CN110055341A - 一种识别虾夷扇贝中部着丝粒染色体的探针及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种虾夷扇贝中部着丝粒染色体的识别方法，通过结合虾夷扇贝基因组序列信息、SNP连锁图谱信息以及fosmid单克隆解码信息，选取了分布于虾夷扇贝SNP连锁图谱上的三个标记对fosmid文库进行筛选，利用筛选到含有SNP位点的克隆制备带有荧光标记的探针，然后利用这些探针进行荧光原位杂交和共杂交，根据三个含有SNP标记的特异性克隆的荧光信号在虾夷扇贝染色体上的分布，实现了虾夷扇贝三对中部着丝粒染色体的特异性识别。本发明提供的三个标记实现了对三对中部着丝粒染色体的识别，对虾夷扇贝染色体的区分鉴定、细胞遗传学图谱的构建以及不同物种来源的染色体之间的进化分析都具有重要的意义。

Description

一种识别虾夷扇贝中部着丝粒染色体的探针及其制备方法

技术领域

本发明属于贝类染色体研究技术领域，具体涉及一种识别虾夷扇贝中部着丝粒染色体的探针及其制备方法。

背景技术

虾夷扇贝(Jay，1857)是一种冷水双壳贝类，也是一种重要的水产养殖物种，具有很大的科研价值和经济价值。虾夷扇贝共有19对染色体，包括中部着丝粒染色体、亚中部着丝粒染色、亚端部着丝粒染色体、端部着丝粒染色体四种染色体类型。核型分析结果显示，虾夷扇贝同染色体的大小呈连续分布，形态较为相近，想要单纯地凭借核型分析就实现染色体的识别是不现实的；而染色体的识别对于推动扇贝细胞遗传研究与遗传育种工作具有重要的意义。

近年来借助于染色体显带技术，动植物染色体的结构与变化得到了更为精细的分析，这已成为鉴定染色体组或个别染色体、探讨物种进化及分析物种分类等问题的有效手段之一。然而已有研究报道表明该技术在贝类染色体研究中缺乏稳定性。荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一种以分子杂交为手段，以荧光显微镜为工具来直观显示DNA序列位置的技术手段。通过应用该技术，染色体和亚染色体区域可以被染色体特异的探针标记与识别，进而实现不同染色体之间的区分鉴定。然而，目前虾夷扇贝缺乏相应的标记作为探针来高效快速地进行染色体的识别。

发明内容

本发明提供一种识别虾夷扇贝中部着丝粒染色体的探针及其制备方法，以及用探针定位中部着丝粒染色体的方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供用于制备检测中部着丝粒染色体探针的SNP标记，包含有：

