CN105039542A - 一种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种开发寡核苷酸探针染液涂染染色体的新方法。以普通小麦中国春和栽培黑麦荆州黑麦为例，利用基于重复序列开发的寡核苷酸探针，通过比较非变性原位杂交信号，确定最佳探针长度和浓度，按照信号强度进行不同探针配比并溶解到2×SSC中形成探针染液，将染色体制片在染液中直接进行染色，获得清晰稳定的中国春和荆州黑麦寡核苷酸涂染核型。方法具有简单快捷、一次可处理多张染色体制片、染液可重复利用的特点，利于提高原位杂交的自动化和商业化水平。同时公布了10个寡核苷酸探针序列和三种鸡尾酒探针染液，为小麦和黑麦染色体工程提供了新的方法，也为其他物种寡核苷酸染液的开发提供了范例。

Description

一种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新方法
技术领域
本发明属于动植物染色体遗传与生物技术领域，涉及一种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新方法。
背景技术
染色体分带技术是二十世纪六十年代末建立起来的，现已成为追踪特定染色体(质)，识别染色体结构一种重要工具。Gill等(1991)(见参考文献：GillBS，FriebeB，EndoTR.Standardkaryotypeandnomenclaturesystemfordescriptionofchromosomebandsandstructuralaberrationinwheat.Genome，1991，34：830-834)建立了基于小麦C-分带的标准带型，并广泛应用于鉴定外源染色体变异系(见参考文献：JiangJ，GillBS.Sequentialchromosomebandingandinsituhybridizationanalysis.Genome，1993，36：792-795)。随着原位杂交技术的发展，人们发现物种专化性重复序列的质粒探针在植物染色体上产生清晰稳定的特征信号，比染色体分带更容易用于染色体识别和区分。Mukai等(1993)(见参考文献：MukaiYB，AkaharaYumikon，YamamotoMaki.SimultaneousdiscriminationofthethreegenomesinhexaploidwheatbymulticolorfluorescenceinsituhybridizationusingtotalgenomicandhighlyrepeatedDNAprobes.Genome，36：489-494)以重复序列pAs1和pSc119.2为探针的多色原位杂交识别了小麦21对中的17对染色体。基于GAA微卫星和pAs1成功的分辨了小麦所有染色体(见参考文献：PedersenC，LangridgeP.Identificationoftheentirechromosomecomplementofbreadwheatbytwo-colorFISH.Genome，1997，40：589-593)。更有趣的是Cuadrado等(2009)(见参考文献：GolczykH，JouveN.Anovel，simpleandrapidnondenaturingFISH(ND-FISH)techniqueforthedetectionofplanttelomeres，potentialusedandpossibletargetstructuresdetected.ChromosomeRes，2009，17：755-762)发现无需事先进行染色体变性，植物染色体端粒序列即可在染色体上产生信号，建立了非变性荧光原位杂交技术(ND-FISH)。在此基础上Cuadrado等(2010)(见参考文献：CuadradoJouveN.Chromosomaldetectionofsimplesequencerepeats(SSRs)usingnondenaturingFISH(ND-FISH).Chromosoma，2010，119：495-503)又以SSR为探针，进行ND-FISH，发现多数序列均可产生几乎与变性FISH相同的杂交效果。
寡聚核苷酸寡探针，是一种人工合成的、根据探针靶序列的碱基顺序用化学方法合成的单链DNA或RNA。在小麦中，王艳芝(见参考文献：王艳芝.百萨偃麦草染色体小片段易位的创制、鉴定与基因定位分析.南京农业大学硕士论文，2013)首次把小麦重复序列质粒探针pSc119.2和pAs1转化为寡聚核苷酸探针，并发现根据pSc119.2核心序列开发的长度为59bp的2个寡核苷酸探针pSc119.2-1和pSc119.2-2均产生与pSc119.2质粒探针完全重叠的信号，而据pAs1核心序列开发的6个寡核苷酸pAs1-1～6则产生了很多不一致的杂交信号，其中寡核苷酸探针pSc119.2-1和pSc119.2-2可以成功用于非变性FISH(见会议文献：WangYanzhi；LiuZhitao；PuJing；WangQing；ZhuangLifang；QiZengjun.DevelopmentandapplicationofoligodeoxynucleotideprobesderivedfromhighlyrepetitivesequencespSc119.2andpAs1(abstract).