CN106350594B - 一种鉴定簇毛麦染色体的核酸探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一对寡核苷酸，以及由此制备的核酸探针。该两条核酸探针可在簇毛麦大部分染色体上较好弥散分布，结合已知的寡聚核酸探针Oligo‑pTa535可快速、准确地鉴定出小麦遗传背景中的簇毛麦染色体和/或染色体片段。该技术省时省力、成本低，可达到类似GISH的杂交效果。

Description

一种鉴定簇毛麦染色体的核酸探针及其应用

技术领域

本发明属于染色体工程领域，具体涉及一种鉴定簇毛麦染色体的核酸探针及其应用。

背景技术

一年生二倍体簇毛麦(2n＝14,VV)是小麦重要的近缘种属，携带多种抗虫、抗病及抗非生物逆境等优良基因(De Pace C 2011)。早在上世纪50年代，研究者就开始进行一年生二倍体簇毛麦遗传物质向小麦遗传背景的转移研究。Sears(1953)首先使用二粒小麦与簇毛麦进行杂交，得到硬粒小麦-簇毛麦双二倍体植株。Blanco等(1988)得到6VS在硬粒小麦中的双端体附加系，该株系遗传稳定且抗白粉病。1991年，Blanco等鉴定得到硬粒小麦″Creso″与簇毛麦的完整单体附加系。Qi等(1995；1998a)在簇毛麦6VS染色体上挖掘到抗小麦白粉病基因Pm21。近年来，携带Pm21基因的6AL/6VS易位系已经被导入不同小麦遗传背景中，并培育出入南农9918，内麦9号等高产抗病的小麦新品种中(陈佩度等,2002)。

细胞学鉴定是鉴定、追踪小麦背景中外源染色体(片段)的最主要、最直接的手段。荧光原位杂交(FISH)由于其稳定性、直观性成为细胞学鉴定手段中最常用的技术。基因组荧光原位杂交(GISH)是FISH中的一种，其以物种总基因组为探针，可准确鉴定出小麦遗传背景中的外源染色体(片段)及小麦异源易位系中染色体的断裂-结合点。但是传统的FISH/GISH技术操作程序复杂，不仅耗时耗力而且成本较高(Zhang et al,2015)。而新开发的结合Oligo核酸序列为探针的ND-FISH技术则因其成本低，省时省力的特点近年来得到广泛的使用(Tang et al,2014)。在该技术中，Tang等(2014)基于几个来自黑麦、小麦等物种的重复序列pAs1，pSc119.2,pTa-535,pTa71,CCS1,和pAWRC.1的序列信息，设计相应的长度约为60bp的Oligo序列(oligo指寡聚核苷酸序列，一般为DNA单链)。并以这些Oligo序列为探针，结合ND-FISH，最后可根据Oligo探针在不同染色体上表达的不同模式快速、准确地分辨出小麦A、B、D及黑麦R染色体。同时，Oligo-pSc119.2,Oligo-pTa-535两种探针的结合也可鉴别小麦A、B染色体组与簇毛麦V组染色体(说明书附图1a，图1c)，Oligo-(GAA)n可在硬粒小麦-簇毛麦双二倍体(2n＝42，ABV)中较好区分出小麦B组染色体(说明书附图1b，图1c)。随后，Fu等(2015)又根据来自黑麦重复序列1162、pSc200和pSc250设计了Oligo-1162,Oligo-pSc200和Oligo-pSc250三种Oligo探针。这三种Oligo探针可较好地涂布在所有的黑麦R组染色体上，达到类似GISH的效果。目前，这种可较好涂布在染色体上以达到GISH杂交效果的Oligo探针在除黑麦之外的其余小麦近缘物种中尚无报道。

