CN112708623A - 一种高效涂染花生a、b亚基因组的探针套、设计方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效涂染花生A、B亚基因组的探针套设计及应用方法，利用花生栽培种Tifrunner基因组序列信息，通过生物信息学方法设计了花生A、B亚基因组的探针套，首次建立了涂染花生A或B亚基因组的技术，该技术能够批量涂染花生染色体材料，高效识别花生染色体组成、染色体易位和与亚基因组亲缘关系近的野生种。本发明建立的涂染花生A亚基因组或B亚基因组的技术，可以替代A.duranensis和A.ipaensis基因组DNA为探针的荧光原位杂交对花生亚基因组染色体进行鉴定，且操作步骤简单、成本低、耗时少，大大提高了识别A亚基因组或B亚基因组染色体组成及变异的效率，大大节约了鉴定的时间和成本。

Description

一种高效涂染花生A、B亚基因组的探针套、设计方法及应用

技术领域

本发明涉及一种高效涂染花生A、B亚基因组的探针套、设计方法及应用，属于细胞学技术领域。

背景技术

花生(Arachis hypogaea L.)是世界上重要的油料和经济作物。花生栽培种是异源四倍体包含A和B两个亚基因组。研究认为花生二倍体野生种A.duranensis和A.ipaensis可能分别是花生栽培种A和B亚基因组的供体亲本。花生栽培种可能是由A.duranensis和A.ipaensis经过偶然杂交加倍演化形成四倍体野生种A.monticola，又经过人工驯化最终演化而成。

花生栽培种A和B亚基因组之间存在部分同源关系，但经过长期的自然选择与人工驯化，花生栽培种基因组已经高度二倍体化，形成了两个稳定的、染色体相对独立遗传亚基因组。以A.duranensis和A.ipaensis基因组DNA为探针对花生栽培种进行基因组荧光原位杂交可以有效识别花生A和B亚基因组，鉴定A和B亚基因组染色体间的交换。然而，基因组荧光原位杂交技术繁琐，需要提取DNA、标记探针、片子变性、探针变性和杂交等过程，且探针中含大量单拷贝序列，致使染色体部分同源性高的物种均能杂交。因此，需要建立一种能节约鉴定时间和成本，且高效识别花生A和B亚基因组的方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高效涂染花生A、B亚基因组的探针套的设计及应用方法，可以实现对A亚基因组和B亚基因组材料和变异体的鉴定，以及对野生种与花生亚基因组亲缘关系的鉴定，可用于花生育种材料创制和遗传研究。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种高效涂染花生A、B亚基因组的探针套，包括A亚基因组探针套和B亚基因组探针套，所述A亚基因组探针套包括FAM荧光标记的A-4和A-7，B亚基因组探针套包括TAM荧光标记的B-9和B-10，具体序列为：

A-4：FAM-5'-TGGAAAGCTCTGGATGTCTACTTTCCAACGCCGTTGAGAG-3'；

A-7：FAM-5'-GAGCTACAGAAGTCCAATTGGCGCGCTCTCAACGGCGTTG-3'；

B-9：TAM-5'-AGCAGAAATCAGATTCAGAGGATGAAGAAGGACTGCTGAT-3'；

B-10：TAM-5'-TCTGGAGCTACAGAACTCGAAATGGCGTGCTTCCAATTGC-3'。

所述高效涂染花生A、B亚基因组的探针套的设计方法，包括以下步骤：

(1)利用Tandem Repeats Finder软件，即TRF，搜索花生栽培种Tifrunner参考基因组中的串联重复序列Tandem repeats，即TR，使用TR-tookit软件对TRF输出结果去冗余，得到非冗余TR阵列Non-redundant TR arrays集合，即NR-TR。对获得NR-TR过滤、筛选、聚类得到重复单元大于300bp、拷贝数大于等于50的TR阵列统计数据；

(2)使用B2DSC检测上述TR阵列序列的同源拷贝在花生Tifrunner参考基因组中的分布情况，得到重复序列代表阵列；将重复序列代表阵列从头开始切割为长40bp的片段，步长为5bp的序列，利用CD-HIT的cdhit-est对所得的40bp片段进行聚类，相关参数为“-n 5-c0.85-d 0-aL 0.8-aS 0.8”，获得非冗余序列集合；将非冗余序列分别提交至本地B2DSC比对到Tifrunner参考基因组，其中过滤参数值pident＝90，qcovhsp＝90，观察非冗余序列在A亚基因组或B亚基因组的富集情况，分别得到花生A、B亚基因组的探针套。

