋白质和结构蛋白质变性。因此，这些不同的环境胁迫通常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，例如产生胁迫蛋白质、上调抗氧化剂、积累相容的溶质和阻止生长。本文中使用的术语“非胁迫”条件是那些对植物不产生胁迫(例如上述胁迫)的环境条件。本领域技术人员熟知给定区域的正常土壤条件和气候条件。
在任何植物中可以有利地改良上述生长特性。
本文所用的术语“植物”包括整株植物、植物的祖代和后代、植物细胞以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花，以及组织和器官，其中前述每种包括目的基因/核酸。术语“植物”还包括悬浮培养物、愈伤组织、胚胎、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样的，其中每种前述包含目的基因/核酸。
尤其可用于本发明方法中的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括选自如下物种的饲料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木：槭树属物种(Acerspp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、冰草属物种(Agropyron spp.)、葱芹属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、燕麦(Avena sativa)、阳桃(Averrhoa carambola)、冬瓜(Benincasahispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)、Cadaba farinosa、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Cannaindica)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、金色苔草(Carex elata)、番木瓜(Caricapapaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、苦苣(Cichoriumendivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋(Colocasia esculenta)、Cola spp.、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynaraspp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蟥属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyrosspp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、穇子(Eleusine coracana)、枇杷(Eriobotrya japonica)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrumspp.)、山毛榉属物种(Fagus spp.)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属物种(Glycine spp.)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属物种(Helianthus spp.)、萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglansspp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lensculinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinusspp.)、Luzula sylvatica、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、西印度樱桃(Malpighia emarginata)、曼密苹果(Mammeaamericana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属物种(Melilotusspp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morusnigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotianum spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryza spp.)、稷(Panicum miliaceum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、鳄梨属物种(Persea spp.)、香芹(Petroselinum crispum)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidiumspp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Prus communis)、栎属物种(Quercusspp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶蔗子属物种(Ribes spp.)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharumspp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属物种(Solanum spp.)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygiumspp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、Triticosecale rimpaui、小麦属物种(Triticum spp.)、小旱金莲(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野豌豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、北美洲野生稻(Zizania palustris)、枣属物种(Ziziphus spp.)等。
其它有利的植物选自群组包括紫菀科(Asteraceae)，例如向日葵属(Helianthus)、万寿菊属(Tagetes)，如物种向日葵(Helianthus annuus)[向日葵]、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tagetes erecta)或细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)[金盏花]；十字花科(Brassicaceae)例如芸苔属(Brassica)、拟南芥属(Arabidopsis)，如物种欧洲油菜(Brassica napus)、芜青物种(Brassica rapa spp)[油菜、欧洲油菜(oilseed rape)、芜青]或拟南芥；豆科(Fabaceae)例如大豆属(Glycine)，如物种大豆(Glycine max)、大豆(SojaHispida)、大豆(Soja max)[大豆]；亚麻科(Linaceae)例如亚麻属(Linum)，如物种亚麻(Linum usitatissimum)[亚麻、亚麻籽]；禾本科(Poaceae)，例如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)，如物种大麦(Hordeumvulgare)[大麦]、黑麦(Secale cereale)[黑麦]、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida)[燕麦]，两色蜀黍(Sorghum bicolor)[高粱、粟]、稻(Oryza sativa)、阔叶稻(Oryza latifolia)[稻]、玉蜀黍[包谷、玉米]、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum，马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare)[小麦、面包小麦、普通小麦]；茄科(Solanaceae)，例如茄属(Solanum)、番茄属(Lcopersicon)，如物种马铃薯(Solanum tuberosum)[土豆]、番茄(Lycopersicon esculentum)、番茄(Lcopersicon lycopersicum)、梨形番茄(Lycopersicon pyriforme)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum)[西红柿].
根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯和烟草。更优选的，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选的植物是谷类。谷类的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高粱和燕麦。
本文所定义的术语“OsLEA3a或其同源物”指例如SEQ ID NO：2代表的稻LEA3a多肽，和属于LEA蛋白质组3的蛋白质，其具有对应于Pfam登录号PF02987或InterPro登录号IPR004238的2个LEA 4蛋白质结构域，并包含大致定义如下的11-mer氨基酸序列基序：位置1、2、5和9是疏水残基，位置3、7和11是带负电的或酰胺残基，位置6和8是带正电的残基，位置4和10可以存在任意氨基酸；在该基序内可以出现一处错配(Dure III，L.，Protein and Peptide Letters 8，115-122，2001)。疏水氨基酸残基组由A、C、F、G、I、L、M、T、V、W、S和Y组成。带负电的氨基酸是D或E，酰胺残基是Q和N。带正电的氨基酸是H、K和R。该基序中的序列保守性不是绝对的，可以存在1或2处错配(图3)。
优选的，11-mer氨基酸序列基序(下文命名为共有记号(consensussignature))对应序列：
T(S/T/A/K)(Q/E/D)A(A/T)(R/K)(D/Q/E)(K/R)A(A/G/Y)(E/G)(SEQ ID NO：3)，
还优选的共有记号序列对应于序列
T(S/T/A/K)(Q/E/D)A(A/T)(R/K)(D/Q/E)(K/R)A(A/G/Y)E
更优选的共有记号对应于序列
T(S/A/K)(Q/D)A(A/T)(R/K)(D/E)KA(A/Y)E，
最优选的共有记号是T(S/A)QAARDKAAE。
术语“结构域”指沿着进化相关蛋白质序列的比对，在特定位置保守的一组氨基酸。尽管其它位置的氨基酸在同源物之间可以变动，在特定位置高度保守的氨基酸指示了对蛋白质的结构、稳定性或活性是关键性的氨基酸。鉴于它们在蛋白质同源物家族的比对序列中的高度保守性，它们可以用作标记来确定任何所讨论的多肽是否属于已经预先鉴定的多肽家族(在本案中，LEA3蛋白质家族)。术语“基序”或“共有序列”或“记号(signature)”指蛋白质序列中的短保守区域。基序通常是结构域的高度保守部分，但也可以只包括结构域的一部分，或位于保守结构域之外(如果基序所有的氨基酸都位于已定义的结构域之外)。
存在专业数据库用于鉴定结构域。鉴定LEA3蛋白质中的LEA 4结构域可以使用以下，例如，SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letuni等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等人，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profile syntax for biomolecularsequences motifs and its function in automatic sequence interpretation.(In)ISMB-94；Proceedings 2nd International Conference on IntelligentSystems for Molecular Biology.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，LathropR.，Searls D.，编著，53-61页，AAAI出版，Menlo Park；Hulo等人，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))或Pfam(Bateman等人，Nucleic AcidsResearch 30(1)：276-280(2002))。EXPASY蛋白组学服务器(由瑞士生物信息学中心(Swiss Institute of Bioinformatics)主管(Gasteiger等人，ExPASy：the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis，NucleicAcids Res.31：3784-3788(2003)))上有一套计算机分析蛋白质序列的工具可以使用。OsLEA3a蛋白质序列用SMART工具(4.1版；Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等人(2002)Nucleic AcidsRes 30，242-244)分析，并使用其在Pfam(17.0版，2005年3约；Bateman等人(2004)Nucl.Acids Res.32，D138-141)和InterPro(版本11.0，2005年7月26日；Mulder等人(2005)Nucl.Acids.Res.33，D201-205)数据库中进行筛选。序列SEQ ID NO：2中的第一个LEA 4结构域始于G28止于D97，第二个始于G101至D163。
通过比对SEQ ID NO：2和其他蛋白质序列，可以容易的鉴定相应的共有记号序列、LEA 4结构域或其它序列基序。这样，利用本领域技术人员熟知的常规技术如序列比对，可以方便的鉴定LEA3多肽或其同源物(包括直系同源物和旁系同源物)。用于比较的序列的比对方法是本领域普遍已知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP利用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48；443-453)的算法寻找可以使匹配数最大化并使空位数最小化的两段完整序列的比对。BLAST算法(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10)计算序列同一性百分比，并统计分析两段序列间的相似度。实施BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(NCBI)公开可用。使用如ClustalW多序列比对算法(1.83版)，用缺省的配对比对参数和百分比评分方法可以方便的鉴定同源物。还可以用MatGAT软件包(Campanella等人，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：an application that generates similarity/identitymatrices using protein or DNA sequences.)中可用的方法之一确定相似度和同一性的整体百分比(global percentage)。本领域技术人员很清楚可以实施细微的手动编辑，优化保守基序间的比对。此外，除了使用全长序列鉴定同源物外，还可以使用特定的结构域(例如LEA 4结构域)。序列同一性的值，在下文中以百分比显示，是对完整的保守结构域或核酸或氨基酸序列使用上述程序及其缺省参数来测定的。
OsLEA3a蛋白质或其同源物的实例包括SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36代表的序列。
应该理解用“OsLEA3a多肽或其同源物”定义的序列不限于用SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：24、SEQID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36代表的序列，而是含有SEQ ID NO：3的共有记号序列，并且优选的还与SEQ ID NO：2具有至少42％序列同一性(使用Needleman-Wunsch算法，空位开放罚分为11且空位延伸罚分为1)的任何多肽可以适用于本发明的方法。然而，本文中使用的术语“OsLEA3a多肽或其同源物”并不包括SEQ ID NO：22(来自大麦的LEA3a)。优选的，多肽是来自稻的多肽。
术语“同源物”涵盖直系同源物序列和旁系同源物序列，这是同源性的两种特殊形式，涉及用于描述基因遗传关系的进化概念。旁系同源物是相同物种中由祖先基因复制产生的基因，直系同源物是在物种形成中产生的、来自不同生物体的基因。
直系同源物和旁系同源物可以通过实施所谓的交互blast搜索找到。这可以通过第一次BLAST进行，所述第一次BLAST包括针对任何序列数据库(如公众可用的NCBI数据库)对询问序列(例如SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2)进行BLAST。当起始于核苷酸序列时可以使用BLASTN或TBLASTX(使用标准缺省值)，当起始于蛋白质序列时可以使用BLASTP或TBLASTN(使用标准缺省值)。可以任选地过滤BLAST结果。之后将过滤结果或未过滤结果的全长序列针对询问序列所来源生物的序列进行反向BLAST(第二次blast)(当询问序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2时，第二次BLAST应该针对稻序列)。然后对第一次和第二次BLAST的结果进行比较。如果第二次BLAST的高级别命中(high-ranking hit)来自与询问序列所来源物种相同的物种时，就鉴定出了旁系同源物；如果高级别命中不是来自与询问序列所来源物种相同的物种时，就鉴定出了直系同源物。优选的直系同源物是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的直系同源物。高级别命中是具有低E值的。E值越低，分数越重要(或换言之，由于偶然发现造成命中的几率越低)。本领域熟知E值的计算。除了E值，比较还用同一性百分比评分。同一性百分比指在特定长度内两个相比较的核酸(或多肽)序列之间相同核苷酸(或氨基酸)的数目。优选的分值大于50，更优选的大于100；并且优选的E值小于e-5，更优选的小于e-6。在大家族的情况下，可以使用ClustalW，然后产生邻接树(neighbour joining tree)，帮助可视化相关基因的聚簇以及鉴定直系同源物和旁系同源物。SEQ ID NO：2的序列直系同源物的实例包括SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：22。SEQ ID NO：2的旁系同源物的实例包括SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：12。
优选的，本发明方法中使用的LEA3蛋白质的LEA 4结构域，按照增加的优选顺序，与SEQ ID NO：2的OsLEA3蛋白质具有至少40％、42％、45％、49％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。图4中显示的矩阵表示蛋白质全长的相似度和同一性(粗体)。倘若只比较了特定的结构域，不同蛋白质的同一性或相似度会更高。
可进行测定确定OsLEA3a的活性。为了确定LEA3蛋白质的活性，测定是本领域可用且已知的，例如，用Goyal等人描述了热胁迫和水胁迫测定(Biochem.J.388，151-157，2005)。
此外，植物中OsLEA3a蛋白质或其同源物的表达，特别是稻中的表达，与对照植物相比，具有增加转基因植物产量的效果，其中增加的产量包括至少以下之一：种子总重量，种子总数和饱满种子数。
OsLEA3a核酸/基因编码OsLEA3a多肽或其同源物。因此本文中定义的术语“OsLEA3a核酸/基因”是编码上述定义的OsLEA3a多肽或其同源物的任何核酸/基因。
OsLEA3a核酸的实例包括但不限于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：33中任一项所代表的那些。
OsLEA3a核酸/基因及其变体可适用于实施本发明的方法。本文中定义的术语“OsLEA3a核酸/基因或其变体”不包括编码SEQ ID NO：22(大麦的LEA3a)的核酸。优选的，OsLEA3a基因变体来自稻。变体OsLEA3a核酸/基因包括OsLEA3a核酸/基因的部分、剪接变体、等位基因变体和/或能够和OsLEA3a核酸/基因杂交的核酸。
本文中论及的“核酸序列”用于意指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物的任何长度的聚合形态，其可以是双链或单链或其类似物，该类似物具有天然核糖核苷酸的重要特征，因此它可以用类似天然存在的多核苷酸的方式与核酸序列杂交。
本文中定义的术语部分指的是编码多肽的DNA的片段，所述多肽包含两个对应于Pfam登录号PF02987或InterPro登录号IPR004238的LEA4结构域和(SEQ ID NO：3)的共有记号序列。通过对OsLEA3a核酸制造一个或多个缺失来制备其部分。部分可以以分离的形式使用或者例如，它们可以融合到其他编码(或非编码)序列以产生组合了一些活性的蛋白质。当融合到其他编码序列时，由翻译产生得到的多肽要比对OsLEA3a片段预测的多肽大。部分一般长度是至少100、150或200个核苷酸，优选的至少250、300或350个核苷酸长度，更优选的至少400、450或500个核苷酸长度，以及最优选的至少550或600个核苷酸长度。优选的，部分是由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：33中任一项所代表的核酸的一部分。最优选的OsLEA3a核酸的部分是SEQ ID NO：1代表的。
术语“片段”、“序列片段”或“序列部分”、“部分”或“其部分”指所述初始序列的截短的序列。截短的序列(核酸或蛋白质序列)长度可以差异很大；最小尺寸是为序列提供至少与初始序列相当的功能和/或活性的足够尺寸的序列，所述初始序列指本发明的核酸分子，或与本发明的核酸分子杂交，或在严格条件下用于本发明的过程，而最大尺寸不是关键的。在一些应用中，最大尺寸一般是基本上不大于提供需要的初始序列的活性和/或功能所需的。相当的功能指至少40％、45％或50％，优选的至少60％、70％、80％或90％或更高的初始序列的功能。