现有技术针对簇毛麦染色体的Oligo序列探针技术方案为：(1)探针开发：根据在簇毛麦染色体上弥散分布的反转录转座子C1-10(Zhang et al，2013)信息，通过BLAST比对，筛选与小麦重复序列同源性较低的60bp区段。同时在RepeatMasker上进行验证，以保证所选择的60bp区段具有重复序列的特征基序。(2)探针制备：将这些序列信息送与Invitrogen(英潍捷基)生物公司进行合成，并在5’端连接荧光基团TAM。(3)探针验证：以这些连接了荧光基团的Oligo序列为探针，与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体(2n＝42，ABV)进行杂交，以验证该探针对簇毛麦染色体的特异性。

由于反转录转座子可分为数个亚家族，不同的亚家族在染色体上的分布区域不尽相同。如：分布于染色体臂、染色体端部、或着丝粒区域等。另外，在同一物种的不同染色体上分布也有不同。因此，基于一条反转录转座子序列设计的oligo探针，不能如GISH一样在染色体的所有区域及同一外源物种的不同染色体都有较好的杂交效果。

参考文献

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发明内容

本发明的目的包括：

提供一对可与簇毛麦染色体或簇毛麦大部分染色体杂交、结合的寡核苷酸序列(即Oligo序列)；

提供一对可在簇毛麦大部分染色体上较好弥散分布的Oligo探针；

提供该Oligo探针用于检测簇毛麦染色体或簇毛麦染色体片段的用途；

提供一种检测小麦遗传背景中簇毛麦染色体的方法；

提供一种杂交液，该杂交液可用于检测识别簇毛麦染色体；

提供一种利用二次或两轮荧光原位杂交，以进一步检测簇毛麦染色体的方法。

本发明具体提供了一对寡核苷酸，由核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示的第一链和核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的第二链组成；并提供了这对寡核苷酸制备检测簇毛麦染色体的核酸探针的用途。

本发明提供的这对寡核苷酸的一种实施方式是，将这对寡核苷酸制备成一对核酸探针；该核酸探针由核酸探针1和核酸探针2组成；所述核酸探针1包括序列表SEQ ID NO.1所示的寡核苷酸和标记基团，其中寡核苷酸的5’端与标记基团连接；所述核酸探针2包括序列表SEQ ID NO.2所示的寡核苷酸和标记基团，其中寡核苷酸的5’端与标记基团连接。

标记基团可任选自本领域常用放射性标记基团和非放射性标记基团，如可任选为：4-甲基-6羧罗丹明或羧基荧光素，羧基荧光素又称FAM；

优选的一种标记基团为4-甲基-6羧罗丹明。

例如，本发明所述核酸探针1可以为为序列表SEQ ID NO.1所示的寡核苷酸的5’端与4-甲基-6羧罗丹明连接得到，所述核酸探针2由序列表SEQ ID NO.2所示的寡核苷酸与4-甲基-6羧罗丹明连接得到。

本发明还提供了上述任一项所述核酸探针用于检测簇毛麦染色体的用途；如检测簇毛麦与小麦杂交品种中的簇毛麦染色体和/或染色体片段。

此外，本发明还提供了一种杂交液，包括上述任一项所述的核酸探针和缓冲液；其中核酸探针1的浓度为0.8-1.5μl/片，核酸探针2的浓度为0.8-1.5μl/片，缓冲液浓度为8-10μl/片。

核酸探针1的浓度优选为1μl/片，核酸探针2的浓度优选为1μl/片，缓冲液浓度优选为8μl/片；所述缓冲液为二倍柠檬酸钠缓冲液：三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液＝1:1(体积比)，pH值7.0。

本发明还提供了一种鉴定簇毛麦染色体的方法，包括以下步骤：

(1)对待检样品使用权利要求2-4任一项所述的核酸探针进行第一次荧光原位杂交，镜检；

(2)对步骤(1)杂交后的同一样品，使用核酸探针Oligo-pTa-535进行第二次荧光原位杂交，镜检；

(3)叠加步骤(1)和步骤(2)的镜检照片。

通过本领域常规方法制备本发明Oligo探针：寡聚核酸的合成及荧光基团4-甲基-6-羧罗丹明(TAMRA)的连接，可按照本领域常规方法制备和合成，也可交由专业公司合成，如交由英潍捷基(invitrogen)公司制备。

