KR101816604B1 - 반쪽시들음병균 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본원은 반쪽시들음병균(Verticillium dahliae)을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 반쪽시들음병균 검출용 조성물, 이를 포함하는 반쪽시들음병균 검출용 키트, 및 이를 이용한 반쪽시들음병균 검출 방법에 관한 것이다.
Description
본원은 반쪽시들음병균(Verticillium dahliae)을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트, 반쪽시들음병균 검출용 조성물, 반쪽시들음병균 검출용 키트, 및 이를 이용한 반쪽시들음병균 검출 방법에 관한 것이다.
과채류 반쪽시들음병균(Verticillium dahliae)은 토양전염성 병해로 감염시기를 조기에 진단하는 기술이 매우 요구되고 있으나, 전 세계적으로 많은 연구가 진행되어 있지는 않았다. 반쪽시들음병균은 인공배양이 어렵고, 생장 속도가 다른 식물병원성 곰팡이에 비해 매우 느린 특성을 가진다. 기존의 과채류 반쪽시들음병균 검출방법은 인공배양을 통한 현미경적 관찰 및 분자생물학적 방법을 통한 진단법이었다. 그러나 실시간(real-time) PCR 또는 qPCR 등을 이용한 진단법은 고가의 장비와 전문가의 데이터 분석을 필요로 하며, 따라서 진단에 소요경비가 비싸고 결과를 얻기까지 최소 100 시간 이상 걸린다는 단점이 있었다.
한편, 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 기존의 PCR 방법과 유사하나 기존 PCR 방법이 변성, 접합, 신장의 세 단계를 반복적으로 수행하면서 유전자의 증폭을 시행하기 때문에 조성물에 온도의 변화를 주어야 하는 반면, 등온증폭법은 고정된 일정 온도에서 접합 및 신장이 가능한 장점을 가지고 있다. 이는 기존 PCR 방법에 사용되는 Taq DNA 중합효소(polymerase)를 사용하는 대신, 핵산말단가수분해(exonuclease) 기능을 갖고 있는 Bst DNA 중합효소를 사용함으로써 열에 의존하지 않고 DNA의 이중나선 구조의 변성을 유발할 수 있기 때문이다. 따라서 등온증폭법은 유전자를 증폭하는 동안 온도의 변화를 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 손쉽게 고정된 온도에서 유전자 증폭을 가능하게 한다.
본원에서는, 반쪽시들음병균(V. dahliae) 셀룰로스-성장-특이적 단백질 부분 mRNA(cellulose-growth-specific protein partial mRNA, 약 879 bp) 유전자 염기서열을 이용하여 특이적인 분자마커를 선발하여 등온증폭용 프라이머 세트를 개발하고자 하였다.
또한, 반쪽시들음병균 근연종들(Verticillium spp.)과의 비특이적 반응여부를 검정하여 본 검출기술의 특이성을 확인하고, 배추, 국화 식물체와 표면미생물과의 비특이적 반응여부를 검정하여 등온증폭용 프라이머세트의 특이성을 확인하고자 하였다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는, 반쪽시들음병균(Verticillium dahliae)을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 반쪽시들음병균 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 2 측면에 따른 조성물을 포함하는, 반쪽시들음병균 검출용 키트를 제공할 수 있다.
본원의 제 4 측면은, (a) 식물체 시료로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 유전체 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 반쪽시들음병균 검출 방법을 제공할 수 있다.
본원의 제 5 측면은, (ⅰ) 감염의심 식물체 시료를 마쇄하는 단계; (ⅱ) 제3항의 반쪽시들음병균 검출용 조성물에 상기 (ⅰ) 단계에서 제조된 마쇄물을 첨가한 후 58℃ 내지 62℃에서 40 분 내지 50 분 동안 방치시키는 단계; 및 (ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계가 완료된 반응물에 SYBR Green solution I (1,000X 농도, invitrogen)을 처리한 후 육안으로 형광색 발색 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 반쪽시들음병균 검출 방법을 제공할 수 있다.
본원은 반쪽시들음병균(Verticillium dahliae)을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도를 제공하고자 한다. 등온증폭기술을 활용한 국내 과채류 반쪽시들음병균 검출기술은 최초의 시도로써, 종래의 반쪽시들음병균 검출방법에 비해 검출시간이 획기적으로 단축되는 효과가 있다. 종래의 방법에 의하면 반쪽시들음병균의 검출에 110 시간 이상이 소요되었으나, 본원의 방법에 따르면 1.5 시간 이내에 반쪽시들음병균의 검출이 가능하였다.