OsLEA3a核酸/基因的另一个变体是在降低的严格条件下，优选的在严格条件下，能够与本文定义的OsLEA3a核酸/基因、或本文定义的部分杂交的核酸，该杂交序列优选的编码包含两个对应于Pfam登录号PF02987或InterPro登录号IPR004238的LEA4结构域和(SEQ ID NO：3)的OsLEA3a共有记号序列的多肽。杂交序列一般长度至少300个核苷酸，优选的长度至少400个核苷酸，更优选的长度至少500个核苷酸，最优选的长度至少600个核苷酸。
优选的，杂交序列是能够与由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33代表的核酸，或上述序列中任一项的部分，上述所定义的部分杂交的序列之一。最优选的杂交序列能够杂交SEQ ID NO：1，或其部分(或探针)。本领域熟知设计探针的方法。探针一般长度小于1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp，优选的长度小于500bp、400bp、300bp、200bp或100bp。一般，DNA-DNA杂交如Southern印迹的探针长度在100和500bp之间变化，而探针中用于DNA-DNA杂交如在PCR扩增中的杂交区域一般短于50但长于10个核苷酸，优选的长度是15、20、25、30、35、40、45或50bp。
本文所定义的术语“杂交”是基本同源的互补核苷酸序列相互退火的过程。杂交过程可以完全发生在溶液中，即互补核酸都在溶液中。杂交过程还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于基质如磁珠、琼脂糖珠子或任何其他树脂上。此外杂交过程可还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于固相支持物如硝化纤维素膜或尼龙膜上，或通过例如照相平版印刷术固定到例如硅质玻璃支持物上(后者称之为核酸阵列或微阵列，或称之为核酸芯片)。为了使得杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链和/或从单链核酸中除去发夹或其他二级结构。
术语“严格”指杂交发生的条件。杂交的严格受到条件例如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成的影响。一般，低严格条件选择是大约比在确定的离子强度和pH下特异性序列的热解链温度(Tm)低约30℃。中等严格条件是当温度比Tm低20℃时并且高严格条件是当温度比Tm低10℃时。高严格杂交条件通常用于分离与靶标核酸序列具有高序列相似度的杂交序列。然而，由于遗传密码的简并性，序列上核酸可以不同并且仍然可以编码本质上相同的多肽。因此，有时需要中等严格杂交条件鉴别此类核酸分子。
Tm是在确定的离子强度和pH下，50％的靶标序列与完全匹配的探针杂交时的温度。Tm依赖于溶液条件、碱基组成以及探针的长度。例如，较长的序列在较高温度下特异杂交。杂交的最大速率是在低于Tm大约16℃到32℃下得到的。杂交溶液中一价阳离子的存在降低了两条核酸链之间的静电排斥，从而促进杂交体的形成；对于高达0.4M的钠浓度，这个作用是明显的(对于更高的浓度，可以忽略该效应)。甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6至0.7℃，加入50％的甲酰胺虽然使杂交速率降低，但使杂交在30至45℃进行。碱基对错配降低了杂交速率和双链体的热稳定性。一般对于大探针，每％碱基错配使Tm降低大约1℃。取决于杂交体的类型，Tm可以使用下列公式计算：
1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
Tm＝81.5℃+16.6×log10[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×[Lc]-1-0.61×％甲酰胺
2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交体：
Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
3)寡-DNA或寡-RNAd杂交体：
对于＜20个核苷酸：Tm＝2(ln)
对于20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)
a或对于其他一价阳离子，但是仅仅在0.01-0.4M的范围精确。
b仅仅对30％至75％范围的％GC精确。
cL＝双链体中碱基对的长度。
d寡，寡核苷酸；ln，引物的有效长度＝2×(G/C数目)+(A/T数目)。
用许多已知技术中的任一项都可以控制非特异性结合，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，在杂交缓冲液中添加异质性的RNA、DNA和SDS，用Rnase处理。对于非同源性的探针，通过变动(i)逐渐降低退火温度(例如从68℃至42℃)或(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)之一，可以实施一系列杂交。技术人员熟知在杂交中可以变动的多种参数，其将维持或者改变严格条件。
除了杂交条件，杂交的特异性一般也取决于杂交后洗涤的作用。为了移除非特异性杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低以及洗涤温度越高，洗涤的严格性越高。洗涤条件通常在杂交严格性或低于杂交严格性下进行。阳性杂交给出的信号是背景信号的至少两倍。总体上，对于核酸杂交测定或基因扩增检测方法恰当的严格条件如上述说明。也可以选择差不多的严格条件。技术人员熟知在洗涤中可以变动的多种参数，其将维持或者改变严格条件。
例如，对于长度超过50个核苷酸的DNA杂交体的典型高严格杂交条件包括在65℃1×SSC中或者42℃1×SSC和50％甲酰胺中杂交，然后在65℃0.3×SSC中洗涤。对于长度超过50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格杂交条件的实例包括在50℃4×SSC中或者40℃6×SSC和50％甲酰胺中杂交，然后在50℃2×SSC中洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当杂交已知序列的核酸时，可以通过比对序列和鉴定本文中描述的保守区域来测定杂交体长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交和洗涤可以另外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化的鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。
为了定义严格性水平的目的，通常参考Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York or to Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989并且每年更新)。
还可用于本发明的方法的核酸是编码SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列的同源物的核酸。
蛋白质的“同源物”涵盖相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，且与其所衍生自的未修饰蛋白质具有相似的生物学活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。
同源物可以是蛋白质“取代变体”的形式，即其中氨基酸序列中的至少一个残基已经被除去，并且不同的残基插入到它的位置上。氨基酸取代一般是单残基的，但是取决于对多肽构成的功能限制可以是成串的；插入片段通常是大约1到10个氨基酸残基。优选的，氨基酸取代包括保守性氨基酸取代。为了产生此类同源物，蛋白质的氨基酸可以被其他具有相似性质(如类似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向)的氨基酸所置换。保守性取代表是本领域所熟知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company和下表1)。
表1：保守性氨基酸取代的实例：
  残基   保守性取代   残基   保守性取代
  Ala   Ser   Leu   Ile；Val
  Arg   Lys   Lys   Arg；Gln
  Asn   Gln；His   Met   Leu；Ile
  Asp   Glu   Phe   Met；Leu；Tyr
  Gln   Asn   Ser   Thr；Gly
  Cys   Ser   Thr   Ser；Val
  Glu   Asp   Trp   Tyr
  Gly   Pro   Tyr   Trp；Phe
  His   Asn；Gln   Val   Ile；Leu
  Ile   Leu，Val
同源物还可以是蛋白质的“插入变体”的形式，即将其中一个或多个氨基酸残基引入到蛋白质中的预定位点。插入可包括N-端和/或C-端融合，以及单个或多个氨基酸的序列内插入。通常，氨基酸序列内的插入将小于N-或C-端的融合，约为1到10个残基的数量。N-或C-端融合蛋白质或肽的实例包括如用于酵母双杂交系统的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、
Figure A20068003406700271
Figure A20068003406700272
表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。
蛋白质“缺失变体”形式的同源物的特征在于从蛋白质除去一个或多个氨基酸。
使用本领域熟知的肽合成技术，如固相肽合成等等，或通过重组DNA操作，可以很容易的制备蛋白质的氨基酸变体(取代-、缺失-和/或插入-变体)。对DNA序列进行操作以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，在DNA的预定位点产生取代突变的技术是本领域技术人员熟知的，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，克利夫兰(Cleveland)，OH)、快速变换的定点诱变(加拿大圣地亚哥斯莱特基因公司(Stratagene，San Diego，CA))、PCR-介导的定点诱变或其他定点诱变方案。
本发明的方法还可以使用编码衍生物的核酸，所述衍生物为SEQ IDNO：2代表的多肽或其直系同源物或旁系同源物的衍生物。“衍生物”包括肽、寡肽、多肽，其与蛋白质天然存在形式的氨基酸序列(例如，如SEQ IDNO：2所示的)相比，可以包括用非天然存在的氨基酸残基取代氨基酸残基，或添加非天然存在的氨基酸残基。蛋白质的“衍生物”还包括肽、寡肽、多肽，其与多肽天然存在形式的氨基酸序列相比，可以包括天然存在的改变的(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、豆蔻酰化、硫酸化)氨基酸残基或非天然改变的氨基酸残基。与其所衍生自的氨基酸序列相比，衍生物还可包括一个或多个非氨基酸取代基或添加，例如与氨基酸序列共价或非共价结合的报道分子或其他配体，如结合以便于其检测的报道分子，以及相对于天然存在蛋白质的氨基酸序列而言非天然存在的氨基酸残基。
另一种可用于本发明方法的核酸变体是编码上述定义的OsLEA3a多肽的剪接变体。本文所用的术语“剪接变体”涵盖这样的核酸序列变体，即其中选定的内含子和/或外显子已经被切除、置换、替换或添加，或其中内含子已将被缩短或延长。这样的变体是其中上述蛋白质的生物学活性基本上保持的那些变体，其可以通过选择性的保留蛋白质的功能片段来获得。此类剪接变体可以是天然发现的或人造的。制备此类剪接变体的方法是本领域已知的。优选的剪接变体是编码包含OsLEA3a共有记号序列(SEQ IDNO：3)的多肽的核酸的剪接变体。优选的，OsLEA3a多肽或其同源物与SEQ ID NO：2具有至少42％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。更优选的是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：33代表的剪接变体。最优选的是SEQ ID NO：1代表的剪接变体。
另一种可用于本发明方法的核酸变体是上述定义的编码OsLEA3a多肽的核酸的等位变体。优选的等位变体是编码包含OsLEA3a共有记号序列(SEQ ID NO：3)，并且具有与SEQ ID NO：2至少42％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽的核酸。优选的，等位变体编码的多肽是SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23、SEQID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31和SEQ IDNO：33代表的。最优选的，编码OsLEA3a多肽的等位变体是SEQ ID NO：1代表的。等位变体天然存在，并且包括在本发明方法中的是这些天然等位基因的用途。等位变体包括单核苷酸多态性(SNP)以及小的插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多数生物天然存在的多态性品系中SNP和INDEL形成了最大的一类序列变体。
可用于本发明方法的其它核酸变体是用基因改组获得的核酸变体。还可以用基因改组或定向进化产生OsLEA3a核酸变体。这由下列组成：DNA改组的重复，随后是适当的筛选和/或选择，以生成具有修饰的生物学活性的OsLEA3核酸或其部分的变体(Castle等人，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
此外，定点诱变可用于产生OsLEA3核酸的变体。一些方法可用来实现定点诱变，最常用方法是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编著)。
OsLEA3a核酸或其变体可以来自任何天然来源或人造来源。可以从微生物来源如酵母或真菌，或者从植物、藻类或动物(包括人)来源中分离核酸/基因或其变体。可以通过严谨的人工操作在组成和/或基因组环境方面从其天然形式修饰这一核酸。核酸优选是植物来源的，可以是来自相同的植物物种(例如与其待引入的植物物种相同)或来自不同的植物物种。核酸可以分离自单子叶植物物种，优选的分离自禾本科，更优选的分离自稻。最优选的，OsLEA3a核酸是SEQ ID NO：1所代表的，并且OsLEA3a氨基酸序列是SEQ ID NO：2所代表的。
因此任何本文中论及的OsLEA3a多肽意指如上述定义的OsLEA3a蛋白质。任何编码此类OsLEA3a蛋白质的核酸都适用于本发明的方法。
根据本发明优选的方面，希望调节、优选的增加OsLEA3a核酸或其变体的表达。增加基因或基因产物表达的方法在本领域中详细记载并且包括例如用适当的启动子驱动的过量表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以将作用为启动子或增强子元件的分离的核酸引入至多核苷酸非异源形式的适当位置上(一般为上游)，从而上调OsLEA3a核酸或其变体的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代来体内改变内源启动子(参见Kmiec，美国专利5,565,350号；Zarling等人，PCT/US93/03868)，或者可以将分离的启动子以适当的方向和与本发明基因的距离引入植物细胞中，从而调控基因的表达。降低基因或基因产物表达的方法在本领域中有详细记载。
通过引入遗传修饰(优选的在OsLEA3a基因的基因座中)可以调节编码OsLEA3a多肽或其同源物的核酸的表达。本文中定义的基因的基因座意指包括目的基因和其编码区上游或下游10kb的基因组区域。
例如，遗传修饰可以通过以下任何一种(或多种)方法引入：TDNA激活、TILLING、定点诱变、定向进化和同源重组或者通过在植物中引入和表达编码OsLEA3a多肽或其同源物的核酸。在引入遗传修饰后，接下来的步骤是选择编码OsLEA3a多肽或其同源物的核酸的修饰表达，这种表达的修饰使得植物具有增加的产量。
T-DNA激活标签(Hayashi等人Science(1992)1350-1353)涉及在目标基因的基因组区域或基因编码区域上游或下游10kb中插入通常包含启动子(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA，如此构型以便启动子指引靶基因表达。通常，破坏靶基因天然启动子对其的表达调控，而使该基因处于新引入的启动子的控制之下。该启动子一般嵌入到T-DNA中。例如，这一T-DNA通过农杆菌属(Argobacterium)感染随机插入到植物基因组中，并导致靠近该插入T-DNA的基因过量表达。由于接近引入的启动子的基因过量表达，所得的转基因植物显示出显性表型。待引入的启动子可以是能指导基因在所需的生物体(在本案中为植物)中表达的任何启动子。例如，组成型、组织偏好的、细胞类型偏好的以及诱导型启动子都适合用于T-DNA激活。
也可以使用TILLING技术(靶向诱导基因组局部损害技术)，把遗传修饰引入到OsLEA3a基因的基因座中。这是一种诱变技术，可用于产生和/或鉴定，并且最终分离具有被调节的表达和/或活性的OsLEA3a核酸的诱变变体。TILLING还允许选择携带这类突变变体的植物。这些突变变体可以表现出在强度或位置或计时(timing)上被修饰的表达(例如如果突变影响启动子)。这些突变变体甚至可表现出比该基因的天然形式所表现出的更高的OsLEA3a活性。TILLNG将高密度诱变与高通量筛选方法结合起来。TILLING一般遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)In Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J，编著Singapore，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等人，(1994)In Meyerowitz EM，Somerville CR，编著，Arabidopsis.Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)In J Martinez-Zapater，J Salinas，编著，Methods on Molecular Biology，第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目标区域的PCR扩增；(d)变性和退火以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中库中异源双链体的存在检测为色谱图中额外的峰值；(f)鉴定突变个体；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域熟知的(McCallum等人，(2000)NatBiotechnol.18，455-457；由Stemple综述(2004)Nat Rev.Genet.5(2)，145-150，2004)。
定点诱变可用于产生OsLEA3a核酸变体。一些方法可用来实现定点诱变；最常用方法是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编著，www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。
定向进化也可以用来产生OsLEA3a核酸变体。这由下列组成：DNA改组的重复，随后是适当的筛选和/或选择，以产生OsLEA3a核酸或其部分的变体，所述变体编码具有修饰的生物学活性的OsLEA3a多肽或其同源物或其部分。(Castle等人，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
T-DNA激活、TILLING、定点诱变和定向进化是能够产生新的等位基因和OsLEA3a变体的技术的实例。
使用同源重组也可以产生本发明的效果，该方法能够在基因组的指定选择位置引入选定的核酸。同源重组是生物学中常规使用的标准技术，用于较低等的生物体如酵母或苔藓Physcomitrella。用于在植物中进行同源重组的方法不仅已在模式植物中描述(Offringa等人(1990)EMBO J.9(10)，3077-84)，而且在作物植物例如稻中描述(Terada等人，(2002)NatureBiotechnol.20(10)，1030-4；lida和Terada(2004)Curr.Opin.Biotechnol.15(2)，132-8)。
引入遗传修饰(在本案中不需要在OsLEA3a基因的基因座中)的优选方法是在植物中引入和表达编码OsLEA3a多肽或其同源物的核酸，如上文所定义的。待引入植物的核酸可以是全长核酸或上文定义的部分或杂交序列。
本发明还提供了遗传构建体和载体，以便于引入和/或表达可用于本发明方法中的核苷酸序列。
因此，本发明提供了基因构建体，其包含：
(i)上文定义的OsLEA3a核酸分子或其变体
(ii)能驱动(i)中核酸序列表达的一个或多个调控序列；
条件是所述OsLEA3a核酸或变体不编码SEQ ID NO：22(大麦的LEA3a蛋白质)。
可用于本发明方法的构建体可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术构建。基因构建体可插入到载体中，该载体可以是商购的，适于转化到植物中并适于在转化的细胞中表达目的基因。因此本发明提供了上文定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
使用包含目的序列(即编码OsLEA3a多肽或其同源物的核酸)的载体转化植物。技术人员熟知为了成功转化、选择和繁殖包含目的序列的宿主细胞，载体上必须存在的遗传元件。目的序列与一个或多个调控序列(至少与启动子)有效连接。术语“调节元件”、“调控序列”和“启动子”在文中都可以互换使用，且应当取其广义，是指能影响与它们连接的序列表达的调节核酸序列。术语“启动子”一般指位于基因转录起始上游的核酸调控序列，其参与识别和结合RNA聚合酶和其他蛋白质，从而指导有效连接的核酸的转录。上述术语包括来源于经典真核生物基因组基因的转录调节序列(包括精确转录起始所需的TATA框，带或不带CCAAT框序列)以及根据发育和/或外界刺激，或以组织特异性方式改变基因表达的另外的调节元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。该术语还包括经典原核基因的转录调节序列，在这种情况下它可以包括-35框序列和/或-10框转录调节序列。术语“调节元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其使得核酸分子能够在细胞、组织或器官中表达，激活或增强这种表达。如本文所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，使得启动子序列能起始目的基因的转录。
