CN114540348B - 毛竹寡核苷酸探针 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了毛竹寡核苷酸探针，包括7种探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑3及SEQ ID NO:6‑9所示。本发明首先利用已发表毛竹基因组测序数据，利用生物信息学方法分析毛竹基因组中重复序列，开发毛竹寡核苷酸探针，同时利用SSR和端粒序列开发毛竹寡核苷酸探针。然后利用新开发的寡核苷酸探针对毛竹及17个近缘竹属竹种染色体组分析，构建毛竹及其近缘种高清FISH核型，目的是建立经济高效且通用性强的毛竹细胞学标记设计技术与染色体识别技术，丰富竹类植物染色体标记，从细胞遗传学角度分析毛竹及其近缘野生种的基因组类型，同时对一些竹种染色体结构变异进行鉴定。

Description

毛竹寡核苷酸探针
本申请为申请号2021102861221、申请日2021年03月17日、发明名称“一种毛竹寡核苷酸探针及其获得方法和使用方法”的分案申请。
技术领域
本发明涉及寡核苷酸探针技术领域，具体涉及毛竹寡核苷酸探针。
背景技术
竹类植物是世界上生长最快的植物，具有重要的经济、生态和文化价值，其笋可以食用，茎秆可以加工成竹地板、竹席、竹炭及各类竹工艺品等，竹类植物四季常绿，是园林绿化及山地造林的重要植物。据不完全统计，全世界约25亿人经济来源依靠竹类植物，竹类植物贸易总额，每年约25亿美元。
全世界竹类植物约有1500个种，可分为温带木本竹种(temperate woodybamboos)、新热带木本竹种(neotropical woody bamboos)、古热带木本竹种(palaeotropical woody bamboos)和草本竹种(tribe Olyreae)四种类型，其中温带木本竹种染色体数目为2n＝46-48，新热带木本竹种染色体数目为2n＝40-48，古热带木本竹种染色体数目为2n＝70-72，草本竹种染色体数目为2n＝22-24。根据一些竹种的染色体数目表现，一些研究者推测，竹类植物染色体基数为X＝12，其中温带木本竹种(2n＝46-48)和新热带木本竹种(2n＝40-48)为4倍体，古热带木本竹种(2n＝70-72)为6倍体。后来一些研究者发现还有一些竹种染色体数目为2n＝64；96及104，如果以染色体基数为X＝12推算，染色体数目为2n＝64及104的竹种倍性无法确定，因此推测竹类植物染色体基数可能为X＝8，而不是X＝12。
为了对竹类植物基因组类型及演化历史有更清晰的认识，一些研究者选择了两个二倍体竹种Olyra latifolia(Ola)(2n＝22)和Raddiaguianensis(Rgu)(2n＝22)、一个四倍体竹种Guadua angustifolia(2n＝4x＝46)和一个六倍体竹种Bonia amplexicaulis(2n＝6x＝72)3种不同倍性的竹种进行了测序分析，根据这些竹种的基因组测序数据，对竹类植物基因组演化历史进行了揭示，推测大约在4.2亿年前，木本竹种从草本竹种中分化出来，并快速形成A、B、C、D四个不同的亚基因组，在后期进化过程中，B基因组与C基因组竹种杂交产生了基因组类型为BBCC的新热带木本竹种，C基因组与D基因组竹种杂交，形成了基因组为CCDD的温带木本竹种，后来又经过漫长的进化，A基因组竹种与基因组为BBCC的新热带木本竹种杂交，形成了染色体组类型为AABBCC的异源六倍体热带木本竹种。毛竹染色体数目为2n＝48，为温带木本竹种，根据上面分子系统学研究结果，其基因组类型应为CCDD，但毛竹(Phyllostachys edulis(Carrière)J.Houz.)测序结果显示，其是一个二倍体竹种，与以上染色体组分类系统不完全吻合。在整个竹类植物中，温带木本竹种在数量上占有绝对优势，这些温带木本竹种在基因组类型上是否存在差异？另外，竹类植物是一种兼性生殖植物，即可通过有性生殖繁殖后代，也可通过无性生殖扩大群体，这种特殊的繁殖方式为竹类植物保存各种遗传变异提供了良好的条件。竹类植物中目前存在着大量的变种及变型，这些变种及变型间在染色体结构上是否存在差异？目前仅靠少数几个竹种的测序结果还无法对这些问题进行有效揭示。