또한, 등온증폭기술을 이용하면 고가의 장비와 전문가가 필요없이 항온기 또는 보온가능한 커피포트 등을 이용하여 반쪽시들음병균을 검출할 수 있어, 현장 적용 가능성이 높아질 것으로 기대된다. 아울러, 건전식물 혹은 재배지역 토양에서 반쪽시들음병균을 신속하게 진단하여 감염확산 및 경제적인 피해를 미연에 차단할 수 있고, 과채류 주요재배지역에 본원의 기술을 적용함으로써 살균제 살포를 줄일 수 있으며, 저농약 안전한 먹거리 생산과 농약안전사용 기준에 부합하는 작물 생산이 가능할 것으로 기대되고, 국내에서 밝혀지지 않은 반쪽시들음병균 발생생태 연구(잠복지역 등)가 가능해질 것으로 예상된다.
도 1은 본원의 일 구현예에 따른 반쪽시들음병균 검출 방법의 개략도이다.
도 2는 반쪽시들음병균의 유전자 염기서열 분석결과이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 반쪽시들음병균 검출용 프라이머의 특이성 검정을 위해 수행한 전기영동 결과를 나타낸 이미지이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 반쪽시들음병균 검출용 프라이머의 특이성 검정을 위해 수행한 전기영동 결과를 나타낸 이미지이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 반쪽시들음병균 검출용 등온증폭반응의 산물의 육안관찰 결과를 나타낸 사진 이미지이다.
도 2는 반쪽시들음병균의 유전자 염기서열 분석결과이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 반쪽시들음병균 검출용 프라이머의 특이성 검정을 위해 수행한 전기영동 결과를 나타낸 이미지이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 반쪽시들음병균 검출용 프라이머의 특이성 검정을 위해 수행한 전기영동 결과를 나타낸 이미지이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 반쪽시들음병균 검출용 등온증폭반응의 산물의 육안관찰 결과를 나타낸 사진 이미지이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.
그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 예를 들어, 용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
또한, 본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는, A 및 B"를 의미한다.
이하, 본원에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 1 측면은, 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는, 반쪽시들음병균(Verticillium dahliae)을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트를 제공할 수 있다. 상기 프라이머 세트는 반쪽시들음병균만을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있다.
본원에서 “특이적”이라는 용어는 반쪽시들음병균에 해당하는 종만을 표적하는 것을 의미할 수 있다.
본원에서 “프라이머”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 약 15 내지 45 개의 염기로 구성될 수 있다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본원에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 및/또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본원의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 프라이머 세트를 포함하는 반쪽시들음병균 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 반쪽시들음병균 검출용 조성물은 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 2 측면에 따른 조성물을 포함하는, 반쪽시들음병균 검출용 키트를 제공할 수 있다.
본원의 키트는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 등온증폭반응용 프라이머 세트뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 및/또는 장치가 포함될 수 있다.
예를 들어, 본원의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 본원의 서열번호 1 내지 서열번호 4의 등온증폭반응용 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 및/또는 멸균증류수 등을 포함할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 반쪽시들음병균 검출용 키트는 시료마쇄용 튜브 용기; 플라스틱 균질기; 및 등온증폭반응용 튜브 용기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 시료마쇄용 튜브 용기는 멸균증류수를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 등온증폭반응용 튜브 용기는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 반쪽시들음병균을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트; 등온증폭 반응용 DNA 중합효소; dNTPs; 반응버퍼 및 증류수를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원에서 “시료마쇄용 튜브 용기”라는 용어는 마쇄 시 식물체 시료를 담을 수 있는 용기를 의미하며, 여기에 멸균증류수가 포함될 수 있다.
본원에서 “플라스틱 균질기”는 식물체 시료를 마쇄하는 도구를 의미할 수 있다.
또한, 상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 상기 설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 설명서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
본원의 제 4 측면은, (a) 식물체 시료로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 유전체 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 반쪽시들음병균 검출 방법을 제공할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 등온증폭반응은 58℃ 내지 62℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 증폭된 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭반응을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선 측정 방법은 증폭반응 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green solution I (1,000X 농도, invitrogen)을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 5 측면은, (ⅰ) 감염의심 식물체 시료를 마쇄하는 단계; (ⅱ) 제3항의 반쪽시들음병균 검출용 조성물에 상기 (ⅰ) 단계에서 제조된 마쇄물을 첨가한 후 58℃ 내지 62℃에서 40 분 내지 50 분 동안 방치시키는 단계; 및 (ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계가 완료된 반응물에 SYBR Green solution I (1,000X 농도, invitrogen)을 처리한 후 육안으로 형광색 발색 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 반쪽시들음병균 검출 방법을 제공할 수 있다. 본원에 따른 반쪽시들음병균 검출용 프라이머를 사용한 등온증폭반응 수행 및 결과확인 공정의 개략도가 도 1에 나타나 있다.