有利地，可以使用任何类型的启动子来驱动核酸序列的表达。启动子可以是诱导型启动子，即应答化学、环境或物理刺激而具有诱导的或增加的转录起始。诱导型启动子的实例是胁迫诱导型启动子，即当植物接触多种胁迫条件时激活的启动子，或病原体诱导型启动子。另外的或可选的，启动子可以是组织偏好的启动子，即能够优先在某些组织如叶、根、种子组织等中起始转录的；或者可以是遍在启动子，其基本上在生物的所有组织或细胞中由活性；或者启动子可以是发育调控的，从而在某些的发育阶段或在经历发育变化的植物部分中有活性。本文中“组织特异性”仅指能够在某些组织中起始转录的启动子。相似的，本文中“细胞特异性”仅指能够在某些细胞中起始转录的启动子。
在植物中有功能的合适启动子是普遍已知的。它们可以采用组成型或诱导型启动子的形式。合适的启动子可以使得在多细胞真核生物中发育特异性的和/或组织特异性的表达；因此，在植物中可以有利的使用叶-、根-、花-、种子-、气孔-、块茎-或果实-特异性的启动子。
在植物中使用的不同的植物启动子例如USP、LegB4-、DC3启动子或者欧芹的泛素启动子。
“植物”启动子包括介导编码序列片段在植物细胞中表达的调节元件。因此，植物启动子不必是植物来源的，也可以来源于病毒或微生物，特别是来自例如攻击植物细胞的病毒。
“植物”启动子还可以源自植物细胞，例如来自用发明过程中待表达和本文描述的核酸序列转化的植物。这也适用于其它“植物”调节信号，例如“植物”终止子。
对于在植物中表达，如前所述，核酸分子必需有效连接到或包含合适的启动子，所述启动子使得以细胞-或组织-特异性的方式在正确的时间点表达基因。可用的启动子是组成型启动子(Benfey等人，EMBO J.8(1989)2195-2202)，例如源自植物病毒的那些，例如35S CAMV(Franck等人，Cell 21(1980)285-294)、19S CaMV(也见美国5352605和WO84/02913)、34S FMV(Sanger等人，Plant.Mol.Biol.，14，1990：433-443)、欧芹泛素启动子，或者植物启动子例如在美国4,962,028中描述的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)小亚基启动子或植物启动子PRP1[Ward等人，Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、PGEL1、OCS[Leisner(1988)Proc NatlAcad Sci USA 85(5)：2553-2557]、lib4、usp、mas[Comai(1990)Plant MolBiol 15(3)：373-381)]、STLS1、ScBV(Schenk(1999)Plant Mol Biol39(6)：1221-1230)、B33、SAD1或SAD2(亚麻启动子，Jain等人，Crop Science，39(6)，1999：1696-1701)或nos(Shaw等人，(1984)Nucleic Acids Res.12(20)：7831-7846)。组成型植物启动子的其它实例是甜菜V-腺苷三磷酸酶(V-ATPase)启动子(WO 01/14572)。合成的组成型启动子的实例是Super启动子(WO 95/14098)和来自G-框的启动子(WO 94/12015)。如果合适，还可以使用化学诱导型启动子，对照EP-A 388186，EP-A 335528，WO 97/06268。在植物中稳定的、组成型的表达本发明的蛋白质是有利的。然而，诱导表达本发明的多肽是有利的，如果，例如在收获前的晚期表达是有利的，因为代谢操作可以导致植物生长延迟。
通过化学诱导型启动子也可以促进植物基因的表达(作为综述，参见Gatz 1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)。当需要以时间特异性方式表达基因时，化学诱导型启动子是特别合适的。这类启动子的实例是水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)、脱落酸诱导型启动子(EP 335 528)、四环素诱导型启动子(Gatz等人.(1992)Plant J.2，397-404)、环己醇-或乙醇诱导型启动子(WO 93/21334)或本文中描述过的其它启动子。
其它合适的启动子是那些与生物或非生物胁迫条件反应的启动子，例如病原体诱导型PRP1基因启动子(Ward等人，Plant.Mol.Biol.22(1993))、番茄热诱导型hsp80启动子(美国5,187,267)、马铃薯冷诱导型α淀粉酶启动子(WO 96/12814)或创伤-诱导型pinII启动子(EP-A-0 375 091)或本文中描述过的其它启动子。
优选的启动子特别是那些在组织和器官、种子细胞如胚乳细胞和发育胚细胞中引起基因表达的启动子。合适的启动子是欧洲油菜的油菜籽蛋白基因启动子(US 5,608,152)、蚕豆(Vicia faba)USP启动子(Baeumlein等人，Mol Gen Genet，1991，225(3)：459-67)、拟南芥属油质蛋白启动子(WO98/45461)、菜豆(Phaseolus vulgaris)菜豆蛋白启动子(US 5,504,200)、芸苔属Bce4启动子(WO 91/13980)、豆arc5启动子、胡萝卜DcG3启动子、或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等人，1992，Plant Journal，2(2)：233-9)，和在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等中引起种子特异性表达的启动子。有利的种子特异性启动子是蔗糖结合蛋白启动子(WO00/26388)、菜豆蛋白启动子和油菜籽蛋白启动子。必需考虑的合适启动子是大麦lpt2或lpt1基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)，以及WO99/16890中描述的启动子(大麦醇溶蛋白基因、稻谷蛋白基因、稻水稻素基因、稻谷醇溶蛋白(prolamin)基因、小麦麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、高粱kasirin基因和裸麦醇溶蛋白基因的启动子)。其它合适的启动子是Amy32b、Amy 6-6和Aleurain[美国5,677,474]、Bce4(欧洲油菜)[US 5,530,149]、大豆球蛋白(大豆)[EP 571741]、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(大豆)[JP 06/62870]、ADR12-2(大豆)[WO 98/08962]、异柠檬酸裂合酶(欧洲油菜)[US 5,689,040]或α-淀粉酶(大麦)[EP 781 849]。其它可以在植物中表达基因的启动子是例如在DE-A19644478中描述的叶特异性启动子或光调节启动子如豌豆petE启动子。
其它合适的植物启动子是胞质的FBPase启动子或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等人，EMBO J.8，1989，2445)、大豆磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶启动子(GenBank登录号U87999)或EP-A-0 249 676中描述的节特异性启动子。
优选的，OsLEA3a核酸或其变体有效的连接组成型启动子。组成型启动子是在大部分但并非必须全部的生长发育阶段以及在大多数环境条件下，在至少一个细胞、组织或器官中有转录活性的。优选的组成型启动子是也基本上遍在表达的组成型启动子。更优选的，组成型启动子源自植物，更优选的源自单子叶植物。最优选的是使用GOS2启动子(来自稻，由SEQID NO：6代表)。要明确的是本发明的适用性并不限于由SEQ ID NO：1所代表的OsLEA3a核酸，本发明的适用性也不限于由GOS2启动子所驱动的OsLEA3a核酸的表达。其他也可以用来驱动OsLEA3a核酸表达的组成型启动子的实例在下表2中显示。
表2：组成型启动子的实例
  基因来源   表达模式   参考文献
肌动蛋白 组成型   McElroy等人，PlantCell，2：163-171，1990
CAMV 35S 组成型   Odell等人，Nature，313：810-812，1985
CaMV 19S 组成型   Nilsson等人，Physiol.Plant.100：456-462，1997
GOS2 组成型   de Pater等人，Plant JNov；2(6)：837-44，1992
泛素 组成型   Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689，1992
稻亲环蛋白 组成型   Buchholz等人，PlantMol Biol.25(5)：837-43，1994
玉米H3组蛋白 组成型   Lepetit等人，Mol.Gen.Genet.231：276-285，1992
肌动蛋白2 组成型   An等人，Plant J.10(1)；107-121，1996
任选的，一个或多个终止子序列(还有调控序列)可用于引入植物的构建体中。术语“终止子”包括调控序列，其是位于转录单位末端的DNA序列，标志初级转录本的3′加工和聚腺苷酸化以及转录的终止。终止子可以源自天然基因，多种其它植物基因，或T-DNA。添加的终止子可以源自例如胭脂氨酸合成酶或章鱼碱合酶基因，或可选的来自另一种植物基因，或较少优选的来自任何其它真核基因。其他调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员知晓适合用于实施本发明的终止子和增强子序列。此类序列是已知的，或本领域技术人员可以很容易的获得。
还可以将内含子序列添加到5’非翻译区(UTR)或编码序列中以增加在细胞溶胶中聚集的成熟信息的量。已经表明在植物和动物表达构建体中的转录单位中包含可剪接的内含子能在mRNA和蛋白质水平上使基因表达增加达1000倍，Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8，4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1，1183-1200(1987)。当将内含子置于转录单位的5’端附近时，基因表达的此类内含子增强通常是最大的。本领域已知玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的用途。总体上参见TheMaize Handbook，116章，Freeling和Walbot编著，Springer，N.Y.(1994)。
其它调控序列(除了启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3′UTR和/或5′UTR区域)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。这类序列是本领域技术人员已知的或可以轻易获得的。
本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需要的复制原点序列。一个实例是需要遗传构建体在细菌细胞中作为附加型基因元件(如质粒或黏粒)维持的情况。优选的复制原点包括但不局限于f1-ori和colE1。
为了检测和/或选择在序列方案中描述和在本发明过程中使用的核酸序列的成功转移，使用标记基因(＝报告基因)是有利的。这些标记基因能够通过一系列不同的原理鉴定核酸分子的成功转移，所述原理例如通过借助于荧光、冷光或在人肉眼可区别的光波长范围内的视觉鉴定，通过对除草剂或抗生素的抗性，通过已知的营养标记(营养缺陷型标记)或抗营养标记，通过酶测定或通过植物激素。可以提及的这类标记的实例可以是GFP(＝绿色荧光蛋白)；萤光素/荧光素酶系统，β-半乳糖苷酶及其有色底物如X-Gal，对除草剂例如咪唑啉酮(imidazolinone)、草甘膦(glyphosate)、草胺膦(phosphinothricin)或磺酰脲的抗性，对抗生素例如博来霉素、潮霉素、链霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)，壮观霉素或杀稻瘟素的抗性(在此仅提出一些)，营养标记例如对甘露糖或木糖的利用，或抗营养标记例如对2-脱氧葡萄糖的抗性。该名单仅代表了一小部分可能的标记。技术人员非常熟悉这些标记。根据生物体和选择方法，优选不同的标记。
因此，遗传构建体任选地可包含选择标记基因。如本文所用，术语“选择标记”或“选择标记基因”包括赋予表达该基因细胞以表型，以便于鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体转染或转化的细胞的任何基因。合适的标记可选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，引入新的新陈代谢性状或允许可视选择的标记。选择标记基因的实例包括能赋予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox)，或提供新陈代谢性状的基因(如允许植物利用甘露糖作为唯一碳源的manA)。可视标记基因的表达导致颜色的形成(例如β-葡糖醛酸糖苷酶，GUS)、发光(如荧光素酶)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。
已知核酸被瞬时的或稳定的整合进植物细胞后，根据使用的表达载体和转染技术，仅有一小部分细胞摄取外源DNA，并且如果需要，将其整合进入基因组。为了鉴定和选择这些整合体，通常将编码选择标记(如上述的抗生素抗性)的基因和目的基因一起引入宿主细胞。植物中优选的选择标记包括赋予对除草剂如草甘膦或草丁膦(gluphosinate)抗性的那些。其它合适的标记是，编码在例如糖或氨基酸的生物合成途径中涉及的基因的标记，如β-半乳糖苷酶、ura3或ilv2。编码基因如荧光素酶、gfp或其他荧光基因的标记同样也是合适的。这类以及上述的标记可以在所述这些基因失去功能的突变体中使用，其中如用常规方法缺失这些基因。此外，将编码选择标记的核酸分子引入宿主细胞，所述选择标记可以是在包含编码本发明或过程中使用的多肽的序列的同一载体上，否则是位于分开的载体上。可以通过例如选择来鉴定稳定转染了引入的核酸的细胞(如整合了选择标记的细胞存活，而其它细胞死亡)。
由于一旦已经成功引入核酸，就不再需要或是在转基因宿主细胞中不希望有标记基因，特别是对抗生素和除草剂抗性的基因，因此，根据本发明引入核酸的过程有利的是使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。已知一种此类方法是共转化。共转化方法使用两个载体同时转化，一个载体带有本发明的核酸，第二个带有标记基因。转化体的大部分(高达40％及以上的转化体)接受，或者在植物的情况下，含有两个载体。对于用农杆菌转化的情况，转化体一般只接受载体的一部分，T-DNA侧翼的序列，其通常代表表达盒。然后可以通过实施杂交从转化植物去掉标记基因。在另一种方法中，使用整合到转座子中的标记基因与需要的核酸一起转化(已知为Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶源杂交或者用赋予转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定的转化转化体。在一些情况下(约10％)，一旦成功进行转化，转座子就跳出宿主细胞基因组并丢失。在其它一些情况下，转座子跳到不同的位置。在这类情况下，必须实施杂交消除标记基因。微生物学中，发展了使得此类事件检测成为可能、或促进检测的技术。其它有利的方法依靠已知的重组系统；其优势在于可以省却用杂交消除。该类型最有名的系统是已知的Cre/lox系统。Cre1是去掉位于loxP序列之间的序列的重组酶。如果标记基因整合在loxP序列之间，一旦成功进行了转化，通过表达重组酶就可以去除所述标记基因。其它重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等人，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等人，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。将根据本发明的核酸序列位点特异性的整合到植物基因组是可能的。这些方法自然也可以用于微生物如酵母、真菌或细菌。
本发明还涵盖了用本发明的方法可获得的植物、植物部分或植物细胞。因此，本发明提供了根据本发明的方法可获得的植物，该植物已在其中引入了上述定义的OsLEA3a核酸或其变体。
发明还提供了生产具有增加产量的转基因植物的方法，包括在植物中引入和表达上述定义的OsLEA3a核酸或其变体。
出于发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组体”意指在以下方面：例如核酸序列、表达盒(＝基因构建体)或含有核酸序列的载体或者转化了本发明的核酸序列、表达盒或载体的生物体，所有这些构建体都用重组方法产生，其中
a)根据本发明的核酸序列，或
b)有效连接根据本发明的核酸序列的遗传调控序列，例如启动子，或
c)a)和b)
中之一没有位于它们天然的遗传环境中或已经用重组方法修饰，可以采用例如取代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式进行修饰。天然遗传环境理解为意指在初始植物中的天然基因组或染色体的基因座或者存在于基因组文库中。对于基因组文库的情况，核酸序列的天然遗传环境优选的至少一部分保留。该环境位于核酸序列至少一侧的侧翼，序列长度至少为50bp，优选的至少500bp，特别优选的至少1000bp，最优选的至少5000bp。当下述表达盒用非天然、合成的(“人工的”)方法如诱变处理进行修饰时，天然存在的表达盒-例如核酸序列的天然启动子与对应的核酸序列间天然存在的组合(所述核酸序列编码具有LEA_4结构域的多肽或该多肽的同源物)-就成为了转基因表达盒。合适的方法描述在例如美国5,565,350或WO 00/15815中。
因此，出于本发明目的的转基因植物理解为意指，如上，本发明方法使用的核酸不是位于它们在所述植物基因组中的天然基因座上，核酸可以被同源的或异源的表达。然而，如上述，转基因还意指当根据本发明的或本发明方法中使用的核酸是位于它们在植物基因组中的天然位置上时，则该序列在天然序列方面已被修饰，和/或该天然序列的调节序列已被修饰。转基因优选的理解为意指根据本发明的核酸在基因组中非天然基因座的表达，即，进行核酸的同源或优选的，异源表达。优选的转基因植物在本文中论及。
根据本发明方法中使用的核酸或载体的宿主植物，表达盒或构建体或载体原则上有利的是所有植物，其能够合成本发明方法中使用的多肽。
更具体的，本发明提供了产生具有增加的产量的转基因植物的方法，该方法包括：
(i)在植物或植物细胞中引入和表达OsLEA3a核酸或其变体；并且
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
核酸可以直接引入到植物细胞或植物本身(包括引入到植物的组织、器官或任何其他部分)之中。根据本发明优选的特征，核酸优选通过转化引入植物中。
本文所涉及的术语“引入”或“转化”包括把外源多核苷酸向宿主细胞中的转移，而不管转移所用的方法如何。无论是通过器官发生还是胚胎发生能够随后克隆繁殖的植物组织，可以用本发明的遗传构建体转化，并从其再生出整株植物。选择的特定组织将根据可用于且最适于待转化的特定物种的克隆繁殖系统而不同。例示性的靶标组织包括叶圆盘、花粉、胚胎、子叶、下胚轴、雌配子体、愈伤组织、已存在的分生组织(例如，顶端分生组织，腋生的芽和根分生组织)以及诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定的被引入到宿主细胞中，并可保持非整合状态，例如，作为质粒。可选择的，它可以整合到宿主基因组中。以本领域技术人员所知的方法，所得的转化植物细胞然后可用来再生转化植物。
将外源基因转移到植物基因组被称为转化。为此描述的用于转化和从植物组织或植物细胞再生植物的方法被用于瞬时转化或稳定转化。有利的转化方法是in planta转化。为此目的，例如可以允许农杆菌作用于植物种子或用农杆菌接种植物分生组织。按照本发明已经证明将转化的农杆菌悬浮液作用于完整植株或至少作用于花原基是特别方便的。然后生长植物直到获得被处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。为了选择转化的植物，在转化中获得的植物材料通常是在选择性条件下，使转化的植物可以与未转化的植物区别开。例如，可以种植在上述方法中获得的种子，在初始生长阶段后，通过喷雾进行合适的选择。其它可能性在于在琼脂平板上使用合适的选择剂生长种子(如果合适在灭菌后)，使得只有转化的种子可以生长为植物。其它特别对植物有利的转化方法是技术人员已知的，并且描述在下文中。
植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利的，任何转化方法都可用于将目的基因引入到合适的祖代细胞中。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、能增加游离DNA摄入的化学品、直接注射DNA到植物中、基因枪轰击、使用病毒或花粉进行转化以及显微注射。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等人，(1982)Nature 296，72-74；Negrutiul等人(1987)Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生质体的电穿孔(Shillito R.D.等人，(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；显微注射到植物材料中(Crossway等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202，179-185)；DNA或RNA包被颗粒轰击(Klein TM等人，(1987)Nature 327，70)；用(非整合型)病毒感染等等。优选通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化使用任何用于稻转化的熟知方法生产转基因稻植物，所述的方法例如在任何以下文献中描述的方法：公开的欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人(Plant J.6(2)，271-282，1994)，其公开的内容以其全文在此引用作为参考。在玉米转化情形下，优选的方法如Ishida等人(Nat.Biotechnol.14(6)，745-50，1996)或Frame等人(Plant Physiol.129(1)，13-22，2002)中所述，其公开的内容以其全文在此引用作为参考。在B.Jenes等人，Techniques for Gene Transfer，在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization编著，S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143以及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)的实例中进一步描述了所述的方法。待表达的核酸或构建体优选的克隆到适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体中，例如pBin19(Bevan等人，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。然后可以以已知方法用该载体转化的农杆菌转化植物，特别是作物植物如作为示例，烟草植物，例如通过将擦伤的或切断的叶子浸浴在农杆菌溶液中，然后在合适的培养基上培养它们。通过根癌农杆菌转化植物描述在例如