识别第一对中部着丝粒染色体的SNP标记M8173，其核苷酸序列为CAGACAGGGAGCTATAGTTTGTACTTA(SEQ ID NO:1)；

识别第二对中部着丝粒染色体的SNP标记M7337，其核苷酸序列为TTTCAATTTACTTAAACTCCCTGTTAT(SEQ ID NO:2)；

识别第三对中部着丝粒染色体的SNP标记M687，其核苷酸序列为TTATTCTATACGAGGACTCCAGCTTTT(SEQ ID NO:3)；

上述的SNP标记用于制备来定位虾夷扇贝三对中部着丝粒染色体的探针，其步骤如下：

1)Fosmid单克隆的筛选：将SNP标记序列与虾夷扇贝fosmid单克隆解码信息进行了交叉比对，定位获得含有SNP同源序列的fosmid单克隆；

2)Fosmid克隆质粒提取：使用酚氯仿/碱裂解的方法提取含有SNP同源序列的fosmid单克隆质粒DNA；

3)制备探针：在16℃条件下使用带有荧光标记的缺刻平移酶对fosmid单克隆质粒DNA进行酶切70～90min来制备大小为200～500bp的荧光标记探针；

上述的探针用于定位虾夷扇贝三对中部着丝粒染色体；

本发明还提供一种虾夷扇贝中部着丝粒染色体的特异性识别方法，是使用上述的探针来进行的，包含有如下的步骤：

1)染色体制备：收集虾夷扇贝担轮幼虫，采用0.01％秋水仙素和0.075M KCL处理，然后保存在卡诺试剂中，接着使用50％醋酸进行解离，采用热滴法进行制片，

2)FISH及共杂交：将步骤1)制备的染色体置于76℃预热的变性液中变性，同时将探针混合液在90℃条件下变性，然后将变性好的探针混合液迅速加到染色体上，盖上盖玻片密封孵育10～12h，然后使用牛血清蛋白进行封阻和罗丹明进行染色；在经历过洗脱之后，使用DAPI进行染色体的复染，然后封片用显微镜观察荧光信号；

3)染色体识别：通过探针的FISH定位结果和不同探针共定位结果分析标记在染色体上的位置和染色体特征。

通过本发明提供的方法可以通过探针信号快速识别定位到每一对中部着丝粒染色体上，具有信号明显，易于区分，高效稳定的特征，这对染色体数量较多生物的细胞遗传学研究具有积极重要的意义。

附图说明

图1：含有SNP标记的探针在虾夷扇贝染色体上的FISH定位结果图，

其中：A：PF9I3克隆特异性定位在一对中部着丝粒染色体上，其荧光信号定位在中部着丝粒染色体短臂中部；

B：PF123I5特异性定位在一对中部着丝粒染色体上，其荧光信号定位在中部着丝粒染色体长臂末端；

C：PF114C20特异性定位在一对中部着丝粒染色体上，荧光信号定位在中部着丝粒染色体着丝粒；

D：PF9I3和PF123I5分别定位在不同对中部着丝粒染色体上，其中PF9I3标记的中部着丝粒染色体长于PF123I5标记的中部着丝粒染色体；

E：PF114C20和PF123I5分别定位在不同对中部着丝粒染色体上，其中PF123I5标记的端部着丝粒染色体长于PF114C20标记的中部着丝粒染色体；

F：PF9I3和PF114C20分别定位在不同对中部着丝粒染色体上，其中PF9I3标记的中部着丝粒染色体长于PF114C20标记的中部着丝粒染色体。

具体操作方式

本发明基于虾夷扇贝基因组大片段fosmid文库、SNP高密度连锁图谱和FISH技术开发特异性探针用作虾夷扇贝中部着丝粒染色体特异性识别标记，从而实现虾夷扇贝三对中部着丝粒染色体的区分鉴定和特异性识别，进一步推动了虾夷扇贝细胞遗传学研究。

以下通过实施例的具体操作对本发明的技术方案做进一步的说明。

实施例1：探针的制备

1)Fosmid单克隆筛选：根据虾夷扇贝SNP连锁图谱与染色体图谱的整合工作，其中三个连锁群LG6、LG9和LG19筛选的三个SNP标记对应虾夷扇贝中部着丝粒染色体。

识别第一对中部着丝粒染色体的SNP标记M8173，其核苷酸序列为CAGACAGGGAGCTATAGTTTGTACTTA(SEQ ID NO:1)；

识别第二对中部着丝粒染色体的SNP标记M7337，其核苷酸序列为TTTCAATTTACTTAAACTCCCTGTTAT(SEQ ID NO:2)；

识别第三对中部着丝粒染色体的SNP标记M687，其核苷酸序列为TTATTCTATACGAGGACTCCAGCTTTT(SEQ ID NO:3)；

上述的SNP标记用于制备来定位虾夷扇贝三对中部着丝粒染色体的探针。

首先利用WGP方法，通过混合构建行池、列池、板池，使用BsaXI和FspEI两种限制性内切酶来获得酶切标签，并根据三维混池策略对40张384孔板的单克隆进行解码。单克隆解码信息可以标识出每个酶切标签序列在虾夷扇贝基因组中所在的scaffold序号以及在该scaffold上的位置。对同一个单克隆中所有的酶切标签序列进行统计，进而可获得fosmid单克隆中所包含的序列信息，比如序列在基因组上的scaffold序号以及序列区段起止位置信息。从每条连锁群端部挑选SNP标记，利用SNP标记序列与虾夷扇贝fosmid文库序列信息进行同源比对，即标记序列必须包含在fosmid单克隆的序列内，并且标记与fosmid单克隆是唯一比对，用此方法每个连锁群筛出一个包含SNP标记的单克隆来用做染色体识别探针。