在植物基因组结构研究中，荧光原位杂交技术是一项非常有用的细胞遗传学技术，借助一些探针在染色体上的物理分布，可对植物染色体结构、染色体组类型、染色体核型及外源染色体等进行精细分析和鉴定。利用荧光原位杂交技术分析植物染色体的前提条件是有合适和充足的荧光探针，也即染色体物理标记。然而，目前竹类植物染色体物理标记非常匮乏，除了45S rDNA外，几乎没有可用的染色体物理标记，目前仅有45S rDNA在毛竹、斑竹(Phyllostachys bambusoides f.lacrima-deae)、龟甲竹(Phyllostachysheterocycla(Carr.)Mitford)、茶秆竹(Pseudoasa amabilis var.amabilis)、菲白竹(Sasa fortunei)、日本矮竹(Sasa pygmea)、铺地竹(Sasa argenteastriatus)及白绿竹(Bambusa oldhamii(W))等8个竹种染色体上的分布特点的报道，大部分竹种的细胞遗传学工作还停留在染色体计数或传统的核型分析等初级细胞遗传学研究水平，这些研究仅能揭示竹类植物染色体数目及形态大小等信息，并不能对竹类植物染色体组类型及染色体结构变异等进行有效分析。竹类植物属于小染色体物种，染色体数目不仅多，而且染色体形态非常小，有些染色体甚至呈点状，部分染色体个体在形态及大小上也非常相似，因此如果没有相应的染色体物理标记作辅助，很难对竹类植物染色体结构变异及染色体组类型等进行精细分析和鉴定。可以说竹类植物染色体物理标记缺乏已成为制约竹类植物细胞遗传学发展的技术瓶颈。
寡核苷酸荧光原位杂交技术是一种以单链寡核苷酸为探针的新型荧光原位杂交技术，这些寡核苷酸探针是一种新型的染色体物理标记，可从已测序物种的基因组中开发。另外，与传统的BAC-FISH技术相比，寡核苷酸荧光原位杂交技术省去了质粒DNA扩繁、提取及探针标记等繁琐步骤，而且实验更加简化和高效。目前毛竹全基因组测序工作已经完成，其基因组大小约2.05Gb，其中转座元件类型的重复序列约占整个基因组的59％，显示毛竹重复序列寡核苷酸探针具有很大的开发空间。
发明内容
本发明要解决的技术问题：本发明首次为竹类植物设计一种经济高效且通用性强的寡核苷酸探针，并首次建立竹类植物寡核苷酸荧光原位杂交技术体系，填补竹类植物染色体物理标记为零的空白；并应用新设计的寡核苷酸探针对包括毛竹在内的18个竹种基因组进行分析，建立毛竹及其近缘种龟甲竹、花毛竹、黄竿乌哺竹、斑竹、高节竹、紫竹、四季竹、金镶玉竹、白哺鸡竹及雷竹等11个竹种的高清FISH核型。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了毛竹寡核苷酸探针，其包括7种探针，7种探针的核苷酸序列如下：
探针Oligo MZ-DL-3，如SEQ ID NO:1所示：TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGG；
探针Oligo MZ-5S-1，如SEQ ID NO:2所示：ATGGAGAGCATGAGGTTGGGGACGGAGGGGAGTTAAGGGG；
探针Oligo Ba-14，如SEQ ID NO:3所示：TCAACAAGGGGGAGGTCTGAGCGGCTAAGATCTCCAGAGAGGAGGTCCTAACG；
探针Oligo Ba-131X-1，如SEQ ID NO:6所示：GTAGGGCACACTAGAAGTCCATTATGGGTGTTTGGTATTGATTTTCTTTCCGTGCCTC；
探针Oligo Ba-131X-2，如SEQ ID NO:7所示：GATTTCATAAAGTGGAGCTCAGGGTACGCGTCGTTCTGGAAAGTTTCACACCGGCTCGG；
探针Oligo Ba-131X-3，如SEQ ID NO:8所示：AAAGATTCCAAATGCACCTAGAAATGACTTCATAAAGTGGAGCTCAGGGTACCCGT；
探针Oligo Ba-131X-4，如SEQ ID NO:9所示：CGTTCTGGAAAGTTTCACACCTGCTCGGAATTATTCCAAATGCACCTAGAAATGAC。
进一步地，每条探针5'端均标记荧光基团。
本发明的有益效果：
1、本发明首先利用已发表的毛竹基因组测序数据，利用生物信息学方法分析毛竹基因组中的重复序列，开发毛竹寡核苷酸探针，同时利用SSR和端粒序列开发毛竹寡核苷酸探针。然后利用新开发的寡核苷酸探针对毛竹及其17个近缘竹属竹种的染色体组进行分析，构建毛竹及其近缘种的高清FISH核型，目的是建立经济高效且通用性强的毛竹细胞学标记设计技术与染色体识别技术，丰富竹类植物染色体标记，从细胞遗传学角度分析毛竹及其近缘野生种的基因组类型，同时对一些竹种染色体结构变异进行鉴定。
2、本发明利用毛竹测序数据和生物信息学分析，首次为毛竹成功开发了寡核苷酸探针标记，为低成本高效率开发竹类植物细胞学标记建立了一种新的有效方法。