Figure A20068003406700431
和Willmitzer，在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中，或从F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants中，第1卷，Engineering and Utilization，编著.S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页等中获知。
通常在转化以后，选择存在有与目的基因共转移的植物可表达基因所编码的一个或多个标记的植物细胞或细胞群，接着将转化的材料再生成整株植物。
如上所述，用根据本发明的表达载体转化的农杆菌也可以以本质上已知的方式用于转化植物如实验植物如拟南芥属或作物植物，例如谷类、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、大豆、稻、棉花、甜菜、油菜、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、胡萝卜、柿子椒、欧洲油菜、木薯(tapioca)、树薯(cassava)、葛根(arrow root)、万寿菊、苜蓿、莴苣和各种树、坚果和葡萄藤物种，特别是含油作物植物例如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、玉米、棉花、亚麻、欧洲油菜、椰子、油棕、红花(Carthamus tinctorius)或可可豆，例如在农杆菌溶液中浸浴受损的叶或叶段，然后在合适的培养基上培养它们。
除了随后再生成完整植株的体细胞转化外，还可以转化植物分生组织的细胞特别是那些发育成配子的细胞。在此情况下，转化的配子在天然的植物发育后，产生转基因植物。因此，例如，用农杆菌处理拟南芥属的种子并且从发育中的植物获得的种子，该植物的某些部分是被转化从而转基因的(Feldman，KA和Marks MD(1987).Mol Gen Genet 208：274-289；Feldmann K(1992).在：C Koncz，N-H Chua and J Shell，编著，Methods inArabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页)。备选方法是基于重复的去除荧光，并用转化的农杆菌孵育莲座中心的切除位点，籍此在后期类似的获得转化的种子(Chang(1994).Plant J.5：551-558；Katavic(1994).Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，特别有效的方法是真空渗入方法及其修正例如“花浸(floral dip)”方法。在拟南芥属的真空渗入的情况下，完整植株在降低的压力下用农杆菌悬浮液处理(Bechthold，N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199)，而在“花浸”方法的情况下，发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌悬浮液暂时孵育(Clough，SJ和Bent，AF(1998).The Plant J.16，735-743)。收获两种情况下的某些部分转基因种子，通过生长在上述选择性条件下区分这些种子与非转基因的种子。此外，细胞质体的稳定转化是有利的，因为细胞质体在大多数作物中是母体遗传的，这降低或消除了通过花粉的转基因流动(transgene flow)的风险。叶绿体基因组的转化一般通过在Klaus等人，2004[NatureBiotechnology 22(2)，225-229]中系统展示过的过程来实现。简言之，待转化的序列与选择性标记基因一起克隆到与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源的侧翼序列指导了位点特异性的整合到原质体系中。已经描述了用于多种不同植物种的质体转化，Bock(2001)Transgenic plastids inbasic research and plant biotechnology.J Mol Biol.2001年9月21；312(3)：425-38或者Maliga，P(2003)Progress towards commercialization ofplastid transformation technology.Trends Biotechnol.21，20-28中也给出了综述。现在其它生物技术进展已经报道了可以用瞬时共整合的标记基因生成无标记质体转化体的形式(Klaus等人，2004，Nature Biotechnology22(2)，225-229)。
可以通过技术人员熟悉的所有方法再生遗传修饰的植物细胞。在上述的S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或
Figure A20068003406700441
和Willmitzer的公开出版物中可以发现合适的方法。
DNA转移和再生之后，可评价推定转化植物中目的基因的存在、拷贝数和/或基因组结构，例如使用Southern分析。可选的或另外的，新引入DNA的表达水平可使用Northern和/或Western分析进行监控，两种技术都是本领域普通技术人员所熟知的。
产生的转化植物可通过多种方法进行繁殖，如通过克隆繁殖或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自花授精并且选择纯合的第二代(或T2)转化体，并且T2植物然后可进一步通过经典的育种技术进行繁殖。
产生的转化生物可以是多种形式的。例如，它们可以是转化细胞与非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，所有的细胞都被转化以含有表达盒)；转化与未转化组织的嫁接体(例如，在植物中，转化的根茎被嫁接到未转化的接穗中)。
本发明显然延及由文中描述的任何方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本发明还延及囊括由任何上述方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一的要求是该后代表现出与在本发明方法中由亲代产生的基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。本发明还包括含有分离的OsLEA3a核酸或其变体的宿主细胞。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。本发明还延及植物的可收获部分，例如但不限于种子、叶、果实、花、茎、茎培养物、根茎、块茎和鳞茎。本发明另外涉及直接来自此类植物的可收获部分的产物，如干的颗粒或粉、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。这些产物还包括以升高的水平存在的并具有经济价值的代谢物。
本发明还包括OsLEA3a核酸或其变体的用途，以及OsLEA3a多肽或其同源物的用途。
一种此类用途涉及改良植物的生长特性，尤其是改良产量，特别是种子产量。种子产量可以包括下列一种或多种：增加的种子总重量、增加的饱满种子数和增加的种子总数。
发现OsLEA3a核酸或其变体，或OsLEA3a多肽或其同源物可以在育种方案中用途，所述育种方案中鉴定了与OsLEA3a基因或其变体遗传连锁的DNA标记。OsLEA3a核酸/基因或其变体，或OsLEA3a多肽或其同源物可以用来定义分子标记。之后可以将此DNA或蛋白质标记用在育种方案中以选择具有增加的产量的植物。例如，OsLEA3a基因或其变体可以是由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：33中任一项代表的核酸。
还发现OsLEA3a核酸/基因的等位变体在标记辅助的育种方案中的用途。此类育种方案有时需要通过植物的诱变处理引入等位变异，例如使用EMS诱变；可选的，该方案可以开始于收集无意引起的“天然”来源的等位变体。之后通过例如PCR进行等位变体的鉴定。接着是选择步骤，用于选择所讨论序列的优良等位变体，其产生增加的产量。通常通过监控含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长特性来进行选择，所述不同等位变体例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：33中任一项的不同等位变体。监控生长特性可以在温室或野外进行。此外任选的步骤包括使已鉴定优良等位变体的植物与另一种植物杂交。例如，这可用于产生目标表型特征的组合。
OsLEA3a核酸或其变体还可用作探针，以对基因进行遗传和物理作图，这些基因是与之连锁的性状的一部分和标记。此类信息可用于植物育种，以开发具有所需表型的品系。OsLEA3a核酸或其变体的此类用途仅需要长度至少为15个核苷酸的核酸序列。OsLEA3a核酸或其变体可用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)MolecularCloning，A Laboratory Manual)可使用OsLEA3a核酸或其变体进行探测。然后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics1：174-181)对所得的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。此外，该核酸可用于探测Southern印迹，该Southern印迹含有代表亲本和确定的遗传杂交后代的一组个体的限制酶处理的基因组DNA。记录DNA多态性的分离，并用来计算OsLEA3a核酸或其变体在之前使用该群体获得的遗传图谱中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4，37-41，中描述了遗传作图中植物基因来源的探针的制备和用途。众多出版物描述了使用上述方法或其变通形式对特定的cDNA克隆进行遗传作图。例如，F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近等基因系及其他的个体组可用于作图。这类方法是本领域技术人员熟知的。
核酸探针也可用于物理作图(即将序列置于物理图上；参见Hoheisel等人，在：Non-mammalian Genomic Analysis：A Practical Guide，Academic press 1996，第319-346页，以及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)。虽然现在的FISH作图方法偏向于使用大的克隆(几个kb到几百kb；参见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)，但是灵敏度的提高允许使用较短的探针进行FISH作图。
遗传和物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸进行。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16，325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和制备引物对，以用于扩增反应或引物延伸反应。此类引物的设计是本领域技术人员所熟知的。在采用基于PCR的遗传作图方法中，有必要鉴定跨越了对应于此核酸序列区域作图的亲代之间的DNA序列差异。但是，这对作图方法通常不是必要的。
根据本发明的方法产生如上所述的具有增加的产量和改变的代谢型的植物。这些有利的生长特性也可与其他经济学上有利的性状组合，如进一步增产性状、对各种胁迫的耐受性、修饰各种结构特征和/或生化和/或生理学特征的性状。改变的代谢型可以发现用作表征具有增加产量的植物的替代途径，所述植物用本发明的方法制备。改变的代谢型还可以作为诊断工具或作为生物标记。
附图说明
本发明现将参考以下附图进行描述，其中：
图1显示了OsLEA3a多肽的典型结构域结构。由SEQ ID NO：2编码的蛋白质包含两个LEA_4结构域(粗体)；11-mer氨基酸基序用下划线表示。最C端的结构域(斜体)是低复杂性区域。
图2显示了二元载体p070，用于在稻中表达受到GOS2启动子控制下的拟南芥OsLEA3a编码序列(内部参考PRO0129)。
图3详述了可用于实施本发明方法的序列的实例。SEQ ID NO：1和2代表OsLEA3a编码序列和推论的蛋白质序列。SEQ ID NO：7至20代表其它稻LEA3a蛋白质的序列和编码序列，SEQ ID NO：21和22是大麦HVA1的序列。SEQ ID NO：4和5是用于克隆OsLEA3a的引物序列。SEQID NO：23至34代表来自非稻物种的LEA3同源物的编码序列和蛋白质序列。SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36分别是SEQ ID NO：14和SEQ IDNO：34的变体。SEQ ID NO：3代表共有记号序列。
图4代表用MATGAT(BLOSUM62矩阵，空位开放罚分为11，空位延伸罚分为1)产生的序列同一性/相似度表。对角线上方用粗体给出序列同一性，在对角线下方给出序列相似度。使用的是全长蛋白质序列。
实施例
本发明现将参考以下实施例进行描述，其仅仅是为了例证说明。
DNA操作：除非另外说明，否则重组DNA技术按照例如Sambrook(Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York，2001)或Ausubel等人(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols的卷1和2(http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)中描述的标准方案实施。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于R.D.D Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)，由BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)(BIOS科学出版有限公司)和Blackwell Scientific Publications(UK)(布莱克威尔科学出版社)出版。
实施例1：OsLEA3a的基因克隆
使用日本晴水稻(Oryza sativa japonica cv Nipponbare)幼苗cDNA文库(英俊公司(Invitrogen)，Paisley，UK)作为模板，PCR扩增稻OsLEA3a编码基因。对从幼苗提取的RNA进行反转录以后，把cDNA克隆到pCMVSport 6.0中。文库的平均插入大小为1.5kb，并且克隆的原始数为1.59×107cfu。原始滴度确定为9.6×105cfu/ml，并且在第一轮扩增以后变成6×1011cfu/ml。质粒提取以后，将200ng的模板用于50μl PCR混合物。用于PCR扩增的引物为prm06120(正向斜体表示AttB1位点，粗体表示起始密码子：5’ggggacaagttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcttcccaccagga-3’)(SEQ ID NO：4)和prm06121(反向，互补，斜体表示AttB2位点，粗体表示终止密码子：5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaaatcattcacggcgtctagt-3’)(SEQ ID NO 5)，其包含用于Gateway重组的AttB位点。使用Hifi Tag DNA聚合酶，在标准条件下进行PCR。同样使用标准方法扩增和纯化期望大小的PCR片段。然后进行Gateway方法的第一步，即BP反应，在此期间，PCR片段与pDONR201质粒体内重组以产生“进入克隆”(entry clone)”p06(根据Gateway术语)。质粒pDONR201作为Gateway
Figure A20068003406700491
技术的一部分购自英俊公司(Invitrogen)。
实施例2：载体构建
然后在LR反应中使用进入克隆p06和用于稻转化的目的载体(destination vector)p00640。该载体包含位于T-DNA边界内的以下部分作为功能性元件：植物选择性标记；可筛选的标记表达盒；旨在与已克隆到进入克隆中的目的序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达(PRO0129)的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：6)位于该Gateway盒的上游。
在LR重组步骤后，使用热击或电穿孔方法将获得的表达载体p07(图1)转化进农杆菌属菌株LBA4044。在YEP培养基中生长转化的菌落，并且用各自的抗生素选择，这在28℃进行2天。将这些农杆菌属培养物用于进行实施例3中描述的植物转化。
植物转化也可以使用其它根癌农杆菌菌株，其是本领域熟知的。这类菌株的实例是C58C1或EHA105。
实施例3：植物转化
稻转化
使用含有表达载体的农杆菌转化稻植物。将稻日本型栽培种日本晴(rice japonica cultivar Nipponbare)的成熟干燥种子脱壳。在70％乙醇中孵育1分钟，然后在0.2％HgCl2中孵育30分钟，然后用灭菌的蒸馏水洗15分钟共6次进行灭菌。将灭菌的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育4周后，切离胚胎发生的，盾盖衍生的愈伤组织并在同一培养基上繁殖。两周后，在相同培养基中传代培养另外2周以倍增或繁殖愈伤组织。在共培养之前，胚胎发生的愈伤组织片在新鲜培养基中传代培养3天(以增强细胞分裂活性)
共培养使用含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404。农杆菌接种在含有合适的抗生素的AB培养基上，28℃培养3天。然后收集细菌并悬浮在液体共培养培养基中达到大约1的密度(OD600)。然后，将悬浮液转移到培养皿中，并将愈伤组织浸入悬浮液15分钟。在滤纸上吸干愈伤组织，将其转移到固体共培养培养基中，在黑暗中25℃培养3天。在存在选择剂时，共培养的愈伤组织生长在含有2，4-D的培养基中，在黑暗中28℃培养4周。在这段时间内，发展出快速生长的抗性愈伤组织岛(callus island)。将这一材料转移到再生培养基并在光中孵育后，胚胎发生潜能释放并在之后的四到五周内发育枝条。从愈伤组织切离枝条并将其在含有生长素的培养基中孵育2至3周，然后将它们从所述培养基中转移到土壤中。变硬的枝条在温室中高湿度和短日照下生长。
一个构建体产生约35个独立的T0稻转化体。初级转化体从组织培养室转移到温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入片段的拷贝数后，只保留对选择试剂表现出耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。在移植三至五个月后收获种子。该方法提供单基因座转化体的比率超过50％(Aldemita和Hodges 1996，Chan等人，1993，Hiei等人，1994)。
玉米转化；
用Ishida等人(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法的修改方案实施玉米(Zea mays)转化。在玉米中转化是基因型依赖的并且只有特定的基因型才能转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188为亲本的杂种是转化供体材料的好来源，但是也可以成功使用其它基因型。授粉约11天后(DAP)，当未成熟胚胎的长度是约1至1.2mm时，从玉米植物中收获穗。共培养未成熟胚胎和含有表达载体的根癌农杆菌，并通过器官发生重新获得转基因植物。切离的胚依次生长在愈伤组织诱导培养基，和含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的玉米再生培养基上。培养板在光及25℃下孵育2-3周，或直到枝条发育。从每个胚中将新鲜枝条转移到玉米生根培养基上并且在25℃孵育2-3周，直到根发育。将生根的枝条移植到温室的土壤中。从表现出对选择剂耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入片段的植物中产生T1种子。
小麦转化
通过Ishida等人，(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50.中描述的方法实施小麦的转化。转化中常用栽培种Bobwhite(可从CIMMYT，Mexico(墨西哥)获得)。共培养未成熟胚和含有表达载体的根癌农杆菌，并且通过器官发生重新获得转基因植株。与农杆菌孵育后，胚依次体外生长在愈伤组织诱导培养基，和含有选择试剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的再生培养基上。培养板在光及25℃下孵育2-3周，或直到枝条发育。从每个胚中将新鲜枝条转移到生根培养基上并且在25℃孵育2-3周，直到根发育。将生根的枝条移植到温室的土壤中。从表现出对选择剂耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入片段的植物中产生T1种子。
大豆转化：
根据在Texas A&M专利US 5,164,310中描述的方法的修改方案转化大豆。一些商业的大豆品种可以通过该方法转化。栽培种Jack(得自伊利诺斯种子公司(tbe Illinois Seed foundation))通常用于转化。大豆种子被灭菌以用于体外播种。从七天大的幼苗中切除下胚轴，胚根和一个子叶。进一步培养上胚轴和剩下的子叶以发育腋结。这些腋结被切离并与含有表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培养处理后，外植体被洗涤并转移到选择培养基中。切离再生的枝条并置于枝条伸长培养基中。将长度不超过1cm的枝条至于生根培养基中直到根生长。将生根的枝条移植到温室的土壤中。从对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。