表1：含有SNP标记的fosmid单克隆信息

2)Fosmid克隆质粒提取：在紫外灭菌的超净工作台，使用灭菌牙签从对应的384孔板挑取含有单克隆的大肠杆菌，置于LB培养基中，在37℃恒温培养箱中活化培养8～12h。待菌液出现浑浊后，使用酚氯仿法进行质粒DNA的提取，吸取1ul的质粒DNA稀释10倍，取4ul跑1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示完整单一的DNA条带，吸取1ul稀释液通过nano测定质粒的质量和浓度，其A260/A230大于1.8，A260/A280在1.8～2.0之间，表明了提取的质粒DNA较为纯净，浓度检测显示终浓度大于200ng/ul，满足探针制备的要求。

3)探针的制备：取3ug的质粒DNA，利用带荧光标记的缺刻平移酶在16℃条件下对质粒DNA进行酶切70～90min，然后取1ul的酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，其片段长度在200～500bp，接着向反应体系里滴加1ul 0.5M EDTA来终止酶切反应，最后用DNA产物纯化试剂盒纯化探针，将探针置于-20℃保存。

实施例2：使用探针定位染色体

1)染色体制备：使用500目筛绢收集虾夷扇贝担轮幼虫，使用0.01％的秋水仙素处理2.5h来进行幼虫的固定，接着用0.075M KCL对幼虫材料进行低渗处理30min，然后将材料置于新鲜配制的卡诺试剂里，并且更换三次卡诺试剂，此处可以将材料置于-20℃长期保存，接着使用新鲜配制的50％醋酸进行解离，5～10min即可，采用热滴法进行制片，将染色体材料固定在载玻片上，在60℃烘箱中放置2～3h使染色体材料紧密贴附在玻片上，防止杂交过程染色体材料的脱落，染色体制备参考文献(Huang et al.2007.Mapping ofribosomal DNA and(TTAGGG)n telomeric sequence by FISH in the bivalvePatinopecten yessoensis(Jay,1857))。

2)FISH及共杂交：将制备的染色体材料置于76℃预热的甲酰胺变性液中进行预变性，同时将探针、柠檬酸钠缓冲液和甲酰胺的混合液在90℃条件下变性5min，然后将变性好的探针混合液迅速加在经过变性和乙醇梯度脱水的染色体上，覆上盖玻片和封口膜，置于避光的湿盒里，在37℃条件下过夜孵育10～12h。在37℃的柠檬酸钠缓冲液冲洗去多余的探针，接着用牛血清白蛋白封阻和抗地高辛罗丹明染料进行染色1h。接着再次使用柠檬酸钠缓冲液洗脱去多余的染液，使用DAPI核酸染液复染染色体20～30min，然后封片固定，最后使用荧光显微镜进行荧光信号的观察，FISH实验过程参考文献(Huang etal.2007.Mapping of ribosomal DNA and(TTAGGG)n telomeric sequence by FISH inthe bivalve Patinopecten yessoensis(Jay,1857))。