3、本发明根据寡核苷酸探针在竹类植物染色体上的分布特征，构建了毛竹及近缘种高清FISH核型，对一些温带木本竹种的基因组类型及分化进行了有效鉴定，为识别毛竹与其近缘野生种基因组、染色体及染色体结构变异奠定了技术基础，为竹类植物相关的分子细胞遗传学研究开辟了新的研究领域。
附图说明
图1为新开发的寡核苷酸探针Oligo Ba-131X-1、Oligo Ba-131X-2、Oligo Ba-131X-3及Oligo Ba-131X-4在毛竹染色体上的分布情况，其中a1，b1及c1红色信号分别为Oligo Ba-131X-1、Oligo Ba-131X-3及Oligo Ba-131X-4，a2，b2及c2绿色信号均为OligoBa-131X-2，a3，b3及c3黄色信号分别为Oligo Ba-131X-1、Oligo Ba-131X-3及Oligo Ba-131X-4与Oligo Ba-131X-2荧光共定位结果。
可以看出来源于同一重复序列单元的Oligo Ba-131X-1、Oligo Ba-131X-2、OligoBa-131X-3及Oligo Ba-131X-4在毛竹每一条染色体上均有杂交信号，且分布位置完全相同，与Oligo Ba-131X-1、Oligo Ba-131X-2及Oligo Ba-131X-3序列相比，Oligo Ba-131X-4产生发荧光信号略弱。
图2为新开发的寡核苷酸探针Oligo MZ-CL22-1、Oligo MZ-CL22-2及Oligo MZ-5S-1在毛竹染色体上的分布情况，其中d1和d2分别为Oligo MZ-CL22-1(绿色)和Oligo MZ-CL22-2(红色)在毛竹染色体上的分布，d3为Oligo MZ-CL22-1和Oligo MZ-CL22-2在毛竹染色体上共定位结果。e1和e2分别为Oligo MZ-CL22-1(红色)和Oligo Ba-131X-2(绿色)在毛竹染色体上的分布，e3为Oligo MZ-CL22-1(红色)和Oligo Ba-131X-2(绿色)在毛竹染色体上共定位结果。f1和f2分别为Oligo MZ-5S-1(红色)和5S rDNA(绿色)在毛竹染色体上的分布，f3为Oligo MZ-5S-1(红色)和5S rDNA(绿色)在毛竹染色体上共定位结果。f4和f5分别为Oligo MZ-5S-1(红色)和5S rDNA(绿色)在雷竹染色体上的分布，f6为Oligo MZ-5S-1(红色)和5S rDNA(绿色)在雷竹染色体上共定位结果。
可以看出新开发的寡核苷酸探针Oligo MZ-CL22-1、Oligo MZ-CL22-2及OligoMZ-5S-1均可在毛竹染色体上产生杂交信号，且Oligo MZ-CL22-1、Oligo Ba-131X-2在毛竹染色体上的分布位置和模式也完全相同。另外寡核苷酸探针Oligo MZ-5S-1产生的荧光与5S rDNA也完全共定位。
图3为新开发的寡核苷酸探针Oligo Ba-14(红色)及Oligo MZ-DL-3(红色)在毛竹染色体上的分布，其中g2和g3分别为Oligo Ba-14(红色)及Oligo MZ-DL-3(红色)在毛竹染色体上的分布，g1为红色荧光通道所拍摄的Oligo Ba-14信号。
可以看出Oligo Ba-14及Oligo MZ-DL-3在毛竹染色体上均有杂交信号。
图4为利用新开发的寡核苷酸探针Oligo MZ-CL22-1对刚竹属竹种黄竿乌哺鸡竹、白哺鸡、斑竹、龟甲竹、花毛竹、高节竹和雷竹进行分析，其中h1-h6分别为Oligo MZ-CL22-1(红色)在黄竿乌哺鸡竹、白哺鸡竹、斑竹、龟甲竹、花毛竹和高节竹染色体上的分布情况，h7为Oligo MZ-CL22-1(绿色)在雷竹染色体上的分布情况。
可以看出Oligo MZ-CL22-1在黄竿乌哺鸡竹、白哺鸡竹、斑竹、龟甲竹、花毛竹、高节竹和雷竹染色体上均可产生杂交信号，且7个竹种Oligo MZ-CL22-1分布模式相似，每条染色体上均有荧光信号存在。
图5为利用新开发的寡核苷酸探针Oligo MZ-CL22-1(红)及45SrDNA(绿色)对刚竹属竹种紫竹进行分析，其中I1和I3为红色通道拍摄的Oligo MZ-CL22-1信号，I1上绿色信号为45SrDNA信号，I2和I4为信号与染色体叠加图。
可以看出寡核苷酸探针Oligo MZ-CL22-1(红)在刚竹属竹种紫竹染色体上也可以产生丰富的杂交信号，Oligo MZ-CL22-1在紫竹染色体上的分布模式与同属的毛竹、龟甲竹、黄竿乌哺鸡竹、白哺鸡竹、斑竹、花毛竹、高节竹及雷竹等竹种分布模式不同，Oligo MZ-CL22-1在紫竹染色体上有2种分布模式，第一种模式其48条染色体中，有11条染色体没有Oligo MZ-CL22-1信号，另外还有一条染色体Oligo MZ-CL22-1信号非常微弱，如I1和I2箭头所示，其余36条染色体均有较强的Oligo MZ-CL22-1信号分布(I1-I2)，第二种分布模式中，其48条染色体中有36条染色体具有Oligo MZ-CL22-1信号分布，另外12条染色体没有任何Oligo MZ-CL22-1信号(I3-I4)。另外，紫竹染色体上有2个45S rDNA(绿色)，其中一个45SrDNA位点信号较强，另外一个位点非常微弱，有时甚至检测不到。
