CN106566876B - 一种寡核苷酸探针及其获得方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种获得寡核苷酸探针的方法，其是从公共数据库下载农作物物种基因组序列，进行过滤后找出串联重复序列，再对初步查找到的重复序列进行筛选，然后将剩下的串联重复序列与已知的探针序列进行比对，去掉已经使用的探针序列，将筛选剩下的串联重复序列进行比对，以进行探针设计并将设计好的探针序列进行合成、验证后，获得能起作用的寡核苷酸序列。本发明成本低，效率高，能用于农作物染色体的非变性荧光原位杂交(ND‑FISH)分析，明确探针所代表的串联重复序列在染色体上的分布，了解染色体的结构特点，建立染色体特定界标，从而识别农作物特定的染色体或染色体区段，使开发的新寡核苷酸探针具有染色体或染色体区段特异性。

Description

一种寡核苷酸探针及其获得方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种寡核苷酸探针及其获得方法。

背景技术

在作物远缘杂交育种、异源多倍化及植物染色体进化研究中，用FISH技术对染色体结构进行分析是必须的。在农作物相关研究中，FISH技术在识别作物染色体也是必不可少的。例如小麦族植物FISH分析中，重复序列pSc119.2、pAs1、pTa71、CCS1、(AAG)n和(AAC)n是常用的探针。最近日本人又开发出了新的重复序列探针pTa-86、pTa-120p、pTa-126、pTa-465、pTa-535p、Ta-566p和Ta-713等用于小麦染色体的结构分析。重复序列的重要作用之一是构成染色体的特定结构，利用重复序列作探针对染色体进行FISH分析，明确探针序列在染色体上的分布，建立染色体特定界标，从而达到识别染色体、了解染色体的结构功能和基因组进化的目的。然而，利用以上提到的这些重复序列作探针时需要进行序列克隆和探针标记，比较费时费力，成本高。

因此，唐宗祥等(2014)根据这些常用的探针序列设计出了一系列寡核苷酸探针(专利号：ZL201410001939.X)，用以代替这些重复序列对麦类作物染色体进行非变性荧光原位杂交(ND-FISH)分析，取得了很好的效果。ND-FISH技术也应用于芝麻等农作物。寡核苷酸探针和ND-FISH技术的应用，使得作物染色体FISH分析过程得到极大的简化、成本降低。然而，目前用于作物染色体ND-FISH分析的探针主要是以微卫星寡核苷酸序列为主，还有极少数非微卫星序列。这些能用于ND-FISH分析的寡核苷酸探针都不是染色体和染色体区段特异的。利用这些已报道的寡核苷酸探针，只有当染色体结构完整时，才能有效地对染色体进行准确识别。一旦染色体结构发生变化如断裂、缺失和易位等，利用这些探针就很难准确识别染色体，尤其是对具体染色体区段的识别更困难。目前开发出的能用于ND-FISH鉴定作物染色体的寡核苷酸探针非常有限，尤其是作物染色体特异和染色体区段特异的寡核苷酸探针更为缺乏。因此，有必要建立一种新的方法，开发出更多的、农作物染色体特异的、能用于ND-FISH分析的新寡核苷酸探针，以利于准确识别农作物染色体和染色体区段，了解特定染色体和染色体区段的结构特点。

以下为几种现有技术：

第一种、根据已有的探针序列进行寡核苷酸探针的设计，比如利用已有的串联重复序列pSc119.2,pAs1,pTa-535,pTa71和CCS1等设计寡核苷酸探针(专利ZL201410001939.X)。缺点为：(1)尽管非微卫星寡核苷酸探针如Oligo-pSc119.2,Oligo-pAs1,Oligo-pTa-535,Oligo-pTa71和Oligo-CCS1等，能对麦类作物和其它作物的染色体进行杂交、在一定条件下能够帮助识别一些麦类作物的染色体，但其识别程度有限，因为这些探针同时在多条染色体上产生杂交信号，有的杂交信号位置相似，而且这些探针在不少作物的染色体区段上还没有清晰可辨的杂交信号。也就是说，利用目前这些探针，只有在染色体完整无缺的情况下，同时采用多种探针才能够准确识别一些作物的染色体。但是，如果染色体发生断裂、缺失或相互之间发生易位，采用这些探针往往不能准确分辨是何种染色体发生了断裂、缺失和易位。而根据这些探针序列设计的寡核苷酸探针其效果与原序列是一样的，因此也会存在同样的弊端；(2)目前能用于农作物染色体ND-FISH分析的有效寡核苷酸探针极其有限，总数不超过20条；远远不能满足对麦类作物和其它作物染色体的结构分析和染色体区段的精确识别，因此必须找到合适的方法开发更多的符合需要的寡核苷酸探针；(3)根据已有的探针序列设计寡核苷酸探针，其效果也只能与原序列一样，很难产生新的效果。