油菜籽/油菜转化：
将5-6天大的幼苗的子叶柄和下胚轴用作外植体用于组织培养并且根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)被转化。商业的栽培种(加拿大农业(Agriculture Canada))是用作转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。将油菜种子表面灭菌用于体外播种。从体外幼苗中切离附着了子叶的子叶柄外植体，并通过将叶柄外植体的切割端浸入细菌悬浮液中来用农杆菌(含有表达载体)接种。将外植体然后在含有3mg/l BAP、3％蔗糖，0.7％Phytagar的MSBAP-3培养基中在23℃，16小时光中培养2天。与农杆菌共培养2天后，将叶柄外植体转移到含有3mg/l BAP，头孢噻肟、羧苄青霉素、或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基中7天，并且然后在有头孢噻肟、羧苄青霉素、或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养直到枝条再生。当枝条5-10mm长时，将其切下并转移到枝条伸长培养基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/l BAP)中。将约2cm长的枝条转移到生根培养基(MS0)用于根诱导。将生根的枝条移植到温室的土壤中。从对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。
苜蓿转化；
利用(McKersie等1999 Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿(Medicago sativa)的再生克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖的，因此需要再生植株。获得再生植株的方法已被描述过。例如，这些可以选自栽培种Rangelander(加拿大农业(Agriculture Canada))或任何其它的如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture 4：111-112)描述过的商业苜蓿品种。可选的，RA3品种(威斯康辛大学(University of Wisconsin))被选择在组织培养中使用(Walker等，1978 AmJ Bot 65：654-659)。叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等，1999Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培养。将外植体在含有288mg/LPro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4，和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上在黑暗中共培养3天。将外植体在半强度Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并置于相同的SH诱导培养基中，该培养基不含有乙酰丁香酮但含有合适的选择剂和合适的抗生素以抑制农杆菌生长。数周后，体细胞胚转移到不含生长调节剂，不含抗生素，含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。将体细胞胚随后在半强度Murashige-Skoog培养基上萌发。生根的幼苗移植到盆中并在温室中生长。从对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝的T-DNA插入片段的植物产生T1种子。
实施例4：稻中在稻GOS2启动子控制下OsLEA3a表达的评估和结果
产生了大约15到20个独立的T0稻转化体。将初级转化体从组织培养室转移到温室中生长，并收获T1种子。5个事件得以保留，其中T1后代发生3∶1的转基因存在/缺乏分离。对于这些事件中的每一个，通过监控可视标记选择，选择了大约10个包含转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)，以及大约10个缺乏转基因的T1幼苗(失效合子)。将选择的T1植物转移到温室中。每个植物具有一个唯一的条形标签以将表型数据与对应植物明确联系起来。所选择的T1植物在10cm直径花盆的土壤中并在下列环境状态下生长：光周期＝11.5小时、日光强度＝30,000勒克斯或更多、日间温度＝28℃、夜间温度＝22℃、相对湿度＝60-70％。转基因植物和相应的失效合子在随机位置上并排生长。当心植物不受到任何胁迫。从播种期到成熟期，植物几次通过数字成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度取得数字图像(2048×1536像素，1千6百万色)。
地上面积(对应于多叶生物量)通过计数区别于背景的地上植物部分的像素的总数而确定。此值取同一时间点从不同的角度拍摄的照片的平均值并通过校准转换到由平方毫米表示的物理表面值(physical surfacevalue)。实验表明通过这种方法测量的地上植物面积与植物地上部分的生物量相关。
收获成熟的初级圆锥花序、装袋并贴上条码标签，然后在37℃烘箱中干燥三天。随后将圆锥花序脱粒并且收集所有的种子。使用鼓风装置将饱满外壳和空外壳分开。在分离后，使用可商购的计数仪器对两批种子进行计数。弃去空外壳。在分析天平上称重饱满外壳并且使用数字成像测量种子的截面积。此方法得到一组下列种子相关参数：
通过计数在分离步骤之后剩下的饱满外壳数确定饱满种子的数目。通过称量所有从植物中收获的饱满外壳来测量总的种子产量(总的种子重量)。通过计数从植株收获的外壳的数目测量每株植物的总种子数。从计数的饱满的种子数目和它们的总重推断得出千粒重(TKW)。收获指数定义为总种子重量和地上面积(mm2)之间的比值，再乘以因子106。将这些参数用图像分析软件从数字图像中自动获得并统计分析。个体种子参数(包括宽度、长度、面积、重量)用定制的装置测量得到，该装置由两个主要元件组成，即称重和成像装置，连接到图像分析软件。
将对不平衡设计进行修正的双因素ANOVA(方差分析)用作统计模型，用于植物表型特征的全面评估。对用该基因转化的所有植株的所有事件的所有测量参数进行F测验。进行F检验以检查基因对所有转化事件的效应，并检验基因的总效应，亦在此称之为“整体基因效应”。如果F检验的值显示数据具有显著性，那么结论是有“基因”效应，这意味着基因的存在或定位引起了效应。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F检验的5％概率水平。
为了检查基因在事件中的效应，即品系特异性效应，在每一事件中使用来自转基因植物和相应无效植物的数据集进行t检验。“无效植物”或“无效分离子”或“无效合子”是以与转基因植物相同的方式处理的，但是转基因已经从中分离的植物。也可以将无效植物描述为纯合的阴性转化植物。将t检验显著性的阈值设定为10％概率水平。一些事件的结果可以高于此阈值或低于此阈值。这是基于这种假设，即基因可能仅在基因组中的某些位置中具有效应，并且此位置依赖性效应的发生不是罕见的。本文中此类基因效应也称为“基因的线性效应(line effect of the gene)”。通过比较t值和t分布得到p值，或者通过比较F值和F分布得到p值。p值给出了零假设(即没有转基因的效应)为正确的概率。
将在第一个实验中得到的OsLEA3a数据在使用T2植物的第二个实验中证实。选择了具有正确表达模式的四个品系用于进一步分析。通过监控标记基因表达来筛选T1中的来自阳性植物(杂合子和纯合子)的几批种子。对于每一个所选事件，随后保存几批杂合种子用于T2评估。在每批种子中，在温室中种植等量的阳性和阴性植物用于评估。
将总数为120的OsLEA3a转化的植物在T2代中评估，即每一事件30株植物，其中15株转基因阳性，15株阴性。
由于进行了具有重叠事件的两个实验，进行组合分析。这可用于检查两个实验中效应的一致性，并且如果在这种情形下，其可用于从两个实验中收集证据从而增加结论的可信性。使用的方法是考虑到数据的多级结构(即实验-事件-分离子)的混合模型方法。P值通过比较似然比值测定和卡方分布得到。
实施例5：OsLEA3a转化体的评估：产量相关参数的测量
当对上述种子进行分析时，发明人发现用OsLEA3a基因构建体转化的植物比缺乏OsLEA3a转基因的植物具有更高的种子产量，以种子总数量(增加11％)，饱满种子数(增加21％)和种子总重量(增加25％)表示。T1代植物中得到的结果在表3中总结。
表3
  ％差异   p-值
  Nr饱满种子数   +21   0.0398
  种子总重量   +25   0.0296
这些阳性结果在T2代中再次得到。T2数据在与T1代结果的组合分析中进行再次评估，并且得到的p值显示观察到的效应是非常显著的。
实施例6：转化植物的代谢分析
转化了OsLEA3a的植物(如实施例1所描述)在如实施例4所描述的在温室中生长。在多种代谢物方面，通过下列程序确定依照本发明的改变的组成。
a)样品的均化
转移10至30个稻粒到塑料管中(Eppendorf(微量离心管)，Safe-Lock，2mL)，并且在液氮冷却下在球磨机(莱驰公司(Retsch))中用不锈钢球均化。
b)冻干
在实验过程中，小心操作通过冻干均化材料使样品或者保持在深度冷冻状态(-40℃以下)或者没有水，直到第一次和溶剂接触。样品被转移到预冷(-40℃)的冷冻干燥仪中。在主要的干燥阶段初始温度是-35℃和压力是0.120毫巴。在干燥过程中，在压力和温度程序后改变参数。12小时后最终的温度是+30℃并且最终压力是0.001至0.004毫巴。在关闭真空泵和制冷装置时，用空气(通过干燥管干燥)或氩气冲洗系统。
c)提取
在冲洗完冻干设备后，马上严格密封有冻干植物材料的管以保护材料免受空气湿度。为提取，在玻璃纤维提取套管(thimble)中称量50mg的一部分干的均化的植物材料并将其转移到5ml ASE装置(具有溶剂控制器(Solvent Controller)和AutoASE软件的加速溶剂提取器(AcceleratedSolvent Extractor)ASE 200(戴安公司))的提取柱体内。ASE装置(具有溶剂控制器和AutoASE软件的加速溶剂提取器ASE 200(戴安公司))的24个样品位置装满植物样品，包括用于质量控制测试的一些样品。
极性物质用大约10ml甲醇/水(80/20，v/v)在70℃和140巴压力，5分钟加热期，1分钟静态提取而被提取。更亲脂的物质用大约10ml甲醇/二氯甲烷(40/60，v/v)在70℃和140巴压力，5分钟加热期，1分钟静态提取而被提取。两种溶剂混合物被倒进相同的玻璃管中(离心管，50ml，装备有螺旋盖和可刺穿的隔膜用于ASE(DIONEX))。在溶剂中添加商业可得的内标，如核糖醇，L-甘氨酸-2，2-d2，L-丙氨酸-2，3，3，3-d4，甲硫氨酸-d3，精氨酸(13C)，色氨酸-d5，α-甲基吡楠葡萄糖苷甲基十九酸酯，甲基十一酸酯，甲基十三酸酯，甲基十五酸酯，甲基二十九酸酯。总的提取物与8ml水混合。扔弃植物样品的固体残渣和提取套管(sleeve)。摇晃提取物并且然后以最小1400g离心5至10分钟以加速相分离。移出1ml上层甲醇/水相(“极性相”，无色)用于气相色谱(GC)分析，并且移出1ml用于液相色谱(LC)分析。扔弃甲醇/水相的剩余物。类似地，移出0.75ml有机相(“脂相”，深绿)用于进一步地GC分析，并且移出0.75ml用于LC分析。所有的这些样品用IR Dancer红外线真空蒸发器(海蒂诗公司(Hettich))蒸发至干燥。蒸发过程中的最大温度不超过40℃。设备内的压力是10毫巴或更低。
d)加工脂和极性相用于LC/MS或LC/MS/MS分析
蒸发至干燥的脂提取物和极性提取物在流动相中继续用于LC分析。
e)LC-MS分析
在从安捷伦科技公司(Agilent Technologies，USA)商业可得的LC/MS系统上进行LC部分。取10μl极性提取物以200μl/分钟的流速注入系统。在色谱法中，分离柱(反相C18)保持在15℃。对于脂提取物，5μl以200μl/分钟的流速注入系统。分离柱(反相C18)保持在30℃。用梯度洗脱实施HPLC。在具有涡轮离子喷射源的应用生物系统公司(AppliedBiosystems)API 4000三级四极仪器上完成质谱分析。对于极性提取物，仪器在全扫描模式阴离子模式中从100-1000amu测量；而对于脂相，仪器在全扫描模式阳离子模式中从100-1000amu测量。
f)用于GC/MS分析的脂相衍生化
140μl氯仿，37μl盐酸(37％(重量)的HCl在水中)，320μl甲醇和20μl甲苯的混合物加入到蒸发的提取物中，用于转甲醇分解(transmethanolysis)。严格密封容器并在摇动的同时在100℃加热2小时。随后蒸发溶液直到残渣完全干燥。羰基的甲氧化(methoximation)通过在严格密封容器内与甲氧胺盐酸盐(5mg/ml在吡啶中，100ml在60℃进行1.5小时)反应完成。加入20μl奇数、直链脂肪酸溶液(从7至25个碳原子的脂肪酸每种0.3mg/mL和具有27，29和31个碳原子的脂肪酸每种0.6mg/mL在3/7(v/v)吡啶/甲苯中的溶液)作为时间标准。最后，用100μl的N-甲基-N-三甲基硅烷基-2，2，2-三氟乙酰胺(MSTFA)的衍生化在60℃进行30分钟，同样在密封容器中。在注入GC之前的终体积是220μl。
g)用于GC/MS分析的极性相衍生化
羰基的甲氧化(methoximation)通过在严格密封的容器内与甲氧胺盐酸盐(5mg/ml在吡啶中，50ml在60℃进行1.5小时)反应完成。加入10μl奇数、直链脂肪酸溶液(从7至25个碳原子的脂肪酸每种0.3mg/mL和具有27，29和31个碳原子的脂肪酸每种0.6mg/mL在3/7(v/v)吡啶/甲苯中的溶液)作为时间标准。最后，用50μl N-甲基-N-三甲基硅烷基-2，2，2-三氟乙酰胺(MSTFA)的衍生化在60℃进行30分钟，同样在密封容器中。在注入GC之前的终体积是110μl。
h)GC-MS分析
GC-MS系统由连接到安捷伦(Agilent)5973 MSD的安捷伦(Agilent)6890 GC组成。自动取样器是来自CTC的CompiPal或GCPal。根据样品材料和要分析的相分离步骤中分离的级分，商业可得的具有不同的含有0％直到35％的芳香部分的聚-甲基-硅氧烷固定相的毛细管分离柱(30m×0.25mm×0.25μm)被用于分析(例如：DB-1ms，HP-5ms，DB-XLB，DB-35ms，安捷伦科技公司(Agilent Technolo-gies))。多达1μL的终体积不分流注入并且具有从70℃至340℃的烘箱温度梯度(根据样品材料和来自相分离步骤的级分的具有不同的加热速率)，以实现充分的色谱分离和每个分析物峰中的扫描数。使用通常的GC-MS标准条件，例如具有名义上的1至1.7ml/分钟的恒流和氦气被用作流动相气体。电离作用通过具有70eV的电子碰撞进行，以2.5至3扫描/秒的扫描速率和标准调谐条件在从15至600的m/z范围内扫描。
i)多种植物样品的分析
样品在每一20个样品的个体系列中分析。在实验中，每个系列包含每个转基因品系的至少3个复制和至少3个各自的无效分离子品系植物作为对照。每一分析物的峰面积根据为植物确立的干重进行调整(标准化面积)。通过进一步针对对照的标准化计算比值。在实验中比值通过标准化面积除以相同系列中对照组的的相应数据的平均值而计算得到。得到的值作为占对照比值(ratio by control)。它们在系列之中是可比较的并且表明转基因植物的分析物浓度与对照组相差多少，所述对照组是给定的系列中各自的无效分离子品系植物。在之前进行了合适的对照以证明载体和转化步骤本身对植物代谢组成没有显著的影响。
不同植物的分析结果可以从下面的表4中看到：
表4：从OsLEA3a转化体得到的种子的分析结果，最小比和最大比是相对于对照植物的。
  代谢物种类   代谢物   最小比   最大比   方法
  氨基酸芳香-莽草酸家族(Amino    AcidsAromatic-ShikimateFamily)   色氨酸   2.4   2.6   LC
  芳香氨基酸-莽草酸家族   色氨酸   1.6   1.8   GC
  芳香氨基酸-莽草酸家族   苯丙氨酸   4.4   4.8   LC
  芳香氨基酸-莽草酸家族   苯丙氨酸   4.2   4.3   GC
  芳香氨基酸-莽草酸家族   酪氨酸   3.6   4.0   LC
  芳香氨基酸-莽草酸家族   酪氨酸   3.9   3.9   GC
  芳香氨基酸-莽草酸家族   莽草酸   5.5   6.3   GC
  芳香氨基酸-莽草酸家族   3.4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)   0.7   0.8   GC
  氨基酸Asp家族   甲硫氨酸   2.1   2.4   LC
  氨基酸Asp家族   甲硫氨酸   3.1   3.4   GC
  氨基酸Asp家族   苏氨酸   5.5   6.5   LC
  氨基酸Asp家族   高丝氨酸   2.5   2.6   GC
  氨基酸Asp家族   天冬氨酸   3.2   3.3   GC
  氨基酸Asp家族   异亮氨酸   5.6   5.6   GC
  氨基酸Glu家族   脯氨酸   1.6   2.8   LC
  氨基酸Glu家族   脯氨酸   2.4   2.4   GC
  氨基酸Glu家族   谷氨酰胺   6.4   7.7   LC
  氨基酸Glu家族   谷氨酰胺   5.0   5.9   GC
  氨基酸Glu家族   谷氨酸(Gluta mate)   1.9   2.1   LC
  氨基酸Glu家族   谷氨酸   2.4   2.6   GC
  氨基酸Glu家族   5-羟脯氨酸   3.5   3.6   GC
  氨基酸光呼吸及相关   半胱氨酸   1.9   2.2   GC
  氨基酸光呼吸及相关   丝氨酸   2.4   2.4   GC
  氨基酸Pyr家族   丙氨酸   2.7   2.7   GC
  氨基酸Pyr家族   亮氨酸   4.1   4.5   GC
  氨基酸Pyr家族   缬氨酸   5.9   6.1   GC
  类胡萝卜素   β-胡萝卜素   1.8   3.1   LC
  类胡萝卜素   隐黄素   6.7   9.5   LC
  类胡萝卜素   番茄红素   4.2   19.3   LC
  类胡萝卜素   玉米黄质   3.4   8.8   LC
  类胡萝卜素   紫黄质   1.8   2.2   LC
  类胡萝卜素   异戊烯焦磷酸   2.3   2.7   LC
  辅因子   辅酶Q9   1.3   1.5   LC
  脂肪酸代谢及相关   2-羟基-棕榈酸   0.8   0.9   GC
  脂肪酸代谢及相关   C16:trans[9]1   0.8   0.9   GC
  脂肪酸代谢及相关   花生酸(C20:0)   0.7   0.8   GC
  脂肪酸代谢及相关   花生酸(C20:[11.14.17]3)   0.3   0.4   GC
  脂肪酸代谢及相关   硬脂酸(C18:0)   0.8   0.9   GC
  有机酸   柠檬酸(citrate)   1.5   1.9   LC
  有机酸   柠檬酸   3.0   3.5   GC
  有机酸   延胡索酸(fumarate)   4.0   4.7   LC
  有机酸   延胡索酸   9.0   10.0   GC
  有机酸   苹果酸(malate)   6.4   7.6   LC
  有机酸   苹果酸   17.9   20.0   GC
  有机酸   丙酮酸(pyruvate)   2.1   2.5   LC
  有机酸   琥珀酸(succinate)   3.9   4.5   LC
  有机酸   琥珀酸   3.6   3.8   GC
  有机酸   甘油酸   2.5   2.6   GC
  有机酸   乙醇酸   1.4   1.7   LC
  有机酸   核糖酸   1.9   2.2   GC
  有机酸   三羟基丁酸，推论的   3.0   3.2   GC
  有机酸   烟酸   1.8   1.9   GC
  其它   γ-氨基丁酸(GABA)   18.6   20.6   GC
  酚类   阿魏酸   2.5   2.7   LC
  酚类   阿魏酸   1.4   1.7   GC
  酚类   奎尼酸   8.3   8.5   GC
  植物激素   茉莉酮酸   6.3   10.9   LC
  植物激素   水杨酸   1.7   1.8   LC
  植物固醇   胆固醇   1.3   1.5   GC
  植物固醇   豆甾烷醇   1.0   1.2   GC
  糖代谢   阿拉伯糖   1.3   1.3   GC
  糖代谢   果糖   3.3   3.6   GC
  糖代谢   葡萄糖   1.5   1.8   GC
  糖代谢   来苏糖   2.6   2.7   GC
  糖代谢   麦芽糖   2.0   2.5   GC
  糖代谢   蜜二糖   1.8   2.3   GC
  糖代谢   肌醇   4.5   4.7   GC
  糖代谢   棉子糖   3.3   3.6   GC
  糖代谢   水苏糖   1.6   2.8   LC
  糖代谢   蔗糖   0.8   0.8   GC
  糖代谢   赤藓糖   0.7   0.7   GC
  糖代谢   半乳糖   6.1   7.1   GC
  糖代谢   甘油醛   0.5   0.5   GC
  糖代谢   甘油-3-磷酸.极性部分   0.5   0.5   GC
  糖代谢   麦芽糖醇   1.7   2.1   GC
  糖代谢   麦芽三糖   2.2   2.5   GC
  生育酚及相关   β/γ-生育酚   1.7   2.9   LC
  生育酚及相关   δ-生育酚   2.0   4.2   LC
  生育酚及相关   α-生育三烯酚(tocotrienol)   0.3   0.5   LC
  生育酚及相关   β/γ-生育三烯酚   1.4   2.1   LC
  蜡成分   蜡酸(C26:0)   0.8   0.8   GC
列2显示分析的代谢物，列1给出了代谢物所属的代谢种类。列3和4显示最小和最大比，从此可以得到转基因植物和它们的野生型各自无效分离子对照品系之间在独立实验中发现的分析的代谢物增加或减少的范围。列4指出了分析方法(气相色谱分析或液相色谱分析)。该表显示占对照比值(ratio by control)值的范围在氨基酸组内是0.7和7.7之间；在类胡萝卜素组内是1.8和19.3之间；在辅因子组内是1.3和1.5之间；在脂肪酸和相关代谢物组内是0.3和0.9之间；在有机酸组内是1.4和20.0之间；在酚类组内是1.4和8.5之间；在植物激素和植物固醇组内是1.0和10.9之间；在糖代谢物组内是0.5和7.1之间；在生育酚和相关代谢物组内是0.3和4.2之间。
序列表
<110>克罗普迪塞恩股份有限公司(CropDesign N.V.)