图6为寡核苷酸探针Oligo MZ-CL22-1(红)、45SrDNA(绿色)及Oligo MZ-5S-1在京竹、金镶玉及四季竹染色体的分布情况，其中J1-J3分别为Oligo MZ-CL22-1(红色)及45SrDNA(绿色)在京竹染色体上的分布，J4-J6分别为Oligo MZ-CL22-1(红色)及Oligo MZ-5S-1(绿色)在金镶玉竹种染色体上的分布，J7-J8分别为Oligo MZ-CL22-1(红色)及45SrDNA(绿色)在四季竹染色体上的分布。
可以看出寡核苷酸探针Oligo MZ-CL22-1在京竹染色体上也有两种分布模式，第一种分布模式中，京竹48条染色体中，有10条染色体没有Oligo MZ-CL22-1信号分布，另外还有2条染色体仅有微弱的Oligo MZ-CL22-1信号(图J1-J2，标号11和12的染色体)，其余36条染色体均有较强的Oligo MZ-CL22-1信号，第二种分布模式中，京竹48条染色体中，有12条染色体完全没有Oligo MZ-CL22-1信号，另外36条染色体均有较强的Oligo MZ-CL22-1信号(图J3)。Oligo MZ-CL22-1在金镶玉竹种染色体上的分情况与京竹第二种分布模式较为相似，48条染色体中，有12条没有任何荧光信号，另外36条染色体均具有Oligo MZ-CL22-1信号(图J4)，另外，Oligo MZ-5S-1在金镶玉竹种中有3个位点，其中两个位点位于一对染色体中间，另外一个位点位于染色体端部。位于染色体臂中间的两个位点在信号强度上存在极大差异，其中一个信号较强，另外一个位点信号极弱，几乎检测不到(图J5-J6箭头所示)。Oligo MZ-CL22-1在四季竹上的分布模式非常特殊，48条染色体中，24条染色体具有OligoMZ-CL22-1信号，另外24条染色体没有任何Oligo MZ-CL22-1信号(J7-J8)。另外，45SrDNA(绿色)在四季竹染色体上有2个位点分布，两条具有45SrDNA的染色体中，一条染色体具有Oligo MZ-CL22-1信号，另一条却没有Oligo MZ-CL22-1信号，如图J8箭头所示。
图7为寡核苷酸探针Oligo MZ-CL22-1在茶杆竹、大明竹、橄榄竹、摆竹、苦竹及唐竹染色体上的分布，K1-K6分别为茶杆竹、大明竹、橄榄竹、摆竹、苦竹及唐竹。
可以看出寡核苷酸探针Oligo MZ-CL22-1在茶杆竹、大明竹、橄榄竹、摆竹、苦竹及唐竹染色体上没有任何信号分布。
图8为新开发的寡核苷酸探针Oligo MZ-DL-3对唐竹、斑竹、金镶玉竹、四季竹、龟甲竹、高节竹、白哺鸡竹、茶杆竹及黄竿乌哺鸡竹染色体进行了分析，可以看出，Oligo MZ-DL-3在这9个竹种染色体上均可产生荧光信号，基本上位于染色体端部，不同竹种在荧光强度上存在一定差异，其中Oligo MZ-DL-3在唐竹、四季竹及白哺鸡竹3个竹种上的荧光强度较强，在斑竹、金镶玉、龟甲竹染色体上的信号较弱。
图9为根据Oligo MZ-CL22-1及45S rDNA在部分竹种上的分布情况，构建的毛竹、龟甲竹、花毛竹、黄竿乌哺鸡竹、斑竹、高节竹、紫竹、四季竹、金镶玉竹、白哺鸡竹及雷竹的高清FISH核型图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。文中如果没有特别说明，其中的百分含量均为重量百分含量。
本发明所用部分试剂如下：
TE缓冲液由10mMTris-HCl和1mM EDTA组成。
2×SSC缓冲液由0.3M的柠檬酸三钠C6H5Na3O7·2H2O和3M的NaCl组成。
1×PBS缓冲液由0.14M NaCl、0.0027M KCl、0.01M Na2HPO4、0.0018M KH2PO4组成。
DAPI缓冲液由0.1M柠檬酸和0.05M Na2HPO4组成。
实施例1、毛竹寡核苷酸探针的获得方法