第四届全国小麦基因组学及分子育种大会(WheatgenomicsandmolecularbreedinginChinaIV).2013.Nanjing.P.94)，为开发小麦乃至其他植物寡核苷酸探针提供了重要信息。Tang等(2014)(见参考文献：ZongxiangTang，ZujunYang，ShulanFu.OligonucleotidesreplacingtherolesofrepetitivesequencespAs1，pSc119.2，pTa-535，pTa71，CCS1，andpAWRC.1forFISHanalysis.JApplGenetics，2014，DOI10.1007)报道了9个基于小麦和黑麦着丝粒等重复序列开发的寡聚核苷酸探针，其中包括2个来自pSc119.2和pAs1的寡核苷酸探针，表明这些寡核苷酸探针可以代替原来的质粒序列并成功用于小麦染色体的鉴定。随后，可以替代基因组原位杂交的黑麦基因组专化寡居核苷酸探针也被开发出来，实现了基因组ND-FISH(见参考文献：ShulanFu，LeiChen，YangyangWang，MengLi，ZujunYang，LingQiu，BenjuYan，ZhenglongRen，ZongxiangTang.OligonucleotideProbesforNDFISHAnalysistoIdentifyRyeandWheatChromosomes.ScientificReports，2015，DOI：10.1038)。Han等(2015)以黄瓜为例，发展了一种针对单条染色体涂染的寡居核苷酸探针开发方法(见参考文献：YonghuaHan，TaoZhang，ParadeeThammapichai，YiqunWeng，andJimingJiang.Chromosome-specificpaintinginCucumisspeciesusingbulkedoligonucleotides.Genetics，2015，DOI：10.1534)。寡聚核苷酸探针开发及ND-FISH的发展将大大提高原位杂交效率，具有重要的应用潜力。
本专利在寡居核苷酸探针开发及ND-FISH研究的基础上，通过连续6年的研究发现，通过优化寡居核苷酸序列长度可以有效地提高ND-FISH的效率，大大节省原位杂交成本，并为开发基于寡核苷酸探针的新型染色体涂染染液提供了可能，本专利以普通小麦中国春和栽培黑麦荆州黑麦为例，公开了一种开发寡聚核苷酸探针染液并进行染色体涂染的新方法，为简化原位杂交程序，实现原位杂交自动化，开发商业化检测试剂盒及商业化检测提供了新的方法。
发明内容
本发明的目的在于公开一种开发寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新型染色体分带方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
1.一种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新方法，其所用的寡核苷酸序列特征如下所示：其中FAM-5′GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA3′，FAM-5′GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA3′和FAM-5′AACAACAACAACAACAACAACAACAACAAC3′为本专利合成，其余探针序列来自王艳芝(2013)(见参考文献：王艳芝.百萨偃麦草染色体小片段易位的创制、鉴定与基因定位分析.南京农业大学硕士论文，2013)。
2.一种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)以发展普通小麦中国春寡聚核苷酸探针染液涂染中国春染色体为例，利用SSR重复序列GAA、质粒DNApSc119.2和pAs1核心序列人工合成寡聚核苷酸探针(GAA)5、(GAA)10、(GAA)19、pSc119.2-1、pAs1-1、pAs1-2、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-5和pAs1-6；
(2)利用非变性荧光原位杂交对步骤(1)中不同长度寡聚核苷酸探针(GAA)5、(GAA)10、(GAA)19进行信号强度比较，选择能够低浓度高效侵染染色体的寡居核苷酸，获得(GAA)10，同样获得探针pSc119.2-1、pAs1-1、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-5和pAs1-6；
(3)根据各探针原位杂交信号强度选择各探针最优浓度，(GAA)10(0.01ng/μl)、pSc119.2-1(0.2ng/μl)、pAs1-1(0.3ng/μl)、pAs1-3(5ng/μl)、pAs1-4(10ng/μl)、pAs1-5(0.3ng/μl)和pAs1-6(5ng/μl)；
(4)按照步骤(3)中探针浓度配比，对不同探针进行混合加在灭菌的2×SSC(0.015MC6H5Na3O7.2H2O-0.15MNaCl)中，配成探针染液。