第二种、利用微卫星串联重复序列作为寡核苷酸探针，比如(AAG)n、(AAC)n、(AG)n、(ACT)n和(ATC)n等。缺点为：(1)这些微卫星探针虽然能对麦类作物和其它作物的染色体进行杂交、在一定条件下能够帮助识别一些麦类作物的染色体，但其识别程度有限，因为这些探针同时在多条染色体上产生杂交信号，而且这些探针在不少染色体区段上还没有清晰可辨的杂交信号；也就是说，利用目前这些微卫星探针，只有在染色体完整无缺的情况下，并借组其它探针才能够准确识别一些作物的染色体；但是，如果染色体发生断裂、缺失或相互之间发生易位，采用这些探针往往不能准确分辨是何种染色体发生了断裂、缺失和易位；(2)用微卫星序列也不能得到大量合适的寡核苷酸探针，因为受重复单位的限制，碱基的组合有限，往往产生相同的效果，比如用(AAG)n和(AAC)n对普通小麦染色体进行FISH分析，效果比较一致。

第三种、用Slaf-seq的方法对麦类植物基因组DNA进行高通量测序，然后选择出现频率高的序列设计寡核苷酸探针。缺点为：(1)目前利用Slaf-seq的方法获得的寡核苷酸探针也只能用于鉴定小麦背景中的黑麦染色体；(2)利用Slaf-seq的方法进行寡核苷酸探针设计的盲目性比较大，尤其是对于基因组庞大的麦类作物，而且Slaf-seq的方法测序成本也相对较高；此外，Slaf-seq的方法对于寻找新串联重复序列难度也大，因为其测序长度有限。

第四种、利用生物信息学方法，集团性分离特定染色体的单拷贝序列，将根据单拷贝序列设计的大量寡核苷酸作为探针，用变性的方式与染色体杂交，以识别特定染色体。缺点为：(1)根据单拷贝序列，集团性开发寡核苷酸探针的方法中，涉及生物信息学分析、PCR、反转录和片段克隆等过程，程序也较繁杂；(2)该方法设计的探针，能和整条特定染色体或染色体臂杂交，从而能识别整条特定染色体或染色体臂，但不能识别特定染色体的局部区段，不具备染色体区段特异性。

第五种、基于全基因组序列的特异性等温寡核苷酸探针的批量获取方法，利用设计算法获得病菌全基因组的特有基因片段序列，批量设计邓文寡核苷酸探针，结合基因芯片扫描，实现致病菌全基因组的扫描分析，发展用于检测已知细菌特异性基因、毒力基因的检测芯片(专利申请号：201510849278.0)。缺点为：(1)只针对基因序列进行探针设计，不能反映重复序列在染色体上的分布情况；(2)旨在开发基因检测芯片，不能研究染色体的结构；(3)不能用于染色体的ND-FISH分析。

第六种、提供了一种寡核苷酸探针，该探针从5’-3’端依次由与靶序列互补的序列、G-四链体封闭序列和G-四链体序列组成；G-四链体封闭序列与部分G-四链体序列互补，形成稳定的发夹结构，将G-四链体序列封闭在探针内部。进行靶分子检测时，探针首先识别靶序列并形成双链结构，随后在Lambda核酸外切酶的消化作用下，打开发夹结构、释放G-四链体序列，循环往复，最终将微量靶分子信息转换为大量G-四链体序列，再通过G-四链体序列转换为可读的光、电等信号；该探针虽然可实现单链核酸的直接检测，也能对可诱导产生单链核酸的双链核酸及其它分子进行间接检测(专利申请号：201610204305.3)；但具有以下缺点：(1)只能在DNA水平上检测单链核酸或可诱导产生单链核酸的双链核酸及其它分子，不能反映重复序列在染色体上的分布情况；(2)不能用来研究染色体的结构；(3)不能用于染色体的ND-FISH分析。