登录(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6204424/#sup1)网站，下载毛竹测序数据，然后利用CD-HIT Suite(http://weizhong-lab.ucsd.edu/cdhit_suite/cgi-bin/index.cgi？cmd＝cd-hit)、DNAMAN(http://www.lynnon.com)和RepeatMasker(http://www.repeatmasker.org/)寻找全部重复序列，按照period size(>4)，copy number(>100)，period size×copy number>3000条件筛选出有效重复序列，按拷贝数从多到少排列，从中设计了80条寡核苷酸序列，合成相应的寡核苷酸探针，然后利用毛竹中期染色体制片对这80条荧光探针进行荧光原位杂交筛选，发现Oligo MZ-CL22-1，Oligo MZ-CL22-2，Oligo Ba-131X-1，Oligo Ba-131X-2，Oligo Ba-131X-3，Oligo Ba-131X-4及Oligo Ba-14均可在毛竹染色体上产生荧光信号，其中Oligo MZ-CL22-1，OligoMZ-CL22-2，Oligo Ba-131X-1，Oligo Ba-131X-2，Oligo Ba-131X-3及Oligo Ba-131X-4在毛竹染色体上分布模式非常相似，均分布在每一条染色体的近着丝粒处。Oligo MZ-CL22-1与Oligo MZ-CL22-2来源于同一重复序列单元的不同区段序列，通过双色FISH证实，OligoMZ-CL22-1与Oligo MZ-CL22-2在毛竹染色体上的分布位置完全重叠(图2，d1-d3)，这两个探针可以作为一个探针使用，同时使用会使荧光信号增强。Oligo Ba-131X-1，Oligo Ba-131X-2、Oligo Ba-131X-3，及Oligo Ba-131X-4这4段寡核苷酸序列是由一条较长的重复序列单元截成4个区段而获得，通过双色FISH证实，这4段序列在毛竹的分布位置也完全重叠(图1，a1-c3)，这4个探针可以作为一个探针使用，同时使用会使荧光信号增强。之后选用Oligo MZ-CL22-1和Oligo Ba-131X-2再次进行双色FISH，结果证实这两个探针在毛竹染色体上的分布位置也完全重叠(图2，e1-e3)。Oligo Ba-14在毛竹染色体上呈现弥散状分布，其中有4条染色体具有很强的端部信号，另外还有两条染色体着丝粒区域具有很强的荧光信号，还有一对染色体几乎整个染色体臂均具有很强的荧光信号(图3，g1-g2，箭头所示)。Oligo MZ-5S-1是利用毛竹基因组DNA序列与小麦5S rDNA序列(GenBank:M10470.1)进行比对分析，根据分析结果，截取同源序列上的一段，设计出一定数量的寡核苷酸探针，然后利用毛竹中期染色体与所设计的探针进行荧光原位杂交分析，发现Oligo MZ-5S-1在毛竹染色体上有荧光信号，之后利用5S rDNA进行定位分析，Oligo MZ-5S-1与5S rDNA信号重叠(图2，f1-f3)，且在龟甲竹、花毛竹及雷竹(图2，f4-f6)等竹种上均可产生荧光信号。MZ-DL-3是截取端粒重复序列上的一段获得，定位后发现其在毛竹染色体端部产生荧光信号(图3，g3)。所获探针如下(5'端标记了荧光基团，但所标记荧光基团并不限于此)：
探针Oligo MZ-DL-3：Digoxigenin-5'-TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGG-3'
探针Oligo MZ-5S-1：TAMRA-5'-ATGGAGAGCATGAGGTTGGGGACGGAGGGGAGTTAAGGGG-3'；
探针Oligo Ba-14：FAM-5'-TCAACAAGGGGGAGGTCTGAGCGGCTAAGATCTCCAGAGAGGAGGTCCTAACG-3'；
探针Oligo MZ-CL22-1：TAMRA-5'-AATAATTCCGAGCAGGTGTGAAACTTTCCAGAACGA-3'；或FAM-5'-AATAATTCCGAGCAGGTGTGAAACTTTCCAGAACGA-3'；
探针Oligo MZ-CL22-2：FAM-5'-TATGAAATCGAGGCACGGAAAGAAAATCAACACCAAACAC-3'；
探针Oligo Ba-131X-1：FAM-5'-GTAGGGCACACTAGAAGTCCATTATGGGTGTTTGGTATTGATTTTCTTTCCGTGCCTC-3'；
探针Oligo Ba-131X-2：TAMRA-5'-GATTTCATAAAGTGGAGCTCAGGGTACGCGTCGTTCTGGAAAGTTTCACACCGGCTCGG-3'；
探针Oligo Ba-131X-3：FAM-5'-AAAGATTCCAAATGCACCTAGAAATGACTTCATAAAGTGGAGCTCAGGGTACCCGT-3'；