3)染色体识别：在显微镜下可以观察到探针PF9I3特异性定位在一对中部着丝粒染色体上，其荧光信号定位在中部着丝粒染色体短臂中部(图1的A所示)；探针PF123I5特异性定位在一对中部着丝粒染色体上，其荧光信号定位在中部着丝粒染色体长臂末端(图1的B所示)；探针PF114C20特异性定位在一对中部着丝粒染色体上，荧光信号定位在中部着丝粒染色体着丝粒位置(图1的C所示)，上述结果表明三对探针可以分别识别一对中部着丝粒染色体，但是由于染色体形态的多样性，探针所识别的染色体存在有交集的可能性，因而我们通过共杂交进行验证探针染色体识别的唯一性。探针PF9I3和PF123I5的共杂交结果表明两对信号分别定位在不同对中部着丝粒染色体上，其中PF9I3标记的中部着丝粒染色体长于PF123I5标记的中部着丝粒染色体(图1的D所示)；探针PF114C20和PF123I5分别定位在不同对中部着丝粒染色体上，其中PF123I5标记的端部着丝粒染色体长于PF114C20标记的中部着丝粒染色体(图1的E所示)；探针PF9I3和PF114C20分别定位在不同对中部着丝粒染色体上，其中PF9I3标记的中部着丝粒染色体长于PF114C20标记的中部着丝粒染色体(图1的F所示)。

上述结果可知，三个探针分别定位在三对不同的中部着丝粒染色体上，同时探针PF9I3定位在最长的一对中部着丝粒染色体上，探针PF114C20定位在最短的一对中部着丝粒染色体上，探针PF123I5所定位的染色体长度介于两者之间。根据染色体按照形态长度的排序规则，即探针PF9I3特异性识别虾夷扇贝第一对中部着丝粒染色体，探针PF123I5特异性识别第二对，探针PF114C20特异性识别第三对；从而表明本发明方法的有效性。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种识别虾夷扇贝中部着丝粒染色体的探针及其制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagacaggga gctatagttt gtactta 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttcaattta cttaaactcc ctgttat 27

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttattctata cgaggactcc agctttt 27

Claims (6)

1.一种SNP标记，其特征在于，所述的SNP标记包含有：

识别一对中部着丝粒染色体的SNP标记，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；

识别第二对中部着丝粒染色体的SNP标记，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

识别第三对中部着丝粒染色体的SNP标记，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

2.权利要求1所述的SNP标记在制备检测虾夷扇贝中部着丝粒染色体探针中的应用。

3.一种检测虾夷扇贝中部着丝粒染色体探针，其特征在于，所述的探针是使用权利要求1所述的SNP标记来筛选虾夷扇贝fosmid单克隆后制备的。

4.权利要求3所述的探针的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)Fosmid单克隆的筛选：将权利要求1所述的SNP标记序列与虾夷扇贝fosmid单克隆解码信息进行了交叉比对，定位获得含有SNP同源序列的fosmid单克隆；

2)Fosmid克隆质粒提取：使用酚氯仿/碱裂解的方法提取含有SNP同源序列的fosmid单克隆质粒DNA；

3)制备探针：使用带有荧光标记的缺刻平移酶对fosmid单克隆质粒DNA进行酶切来制备大小为200～500bp的荧光标记探针。

5.权利要求3所述的探针在定位虾夷扇贝中部着丝粒染色体中的应用。

6.一种虾夷扇贝中部着丝粒染色体的特异性识别方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)染色体制备：收集虾夷扇贝担轮幼虫，采用0.01％秋水仙素和0.075M KCL处理，然后保存在卡诺试剂中，接着使用50％醋酸进行解离，采用热滴法进行制片，

2)FISH及共杂交：将步骤1)制备的染色体置于76℃预热的变性液中变性，同时将权利要求3所述的探针混合液在90℃条件下变性，然后将变性好的探针混合液迅速加到染色体上，盖上盖玻片密封孵育10～12h，然后使用牛血清蛋白进行封阻和罗丹明进行染色；在经历过洗脱之后，使用DAPI进行染色体的复染，然后封片用显微镜观察荧光信号；

3)染色体识别：通过探针的FISH定位结果和不同探针共定位结果分析标记在染色体上的位置和染色体特征。