<120>通过组3LEA表达的植物产量改良
<130>PF57950
<150>EP 05108483.8
<151>2005-09-15
<150>US 60/717,738
<151>2005-09-19
<160>36
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>603
<212>DNA
<213>稻(Oryza sativa)
<400>1
atggcttccc accaggacca ggctagctac cgcgccggcg agaccaaggc ccacaccgag  60
gagaaggcgg ggcaggtgat gggggcgagc aaggacaagg cgagcgaggc gaaggacagg  120
gcgtcggagg cggcggggca cgccgccggc aaggggcagg ataccaagga ggcgacgaag  180
gagaaggcgc aggcggcgaa ggagagggcg tcggagacgg cgcaggcggc gaaggacaag  240
acctccagca cgtcgcaggc ggcgagggac aaagccgccg agagcaagga ccagaccggc  300
ggcttcctcg gcgagaagac cgagcaggcc aagcagaagg ccgccgagac cgctggcgcc  360
gccaagcaga agaccgccga gacggcgcag tacaccaagg actctgccat cgccggcaag  420
gacaagaccg gcagcgtcct ccaacaggcg agtgagcagg tgaagagcac ggtggtcggc  480
gccaaggacg cggtgatgag cacgctgggg atgaccgaag acgaggccgg caccgacgac  540
ggcgccaaca aggacacctc tgccaccgcc gccgccacgg agacgacggc gagggatcac  600
tag                                                                603
<210>2
<211>200
<212>PRT
<213>稻
<400>2
Met Ala Ser His Gln Asp Gln Ala Ser Tyr Arg Ala Gly Glu Thr Lys
1               5                   10                  15
Ala His Thr Glu Glu Lys Ala Gly Gln Val Met Gly Ala Ser Lys Asp
            20                  25                  30
Lys Ala Ser Glu Ala Lys Asp Arg Ala Ser Glu Ala Ala Gly His Ala
        35                  40                  45
Ala Gly Lys Gly Gln Asp Thr Lys Glu Ala Thr Lys Glu Lys Ala Gln
    50                  55                  60
Ala Ala Lys Glu Arg Ala Ser Glu Thr Ala Gln Ala Ala Lys Asp Lys
65                  70                  75                  80
Thr Ser Ser Thr Ser Gln Ala Ala Arg Asp Lys Ala Ala Glu Ser Lys
                85                  90                  95
Asp Gln Thr Gly Gly Phe Leu Gly Glu Lys Thr Glu Gln Ala Lys Gln
            100                 105                 110
Lys Ala Ala Glu Thr Ala Gly Ala Ala Lys Gln Lys Thr Ala Glu Thr
        115                 120                 125
Ala Gln Tyr Thr Lys Asp Ser Ala Ile Ala Gly Lys Asp Lys Thr Gly
    130                 135                 140
Ser Val Leu Gln Gln Ala Ser Glu Gln Val Lys Ser Thr Val Val Gly
145                 150                 155                 160
Ala Lys Asp Ala Val Met Ser Thr Leu Gly Met Thr Glu Asp Glu Ala
                165                 170                 175
Gly Thr Asp Asp Gly Ala Asn Lys Asp Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ala
            180                 185                 190
Thr Glu Thr Thr Ala Arg Asp His
        195                 200
<210>3
<211>11
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>基序
<220>
<221>变体
<222>(2)..(2)
<223>/置换＝″Thr″/置换＝″Ala″/置换＝″Lys″
<220>
<221>变体
<222>(3)..(3)
<223>/置换＝″Glu″/置换＝″Asp″
<220>
<221>变体
<222>(5)..(5)
<223>/置换＝″Thr″
<220>
<221>变体
<222>(6)..(6)
<223>/置换＝″Lys″
<220>
<221>变体
<222>(7)..(7)
<223>/置换＝″Gln″/置换＝″Glu″
<220>
<221>变体
<222>(8)..(8)
<223>/置换＝″Arg″
<220>
<221>变体
<222>(10)..(10)
<223>/置换＝″Gly″/置换＝″Tyr″
<220>
<221>变体
<222>(11)..(11)
<223>/置换＝″Gly″
<400>3
Thr Ser Gln Ala Ala Arg Asp Lys Ala Ala Glu
1               5                   10
<210>4
<211>52
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>引物：prm06118
<400>4
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aaacaatggc ttcccaccag ga    52
<210>5
<211>50
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>引物：prm06119
<400>5
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta aatcattcac ggcgtctagt       50
<210>6
<211>2193
<212>DNA
<213>稻
<400>6
aatccgaaaa gtttctgcac cgttttcacc ccctaactaa caatataggg aacgtgtgct  60
aaatataaaa tgagacctta tatatgtagc gctgataact agaactatgc aagaaaaact  120
catccaccta ctttagtggc aatcgggcta aataaaaaag agtcgctaca ctagtttcgt  180
tttccttagt aattaagtgg gaaaatgaaa tcattattgc ttagaatata cgttcacatc  240
tctgtcatga agttaaatta ttcgaggtag ccataattgt catcaaactc ttcttgaata    300
aaaaaatctt tctagctgaa ctcaatgggt aaagagagag atttttttta aaaaaataga    360
atgaagatat tctgaacgta ttggcaaaga tttaaacata taattatata attttatagt    420
ttgtgcattc gtcatatcgc acatcattaa ggacatgtct tactccatcc caatttttat    480
ttagtaatta aagacaattg acttattttt attatttatc ttttttcgat tagatgcaag    540
gtacttacgc acacactttg tgctcatgtg catgtgtgag tgcacctcct caatacacgt    600
tcaactagca acacatctct aatatcactc gcctatttaa tacatttagg tagcaatatc    660
tgaattcaag cactccacca tcaccagacc acttttaata atatctaaaa tacaaaaaat    720
aattttacag aatagcatga aaagtatgaa acgaactatt taggtttttc acatacaaaa    780
aaaaaaagaa ttttgctcgt gcgcgagcgc caatctccca tattgggcac acaggcaaca    840
acagagtggc tgcccacaga acaacccaca aaaaacgatg atctaacgga ggacagcaag    900
tccgcaacaa ccttttaaca gcaggctttg cggccaggag agaggaggag aggcaaagaa    960
aaccaagcat cctcctcctc ccatctataa attcctcccc ccttttcccc tctctatata    1020
ggaggcatcc aagccaagaa gagggagagc accaaggaca cgcgactagc agaagccgag    1080
cgaccgcctt cttcgatcca tatcttccgg tcgagttctt ggtcgatctc ttccctcctc    1140
cacctcctcc tcacagggta tgtgcccttc ggttgttctt ggatttattg ttctaggttg    1200
tgtagtacgg gcgttgatgt taggaaaggg gatctgtatc tgtgatgatt cctgttcttg    1260
gatttgggat agaggggttc ttgatgttgc atgttatcgg ttcggtttga ttagtagtat    1320
ggttttcaat cgtctggaga gctctatgga aatgaaatgg tttagggtac ggaatcttgc    1380
gattttgtga gtaccttttg tttgaggtaa aatcagagca ccggtgattt tgcttggtgt    1440
aataaaagta cggttgtttg gtcctcgatt ctggtagtga tgcttctcga tttgacgaag    1500
ctatcctttg tttattccct attgaacaaa aataatccaa ctttgaagac ggtcccgttg    1560
atgagattga atgattgatt cttaagcctg tccaaaattt cgcagctggc ttgtttagat    1620
acagtagtcc ccatcacgaa attcatggaa acagttataa tcctcaggaa caggggattc    1680
cctgttcttc cgatttgctt tagtcccaga attttttttc ccaaatatct taaaaagtca    1740
ctttctggtt cagttcaatg aattgattgc tacaaataat gcttttatag cgttatccta    1800
gctgtagttc agttaatagg taatacccct atagtttagt caggagaaga acttatccga    1860
tttctgatct ccatttttaa ttatatgaaa tgaactgtag cataagcagt attcatttgg    1920
attatttttt ttattagctc tcaccccttc attattctga gctgaaagtc tggcatgaac    1980
tgtcctcaat tttgttttca aattcacatc gattatctat gcattatcct cttgtatcta    2040
cctgtagaag tttctttttg gttattcctt gactgcttga ttacagaaag aaatttatga    2100
agctgtaatc gggatagtta tactgcttgt tcttatgatt catttccttt gtgcagttct    2160
tggtgtagct tgccactttc accagcaaag ttc                                 2193
<210>7
<211>968
<212>DNA
<213>稻
<400>7
agccagtgca aatctgatcg atcaaggtaa tcgagcaaaa tccatcagag ttctaacatt    60
cgcgcgtgaa tttcgaggtt aatttttgaa gcttaggatc aatggcttcc caccaggacc    120
aggctagcta ccgcgccggc gagaccaagg cccacaccga ggagaaggcg gggcaggtga    180
tgggggcgag caaggacaag gcgagcgagg cgaaggacag ggcgtcggag gcggcggggc    240
acgccgccgg caaggggcag gataccaagg aggcgacgaa ggagaaggcg caggcggcga    300
aggagagggc gtcggagacg gcgcaggcgg cgaaggacaa gacctccagc acgtcgcagg    360
cggcgaggga caaagccgcc gagagcaagg accagaccgg cggcttcctc ggcgagaaga    420
ccgagcaggc caagcagaag gccgccgaga ccgctggcgc cgccaagcag aagaccgccg    480
agacggcgca gtacaccaag gactctgcca tcgccggcaa ggacaagacc ggcagcgtcc    540
tccaacaggc gagtgagcag gtgaagagca cggtggtcgg cgccaaggac gcggtgatga    600
gcacgctggg gatgaccgaa gacgaggccg gcaccgacga cggcgccaac aaggacacct    660
ctgccaccgc cgccgccgcg gagacgacgg cgagggatca ctagacgccg tgaatgattt    720
ccctttgggt ctatttatgt atgttttcac ttcaaattcg gtgcaagttt gaatttgttt    780
ttgtgtcgtt ttgagtctgt atcgatgctg tatgaagtgg tggtcgtcgc aggggaggat    840
ttctgacggg tgtgggtgat gtgtactgat gatgttcagt tgttttcgtc agagtttctc    900
gtctgtgttc tgtttattat ggcgtaacaa taataaaagt ttgggcctaa agcccgcatt    960
tgtggttt                                                             968
<210>8
<211>200
<212>PRT
<213>稻
<400>8
Met Ala Ser His Gln Asp Gln Ala Ser Tyr Arg Ala Gly Glu Thr Lys
1               5                   10                  15
Ala His Thr Glu Glu Lys Ala Gly Gln Val Met Gly Ala Ser Lys Asp
            20                  25                  30
Lys Ala Ser Glu Ala Lys Asp Arg Ala Ser Glu Ala Ala Gly His Ala
        35                  40                  45
Ala Gly Lys Gly Gln Asp Thr Lys Glu Ala Thr Lys Glu Lys Ala Gln
    50                  55                  60
Ala Ala Lys Glu Arg Ala Ser Glu Thr Ala Gln Ala Ala Lys Asp Lys
65                  70                  75                  80
Thr Ser Ser Thr Ser Gln Ala Ala Arg Asp Lys Ala Ala Glu Ser Lys
                85                  90                  95
Asp Gln Thr Gly Gly Phe Leu Gly Glu Lys Thr Glu Gln Ala Lys Gln
            100                 105                 110
Lys Ala Ala Glu Thr Ala Gly Ala Ala Lys Gln Lys Thr Ala Glu Thr
        115                 120                 125
Ala Gln Tyr Thr Lys Asp Ser Ala Ile Ala Gly Lys Asp Lys Thr Gly
    130                 135                 140
Ser Val Leu Gln Gln Ala Ser Glu Gln Val Lys Ser Thr Val Val Gly
145                 150                 155                 160
Ala Lys Asp Ala Val Met Ser Thr Leu Gly Met Thr Glu Asp Glu Ala
                165                 170                 175
Gly Thr Asp Asp Gly Ala Asn Lys Asp Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ala
            180                 185                 190
Ala Glu Thr Thr Ala Arg Asp His
        195                 200
<210>9
<211>966
<212>DNA
<213>稻
<400>9
gatcaagata atcgagcaaa atccatcaga gttctaacat tcgcgcgtga atttcgaggt    60
taatttttga agcttaggat caatggcttc ccaccaggac caggctagct accgcgccgg    120
cgagaccaag gcccacaccg aggagaaggc ggtgcaggtg atgggggcga gcaaggacaa    180
ggcgagcgag gcgaaggaca gagcgtcgga ggcggcggtg cacgccgccg gcaaggggca    240
ggataccaag gaggcgacga aggagaaggc gcaggcggcg aaggagaggg cgtcggagac    300
ggcgcaggcg gcgaaggaca agacctccgg cacggcgcag gcggcgaggg acaaagccgc    360
cgagagcaag gaccagaccg gcggcttcct cggcgagaag accgagcagg ccaagcagaa    420
ggccgccgag accgctggcg ccgccaagca gaagaccgcc gagacggcgc agtacaccaa    480
ggactctgcc atcgccggca aggacaagac cggcagcgtc ctccaacagg cgagtgagca    540
ggtgaagagc acggtggtcg gcgccaagga cgcggtgatg agcacgctgg ggatgaccga    600
agacaaggcc ggcaccgacg acggcgccaa caaggacacc tctgccaccg ccgccgccac    660
ggagacgacg gcgagggatc actagacgcc gtgaatgatt tccctttggg tctatttatg    720
tatgttttca cttcaaattc ggtgcaagtt tgaatttgtt tttgtgtcgt tttgagtctg    780
tatcgatgct gtatgaagtg gtggtcgtcg caggggagga tttctgacgg gtgtgggtga    840
tgtgtactga tgatgttcag ttgttttcgt cagagtttct cgtctgtgtt ctgtttatta    900
tggcgtaaca ataataaaag tttgggccta aagcccgcat ttgtggttta aaaaaaaaaa    960
aaaaaa                                                               966
<210>10
<211>200
<212>PRT
<213>稻
<400>10
Met Ala Ser His Gln Asp Gln Ala Ser Tyr Arg Ala Gly Glu Thr Lys
1               5                   10                  15
Ala His Thr Glu Glu Lys Ala Val Gln Val Met Gly Ala Ser Lys Asp
            20                  25                  30
Lys Ala Ser Glu Ala Lys Asp Arg Ala Ser Glu Ala Ala Val His Ala
        35                  40                  45
Ala Gly Lys Gly Gln Asp Thr Lys Glu Ala Thr Lys Glu Lys Ala Gln
    50                  55                  60
Ala Ala Lys Glu Arg Ala Ser Glu Thr Ala Gln Ala Ala Lys Asp Lys
65                  70                  75                  80
Thr Ser Gly Thr Ala Gln Ala Ala Arg Asp Lys Ala Ala Glu Ser Lys
                85                  90                  95
Asp Gln Thr Gly Gly Phe Leu Gly Glu Lys Thr Glu Gln Ala Lys Gln
            100                 105                 110
Lys Ala Ala Glu Thr Ala Gly Ala Ala Lys Gln Lys Thr Ala Glu Thr
        115                 120                 125
Ala Gln Tyr Thr Lys Asp Ser Ala Ile Ala Gly Lys Asp Lys Thr Gly
    130                 135                 140
Ser Val Leu Gln Gln Ala Ser Glu Gln Val Lys Ser Thr Val Val Gly
145                 150                 155                 160
Ala Lys Asp Ala Val Met Ser Thr Leu Gly Met Thr Glu Asp Lys Ala
                165                 170                 175
Gly Thr Asp Asp Gly Ala Asn Lys Asp Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ala
            180                 185                 190
Thr Glu Thr Thr Ala Arg Asp His
        195                 200
<210>11
<211>603
<212>DNA
<213>稻
<400>11
atggcttccc accaggacca ggctagctac cgcgccggcg agaccaaggc ccacaccgag    60
gagaaggcgg ggcaggtgat gggggcgagc aaggacaagg cgagcgaggc gaaggacagg    120
gcgtcggagg cggcggggca cgccgccggc aaggggcagg ataccaagga ggcgacgaag    180
gacaaggcgc aggcggcgaa ggatagggcg tcggagacgg cgcaggcggc gaaggacaag    240
acctccagca cgtcgcaggc ggcgagggac aaagccgccg agagcaagga ccagaccggc    300
ggcttcctcg gcgagaagac cgagcaggcc aagcagaagg ccgccgagac cgctggcgcc    360
gccaagcaga aaacccccga gacggcgcag tacaccaagg actctgccat cgccggcaag    420
gacaagaccg gcagcgtcct ccaacaggcg agtgagcagg tgaagagcac ggtggtcggc    480
gccaaggacg cggtgatgag cacgctgggg atgaccgaag acgaggccgg caccgacgac    540
ggcgccaaca aggacacctc tgccaccgcc gccgccacgg agacgacggc gagggatcac    600
tag                                                                  603
<210>12
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<213>稻
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Met Ala Ser His Gln Asp Gln Ala Ser Tyr Arg Ala Gly Glu Thr Lys
1               5                   10                  15
Ala His Thr Glu Glu Lys Ala Gly Gln Val Met Gly Ala Ser Lys Asp
            20                  25                  30
Lys Ala Ser Glu Ala Lys Asp Arg Ala Ser Glu Ala Ala Gly His Ala
        35                  40                  45
Ala Gly Lys Gly Gln Asp Thr Lys Glu Ala Thr Lys Asp Lys Ala Gln
    50                  55                  60
Ala Ala Lys Asp Arg Ala Ser Glu Thr Ala Gln Ala Ala Lys Asp Lys
65                  70                  75                  80
Thr Ser Ser Thr Ser Gln Ala Ala Arg Asp Lys Ala Ala Glu Ser Lys
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Asp Gln Thr Gly Gly Phe Leu Gly Glu Lys Thr Glu Gln Ala Lys Gln
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Lys Ala Ala Glu Thr Ala Gly Ala Ala Lys Gln Lys Thr Pro Glu Thr
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Ala Gln Tyr Thr Lys Asp Ser Ala Ile Ala Gly Lys Asp Lys Thr Gly
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Ser Val Leu Gln Gln Ala Ser Glu Gln Val Lys Ser Thr Val Val Gly
145                 150                 155                 160
Ala Lys Asp Ala Val Met Ser Thr Leu Gly Met Thr Glu Asp Glu Ala
                165                 170                 175
Gly Thr Asp Asp Gly Ala Asn Lys Asp Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ala
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Thr Glu Thr Thr Ala Arg Asp His
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Met Ala Ser Gln Gln Glu Arg Ala Ser Tyr His Ala Gly Glu Thr Lys
1               5                   10                  15
Ala His Ala Glu Glu Lys Thr Gly Arg Met Met Gly Thr Ala Gln Glu
            20                  25                  30
Lys Ala Arg Glu Ala Lys Asp Thr Ala Ser Asp Ala Ala Gly Arg Ala
        35                  40                  45
Met Gly Arg Gly His Gly Ala Lys Glu Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr
    50                  55                  60
Glu Thr Lys Asp Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr Glu Ala Lys Asp Ala
65                  70                  75                  80
Ala Ser Asp Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Lys Gly Arg Gly Ala Ala
                85                  90                  95
Gly Ala Thr Arg Asp Lys Ala Tyr Asp Ala Lys Asp Arg Ala Ala Asp
            100                 105                 110