探针Oligo Ba-131X-4：FAM-5'-CGTTCTGGAAAGTTTCACACCTGCTCGGAATTATTCCAAATGCACCTAGAAATGAC-3'。
实施例2、毛竹寡核苷酸探针的使用方法
本发明利用从毛竹基因组中开发出的Oligo MZ-CL22-1(由于Oligo MZ-CL22-1、Oligo MZ-CL22-2、Oligo Ba-131X-1、Oligo Ba-131X-2、Oligo Ba-131X-3及Oligo Ba-131X-4功能相同，从其中选择了Oligo MZ-CL22-1)，Oligo MZ-DL-3及Oligo MZ-5S-1寡核苷酸探针对毛竹及其近缘竹属竹种进行了分析，所用探针浓度均为66.7ng/μl。
1、试验材料
所用毛竹和17个近缘竹属竹种均采集于浙江农林大学翠竹园(表1)。
表1：18个竹种的采样信息
Figure BDA0003556876050000081
Figure BDA0003556876050000091
2、荧光原位杂交涂染分析探针
具体包括以下步骤：
(1)前期准备
(a)染色体制片的制备：将不同竹种的根尖从固定液中取出，先用预冷的双蒸水处理10min，再用预冷的0.075M的KCL溶液处理10min，用刀片切取不同竹种的根尖分生区，分别放入2.5％纤维素酶和果胶酶的混合液中，37℃酶解1.5h，酶解结束后，吸去酶液，之后分别用预冷的TE缓冲液和无水乙醇各处理3次，每次5min，无水乙醇处理结束后，吸去无水乙醇，加入适量的固定液(乙酸:乙醇按体积比9:1配制)，用镊子将根尖夹碎，制备成细胞悬浮液，进行染色体滴片，每张载玻片滴加7μl细胞悬浮液，让细胞悬浮液在载玻片上缓慢散开，再于空气中气干染色体制片，利用相差显微镜对染色体制片进行观察和筛选，筛选出优质的染色体制片，用于后续荧光原位杂交实验。
(b)染色体制片预处理：每张染色体制片先加入40μl RNA酶，盖上盖玻片，于37℃处理1h，之后取下盖玻片，加入40μl胃蛋白酶，盖上盖玻片，于37℃处理10min，再取下盖玻片，加入4％多聚甲醛，盖上盖玻片，于室温下处理10min，最后取下盖玻片于70％v/v、90％v/v及100％v/v的乙醇进行梯度脱水，每级酒精处理5min，脱水结束后，气干。
(c)染色体制片变性：预处理后的染色体制片放在0.15M的NaOH溶液中42℃变性7min，再于室温条件下分别在70％v/v、95％v/v、100％v/v的乙醇中梯度脱水各5min，吹干染色体制片。
(d)杂交液的制备：先在离心管中配制杂交液，1张染色体制片所用杂交液包括去离子甲酰胺(分析纯)9μl、2×SSC缓冲液1.8μl、50wt％的硫酸葡聚糖溶液2.4μl、10mg/ml鲑鱼精DNA 0.6μl、Oligo探针1.2μl和ddH2O 3.0μl；杂交液在离心管内混匀后在100℃变性13min，然后将离心管立即置于-20℃的无水乙醇中冷却10-15min；
(2)荧光原位杂交混合涂染分析
将步骤(d)的杂交液滴到步骤(c)的染色体制片上，盖上盖玻片，于37℃杂交6-8h；室温条件下取下盖玻片，分别用2×SSC缓冲液浸泡3次，各10min；再用1×PBS缓冲液浸泡5min；将染色体制片沥干，在每张染色体制片上加含0.5μg/mL DAPI的DAPI缓冲液500μl，染色10-15min，用DAPI缓冲液冲洗4-5次，吹干染色体制片，滴12μl防荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，用荧光显微镜照相获取荧光原位杂交图片(图4-图7)。从图4可以看出，Oligo MZ-CL22-1在黄竿乌哺鸡竹、白哺鸡竹、斑竹、龟甲竹、花毛竹、高节竹和雷竹7个竹种的每一条染色体近着丝粒区域均可产生荧光信号，且信号分布模式与毛竹相似。Oligo MZ-CL22-1在紫竹、金镶玉竹、京竹及四季竹4个竹种染色体上也可产生清晰的荧光信号，但是其荧光信号分布模式与毛竹、黄竿乌哺鸡竹、白哺鸡竹、斑竹、龟甲竹、花毛竹、高节竹及雷竹情况不同，Oligo MZ-CL22-1在紫竹染色体上有2种分布模式，第一种模式如I1和I2所示，48条染色体中，有37条染色体具有Oligo MZ-CL22-1信号(红色信号)，其中有36条染色体信号清晰可见，另外1条染色体Oligo MZ-CL22-1信号非常微弱，几乎检测不出来，如I1和I2图中箭头所示，另外还有11条染色体完全没有信号(图5)；第二种分布模式如I3和I4所示，有36条染色体具有明显的Oligo MZ-CL22-1信号，另外12条染色体完全没有Oligo MZ-CL22-1信号(图5)，另外，由图5还可以看出，45S rDNA在紫竹同源染色体上存在明显差异，其中一条染色体的45S rDNA信号较强，而另外一条染色体的45S rDNA信号极弱，有时甚至检测不到，如图5，I4箭头所示，这一结果暗示着紫竹其中一条染色体在45S rDNA区域发生过染色体片段的缺失。