第七种、利用PROBER软件开发FISH寡核苷酸探针，该软件首先屏蔽掉重复序列，找到单拷贝序列，设计100-200bp长的寡核苷酸探针，用于染色体的变性FISH分析。缺点为；(1)着眼于单拷贝序列，不能反映重复序列在染色体上的分布；(2)寡核苷酸探针较长，通过合成途径较昂贵，探针标记途径繁琐。

综上所述，有必要对现有技术做进一步完善。

发明内容

针对上述问题，本发明提出了一种成本低，效率高，能用于农作物染色体的非变性荧光原位杂交(ND-FISH)分析，明确探针所代表的串联重复序列在染色体上的分布，了解染色体的结构特点，建立染色体特定界标，从而识别农作物特定的染色体或染色体区段，使开发的新寡核苷酸探针具有染色体或染色体区段特异性的寡核苷酸探针及其获得方法。

本发明的技术方案如下：

上述的寡核苷酸探针，其主要包括以下寡核苷酸序列：

Oligo-1AS.20:AACTTTTTTCAAATTCGATG；

Oligo-4AL.20:TGAAAAAAGTTCATCAAATT；

Oligo-6AS.4:TCGATGAACTTTTTCAAAT；

Oligo-3AS.49:GACACCGAGGCACCGTAAACCCTAATGGTTAGGTTTAGGTGGCTCCGTC；

Oligo-5BL.49:AAGTTGATGGCTTTAGGTGGTTCCGTCGACCCCGAGCCACCCTAGACCC；

Oligo-10.13.4:GGGTTTTGGTGGCTCGGGGTCGACGAAAACACCTAAAGCTATCAGTTA；

Oligo-5AL.44:TAGCTCTACAAGCTAGTTCAAATAATTTTACACTAGAGTTGAAC；

Oligo3B.61:GCCTGAAAATTACAACTTTTCGACACCGCCACGTGTAAGCCCGACCCAAACA CAACCC；

Oligo-M18s-3:GGAGG CGCGC TGCCA CGGGC GGCAG GGCTGT TCGGC CTTGC GTTTGGGCTG AAAAC GAG；

Oligo-M74471:AGTAGC AGTAGC AGTAGC AGTAGC。

所述寡核苷酸探针，其中：所述寡核苷酸序列Oligo-1AS.20和Oligo-4AL.20作探针与小麦染色体杂交时，与小麦5A染色体短臂亚端部杂交，用于识别小麦5A染色体短臂亚端部区域；所述寡核苷酸序列Oligo-6AS.4作探针与黑麦染色体杂交时，在黑麦1R染色体短臂和黑麦6R染色体短臂产生杂交信号，黑麦6R染色体短臂上的信号强于黑麦1R染色体短臂上的信号，用于鉴定黑麦1R染色体短臂和黑麦6R染色体短臂区段，并根据信号强弱将黑麦1R染色体短臂和黑麦6R染色体短臂区分开；所述寡核苷酸序列Oligo-3AS.49、Oligo-5BL.49和Oligo-10.13.4作探针与小麦染色体杂交时，与小麦7D染色体长臂端部产生杂交信号，用于识别小麦7D染色体长臂端部区段；所述寡核苷酸序列Oligo-5AL.44作探针与黑麦染色体杂交时，在黑麦5R染色体长臂上产生杂交信号，用于识别黑麦5R染色体长臂区段；所述寡核苷酸序列Oligo3B.61为探针与小麦染色体杂交时，在小麦3B染色体长臂端部产生杂交信号，用于特异鉴定小麦3B染色体长臂端部区段；所述寡核苷酸序列Oligo-M18s-3为探针与玉米染色体杂交时，在6号染色体上产生杂交信号，用于特异识别玉米6号染色体；所述寡核苷酸序列Oligo-M74471为探针与玉米染色体杂交时，在1号和4号染色体长臂上产生杂交信号，且在4号染色体上的信号强于1号染色体上的信号，用于特异识别玉米1号和4号染色体并且根据信号强弱将1号和4号染色体区分开。

一种寡核苷酸探针的获得方法，是从公共数据库下载农作物物种基因组序列，进行过滤后找出串联重复序列，再对初步查找到的重复序列进行筛选，然后将剩下的串联重复序列与已知的探针序列进行比对，去掉已经使用的探针序列，将筛选剩下的串联重复序列进行比对，以进行探针设计并将设计好的探针序列进行合成、验证后，获得能起作用的寡核苷酸序列。