(5)将准备好的根尖中期染色体制片置于步骤(4)探针染液中，37℃杂交染色6h后，取出载玻片，用蒸馏水冲洗3次，滴加6μlVECTASHIELDMountingMediumforFluorescencewithDAPI(Vector)，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察照相。
本发明提供的方法，概括性地表述如下：
利用物种专化重复序列或基因组序列设计的寡居核苷酸探针，通过比较不同长度探针非变性原位杂交信号强度，选择合适长度探针，并优化确定探针浓度。按照探针浓度进行配比加入到2×SSC中混合成探针染液，取组配好的探针染液直接盛放于玻璃染色缸(高7.6cm，内径3cm)中，将准备好的染色体制片直接置于染液中，37℃染色6h，拿出载玻片，用蒸馏水冲洗3次，滴加6μlVECTASHIELDMountingMediumforFluorescencewithDAPI(Vector)，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察照相。
与传统原位杂交程序相比较，本发明方法省去了染色液直接滴加在每张制片上的过程，而且染液可以重复利用，并能同时进行批量制片染色，具有简单、快捷、节约成本的特点；本发明通过优化寡核苷酸探针长度和浓度配比，组配成功的可用于小麦和黑麦染色体分析的三个探针染液说明本方法可以用于多种生物的染色体分析，开发系列的商业化的寡核苷酸染液，为染色体分析自动化和商业化检测提供了可能。
有益效果：
1.本发明以普通小麦中国春和栽培黑麦荆州黑麦为例，公开了一种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新型染色体分带方法，染色方法简单快捷，节省成本，可以同时对批量染色体制片进行处理，染液可重复利用，获得的染色体带型清晰稳定。
2.本发明为染色体原位杂交自动化分析和商业化检测提供了可能。
3.本发明公布了9个染色体寡核苷酸探针，并发展了三种探针染液，说明本发明提供的方法的可行，该染液在中国春及黑麦染色体上产生了丰富带型。
4.本发明说明利用不同浓度和配比混合的寡核苷酸探针可以开发染色体涂染试剂盒，具有重要的商业价值。
附图说明
图1探针终浓度为33.33ng/μl(GAA)5、(GAA)10和(GAA)19长度ND-FISH比较结果。a-b图：(GAA)5DAPI染色和ND-FISH；c-d图：(GAA)10DAPI染色和ND-FISH；e-f图：(GAA)19DAPI染色和ND-FISH。可以看出(GAA)5信号很弱，(GAA)10和(GAA)19信号明显好于(GAA)5。
图2探针终浓度为333.3ng/μl(GAA)5和探针终浓度为0.01ng/μl(GAA)10长度ND-FISH比较结果。a-b图：(GAA)5DAPI染色和ND-FISH；c-d图：(GAA)10DAPI染色和ND-FISH。可以看出(GAA)5终浓度达到333.3ng/μl和终浓度为仅为0.01ng/μl(GAA)10均可产生清晰的杂交信号，但浓度却相差33333倍。
图3pAs1-1、pAs1-2、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-5和pAs1-6探针ND-FISH及利用质粒pAs1定位结果。a图：pAs1-1(红)和质粒pAs1(绿)FISH；b图：pAs1-2(红)和质粒pAs1(绿)FISH；c图：pAs1-3(红)和质粒pAs1(绿)FISH；d图：pAs1-4(红)和质粒pAs1(绿)FISH；e图：pAs1-5(红)和质粒pAs1(绿)FISH；f图：pAs1-6(红)和质粒pAs1(绿)FISH。可以看出pAs1-1和pAs1-5产生与质粒pAs1相似的杂交信号，pAs1-2、pAs1-3、pAs1-4和pAs1-6产生了与质粒pAs1不同的杂交信号。
图4“染液1”对中国春染色体染色结果，绿色为pSc119.2-1，红色为pAs1-1和pAs1-5。可以看出中国春染色体上产生了清晰稳定的杂交信号。
图5“染液2”对中国春染色体染色结果，绿色为(GAA)10，红色为pAs1-1和pAs1-5。可以看出中国春染色体上产生了清晰稳定的杂交信号。
图6同一染缸“染液3”对不同批次黑麦染色体染色结果，绿色为pSc119.2-1，红色为(AAC)10。a图：第1批次染色结果图片；b图：第5批次染色结果图片。由图可以看出，与第1批次相比，第5批次染色结果同样产生了清晰稳定的杂交信号，说明染液可重复多次利用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
实施例1
以发展普通小麦中国春寡聚核苷酸探针染液涂染中国春染色体为例