Oligo MZ-CL22-1在京竹染色体上分布模式与紫竹相似，也存在2种分布模式，第一种分布模式中，有38条染色体具有Oligo MZ-CL22-1信号，其中36条染色体的Oligo MZ-CL22-1信号较强，另外还有1对染色体信号极弱，几乎检测不到，另外有10条染色体完全没有信号(图6，J1-J2)；第二种分布模式中，有36条染色体具有较强的Oligo MZ-CL22-1信号，另外12条染色体完全没有Oligo MZ-CL22-1信号(图6，J3)。Oligo MZ-CL22-1在金镶玉竹种上有一种分布模式，其48条染色体中有36条染色体具有清晰的Oligo MZ-CL22-1信号，另外12条染色体完全没有Oligo MZ-CL22-1信号(图6，J4)。图6，J5-J6是利用Oligo MZ-5S-1和OligoMZ-CL22-1对金镶玉竹种进行双色FISH分析，可以看出Oligo MZ-5S-1在金镶玉竹种上有3个位点，其中2个位点位于一对同源染色体上，另外一个位点单独位于染色体臂末端，位于同源染色体上的两个Oligo MZ-5S-1信号在强度上存在很大差异，1个信号强度较强，另外一个非常微弱，几乎检测不到，如图6，J5-J6箭头所示(图6)，这一结果暗示着金镶玉竹种在这一区域可能发生过DNA片段缺失或插入等遗传变异。J7-J8是Oligo MZ-CL22-1及45SrDNA在四季竹染色体上的分布情况，可以看出，其48条染染色体中，其中24条具有OligoMZ-CL22-1信号，另外24条染色体完全没有Oligo MZ-CL22-1信号(图6)。K1-K6分别为OligoMZ-CL22-1在茶杆竹、大明竹、橄榄竹、摆竹、苦竹及唐竹染色体上的分布，可以看出OligoMZ-CL22-1在这6个竹种染色体上没有任何信号(图7)。根据OligoMZ-CL22-1在18种不同竹种上的分布结果，我们可以初步确定竹类植物染色体基数为X＝12，18个竹种在染色体组类型上可初步分成4类：第一类主要包括刚竹属的毛竹、花毛竹、斑竹、高节竹、黄竿乌哺鸡竹、白哺鸡竹、雷竹及龟甲竹，这8个竹种具有相同的染色体组类型，第二类主要包括刚竹属的紫竹、金镶玉竹及京竹，这3个竹种的染色体组类型与毛竹等竹种大部分相同，另外可能增加了1套其他类型的染色体组。第三类主要为四季竹，我们推测四季竹为异源四倍体，有2个不同的染色体组，其中1套染色体组与毛竹等竹种其中的1套染色体组相同，另外一套染色体组未知。第四类主要包括茶杆竹、大明竹、橄榄竹、摆竹、苦竹及唐竹，这6个竹种在染色体组类型上与毛竹等竹种没有重叠，属于完全不同的基因组类型。以上结果说明本发明可以初步分析和识别不同竹种的染色体组。
图8是新开发的寡核苷酸探针Oligo MZ-DL-3对唐竹、斑竹、金镶玉竹、四季竹、龟甲竹、高节竹、白哺鸡竹、茶杆竹及黄竿乌哺鸡竹染色体进行了分析，可以看出，Oligo MZ-DL-3在这9个竹种染色体上均可产生荧光信号，基本上位于染色体端部，不同竹种在荧光强度上存在一定差异，其中Oligo MZ-DL-3在唐竹、四季竹及白哺鸡竹3个竹种上的荧光强度较强，在斑竹、金镶玉竹、龟甲竹染色体上的信号较弱，这些结果说明，这些竹种染色体端粒序列在拷贝数上存在一定差异。另外，在黄竿乌哺鸡竹一些染色体着丝粒部位也观察到了Oligo MZ-DL-3信号，说明这几条染色体发生断裂及重接过程，导致端粒信号在着丝粒部位出现。
根据Oligo MZ-CL22-1及45S rDNA在不同竹种上的分布特征，把11个竹种的染色体剪切出来，按照染色体长度从长到短原则构建了毛竹、龟甲竹、花毛竹、黄竿乌哺竹、斑竹、高节竹、紫竹、四季竹、金镶玉竹、白哺鸡竹及雷竹等11个竹种的高清FISH核型(图9)，从图9可以看出，根据Oligo MZ-CL22-1及45S rDNA等探针信号分布模式，进一步提高了这些竹种的染色体核型配对准确性，并且可以看出，四季竹第3对染色体具有45S rDNA信号，但是这一对同源染色体中，其中一条近端部具有Oligo MZ-CL22-1荧光信号，另外一条却没有Oligo MZ-CL22-1荧光信号，说明其中一条染色体染色体片段在结构上发生过遗传变异，显示出本发明可以用于染色体结构变异识别。
以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江农林大学
<120> 毛竹寡核苷酸探针