Thr Ala Gln Ser Ala Ala Asp Arg Ala Arg Asp Gly Ala Gly Gln Thr
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Gly Ser Tyr Ile Gly Gln Thr Ala Glu Ala Ala Lys Gln Lys Ala Ala
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Gly Ala Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Thr Ala Ile Ala Gly Lys Asp Lys
145                 150                 155                 160
Thr Gly Ala Val Leu Gln Gln Ala Gly Glu Gln Val Lys Ser Val Ala
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Val Gly Ala Lys Asp Ala Val Met Tyr Thr Leu Gly Met Ser Gly Asp
            180                 185                 190
Asn Lys Asn Asn Ala Ala Ala Gly Lys Asp Thr Ser Thr Tyr Lys Pro
        195                 200                 205
Gly Thr Gly Ser Asp Tyr Gln
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<213>稻
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gagtgtgtgt gactcgatcc agcgtagttt cagttcgtgt gttggtgagt gattccagcc    120
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gcgaccaagg agaaggcgta cgagaccaag gacgcgacca aggagaaggc gtacgaggca    360
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gccgaccgcg cccgcgacgg cgccgggcag accgggagct acattggaca gaccgccgag    540
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Met Ala Ser Gln Gln Glu Arg Ala Ser Tyr His Ala Gly Glu Thr Lys
1               5                   10                  15
Ala Arg Ala Glu Glu Lys Thr Gly Arg Met Met Gly Thr Ala Gln Glu
            20                  25                  30
Lys Ala Arg Glu Ala Lys Asp Thr Ala Ser Asp Ala Ala Gly Arg Ala
        35                  40                  45
Met Gly Arg Gly His Gly Ala Lys Glu Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr
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Glu Thr Lys Asp Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr Glu Ala Lys Asp Ala
65                  70                  75                  80
Ala Ser Asp Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Lys Gly Arg Gly Ala Ala
                85                  90                  95
Gly Ala Thr Arg Asp Lys Ala Tyr Asp Ala Lys Asp Arg Ala Ala Asp
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Thr Ala Gln Ser Ala Ala Asp Arg Ala Arg Asp Gly Ala Gly Gln Thr
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Gly Ser Tyr Ile Gly Gln Thr Ala Glu Ala Ala Lys Gln Lys Ala Ala
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Gly Ala Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Thr Ala Ile Ala Gly Lys Asp Lys
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Thr Gly Ala Val Leu Gln Gln Ala Gly Glu Gln Val Lys Ser Val Ala
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Val Gly Ala Lys Asp Ala Val Met Tyr Thr Leu Gly Met Ser Gly Asp
            180                 185                 190
Asn Lys Asn Asn Ala Ala Ala Gly Lys Asp Thr Ser Thr Tyr Lys Pro
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Gly Thr Gly Ser Asp Tyr Gln
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<213>稻
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<213>稻
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Met Ala Ser Gln Gln Glu Arg Ala Ser Tyr His Ala Gly Glu Thr Lys
1               5                   10                  15
Ala Arg Ala Glu Glu Lys Thr Gly Arg Met Met Gly Thr Ala Gln Glu
            20                  25                  30
Lys Ala Arg Glu Ala Lys Asp Thr Ala Ser Asp Ala Ala Gly Arg Ala
        35                  40                  45
Met Gly Arg Gly His Gly Ala Lys Glu Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr
    50                  55                  60
Glu Thr Lys Asp Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr Glu Ala Lys Asp Ala
65                  70                  75                  80
Ala Ser Asp Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Lys Gly Arg Gly Ala Ala
                85                  90                  95
Gly Ala Thr Arg Asp Lys Ala Tyr Asp Ala Lys Asp Arg Ala Ala Asp
            100                 105                 110
Thr Ala Gln Ser Ala Ala Asp Arg Ala Arg Asp Gly Ala Gly Gln Thr
        115                 120                 125
Gly Ser Tyr Ile Gly Gln Thr Ala Glu Ala Ala Lys Gln Lys Ala Ala
    130                 135                 140
Gly Ala Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Thr Ala Ile Ala Gly Lys Asp Lys
145                 150                 155                 160
Thr Gly Ala Val Leu Gln Gln Ala Gly Glu Gln Val Lys Ser Val Ala
                165                 170                 175
Val Gly Ala Lys Asp Ala Val Met Tyr Thr Leu Gly Met Ser Gly Asp
            180                 185                 190
Asn Lys Asn Asn Ala Ala Ala Gly Lys Asp Thr Ser Thr Tyr Lys Pro
        195                 200                 205
Gly Thr Gly Ser Asp Tyr Gln
    210                 215
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<211>978
<212>DNA
<213>稻
<400>19
aagaggcaag agcatccgta ttaaccagcc ttttgagact tgagagtgtg tgtgactcga    60
tccagcgtag tttcagttcg tgtgttggtg agtgattcca gccaagtttg cgatggcttc    120
tcagcaggaa cgggctagct accacgccgg cgagaccaag gcccgcgccg aggagaagac    180
ggggcgcatg atgggcacgg cgcaggagaa ggcgcgggag gccaaggaca cggcgtccga    240
cgccgcgggg cgcgcgatgg gcaggggaca cggcgccaag gaggcgacca aggagaaggc    300
gtacgagacc aaggacgcga ccaaggagaa ggcgtacgag gcaaaggacg cggcctccga    360
cgccaccggc cgcgccatgg acaagggccg cgccgcgggc gccacgaggg acaaggcgta    420
cgatgccaag gacagggcgg ctgacacggc gcagtccgcc gccgaccgcg cccgcgacgg    480
cgccgggcag accgggagct acattggaca gaccgccgag gccgccaagc agaaagcggc    540
cggcgccgcg cagtacgcca aggagaccgc gatcgccggc aaggacaaga ccggcgccgt    600
gctccagcag gcaggggagc aggtgaagag cgtggcggtg ggggcgaagg acgcggtgat    660
gtacacgctc gggatgtcag gcgataacaa gaacaacgcc gctgccggca aggacaccag    720
cacctacaag cctggaactg ggagtgacta ccagtaatac ggtagaagaa gcatgtgtcg    780
tctttggcac tgatgccaaa gtgtacgtgt tgtatcctct tttttaagtt tcagctcgac    840
ttcgacgtgt tcggtgtcac actttggttt ttcagttgtg ctcaactgtt catgtttctg    900
gttccatgga gggccagtgt ggaggtcaat gtttaagctt tcgttttaaa atctgataat    960
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<212>PRT
<213>稻
<400>20
Met Ala Ser Gln Gln Glu Arg Ala Ser Tyr His Ala Gly Glu Thr Lys
1               5                   10                  15
Ala Arg Ala Glu Glu Lys Thr Gly Arg Met Met Gly Thr Ala Gln Glu
            20                  25                  30
Lys Ala Arg Glu Ala Lys Asp Thr Ala Ser Asp Ala Ala Gly Arg Ala
        35                  40                  45
Met Gly Arg Gly His Gly Ala Lys Glu Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr
    50                  55                  60
Glu Thr Lys Asp Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr Glu Ala Lys Asp Ala
65                  70                  75                  80
Ala Ser Asp Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Lys Gly Arg Ala Ala Gly
                85                  90                  95
Ala Thr Arg Asp Lys Ala Tyr Asp Ala Lys Asp Arg Ala Ala Asp Thr
            100                 105                 110
Ala Gln Ser Ala Ala Asp Arg Ala Arg Asp Gly Ala Gly Gln Thr Gly
        115                 120                 125
Ser Tyr Ile Gly Gln Thr Ala Glu Ala Ala Lys Gln Lys Ala Ala Gly
    130                 135                 140
Ala Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Thr Ala Ile Ala Gly Lys Asp Lys Thr
145                 150                 155                 160
Gly Ala Val Leu Gln Gln Ala Gly Glu Gln Val Lys Ser Val Ala Val
                165                 170                 175
Gly Ala Lys Asp Ala Val Met Tyr Thr Leu Gly Met Ser Gly Asp Asn
            180                 185                 190
Lys Asn Asn Ala Ala Ala Gly Lys Asp Thr Ser Thr Tyr Lys Pro Gly
        195                 200                 205
Thr Gly Ser Asp Tyr Gln
    210
<210>21
<211>642
<212>DNA
<213>大麦(Hordeum vulgare)
<400>21
atggcctcca accagaacca ggggagctac cacgccggcg agaccaaggc ccgcaccgag  60
gagaagaccg ggcagatgat gggcgccacc aagcagaagg cggggcagac caccgaggcc  120
accaagcaga aggccggcga gacggccgag gccaccaagc agaagaccgg cgagacggcc  180
gaggccgcca agcagaaggc cgccgaggcc aaggacaaga cggcgcagac ggcgcaggcg  240
gccaaggaca agacgtacga gacggcgcag gcggccaagg agcgcgccgc ccagggcaag  300
gaccagaccg gcagcgccct cggcgagaag acggaggcgg ccaagcagaa ggccgccgag  360
acgacggagg cggccaagca gaaggccgcc gaggcaaccg aggcggccaa gcagaaggcg  420
tccgacacgg cgcagtacac caaggagtcc gcggtggccg gcaaggacaa gaccggcagc  480
gtcctccagc aggccggcga gacggtggtg aacgccgtgg tgggcgccaa ggacgccgtg  540
gcaaacacgc tgggcatggg aggggacaac accagcgcca ccaaggacgc caccaccggc  600
gccaccgtca aggacaccac caccaccacc aggaatcact ag                     642
<210>22
<211>213
<212>PRT
<213>大麦
<400>22
Met Ala Ser Asn Gln Asn Gln Gly Ser Tyr His Ala Gly Glu Thr Lys
1               5                   10                  15
Ala Arg Thr Glu Glu Lys Thr Gly Gln Met Met Gly Ala Thr Lys Gln
            20                  25                  30
Lys Ala Gly Gln Thr Thr Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Gly Glu Thr
        35                  40                  45
Ala Glu Ala Thr Lys Gln Lys Thr Gly Glu Thr Ala Glu Ala Ala Lys
    50                  55                  60
Gln Lys Ala Ala Glu Ala Lys Asp Lys Thr Ala Gln Thr Ala Gln Ala
65                  70                  75                  80
Ala Lys Asp Lys Thr Tyr Glu Thr Ala Gln Ala Ala Lys Glu Arg Ala
                85                  90                  95
Ala Gln Gly Lys Asp Gln Thr Gly Ser Ala Leu Gly Glu Lys Thr Glu
            100                 105                 110
Ala Ala Lys Gln Lys Ala Ala Glu Thr Thr Glu Ala Ala Lys Gln Lys
        115                 120                 125
Ala Ala Glu Ala Thr Glu Ala Ala Lys Gln Lys Ala Ser Asp Thr Ala
    130                 135                 140
Gln Tyr Thr Lys Glu Ser Ala Val Ala Gly Lys Asp Lys Thr Gly Ser
145                 150                 155                 160
Val Leu Gln Gln Ala Gly Glu Thr Val Val Asn Ala Val Val Gly Ala
                165                 170                 175
Lys Asp Ala Val Ala Asn Thr Leu Gly Met Gly Gly Asp Asn Thr Ser
            180                 185                 190
Ala Thr Lys Asp Ala Thr Thr Gly Ala Thr Val Lys Asp Thr Thr Thr
        195                 200                 205
Thr Thr Arg Asn His
    210
<210>23
<211>552
<212>DNA
<213>无芒雀麦(Bromus inermis)
<400>23
atggcatcca accaggacaa ggcaagctac cacgccggcg aggccaaggc ccgcaccgag    60
gagaaggccg gacaggtgac cggcgcggcc aaggacaagg cgtgcgaggc caaggaccgg    120
gcgtcggacg cggcggggca cgcgaccggg aaggggcagg gcgccgtcga ggccacgaag    180
cagaaggccg gcgaggcggg gcagaagacg tccgagacgg cgcaggccgc caaggaccgg    240
gccgccgagg gcaaggacca ggccggcagc tacctcggcc agacggccga ggccgccaag    300
gagaaggcct cccaggcgac ggggtacacg caggacaggg ccgccgacgc ggcgcagtac    360
acgaaggact ccgccgtcgc cggcaaggac aagaccggca gcgtcctcgc tcaggccggc    420
gagcaggtga agaacgtggt ggttggcgcc aaagacgcgg tggccaacac gctggggatg    480
gggggagaca acaacactag ctcaaccaag gacagtagca ccaccgagac gatcaccaag    540
aatcatcact ag                                                        552
<210>24
<211>183
<212>PRT
<213>无芒雀麦
<400>24
Met Ala Ser Asn Gln Asp Lys Ala Ser Tyr His Ala Gly Glu Ala Lys
1               5                   10                  15
Ala Arg Thr Glu Glu Lys Ala Gly Gln Val Thr Gly Ala Ala Lys Asp
            20                  25                  30
Lys Ala Cys Glu Ala Lys Asp Arg Ala Ser Asp Ala Ala Gly His Ala
        35                  40                  45
Thr Gly Lys Gly Gln Gly Ala Val Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Gly
    50                  55                  60
Glu Ala Gly Gln Lys Thr Ser Glu Thr Ala Gln Ala Ala Lys Asp Arg
65                  70                  75                  80
Ala Ala Glu Gly Lys Asp Gln Ala Gly Ser Tyr Leu Gly Gln Thr Ala
                85                  90                  95
Glu Ala Ala Lys Glu Lys Ala Ser Gln Ala Thr Gly Tyr Thr Gln Asp
            100                 105                 110
Arg Ala Ala Asp Ala Ala Gln Tyr Thr Lys Asp Ser Ala Val Ala Gly
        115                 120                 125
Lys Asp Lys Thr Gly Ser Val Leu Ala Gln Ala Gly Glu Gln Val Lys
    130                 135                 140
Asn Val Val Val Gly Ala Lys Asp Ala Val Ala Asn Thr Leu Gly Met
145                 150                 155                 160
Gly Gly Asp Asn Asn Thr Ser Ser Thr Lys Asp Ser Ser Thr Thr Glu
                165                 170                 175
Thr Ile Thr Lys Asn His His
           180
<210>25
<211>666
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<400>25
atggcttccc accaggacaa ggctagctac caggccggcg agaccaaggc ccgcaccgag  60
gagaagaccg ggcaggcggt gggggcgacc aaggacacgg cgcagcacgc caaggaccgg  120
gcggcggacg cggcggggca cgcggcgggc aagggccagg acgccaagga ggccaccaag  180
cagaaggcgt ccgacaccgg cagctacctg ggcaagaaga ccgacgaggc caagcacaag  240
gccggcgaga cgacggaggc caccaagcac aaggccggcg agacgacgga ggccgccaag  300
cagaaggccg gcgagacgac ggaggccgcc aagcagaagg ccggcgagac gacggagacg  360
accaagcaga aggccggcga gacgacggag gccgccaggc agaaggcagc cgacgccatg  420
gaggccgcca agcagaaggc cgccgaggcc gggcagtacg ccaaggacac cgccgtctcc  480
ggcaaggaca agtccggcgg cgtcatccag caggccactg agcaggtgaa gagcgcggcg  540
gcggggcgca aggacgcggt gatgagcacg ctggggatgg gcggggacaa caagcagggc  600
gacgccaaca ccaacaccaa caccaacacc accaaggact cctctaccat caccagggat  660
cactag                                                             666
<210>26
<211>221
<212>PRT
<213>玉米
<400>26
Met Ala Ser His Gln Asp Lys Ala Ser Tyr Gln Ala Gly Glu Thr Lys
1               5                   10                  15
Ala Arg Thr Glu Glu Lys Thr Gly Gln Ala Val Gly Ala Thr Lys Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Gln His Ala Lys Asp Arg Ala Ala Asp Ala Ala Gly His Ala
        35                  40                  45
Ala Gly Lys Gly Gln Asp Ala Lys Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Ser
    50                  55                  60
Asp Thr Gly Ser Tyr Leu Gly Lys Lys Thr Asp Glu Ala Lys His Lys
65                  70                  75                  80
Ala Gly Glu Thr Thr Glu Ala Thr Lys His Lys Ala Gly Glu Thr Thr
                85                  90                  95
Glu Ala Ala Lys Gln Lys Ala Gly Glu Thr Thr Glu Ala Ala Lys Gln
            100                 105                 110
Lys Ala Gly Glu Thr Thr Glu Thr Thr Lys Gln Lys Ala Gly Glu Thr
        115                 120                 125
Thr Glu Ala Ala Arg Gln Lys Ala Ala Asp Ala Met Glu Ala Ala Lys
    130                 135                 140
Gln Lys Ala Ala Glu Ala Gly Gln Tyr Ala Lys Asp Thr Ala Val Ser
145                 150                 155                 160
Gly Lys Asp Lys Ser Gly Gly Val Ile Gln Gln Ala Thr Glu Gln Val
                165                 170                 175
Lys Ser Ala Ala Ala Gly Arg Lys Asp Ala Val Met Ser Thr Leu Gly
            180                 185                 190
Met Gly Gly Asp Asn Lys Gln Gly Asp Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr
        195                 200                 205
Asn Thr Thr Lys Asp Ser Ser Thr Ile Thr Arg Asp His
    210                 215                 220
<210>27
<211>690
<212>DNA
<213>欧洲油菜(Brassica napus)
<400>27
atggcgtcta accaacaaag ctacaaagct ggtgaaacca gaggcaagac tcaggagaag    60