上述获得寡核苷酸探针的方法，其中，具体步骤如下：(1)从公共数据库下载小麦及其近缘种属，以及玉米的基因组序列，用perl语言编程对原始序列进行过滤，去掉过短的序列，然后用Refind、TRF软件找出串联重复序列；(2)用perl语言编程对初步查找到的重复序列进行筛选，编程过程中设置四个关键参数即重复单位、拷贝数、相似度和插入或缺失比率；(3)用植物基因组数据库中的blast工具，将剩下的串联重复序列与已知的探针序列进行比对，去掉目前已经使用的探针序列，进一步缩小串联重复序列的选择范围；(4)用植物基因组数据库中的blast工具对上述步骤(3)筛选剩下的串联重复序列进行比对，分析序列在染色体上的分布特点，根据序列所处的染色体位置、拷贝数高低以及序列匹配长短来决定用于探针设计的序列；(5)将设计好的探针序列进行探针合成；(6)待探针合成后，逐条进行非变性荧光原位杂交(ND-FISH)试验，验证探针；(7)探针验证结束后，获得能起作用的寡核苷酸序列。

所述获得寡核苷酸探针的方法，其中：所述步骤(2)中所述的重复单位大于6，拷贝数大于10，相似度大于70％，插入或缺失比率小于15％。

所述获得寡核苷酸探针的方法，其中：所述步骤(5)具体是采用固相亚磷酰胺三酯法，在DNA合成时，对5'端碱基进行荧光标记，以获得用于非变性荧光原位杂交(ND-FISH)分析的探针。

所述获得寡核苷酸探针的方法，其中，所述步骤(6)具体操作流程为：将合成的探针用1倍的TE缓冲液溶解，然后再用1倍的TE缓冲液和2倍的SSC缓冲液等体积混合液稀释10倍，成为工作液，再每张富有染色体的载玻片上加0.4-0.5μl工作液，盖上盖玻片于湿润盒子中放置1个小时，再用2倍的SSC缓冲液洗涤1次，加上荧光染料DAPI后进行显微镜观察。

所述获得寡核苷酸探针的方法，其中：所述步骤(6)在非变性荧光原位杂交(ND-FISH)验证过程中杂交时间为1个小时。

有益效果：

本发明寡核苷酸探针的获得方法设计探针的成本低，效率高，一方面利用了目前公布的农作物基因组序列，另一方面在生物信息学分析过程中，将不同生物信息学方法有机整合，同时设置了4个关键参数，将4个关键参数恰当匹配，能准确找到目标序列，从而方便了探针的设计。与前人的方法相比，减少了基因组DNA提取、酶切反应、PCR反应和DNA片段克隆等复杂过程。

本发明是从寻找新的串联重复序列(非微卫星序列)入手，根据新的串联重复序列，设计新的寡核苷酸探针，与前人所用探针相比，这些寡核苷酸探针具有染色体区段特异性，而且这些探针能用于农作物染色体的ND-FISH分析，明确探针所代表的串联重复序列在染色体上的分布，了解染色体的结构特点，建立染色体特定界标，从而识别农作物特定的染色体或染色体区段，具有染色体或染色体区段特异性并且使用方便，用于农作物染色体ND-FISH分析的寡核苷酸探针，使开发的新寡核苷酸探针具有染色体或染色体区段特异性。