과채류에 발생하는 반쪽시들음병균(V. dahliae)은 인공배양이 어렵고, 생장 속도가 다른 식물병원성 곰팡이에 비해 매우 느린 특징이 있다. 종래에는 과채류 반쪽시들음병균 검출을 위해 인공배양을 통한 현미경적 관찰 또는 분자생물학적 방법을 통해 진단하였으나, 이러한 방법은 필요경비가 비싸며, 진단에 최소 100시간 이상 소요되는 단점이 있었다. 본원발명에 따른 반쪽시들음병균 검출용 프라이머를 사용하여 등온증폭반응을 수행하는 경우, 시료마쇄부터 분석 까지 약 1.5 시간 이내에 완료될 수 있으며, 따라서 빠른 시간 내에 반쪽시들음병균의 감염유무 확인 및 종 동정이 가능하다 (표 1).
본원은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본원의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
[
실시예
]
과채류
반쪽시들음병균
검출용
프라이머
제작
과채류 반쪽시들음병균(Verticillium dahliae)의 cellulose-growth-specific protein partial mRNA 유전자 염기서열 분석을 수행하였으며, 그 결과, 약 870 bp 크기의 DNA 단편이 수득되었다 (도 2). 이후, 수득된 유전자 염기서열을 이용하여 등온증폭반응용 프라이머를 제작하였다. 제작된 프라이머의 핵산 서열 및 길이 등의 정보가 아래의 표 2에 나타나 있다.
프라이머 Ver-F3가 서열번호 1, Ver-B3가 서열번호 2, Ver-FIP가 서열번호 3, 그리고 Ver-BIP가 서열번호 4로 명명되었다.
과채류
반쪽시들음병균
검출용
프라이머의
반응물 조성 및 온도조건
제작된 반쪽시들음병균 검출용 프라이머를 이용하여 반쪽시들음병균을 검출하기 위한 조성과 반응조건을 설정하기 위한 실험을 수행하였으며, 그 결과 확립된 조성이 아래의 표 3에 나타나 있다.
본원의 프라이머를 이용한 반쪽시들음병균 검출용 등온증폭법의 온도조건은 60℃이며, 사용법은 다음과 같았다:
시료마쇄액 혹은 DNA + 반응조성물 → 전처리 95℃ 5 분 → Bst 폴리머라제(polymerase) 첨가 → 60℃ 45분 → 결과 확인(발색유무)
발색에 관여하는 1.5 μl SYBR green solution I(1,000X 농도) 용액은 0.2 ml 반응용 튜브에 넣고 열을 가하여 고형화한 후 검출을 위해 사용하였다.
반쪽시들음병균
검출용
프라이머의
특이성 검정
반쪽시들음병균 등온증폭법의 근연종과의 특이성을 검정하기 위해, 반쪽시들음병균과 그 근연종의 총 유전체 DNA를 각각 추출한 후 위에서 확립된 검출용 조성물과 온도조건을 이용하여 등온증폭반응 및 전기영동을 수행하였다. 그 결과, 본원의 반쪽시들음병균 검출용 프라이머는 반쪽시들음병균에서만 DNA ladder 현상이 관찰되어 특이적인 반응을 나타냄을 알 수 있었다. 또한, 반쪽시들음병균(Verticillium dahliae)의 근연종(Verticillium sp ., V. chlamydosporium)에서 비특이적 반응이 관찰되지 않아(DNA ladder 현상 없음), 본원의 반쪽시들음병균 검출용 프라이머는 반쪽시들음병균에만 높은 특이성을 가진다는 사실을 확인할 수 있었다 (도 3). 도 3은 근연종을 이용한 반쪽시들음병균 검출용 프라이머 특이성 검정 결과이며, M은 100 bp DNA ladder, 1 레인은 V. dahliae (국화: 11-027), 2 레인은 V. dahliae (국화: 13-118), 3 레인은 V. dahliae (배추: 13-252), 4 레인은 V. dahliae (배추: 14-324), 5 레인은 V. chlamydosporium (KACC No. 40859), 6 레인은 Verticillium sp . (KACC No. 42493), 그리고 7 레인은 음성대조구에 대하여 등온증폭반응을 수행한 산물이다.
또한, 향후 반쪽시들음병균 검출용 등온증폭기술이 적용될 배추 및 국화에서 식물체 총 유전체 DNA와 배추 및 국화 뿌리에 존재하는 미생물 군집과의 비특이적 반응을 검정한 결과, 반쪽시들음병균이 있는 실험군에서만 특이적 반응을 나타냄을 확인하였다 (도 4). 도 4는 반쪽시들음병균 검출용 등온증폭법과 기주식물과의 비특이적 반응을 검정한 결과이며, M은 100 bp DNA ladder, 1 레인은 V. dahliae (국화: 11-027), 2 레인은 국화 잎, 3 레인은 국화 뿌리 및 근권미생물, 4 레인은 배추 잎, 5 레인은 배추 뿌리 및 근권미생물, 및 6 레인은 음성대조구에 대하여 등온증폭반응을 수행한 산물이다.