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Oligo MZ-DL-3(人工序列)
<400> 1
tttagggttt agggtttagg g 21
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Oligo MZ-5S-1(人工序列)
<400> 2
atggagagca tgaggttggg gacggagggg agttaagggg 40
<210> 3
<211> 53
<212> DNA
<213> Oligo Ba-14(人工序列)
<400> 3
tcaacaaggg ggaggtctga gcggctaaga tctccagaga ggaggtccta acg 53
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> Oligo MZ-CL22-1(人工序列)
<400> 4
aataattccg agcaggtgtg aaactttcca gaacga 36
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Oligo MZ-CL22-2(人工序列)
<400> 5
tatgaaatcg aggcacggaa agaaaatcaa caccaaacac 40
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> Oligo Ba-131X-1(人工序列)
<400> 6
gtagggcaca ctagaagtcc attatgggtg tttggtattg attttctttc cgtgcctc 58
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> Oligo Ba-131X-2(人工序列)
<400> 7
gatttcataa agtggagctc agggtacgcg tcgttctgga aagtttcaca ccggctcgg 59
<210> 8
<211> 56
<212> DNA
<213> Oligo Ba-131X-3(人工序列)
<400> 8
aaagattcca aatgcaccta gaaatgactt cataaagtgg agctcagggt acccgt 56
<210> 9
<211> 56
<212> DNA
<213> Ba-131X-4(人工序列)
<400> 9
cgttctggaa agtttcacac ctgctcggaa ttattccaaa tgcacctaga aatgac 56

Claims (2)

1.毛竹寡核苷酸探针，其特征在于，其包括7种探针，7种探针的核苷酸序列如下：
探针Oligo MZ-DL-3，如SEQ ID NO:1所示：TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGG；
探针Oligo MZ-5S-1，如SEQ ID NO:2所示：ATGGAGAGCATGAGGTTGGGGACGGAGGGGAGTTAAGGGG；
探针Oligo Ba-14，如SEQ ID NO:3所示：TCAACAAGGGGGAGGTCTGAGCGGCTAAGATCTCCAGAGAGGAGGTCCTAACG；
探针Oligo Ba-131X-1，如SEQ ID NO:6所示：GTAGGGCACACTAGAAGTCCATTATGGGTGTTTGGTATTGATTTTCTTTCCGTGCCTC；
探针Oligo Ba-131X-2，如SEQ ID NO:7所示：GATTTCATAAAGTGGAGCTCAGGGTACGCGTCGTTCTGGAAAGTTTCACACCGGCTCGG；
探针Oligo Ba-131X-3，如SEQ ID NO:8所示：AAAGATTCCAAATGCACCTAGAAATGACTTCATAAAGTGGAGCTCAGGGTACCCGT；
探针Oligo Ba-131X-4，如SEQ ID NO:9所示：CGTTCTGGAAAGTTTCACACCTGCTCGGAATTATTCCAAATGCACCTAGAAATGAC。
2.根据权利要求1所述的毛竹寡核苷酸探针，其特征在于，每条探针5'端均标记荧光基团。
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GR01 Patent grant
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