附图说明

图1为本发明寡核苷酸探针中探针Oligo-4AL.20与小麦中国春染色体杂交，只在5AS亚端部产生杂交信号的示图；

图2为本发明寡核苷酸探针中探针Oligo-6AS.4与黑麦染色体杂交，只在1RS和6RS产生杂交信号的示图；

图3为本发明寡核苷酸探针中探针Oligo-5BL.49与小麦中国春染色体杂交，只在7DL端部产生杂交信号的示图；

图4为本发明寡核苷酸探针中探针Oligo-5AL.44只在黑麦5RL上产生杂交信号的示图；

图5为本发明寡核苷酸探针中探针Oligo3B.61与小麦中国春染色体杂交，只在3BL端部产生杂交信号的示图；

图6为本发明寡核苷酸探针中探针Oligo-M18s-3与玉米B73染色体杂交，只在6号染色体上产生杂交信号示图；

图7为本发明寡核苷酸探针中探针Oligo-M74471与玉米B73染色体杂交，只在1号和4号染色体上产生强弱不同的杂交信号的示图。

具体实施方式

本发明寡核苷酸探针的获得方法，是一种用于非变性荧光原位杂交(ND-FISH)鉴定农作物特定染色体的获得寡核苷酸探针的方法，其具体步骤如下：

(1)从公共数据库如NCBI(美国国立生物技术信息中心)、IWGSC(国际小麦基因组测序联合会)、MaizeGDB(玉米遗传学和基因组学数据库)、EnsemblPlants(植物基因组数据库)等下载小麦及其近缘种属，以及玉米的基因组序列，用perl语言编程对原始序列进行过滤，去掉过短的序列，然后用Refind、TRF软件找出串联重复序列。这一步查找到上万条的串联重复序列。

(2)用perl语言编程对初步查找到的大量重复序列进行筛选，编程过程中设置四个关键参数，即：重复单位(Period Size)大于6，拷贝数(Copy Number)大于10，相似度(Percent Matches)大于70％，插入或缺失比率(Percent Indels)小于15％，筛选后剩下少量串联重复序列。

(3)用植物基因组数据库中的blast工具，将剩下的少量串联重复序列与已知的探针序列进行比对，去掉目前已经使用的探针序列，进一步缩小串联重复序列的选择范围。

(4)用植物基因组数据库(EnsemblPlants)中的blast工具对第(3)步筛选剩下的串联重复序列进行比对，分析序列在染色体上的分布特点，根据序列所处的染色体位置、拷贝数高低以及序列匹配长短等决定用于探针设计的序列。

(5)将设计好的探针序列进行探针合成，具体方法主要是固相亚磷酰胺三酯法，在DNA合成时，对5'端碱基进行荧光标记，以获得用于非变性荧光原位杂交(ND-FISH)分析的探针。

(6)待探针合成后，逐条进行非变性荧光原位杂交(ND-FISH)试验，验证探针，非变性荧光原位杂交(ND-FISH)验证过程中，杂交时间为1个小时；具体操作流程为：将合成的探针用1倍的TE溶解(TE是一种通用的缓冲液)(100μl/OD值)，然后再用1倍的TE和2倍的SSC(SSC是一种通用的缓冲液)等体积混合液稀释10倍，成为工作液，在每张富有染色体的载玻片上加0.4-0.5μl工作液，盖上盖玻片于湿润盒子中放置1个小时，然后用2倍的SSC洗涤1次，加上DAPI(DAPI是一种通用的荧光染料)后进行显微镜观察。

(7)获得的能起作用的寡核苷酸序列。

其中，上述寡核苷酸探针的获得方法中得到的寡核苷酸序列包括：

Oligo-1AS.20:AACTTTTTTCAAATTCGATG；

Oligo-4AL.20:TGAAAAAAGTTCATCAAATT；

Oligo-6AS.4:TCGATGAACTTTTTCAAAT；

Oligo-3AS.49:GACACCGAGGCACCGTAAACCCTAATGGTTAGGTTTAGGTGGCTCCGTC；

Oligo-5BL.49:AAGTTGATGGCTTTAGGTGGTTCCGTCGACCCCGAGCCACCCTAGACCC；

Oligo-10.13.4:GGGTTTTGGTGGCTCGGGGTCGACGAAAACACCTAAAGCTATCAGTTA；

Oligo-5AL.44:TAGCTCTACAAGCTAGTTCAAATAATTTTACACTAGAGTTGAAC；

Oligo3B.61:GCCTGAAAATTACAACTTTTCGACACCGCCACGTGTAAGCCCGACCCAAACA CAACCC；

Oligo-M18s-3:GGAGG CGCGC TGCCA CGGGC GGCAG GGCTGT TCGGC CTTGC GTTTGGGCTG AAAAC GAG；

Oligo-M74471:AGTAGC AGTAGC AGTAGC AGTAGC。

上述各寡核苷酸序列都能起到应有的功能：

(1)以寡核苷酸序列Oligo-1AS.20和Oligo-4AL.20作探针与小麦染色体杂交时，都只与5AS(小麦5A染色体短臂)亚端部杂交，因此，能用这两条探针识别小麦5AS亚端部区域(图1)。