所述非冗余序列在A亚基因组或B亚基因组的富集情况为：在A亚基因组染色体富集、分布均匀、平均峰值在20拷贝/Mb以上，在B亚基因组不富集时，最终所得包含两个序列A-4和A-7的A亚基因组探针套。

所述非冗余序列在A亚基因组或B亚基因组的富集情况为：在B亚基因组富集、染色体分布均匀、平均峰值在20拷贝/Mb以上，在A亚基因组不富集时，最终所得包含两个序列B-9和B-10的B亚基因组探针套。

所述高效涂染花生A、B亚基因组的探针套的应用方法，包括以下步骤：

(1)杂交染液配制：将A亚基因组探针套干粉和/或B亚基因组探针套干粉用500μL超纯水溶解；每张制片滴加上述A亚基因组探针套溶液和/或B亚基因组探针套溶液各2μL、2×SSC缓冲液10μL和100μg/mL DAPI原液0.5μL的混合液；所述A亚基因组探针套干粉为0.1OD A-4和0.1OD A-7，B亚基因组探针套干粉为0.1OD B-9和0.1OD B-10；

(2)染色：将(1)中配置的染液滴到花生栽培种Tifrunner根尖细胞中期染色体制片上，盖上盖玻片，37℃染色2-3h；然后去掉盖玻片用蒸馏水冲洗10-15次，吹干之后滴加封片剂并盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察、照相。

2×SSC缓冲液由0.3M的柠檬酸三钠C₆H₅Na₃O₇·2H₂O和3M的NaCl组成。

所述的高效涂染花生A、B亚基因组的探针套在鉴定花生材料中A亚基因组和B亚基因组的组成中的应用。

所述的高效涂染花生A、B亚基因组的探针套在鉴定花生材料中A亚基因组和B亚基因组之间的染色体易位中的应用。

所述的高效涂染花生A、B亚基因组的探针套在确定花生野生种基因组与A和/或B亚基因组间的亲缘关系中的应用。

本发明有益效果：

本发明利用花生栽培种Tifrunner基因组序列信息，通过生物信息学方法设计了花生A、B亚基因组的探针套，首次建立了探针涂染花生A或B亚基因组的技术，该技术能够批量涂染花生染色体材料，高效识别花生染色体组成、染色体易位和与亚基因组亲缘关系近的野生种。

本发明建立的探针涂染花生A亚基因组或B亚基因组的技术，可以替代A.duranensis和A.ipaensis基因组DNA为探针的基因组荧光原位杂交对花生亚基因组染色体进行鉴定，且操作步骤简单、成本低、耗时少，大大提高了识别A亚基因组或B亚基因组染色体组成及变异的效率，大大节约了鉴定的时间和成本。

附图说明

图1为花生亚基因组探针套在Tifrunner参考基因组中的分布。

其中，(a)A亚基因组探针套A-4和A-7在Tifrunner参考基因组中的分布；(b)B亚基因组探针套B-9和B-10在Tifrunner参考基因组中的分布；黑色线条代表探针在染色体上的分布位置。

图2为用A和B亚基因组探针套对Tifrunner染色体的染色结果。

其中，(a)Tifrunner染色体的DAPI染色；(b)A(绿)和B(红)亚基因组探针套对Tifrunner染色体的染色合成图；(c)B(红)亚基因组探针套在Tifrunner染色体上的信号；(d)A(绿)亚基因组探针套在Tifrunner染色体上的信号。

图3a为用A(绿)和B(红)亚基因组探针套对Tifrunner的染色；图3b为用A.duranensis(绿)和A.ipaensis(红)全基因组DNA探针对Tifrunner的原位杂交顺序实验结果。

图4为用A(绿)和B(红)亚基因组探针套对ZW7(a)、Slh(b)和W1824(c)的染色结果。

图5为通过A(绿)和B(红)亚基因组探针套染色鉴定的经过辐射诱变而未产生变异四粒红材料。

其中，(a-p)依次为材料FS2020-8-1、FS2020-8-2、FS2020-14-1、FS2020-18-3、FS2020-22-2、FS2020-28-6、FS2020-29-2、FS2020-29-3、FS2020-30-1、FS2020-36-2、FS2020-38-3、FS2020-39-3、FS2020-39-4、FS2020-51-2、FS2020-27、FS2020-14-2。

图6为通过A(绿)和B(红)亚基因组探针套染色鉴定的经过辐射诱变而产生变异四粒红材料。

其中，(a-i)依次为材料FS2020-372-1、FS2020-2-1、FS2020-23-1、FS2020-26-1、FS2020-28-2、FS2020-34-2、FS2020-35、FS2020-54-1、FS2020-54-3。