acaggacaag caatgggagc aatgagggac aaggctgagg aaggcaagga caagacttcc    120
cagacggctc aaaaggccca acaaaaggca caagagactg cccaggcagc taaagacaag    180
acatctcaag ctgcccaaac gacccaacaa aaggctcaag agacggcaca ggcagcgaaa    240
gacaagacat ctcaagctgc ccaaacgacc cagcaaaagg ctcatgagac gacccaatca    300
gcaaaagaca agacatctca agctgcccag acggcccaag aaaaagcccg ggagacgaag  360
gacaagaccg gaagttacat gtccgagaca ggagaagcca taaagcagaa ggctcaaaac  420
gctgctcagt acacaaagga gacggctcaa gaagcggctc agtacacgaa agagacggct  480
gaagccggta gagacaagac cggtgggttc ttgagccaga caggcgagca agtgaagcag  540
atggcaatgg gtgcagctga tgcggtgaag cacactgttg gaatggctac ggaggaagaa  600
gaccgggagc attatccagg caccactacg accactactg gtactactcg gaccactgat  660
ccgactcatc atacttatca gaggaagtga                                   690
<210>28
<211>229
<212>PRT
<213>欧洲油菜
<400>28
Met Ala Ser Asn Gln Gln Ser Tyr Lys Ala Gly Glu Thr Arg Gly Lys
1               5                   10                  15
Thr Gln Glu Lys Thr Gly Gln Ala Met Gly Ala Met Arg Asp Lys Ala
            20                  25                  30
Glu Glu Gly Lys Asp Lys Thr Ser Gln Thr Ala Gln Lys Ala Gln Gln
        35                  40                  45
Lys Ala Gln Glu Thr Ala Gln Ala Ala Lys Asp Lys Thr Ser Gln Ala
    50                  55                  60
Ala Gln Thr Thr Gln Gln Lys Ala Gln Glu Thr Ala Gln Ala Ala Lys
65                  70                  75                  80
Asp Lys Thr Ser Gln Ala Ala Gln Thr Thr Gln Gln Lys Ala His Glu
                85                  90                  95
Thr Thr Gln Ser Ala Lys Asp Lys Thr Ser Gln Ala Ala Gln Thr Ala
            100                 105                 110
Gln Glu Lys Ala Arg Glu Thr Lys Asp Lys Thr Gly Ser Tyr Met Ser
        115                 120                 125
Glu Thr Gly Glu Ala Ile Lys Gln Lys Ala Gln Asn Ala Ala Gln Tyr
    130                 135                 140
Thr Lys Glu Thr Ala Gln Glu Ala Ala Gln Tyr Thr Lys Glu Thr Ala
145                 150                 155                 160
Glu Ala Gly Arg Asp Lys Thr Gly Gly Phe Leu Ser Gln Thr Gly Glu
                165                 170                 175
Gln Val Lys Gln Met Ala Met Gly Ala Ala Asp Ala Val Lys His Thr
            180                 185                 190
Val Gly Met Ala Thr Glu Glu Glu Asp Arg Glu His Tyr Pro Gly Thr
        195                 200                 205
Thr Thr Thr Thr Thr Gly Thr Thr Arg Thr Thr Asp Pro Thr His His
    210                 215                 220
Thr Tyr Gln Arg Lys
225
<210>29
<211>696
<212>DNA
<213>玉米
<400>29
atggcttctc gtcagcagca tcctactagc taccacgccg gcgagaccaa ggcccgtgcc  60
gaggagaaga cgggtcaagt gatgggggcg acgcaggaga aagggaggga ggccaagcac  120
aaggcgtccg acgcctccga ccgcgccatg ggaatgggcc acgacgccat ggaggcgacc  180
agggagaagg cgcgcgccgc cgcggaccga accatgggga tgggccacga cgccggggag  240
gcggccaagg acagggcgta ccgggccaag gacgcggcct ccggtgccgc tggccgcgcc  300
agggacactg cgtccgacgc ggccggcgct gccggggacc gcgcccgcga cggcgcgcag  360
cagaccggga gctacgtcgc gcagacggcc gaggccgcca ggcagaaggc ggccggcgcc  420
gcgctgtacg ccaaggacac cgtggtggcc ggcaaggaca agaccggcgc cctcctgcag  480
caggcagggg agaaggtgat gagcacggcc gtgggggcca aggacacggt tgtcagcacg  540
gccgtggggg ccaaggacac ggttgtcagc accgccgtgg gagccaagga cgcgatgatg    600
aactcgctcg gcatggccgg cgaggacaag gacggcacca ccaccaccga cgccggcaag    660
gacaccagca cccgcaagcc tggcagggac tattag                              696
<210>30
<211>231
<212>PRT
<213>玉米
<400>30
Met Ala Ser Arg Gln Gln His Pro Thr Ser Tyr His Ala Gly Glu Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala Arg Ala Glu Glu Lys Thr Gly Gln Val Met Gly Ala Thr Gln
            20                  25                  30
Glu Lys Gly Arg Glu Ala Lys His Lys Ala Ser Asp Ala Ser Asp Arg
        35                  40                  45
Ala Met Gly Met Gly His Asp Ala Met Glu Ala Thr Arg Glu Lys Ala
    50                  55                  60
Arg Ala Ala Ala Asp Arg Thr Met Gly Met Gly His Asp Ala Gly Glu
65                  70                  75                  80
Ala Ala Lys Asp Arg Ala Tyr Arg Ala Lys Asp Ala Ala Ser Gly Ala
                85                  90                  95
Ala Gly Arg Ala Arg Asp Thr Ala Ser Asp Ala Ala Gly Ala Ala Gly
            100                 105                 110
Asp Arg Ala Arg Asp Gly Ala Gln Gln Thr Gly Ser Tyr Val Ala Gln
        115                 120                 125
Thr Ala Glu Ala Ala Arg Gln Lys Ala Ala Gly Ala Ala Leu Tyr Ala
    130                 135                 140
Lys Asp Thr Val Val Ala Gly Lys Asp Lys Thr Gly Ala Leu Leu Gln
145                 150                 155                 160
Gln Ala Gly Glu Lys Val Met Ser Thr Ala Val Gly Ala Lys Asp Thr
                165                 170                 175
Val Val Ser Thr Ala Val Gly Ala Lys Asp Thr Val Val Ser Thr Ala
            180                 185                 190
Val Gly Ala Lys Asp Ala Met Met Asn Ser Leu Gly Met Ala Gly Glu
        195                 200                 205
Asp Lys Asp Gly Thr Thr Thr Thr Asp Ala Gly Lys Asp Thr Ser Thr
    210                 215                 220
Arg Lys Pro Gly Arg Asp Tyr
225                 230
<210>31
<211>588
<212>DNA
<213>玉米
<400>31
atggcttccc accaggacaa ggctagctac caggccggcg aaaccaaggc ccgcaccgag    60
gagaagaccg ggcaggcggt gggggcgacc aaggacacgg cgcagcacgc caaggaccgg    120
gcggcggacg cggcggggca cgcggcgggc aagggccagg acgccaagga ggccaccaag    180
cagaaggcgt ccgacaccgg cagctacctg ggcaagaaga ccgacgaggc caagcacaag    240
gccggcgaga cgacggaggc caccaagcag aaggccggcg agacgacgga ggcgaccaag    300
cagaaggccg gcgagacgac ggaggccgcc aggcagaagg cagccgacgc catggaggca    360
gccaagcaga aggccgccga ggccgggcag tacgccaagg acaccgccgt ctccggcaag    420
gacaagtccg gcggcgtcat ccagcaggcc actgagcagg tgaagagcgc ggcggcgggc    480
gccaaggacg cggtgatgag cacgctgggg atgggcgggg acgacaagca gggcgacgcc    540
aacaccaaca ccaacaagga ctcctctacc atcaccaggg atcactag                 588
<210>32
<211>195
<212>PRT
<213>玉米
<400>32
Met Ala Ser His Gln Asp Lys Ala Ser Tyr Gln Ala Gly Glu Thr Lys
1               5                   10                  15
Ala Arg Thr Glu Glu Lys Thr Gly Gln Ala Val Gly Ala Thr Lys Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Gln His Ala Lys Asp Arg Ala Ala Asp Ala Ala Gly His Ala
        35                  40                  45
Ala Gly Lys Gly Gln Asp Ala Lys Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Ser
    50                  55                  60
Asp Thr Gly Ser Tyr Leu Gly Lys Lys Thr Asp Glu Ala Lys His Lys
65                  70                  75                  80
Ala Gly Glu Thr Thr Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Gly Glu Thr Thr
                85                  90                  95
Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Gly Glu Thr Thr Glu Ala Ala Arg Gln
            100                 105                 110
Lys Ala Ala Asp Ala Met Glu Ala Ala Lys Gln Lys Ala Ala Glu Ala
        115                 120                 125
Gly Gln Tyr Ala Lys Asp Thr Ala Val Ser Gly Lys Asp Lys Ser Gly
    130                 135                 140
Gly Val Ile Gln Gln Ala Thr Glu Gln Val Lys Ser Ala Ala Ala Gly
145                 150                 155                 160
Ala Lys Asp Ala Val Met Ser Thr Leu Gly Met Gly Gly Asp Asp Lys
                165                 170                 175
Gln Gly Asp Ala Asn Thr Asn Thr Asn Lys Asp Ser Ser Thr Ile Thr
            180                 185                 190
Arg Asp His
        195
<210>33
<211>636
<212>DNA
<213>普通小麦(Triticum aestivum)
<400>33
atggcctcca accagaacca ggccagctac cacgccggcg agaccaaggc ccgcaccgag    60
gagaagaccg ggcaggtgat gggcgcgacc aaggacaagg cggggcagac cacggaggcc    120
accaagcaga aggccggaca gaccaccgag gccaccaagc agaaggccgg cgagacggcc    180
gaggcaacga agcagaaggc cggtcaggcc acggaggcca cgaagcagaa ggccggcgag    240
acggccgagg ccaccaagca gaaggccgcc gaggccaagg acaagactgc gcagacggcg    300
caggcggcca aggagcgcgc cgccgagacc aaggaccaga ccggcagcta cctcggcgag    360
aagacagaga tggccaagca gaaggccgcc gagacgaccg aggctgccaa gcagaaggcc    420
tcggagacgg cgcagtacac caaggagtcc gtcgccggca aggacaagac cggcagcgtc    480
ctccagcagg ccggcgagac ggtggtgaac gccgtggatg gcgccaagga cgccgtggcc    540
aacacgctgg gcaatgggcc ggacaacgcc accaaggaca cctccaccgg cgccaccacg    600
aaggacacca ccaccaccac caccaggaat cactag                              636
<210>34
<211>211
<212>PRT
<213>普通小麦
<400>34
Met Ala Ser Asn Gln Asn Gln Ala Ser Tyr His Ala Gly Glu Thr Lys
1               5                   10                  15
Ala Arg Thr Glu Glu Lys Thr Gly Gln Val Met Gly Ala Thr Lys Asp
            20                  25                  30
Lys Ala Gly Gln Thr Thr Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Gly Gln Thr
        35                  40                  45
Thr Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Lys
    50                  55                  60
Gln Lys Ala Gly Gln Ala Thr Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Gly Glu
65                  70                  75                  80
Thr Ala Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Ala Glu Ala Lys Asp Lys Thr
                85                  90                  95
Ala Gln Thr Ala Gln Ala Ala Lys Glu Arg Ala Ala Glu Thr Lys Asp
            100                 105                 110
Gln Thr Gly Ser Tyr Leu Gly Glu Lys Thr Glu Met Ala Lys Gln Lys
        115                 120                 125
Ala Ala Glu Thr Thr Glu Ala Ala Lys Gln Lys Ala Ser Glu Thr Ala
    130                 135                 140
Gln Tyr Thr Lys Glu Ser Val Ala Gly Lys Asp Lys Thr Gly Ser Val
145                 150                 155                 160
Leu Gln Gln Ala Gly Glu Thr Val Val Asn Ala Val Asp Gly Ala Lys
                165                 170                 175
Asp Ala Val Ala Asn Thr Leu Gly Asn Gly Pro Asp Asn Ala Thr Lys
            180                 185                 190
Asp Thr Ser Thr Gly Ala Thr Thr Lys Asp Thr Thr Thr Thr Thr Thr
        195                 200                 205
Arg Asn His
    210
<210>35
<211>214
<212>PRT
<213>稻
<400>35
Met Ala Ser Gln Gln Glu Arg Ala Ser Tyr His Ala Gly Glu Thr Lys
1               5                   10                  15
Ala Arg Ala Glu Glu Lys Thr Gly Arg Met Met Gly Thr Ala Gln Glu
            20                  25                  30
Lys Ala Arg Glu Ala Lys Asp Thr Ala Ser Asp Ala Ala Gly Arg Ala
        35                  40                  45
Met Gly Arg Gly His Gly Ala Lys Glu Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr
    50                  55                  60
Glu Thr Lys Asp Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr Glu Ala Lys Asp Ala
65                  70                  75                  80
Ala Ser Asp Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Lys Gly Arg Ala Ala Gly
                85                  90                  95
Ala Thr Arg Asp Lys Ala Tyr Asp Ala Lys Asp Arg Ala Ala Asp Thr
            100                 105                 110
Ala Gln Ser Ala Ala Asp Arg Ala Arg Asp Gly Ala Gly Gln Thr Gly
        115                 120                 125
Ser Tyr Ile Gly Gln Thr Ala Glu Ala Ala Lys Gln Lys Ala Ala Gly
    130                 135                 140
Ala Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Thr Ala Ile Ala Gly Lys Asp Lys Thr
145                 150                 155                 160
Gly Ala Val Leu Gln Gln Ala Gly Glu Gln Val Lys Ser Val Ala Val
                165                 170                 175
Gly Ala Lys Asp Ala Val Met Tyr Thr Leu Gly Met Ser Gly Asp Asn
            180                 185                 190
Lys Asn Asn Ala Ala Ala Gly Lys Asp Thr Ser Thr Tyr Lys Pro Gly
        195                 200                 205
Thr Gly Ser Asp Tyr Gln
    210
<210>36
<211>169
<212>PRT
<213>普通小麦
<400>36
Met Ala Ser Asn Gln Asn Gln Ala Ser Tyr Ala Ala Gly Glu Thr Lys
1               5                   10                  15
Ala Arg Thr Glu Glu Lys Thr Gly Gln Met Met Asp Lys Ala Gly Gln
            20                  25                  30
Ala Thr Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Gly Glu Ala Lys Asp Lys Thr
        35                  40                  45
Ala Gln Thr Ala Gln Ala Ala Lys Asp Arg Ala Ala Glu Ser Lys Asp
    50                  55                  60
Gln Thr Gly Ser Phe Leu Gly Glu Lys Thr Glu Ala Ala Lys Gln Lys
65                  70                  75                  80
Thr Ala Glu Ala Thr Asp Ala Ala Lys Gln Lys Ala Ser Glu Thr Ala
                85                  90                  95
Gln Tyr Ala Gln Glu Arg Ser Ser Asp Ala Ala Gln Tyr Thr Lys Glu
            100                 105                 110
Ser Ala Val Ala Gly Lys Asp Lys Thr Gly Ser Val Leu Gln Gln Ala
        115                 120                 125
Gly Glu Thr Val Val Ser Ala Val Val Gly Ala Lys Asp Ala Val Ala
    130                 135                 140
Asn Thr Leu Gly Met Gly Gly Asp Asn Thr Asn Thr Ala Lys Asp Ser
145                 150                 155                 160
Thr Thr Glu Lys Ile Thr Arg Asp His
                165

Claims (28)

1. 相对于对照植物增加植物产量的方法，包括调节在植物中编码OsLEA3a多肽或其同源物的核酸的表达，和任选的选择具有增加产量的植物，条件是所述OsLEA3a多肽或其同源物不是SEQ ID NO：22(大麦)。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述调节的表达是通过优选的在编码OsLEA3a多肽或其同源物的基因的基因座中引入遗传修饰来实现。
3. 根据权利要求2的方法，其中所述遗传修饰通过以下之一来实现：T-DNA激活，TILLING，定点诱变或定向进化。
4. 相对于对照植物增加植物产量的方法，其包括在植物中引入和表达OsLEA3a核酸或其变体，条件是所述的OsLEA3a核酸或其变体不编码SEQ ID NO：22(大麦LEA3a)。
5. 根据权利要求4的方法，其中所述的核酸编码SEQ ID NO：2的OsLEA3a蛋白质的同源物，优选的所述的核酸编码SEQ ID NO：2的OsLEA3a蛋白质的旁系同源物。
6. 根据权利要求4的方法，其中所述的变体是OsLEA3a核酸的一部分或能够杂交OsLEA3a核酸的序列，该部分或杂交序列编码包含2LEA_4结构域和SEQ ID NO：3的OsLEA3a共有记号序列的多肽。
7. 根据权利要求5或6的方法，其中所述的OsLEA3a核酸或其变体在植物中是过量表达的。
8. 根据权利要求5至7中任一项的方法，其中所述OsLEA3a核酸或其变体是植物来源的，优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科，最优选的，核酸来自稻。
9. 根据权利要求5至8中任一项的方法，其中所述的OsLEA3a核酸或其变体与组成型启动子有效连接。
10. 根据权利要求9的方法，其中所述的组成型启动子是GOS2启动子。
11. 根据权利要求1至10中任一项的方法，其中所述的增加的产量是增加的种子产量。
12. 根据权利要求1至11中任一项的方法，其中所述的增加的产量选自：增加的种子总重量，增加的饱满种子数或增加的收获指数。
13. 根据权利要求1至12中任一项的方法可获得的植物。
14. 构建体，其包含：
(i)OsLEA3a核酸或其变体；
(ii)有效连接到(i)的核酸序列的一个或多个调控序列，
条件是所述的OsLEA3a核酸或其变体不编码SEQ ID NO：22(大麦LEA3a)。
15. 根据权利要求14的构建体，其中所述的调控序列是组成型启动子。
16. 根据权利要求15的构建体，其中所述的组成型启动子是GOS2启动子。
17. 根据权利要求16的构建体，其中所述的GOS2启动子由SEQ IDNO：6所代表。
18. 用根据权利要求14至17中任一项的构建体转化的植物。
19. 生产与对照植物相比具有增加的产量的转基因植物的方法，该方法包括：
(i)在植物或植物细胞中引入并表达OsLEA3a核酸或其变体；
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞，
条件是所述的OsLEA3a核酸或其变体不编码SEQ ID NO：22(大麦LEA3a)。
20. 在非胁迫条件下生长时具有增加的产量的转基因植物，其由引入所述植物的OsLEA3a核酸或其变体而产生。
21. 根据权利要求13、18或20的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物，例如甘蔗或其中该植物是谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦或高粱。
22. 根据权利要求13、18、20或21中任一项的植物的可收获部分。
23. 根据权利要求22的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分是种子。
24. 直接来自根据权利要求21的植物和/或来自根据权利要求22或23的植物的可收获部分的产品。
25. OsLEA3a核酸/基因或其变体的用途，或OsLEA3a多肽或其同源物的用途，其用于相对于对照植物，改良在非胁迫条件下生长的植物的产量，特别是种子产量。
26. 根据权利要求25的用途，其中所述的种子产量是下面一种或多种：增加的种子总重量，增加的饱满种子数和增加的收获指数。
27. OsLEA3a核酸/基因或其变体的用途，或OsLEA3a多肽或其同源物的用途，其用作分子标记。
28. 具有改变的代谢物水平的植物种子，其中所述植物种子中代谢物水平和对照植物种子的代谢物水平的比值范围在氨基酸组内是0.7和7.7之间；在类胡萝卜素组内是1.8和19.3之间；在辅因子组内是1.3和1.5之间；在脂肪酸和相关代谢物组内是0.3和0.9之间；在有机酸组内是1.4和20.0之间；在酚类组内是1.4和8.5之间；在植物激素和植物固醇组内是1.0和10.9之间；在糖代谢物组内是0.5和7.1之间；在生育酚和相关代谢物组内是0.3和4.2之间；该植物具有编码OsLEA3a蛋白质或其同源物的核酸的调节的表达。
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