(2)以寡核苷酸序列Oligo-6AS.4作探针，与黑麦染色体杂交时，只在1RS(黑麦1R染色体短臂)和6RS(黑麦6R染色体短臂)产生杂交信号，而6RS上的信号强于1RS上的信号(图2)。因此该探针可以用于鉴定1RS和6RS区段，并根据信号强弱将1RS和6RS区分开。

(3)以寡核苷酸序列Oligo-3AS.49、Oligo-5BL.49和Oligo-10.13.4作探针与小麦染色体杂交时，只与7DL(小麦7D染色体长臂)端部产生杂交信号(图3)，因此这3条探针可以用来识别7DL端部区段。

(4)以寡核苷酸序列Oligo-5AL.44作探针，与黑麦染色体杂交时，只在5RL(黑麦5R染色体长臂)上产生杂交信号(图4)，因此该探针可以用来识别黑麦5RL区段。

(5)以寡核苷酸序列Oligo3B.61为探针，与小麦染色体杂交时，只在3BL(小麦3B染色体长臂)端部产生杂交信号(图5)。因此，该探针可以用来特异鉴定小麦3BL端部区段。

(6)以寡核苷酸序列Oligo-M18s-3为探针，与玉米染色体杂交时，只在6号染色体上产生杂交信号(图6)。因此，该探针可以用来特异识别玉米6号染色体。

(7)以寡核苷酸序列Oligo-M74471为探针，与玉米染色体杂交时，只在1号和4号染色体长臂上产生杂交信号，而且在4号染色体上的信号明显强于1号染色体上的信号(图7)。因此，该探针可以用来特异识别玉米1号和4号染色体，并且根据信号强弱可以将1号和4号染色体区分开。

以上10条寡核苷酸序列的探针使作物染色体FISH实验变得简便易行。以上寡核苷酸序列的获得，省去了探针的标记过程，通过公司以较低价格合成后就可直接使用，避免了自己实验室探针标记失败的情况，探针成本降低。同时，它们都可以用于非变性荧光原位杂交(ND-FISH)分析(以上实验结果都是用ND-FISH分析获得的)，避免了杂交过程中染色体和探针变性过程，而且杂交时间只需1个小时。

本发明在玉米、小麦、黑麦上都应用成功，说明具有通用性，也应该能用于水稻、油菜等其它作物。另外，随着麦类作物基因组测序的进一步发展，用本专利申请的技术方案还将会找到更多的适合麦类作物的寡核苷酸探针。作物不同品种、不同个体的基因组序列都有差异，随着测序技术的发展，测序成本将大幅度降低，将会对众多作物品种和个体进行测序，利用本发明将会找到作物品种或个体特异的寡核苷酸探针。

本发明成本低，效率高，能用于农作物染色体的非变性荧光原位杂交(ND-FISH)分析，明确探针所代表的串联重复序列在染色体上的分布，了解染色体的结构特点，建立染色体特定界标，从而识别农作物特定的染色体或染色体区段，使开发的新寡核苷酸探针具有染色体或染色体区段特异性。

Claims (6)

1.一种寡核苷酸探针，其特征在于，主要包括以下寡核苷酸序列：

Oligo-1AS.20: AACTTTTTTCAAATTCGATG；

Oligo-4AL.20: TGAAAAAAGTTCATCAAATT；

Oligo-6AS.4: TCGATGAACTTTTTCAAAT；

Oligo-3AS.49:GACACCGAGGCACCGTAAACCCTAATGGTTAGGTTTAGGTGGCTCCGTC；

Oligo-5BL.49:AAGTTGATGGCTTTAGGTGGTTCCGTCGACCCCGAGCCACCCTAGACCC；

Oligo-10.13.4:GGGTTTTGGTGGCTCGGGGTCGACGAAAACACCTAAAGCTATCAGTTA；

Oligo-5AL.44: TAGCTCTACAAGCTAGTTCAAATAATTTTACACTAGAGTTGAAC；

Oligo3B.61:GCCTGAAAATTACAACTTTTCGACACCGCCACGTGTAAGCCCGACCCAAACACAA CCC；

Oligo-M18s-3: GGAGG CGCGC TGCCA CGGGC GGCAG GGCTGT TCGGC CTTGC GTTTGGGCTG AAAAC GAG；

Oligo-M74471: AGTAGC AGTAGC AGTAGC AGTAGC。

2.如权利要求1所述的寡核苷酸探针，其特征在于：所述寡核苷酸序列Oligo-1AS.20和Oligo-4AL.20作探针与小麦染色体杂交时，与小麦5A染色体短臂亚端部杂交，用于识别小麦5A染色体短臂亚端部区域；