图7为A(绿)和B(红)亚基因组探针套对14个花生二倍体野生种染色体染色的结果。

其中，(a-n)依次为A.duranensis(基因组AA)、A.diogoi(基因组AA)、A.herzogii(基因组AA)、A.villosa(基因组AA)、A.microsperma(基因组AA)、A.simpsonii(基因组AA)、A.duranensis-2(基因组AA)、A.ipaensis(基因组BB)、A.valida(基因组BB)、A.batizocoi(基因组KK)、A.trinitensis(基因组FF)、A.stenophylla(基因组EE)、A.pusilla(基因组HH)和A.dardonoi(基因组基因组HH)。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1、一种高效涂染花生A、B亚基因组的探针套的设计方法

(1)利用Tandem Repeats Finder(TRF,v4.09)软件搜索花生栽培种Tifrunner参考基因组(https://www.peanutbase.org/download)中的串联重复序列(Tandem repeats,TR)，使用TR-tookit软件对TRF输出结果去冗余，得到非冗余TR阵列(Non-redundant TRarrays,NR-TR)集合。对获得NR-TR过滤、筛选、聚类得到重复单元大于300bp、拷贝数大于等于50的TR阵列统计数据。

(2)花生A亚基因组探针套设计：使用B2DSC(https://gitee.com/lhtk/b2dsc)检测上述TR阵列序列的同源拷贝在花生Tifrunner参考基因组中的分布情况，结果发现了一个重复单元长度为508bp的代表阵列，其重复单元序列的同源拷贝特异地均匀富集于花生A亚基因组，A亚基因组峰度明显高于B亚基因组。将所得重复序列代表阵列的全长序列从头开始切割为长40bp的序列片段，步长(step)为5bp的序列，利用CD-HIT的cdhit-est对这些40bp片段进行聚类，相关参数为“-n 5-c 0.85-d 0-aL 0.8-aS 0.8”，获得非冗余序列集合。将非冗余序列分别提交至本地B2DSC比对到Tifrunner参考基因组，观察其是否在A或B亚基因组富集(过滤参数值pident＝90,qcovhsp＝90条件下)，若在A亚基因组富集，在B亚基因组不富集则保留，在A、B亚基因组都富集则丢弃。结果获得了包含两个序列的A亚基因组探针套，该探针套在A亚基因组富集染色体分布均匀、平均峰值较高(20拷贝/Mb以上)，在B亚基因组不富集(图1a)，进一步用FAM荧光标记的A-4和A-7，获得A亚基因组探针套。

(3)花生B亚基因组探针套设计：同上(2)中花生A亚基因组探针套的设计方法，获得了包含两个序列的B亚基因组探针套，该探针套在B亚基因组富集染色体分布均匀、平均峰值较高(20拷贝/Mb以上)，在A亚基因组不富集(图1b)，进一步用TAM荧光标记的B-9和B-10，获得B亚基因组探针套。

由图1可知，A亚基因组探针套几乎覆盖了Tifrunner参考基因组A基因组染色体，呈现富集状态，而B亚基因组则几乎没有分布(a)。B亚基因组探针套几乎覆盖了Tifrunner参考基因组B亚基因组染色体，呈现富集状态，而A基因组则几乎没有分布(b)。

实施例2、一种高效涂染花生A、B亚基因组的探针套的应用方法

(1)杂交染液配制：将A亚基因组探针套干粉(A-4和A-7各0.1OD)和/或B亚基因组探针套干粉(B-9和B-10各0.1OD)用500μL超纯水溶解。每张制片滴加上述A亚基因组探针套溶液和B亚基因组探针套溶液各2μL、2×SSC缓冲液(由0.3M的柠檬酸三钠C₆H₅Na₃O₇·2H₂O和3M的NaCl组成)10μL和100μg/mL DAPI原液0.5μL混合液；

(2)染色：将(1)中配置的染液滴到花生栽培种Tifrunner根尖细胞中期染色体制片上，盖上盖玻片，37℃染色2-3h；然后去掉盖玻片用蒸馏水冲洗10-15次，吹干之后滴加封片剂并盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察、照相，获得Tifrunner染色体(图2)。