利用SSR重复序列GAA、质粒DNApSc119.2和pAs1核心序列人工合成寡聚核苷酸探针(GAA)5、(GAA)10、(GAA)19、pSc119.2-1、pAs1-1、pAs1-2、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-5和pAs1-6；利用非变性荧光原位杂交对不同长度寡聚核苷酸探针(GAA)5、(GAA)10、(GAA)19进行信号强度比较，选择能够低浓度高效侵染染色体的寡居核苷酸，获得(GAA)10(见图1)，同样获得探针pSc119.2-1、pAs1-1、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-5和pAs1-6；根据各探针原位杂交信号强度选择各探针最优浓度，(GAA)10(0.01ng/μl)、pSc119.2-1(0.2ng/μl)、pAs1-1(0.3ng/μl)、pAs1-3(5ng/μl)、pAs1-4(10ng/μl)、pAs1-5(0.3ng/μl)和pAs1-6(5ng/μl)(见图2和图3)；根据探针浓度配比，对不同探针进行混合加在灭菌的2×SSC(0.015MC6H5Na3O7.2H2O-0.15MNaCl)中，配成探针染液，最终混合了两种探针染液分别为“染液1”(0.2ng/μlpSc119.2-1，0.3ng/μlpAs1-1和0.3ng/μlpAs1-5，见图4)和“染液2”(0.01ng/μl(GAA)10，0.3ng/μlpAs1-1和0.3ng/μlpAs1-5，见图5)。分别取组配好的染液30ml盛放于玻璃染色缸中，将准备好的根尖中期染色体制片置于探针染液中，于37℃培养相中染色6h-7h后，取出载玻片，用蒸馏水冲洗3次，滴加6μlVECTASHIELDMountingMediumforFluorescencewithDAPI(Vector)，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察照相。
实施例2
以发展黑麦寡聚核苷酸探针染液涂染荆州黑麦染色体为例
利用SSR重复序列AAC和质粒DNApSc119.2核心序列人工合成寡聚核苷酸探针(AAC)10和pSc119.2-1；利用非变性荧光原位杂交对不同长度寡聚核苷酸探针进行信号强度比较，并根据各探针原位杂交信号强度选择各探针最优浓度(AAC)10(0.02ng/μl)、pSc119.2-1(0.2ng/μl)、pAs1-1(0.3ng/μl)、pAs1-3(5ng/μl)、pAs1-4(10ng/μl)、pAs1-5(0.3ng/μl)和pAs1-6(5ng/μl)；根据探针浓度配比，对不同探针进行混合加在灭菌的2×SSC(0.015MC6H5Na3O7.2H2O-0.15MNaCl)中，配成探针“染液3”(0.01ng/μl(AAC)10和0.2ng/μlpSc119.2-1)。将准备好的根尖中期染色体制片置于探针染液中，37℃杂交染色6h后，取出载玻片，用蒸馏水冲洗3次，滴加6μlVECTASHIELDMountingMediumforFluorescencewithDAPI(Vector)，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察照相。用同一染缸“染液3”顺序进行5次试验，以检测染液的可重复利用性(见图6)。
表1中国春及黑麦寡居核苷酸探针标记
可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新方法，开发染液的寡核苷酸探针序列特征如下：
2.一种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)以发展普通小麦中国春寡聚核苷酸探针染液涂染中国春染色体为例，利用SSR重复序列GAA、质粒DNApSc119.2和pAs1核心序列人工合成寡聚核苷酸探针(GAA)5、(GAA)10、(GAA)19、pSc119.2-1、pAs1-1、pAs1-2、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-5和pAs1-6；
(2)利用非变性荧光原位杂交对步骤(1)中不同长度的寡聚核苷酸探针(GAA)5、(GAA)10、(GAA)19进行信号强度比较，选择能够在低浓度下高效侵染染色体的寡居核苷酸，发现(GAA)10，同样获得探针pSc119.2-1、pAs1-1、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-5和pAs1-6；
(3)根据各探针原位杂交信号强度选择各探针最优浓度，(GAA)10(0.01ng/μl)、pSc119.2-1(0.2ng/μl)、pAs1-1(0.3ng/μl)、pAs1-3(10ng/μl)、pAs1-4(10ng/μl)、pAs1-5(0.3ng/μl)和pAs1-6(10ng/μl)；
(4)按照步骤(3)中探针浓度配比，对不同探针进行混合加在灭菌的2×SSC(0.015MC6H5Na307.2H2O-0.15MNaCl)中。
(5)将准备好的根尖中期染色体制片置于步骤(4)中探针染液中，37℃杂交6h后，取出载玻片，用蒸馏水冲洗3次，滴加6μlVECTASHIELDMountingMediumforFluorescencewithDAPI(Vector)，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察照相。
3.权利要求2所述的利用寡聚核苷酸探针在发展人类、动物和植物染色体寡聚核苷酸探针染液上的应用。
4.权利要求2所述利用本发明方法利用寡聚核苷酸探针染液在商业化试剂盒开发及商业化检测中的应用。
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