반쪽시들음병균
등온증폭 산물의 육안관찰
본원의 반쪽시들음병 검출용 프라이머를 이용한 등온증폭반응에 의해 증폭된 산물을 전기영동 없이 육안으로 관찰하기 위해, 1.5 μl의 SYBR green solution I(1,000X 농도)을 0.2 ml 반응용 튜브에 열처리를 통해 고형화하였다. 이어서, 반쪽시들음병 검출을 위한 증온증폭법이 완료된 0.2 ml 반응용 튜브를 위, 아래로 흔들어 튜브 뚜껑에 고형화 된 SYBR green solution을 녹여 반응결과를 형광 발색 여부를 통해 확인하였다 (도 5). 도 5는 반쪽시들음병균 검출을 위한 등온증폭반응 산물의 육안관찰(좌)와 UV램프 관찰(우) 결과를 보여준다. 1번 및 2번 튜브는 배추 반쪽시들음병균, 3번 및 4번 튜브는 국화 반쪽시들음병균, 그리고 5번 튜브는 음성대조구이다.
본 방법에 따르면 UV 램프 없이 육안으로도 쉽게 관찰이 가능하였으며, 반응산물이 담기는 PCR 튜브에 열처리를 통해 간편하게 부착시킬 수 있어 높은 활용도를 가질 것으로 기대된다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 겹합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT:RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> PRIMER SET FOR LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION REACTION
FOR DETECTING VERTICILLIUM DAHLIAE, AND USES THEREOF
<130> 0
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ver-F3
<400> 1
tcctcctcaa caggagtgg 19
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ver-B3
<400> 2
cgatccctgg ccccaa 16
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ver-FIP(forward inner primer)
<400> 3
tcctctgctg cccctgtcgt ttttgctcag tgtgagtggt gg 42
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ver-BIP(backward inner primer)
<400> 4
gagcgtcggt ggcaacaggt ttttctttac ctgctctggc gc 42
Claims (11)
- 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는, 반쪽시들음병균(Verticillium dahliae)을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트.
- 제 1 항의 프라이머 세트를 포함하는, 반쪽시들음병균 검출용 조성물.
- 제 2 항에 있어서,
등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 더 포함하는, 반쪽시들음병균 검출용 조성물.
- 제 2 항의 조성물을 포함하는, 반쪽시들음병균 검출용 키트.
- 제 4 항에 있어서,
시료마쇄용 튜브 용기; 플라스틱 균질기; 및 등온증폭반응용 튜브 용기를 포함하는, 반쪽시들음병균 검출용 키트.
- 제 5 항에 있어서,
상기 시료마쇄용 튜브 용기는 멸균증류수를 포함하는 것인, 반쪽시들음병균 검출용 키트.
- 제 5 항에 있어서,
상기 등온증폭반응용 튜브 용기는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 반쪽시들음병균을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트; 등온증폭 반응용 DNA 중합효소; dNTPs; 반응버퍼 및 증류수를 포함하는 것인, 반쪽시들음병균 검출용 키트.
- (a) 식물체 시료로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 유전체 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 반쪽시들음병균 검출 방법.
- 제 8 항에 있어서,
상기 등온증폭반응은 58℃ 내지 62℃에서 수행되는 것인, 반쪽시들음병균 검출 방법.
- 제 8 항에 있어서,
상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green solution I (1,000X 농도, invitrogen)을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 포함하는, 반쪽시들음병균 검출 방법.
- (ⅰ) 감염의심 식물체 시료를 마쇄하는 단계;
(ⅱ) 제3항의 반쪽시들음병균 검출용 조성물에 상기 (ⅰ) 단계에서 제조된 마쇄물을 첨가한 후 58℃ 내지 62℃에서 40 분 내지 50 분 동안 방치시키는 단계; 및
(ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계가 완료된 반응물에 SYBR Green solution I (1,000X 농도, invitrogen)을 처리한 후 육안으로 형광색 발색 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 반쪽시들음병균 검출 방법.
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| KR1020160154019A KR101816604B1 (ko) | 2016-11-18 | 2016-11-18 | 반쪽시들음병균 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102248546B1 (ko) | 2019-11-26 | 2021-05-06 | 대한민국 | 토마토반점위조바이러스, 국화줄기괴저바이러스, 및 베르티실리움 달리애 동시 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103602676B (zh) | 2013-11-20 | 2015-08-05 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 核酸和引物对以及鉴定大丽轮枝菌致病型的方法和试剂盒 |
-
2016
- 2016-11-18 KR KR1020160154019A patent/KR101816604B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
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| CN103602676B (zh) | 2013-11-20 | 2015-08-05 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 核酸和引物对以及鉴定大丽轮枝菌致病型的方法和试剂盒 |
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| NCBI Reference Sequence: XM_009654586.1. |
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