通过A和B亚基因组探针套对Tifrunner染色体的染色结果，其中(a)为Tifrunner染色体的DAPI染色(染液中未含A亚基因组探针套和B亚基因组探针套)；(b)为A(绿)亚基因组探针套和B(红)亚基因组探针套对Tifrunner染色体的染色合成图；(d)为A(绿)亚基因组探针套在Tifrunner染色体上的信号；(c)B为(红)亚基因组探针套在Tifrunner染色体上的信号。可以看出Tifrunner的20条染色体为红色(图2b、图2c中亮点)，20条染色体为绿色(图2b、图2d中亮点)，表明A和B亚基因组探针套染色可以对Tifrunner染色体染色。

通过顺序实施A亚基因组探针套和B亚基因组探针套染色(图3a)，及A.duranensis和A.ipaensis基因组原位杂交(图3b)，可以看出A亚基因组探针套和B亚基因组探针套染色结果与A.duranensis和A.ipaensis基因组原位杂交结果一致，表明A和B亚基因组探针套染色结果可以替代A.duranensis和A.ipaensis基因组原位杂交识别花生A和B亚基因组。

实施例3、花生亚基因组的探针套识别花生材料A和B亚基因组的组成

利用花生A、B亚基因组的探针套(A亚基因组探针套和B亚基因组探针套)对花生野生种A.monticola(Zw7)、四粒红(Slh)和二倍体野生种A.duranensis与A.ipaensis杂种F₁W1824进行染色、照相。根据红绿染色体数目，可以发现Zw7和Slh包含20条红色信号(图中亮点)染色体，20条绿色信号(图中亮点)染色体，表明Zw7和Slh均为正常的异源四倍体(图4a和4b)，其A和B亚基因组染色体未发生明显的变化。W1824为10条红色信号(图中亮点)染色体，10条绿色信号(图中亮点)染色体(图4c)，表明W1824为真实的二倍体野生种A.duranensis与A.ipaensis杂种F₁。

实施例4、花生亚基因组的探针套识别花生染色体易位

利用花生A、B亚基因组的探针套(A亚基因组探针套和B亚基因组探针套)同时对25个花生四粒红Co⁶⁰-γ辐射材料进行染色、照相。

其中发现有16个材料(图5a-p)A和B亚基因组染色体为20条绿色信号(图中亮点)，20条红色信号(图中亮点)，与四粒红相比没有明显变化，说明没有发生明显的染色体交换。

但有9个材料(图6a-i)出现了1-4条红色与绿色信号相连接的染色体，表明这些染色体发生了A和B亚基因组易位。因此，该方法可以鉴定A和B亚基因组间的易位。

实施例5、花生亚基因组的探针套确定花生野生种基因组与A和B亚基因组间的亲缘关系

利用花生A、B亚基因组的探针套(A亚基因组探针套和B亚基因组探针套)对14个花生野生种A.duranensis(基因组AA)、A.diogoi(基因组AA)、A.herzogii(基因组AA)、A.villosa(基因组AA)、A.microsperma(基因组AA)、A.simpsonii(基因组AA)、A.duranensis-2(基因组AA)、A.ipaensis(基因组BB)、A.valida(基因组BB)、A.batizocoi(基因组KK)、A.trinitensis(基因组FF)、A.stenophylla(基因组EE)、A.pusilla(基因组HH)和A.dardonoi(基因组HH)进行批量染色、照相。

发现A.duranensis、A.diogoi、A.herzogii、A.villosa、A.microsperma、A.simpsonii和A.duranensis-2出现强的绿色信号(图中亮点)，弱的红色信号(图中亮点不明显)；A.ipaensis、A.valida、A.batizocoi和A.trinitensis出现强的红色信号(图中亮点)，弱的绿色信号(图中亮点不明显)；A.stenophylla染色体两种信号均较强，而A.pusilla和A.dardonoi染色体两种信号均没有(图7)，表明野生种A.duranensis、A.diogoi、A.herzogii、A.villosa、A.microsperma、A.simpsonii和A.duranensis-2基因组与花生A亚基因组亲缘关系较近，野生种A.ipaensis、A.valida、A.batizocoi和A.trinitensis基因组与花生B亚基因组亲缘关系较近，A.stenophylla基因组与A、B亚基因组的关系均相对较近，A.pusilla和A.dardonoi基因组与A和B亚基因组的关系都较远。因此，该方法可以有效识别与A或B亚基因组亲缘关系近的野生种。

序列表

<110> 河南省农业科学院

<120> 一种高效涂染花生A、B亚基因组的探针套、设计方法及应用

<130> 探针套的设计

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tggaaagctc tggatgtcta ctttccaacg ccgttgagag 40

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gagctacaga agtccaattg gcgcgctctc aacggcgttg 40