所述寡核苷酸序列Oligo-6AS.4作探针与黑麦染色体杂交时，在黑麦1R染色体短臂和黑麦6R染色体短臂产生杂交信号，黑麦6R染色体短臂上的信号强于黑麦1R染色体短臂上的信号，用于鉴定黑麦1R染色体短臂和黑麦6R染色体短臂区段，并根据信号强弱将黑麦1R染色体短臂和黑麦6R染色体短臂区分开；

所述寡核苷酸序列Oligo-3AS.49、Oligo-5BL.49和Oligo-10.13.4作探针与小麦染色体杂交时，与小麦7D染色体长臂端部产生杂交信号，用于识别小麦7D染色体长臂端部区段；

所述寡核苷酸序列Oligo-5AL.44作探针与黑麦染色体杂交时，在黑麦5R染色体长臂上产生杂交信号，用于识别黑麦5R染色体长臂区段；

所述寡核苷酸序列Oligo3B.61为探针与小麦染色体杂交时，在小麦3B染色体长臂端部产生杂交信号，用于特异鉴定小麦3B染色体长臂端部区段；

所述寡核苷酸序列Oligo-M18s-3为探针与玉米染色体杂交时，在6号染色体上产生杂交信号，用于特异识别玉米6号染色体；

所述寡核苷酸序列Oligo-M74471为探针与玉米染色体杂交时，在1号和4号染色体长臂上产生杂交信号，且在4号染色体上的信号强于1号染色体上的信号，用于特异识别玉米1号和4号染色体并且根据信号强弱将1号和4号染色体区分开。

3.一种如权利要求1或2任一所述的寡核苷酸探针的获得方法，其特征在于，是从公共数据库下载农作物物种基因组序列，进行过滤后找出串联重复序列，再对初步查找到的重复序列进行筛选，然后将剩下的串联重复序列与已知的探针序列进行比对，去掉已经使用的探针序列，将筛选剩下的串联重复序列进行比对，以进行探针设计并将设计好的探针序列进行合成、验证后，获得能起作用的寡核苷酸序列；

所述寡核苷酸探针的获得方法，具体步骤如下：

（1）从公共数据库下载小麦及其近缘种属，以及玉米的基因组序列，用perl语言编程对原始序列进行过滤，去掉过短的序列，然后用Refind、TRF软件找出串联重复序列；

（2）用perl语言编程对初步查找到的重复序列进行筛选，编程过程中设置四个关键参数即重复单位、拷贝数、相似度和插入或缺失比率；所述的重复单位大于6，拷贝数大于10，相似度大于70%，插入或缺失比率小于15%；

（3）用植物基因组数据库中的blast工具，将剩下的串联重复序列与已知的探针序列进行比对，去掉目前已经使用的探针序列，进一步缩小串联重复序列的选择范围；

（4）用植物基因组数据库中的blast工具对上述步骤（3）筛选剩下的串联重复序列进行比对，分析序列在染色体上的分布特点，根据序列所处的染色体位置、拷贝数高低以及序列匹配长短来决定用于探针设计的序列；

（5）将设计好的探针序列进行探针合成；

（6）待探针合成后，逐条进行非变性荧光原位杂交试验，验证探针；

（7）探针验证结束后，获得能起作用的寡核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的获得寡核苷酸探针的方法，其特征在于：所述步骤（5）具体是采用固相亚磷酰胺三酯法，在DNA合成时，对5'端碱基进行荧光标记，以获得用于非变性荧光原位杂交分析的探针。

5.如权利要求3所述的获得寡核苷酸探针的方法，其特征在于，所述步骤（6）具体操作流程为：将合成的探针用1倍的TE缓冲液溶解，然后再用1倍的TE缓冲液和2倍的SSC缓冲液等体积混合液稀释10倍，成为工作液，在每张富有染色体的载玻片上加0.4-0.5μl工作液，盖上盖玻片于湿润盒子中放置1个小时，再用2倍的SSC缓冲液洗涤1次，加上荧光染料DAPI后进行显微镜观察。

6.如权利要求3所述的获得寡核苷酸探针的方法，其特征在于：所述步骤（6）在非变性荧光原位杂交验证过程中杂交时间为1个小时。

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