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

agcagaaatc agattcagag gatgaagaag gactgctgat 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tctggagcta cagaactcga aatggcgtgc ttccaattgc 40

Claims (9)

1.一种高效涂染花生A、B亚基因组的探针套，其特征在于，包括A亚基因组探针套和B亚基因组探针套，所述A亚基因组探针套包括FAM荧光标记的A-4和A-7，B亚基因组探针套包括TAM荧光标记的B-9和B-10，具体序列为：

A-4：FAM-5'-TGGAAAGCTCTGGATGTCTACTTTCCAACGCCGTTGAGAG-3'；

A-7：FAM-5'-GAGCTACAGAAGTCCAATTGGCGCGCTCTCAACGGCGTTG-3'；

B-9：TAM-5'-AGCAGAAATCAGATTCAGAGGATGAAGAAGGACTGCTGAT-3'；

B-10：TAM-5'-TCTGGAGCTACAGAACTCGAAATGGCGTGCTTCCAATTGC-3'。

2.一种如权利要求1所述高效涂染花生A、B亚基因组的探针套的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用Tandem Repeats Finder软件，即TRF，搜索花生栽培种Tifrunner参考基因组中的串联重复序列Tandem repeats，即TR，使用TR-tookit软件对TRF输出结果去冗余，得到非冗余TR阵列Non-redundant TR arrays集合，即NR-TR。对获得NR-TR过滤、筛选、聚类得到重复单元大于300bp、拷贝数大于等于50的TR阵列统计数据；

(2)使用B2DSC检测上述TR阵列序列的同源拷贝在花生Tifrunner参考基因组中的分布情况，得到重复序列代表阵列；将重复序列代表阵列从头开始切割为长40bp的片段，步长为5bp的序列，利用CD-HIT的cdhit-est对所得的40bp片段进行聚类，相关参数为“-n 5-c0.85-d 0-aL 0.8-aS 0.8”，获得非冗余序列集合；将非冗余序列分别提交至本地B2DSC比对到Tifrunner参考基因组，其中过滤参数值pident＝90，qcovhsp＝90，观察非冗余序列在A亚基因组或B亚基因组的富集情况，分别得到花生A、B亚基因组的探针套。

3.一种如权利要求2所述高效涂染花生A、B亚基因组的探针套的设计方法，其特征在于，所述非冗余序列在A亚基因组或B亚基因组的富集情况为：在A亚基因组染色体富集、分布均匀、平均峰值在20拷贝/Mb以上，在B亚基因组不富集时，最终所得包含两个序列A-4和A-7的A亚基因组探针套。

4.一种如权利要求2所述高效涂染花生A、B亚基因组的探针套的设计方法，其特征在于，所述非冗余序列在A亚基因组或B亚基因组的富集情况为：在B亚基因组富集、染色体分布均匀、平均峰值在20拷贝/Mb以上，在A亚基因组不富集时，最终所得包含两个序列B-9和B-10的B亚基因组探针套。

5.一种如权利要求1-4任一项所述高效涂染花生A、B亚基因组的探针套的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)杂交染液配制：将A亚基因组探针套干粉和/或B亚基因组探针套干粉用500μL超纯水溶解；每张制片滴加上述A亚基因组探针套溶液和/或B亚基因组探针套溶液各2μL、2×SSC缓冲液10μL和100μg/mL DAPI原液0.5μL的混合液；所述A亚基因组探针套干粉为0.1ODA-4和0.1OD A-7，B亚基因组探针套干粉为0.1OD B-9和0.1OD B-10；

(2)染色：将(1)中配置的染液滴到花生栽培种Tifrunner根尖细胞中期染色体制片上，盖上盖玻片，37℃染色2-3h；然后去掉盖玻片用蒸馏水冲洗10-15次，吹干之后滴加封片剂并盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察、照相。

6.一种如权利要求5所述高效涂染花生A、B亚基因组的探针套的应用方法，其特征在于，2×SSC缓冲液由0.3M的柠檬酸三钠C₆H₅Na₃O₇·2H₂O和3M的NaCl组成。

7.一种如权利要求1所述的高效涂染花生A、B亚基因组的探针套在鉴定花生材料中A亚基因组和B亚基因组的组成中的应用。

8.一种如权利要求1所述的高效涂染花生A、B亚基因组的探针套在鉴定花生材料中A亚基因组和B亚基因组之间的染色体易位中的应用。

9.一种如权利要求1所述的高效涂染花生A、B亚基因组的探针套在确定花生野生种基因组与A和/或B亚基因组间的亲缘关系中的应用。

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