有益效果

本发明提供的Oligo探针可在簇毛麦大部分染色体上较好弥散分布，可通过省时省力且成本较低的ND-FISH即可达到类似GISH的杂交效果。以快速并较准确地鉴定出小麦遗传背景中的簇毛麦染色体(片段)。

采用本发明公开的Oligo探针C1-10-5、C1-10-6结合Oligo-pTa-535进行两轮杂交的FISH方法可有效在小麦背景下区分大部分的簇毛麦染色体。本发明提供的鉴别簇毛麦染色体的细胞学方法可用于簇毛麦大部分染色体向小麦转移过程中的簇毛麦染色体的追踪，特别是当簇毛麦染色体与小麦染色体发生易位时，本方法可达到类似传统GISH的效果，较准确鉴定出簇毛麦染色体与小麦染色体的断裂-结合位点，对构建簇毛麦染色体的分子标记物理图谱、基因的染色体物理定位提供快速准确且低成本的技术保证，有利于加快簇毛麦染色体向受体品种的转移与利用，加速育种进程，提高新品种选育的效率。

附图说明

图1a为Oligo探针Oligo-pSc119.2结合Oligo-pTa-535对硬粒小麦-簇毛麦双二倍体(2n＝42，ABV)的杂交模式图；

图1b Oligo-(GAA)n对硬粒小麦-簇毛麦双二倍体(2n＝42，ABV)的杂交模式图；

图1c小麦AB染色体组、簇毛麦V染色体组标准FISH核型图；

图1c的图片内，染色体编号中的数字代表同源群，左边的字母代表染色体组，例如：1A染色体即为第一排第一列染色体，2V即为第三排第二列染色体。

图2a Oligo探针C1-10-5结合Oligo探针C1-10-6对硬粒小麦-簇毛麦双二倍体(2n＝42，ABV)的杂交效果图；

图2b Oligo探针C1-10-5，Oligo探针C1-10-6及Oligo探针Oligo-pTa-535相结合的对硬粒小麦-簇毛麦双二倍体(2n＝42，ABV)杂交效果图；

图2c Oligo探针Oligo-pSc119.2结合Oligo-(GAA)n相结合对硬粒小麦-簇毛麦双二倍体(2n＝42，ABV)的杂交效果图；

图2d Oligo探针C1-10-5，Oligo探针C1-10-5、Oligo-pTa-535及Oligo-pSc119.2相结合对硬粒小麦-簇毛麦双二倍体(2n＝42，ABV)的杂交效果图。

具体实施方式

实施例1Oligo序列探针的设计及制备

根据簇毛麦染色体基因组序列及已报道的在簇毛麦染色体上弥散分布的重复序列，采用BLAST及RepeatMasker软件设计，经筛选得到60bp的Oligo序列C1-10-5和Oligo序列C1-10-6，交由英潍捷基(Invitrogen)公司合成，并在二序列的5‘端分别连接荧光基团4－甲基-6－羧罗丹明，获得Oligo探针C1-10-5(即本发明核酸探针1)和Oligo探针C1-10-6(即本发明核酸探针2)。其中，Oligo序列C1-10-5和Oligo序列C1-10-6从5‘端到3‘端的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示.

实施例2簇毛麦染色体的荧光原位杂交验证实验

(1)、取硬粒小麦-簇毛麦双二倍体TH1W(2n＝42，AABBVV)的根：

1)将种子放于湿润滤纸上，在23℃条件下培养24h。

2)将种子转于4℃条件下培养24h。

3)将种子转于23℃条件下培养直至其发根。

4)当根长至1-2cm时，取根将其置于湿润的0.5ml EP管中(EP管置于冰上)。0.5ml的EP管应预先在其盖上戳一个直径约为3mm左右的小洞，以方便对根尖进行笑气处理。

5)将装有根的EP管放入笑气罐中，笑气罐通笑气(0.9Mpa)处理2h。

6)取出EP管置于冰上，往其中加入90％乙酸，固定根尖8-10min。用ddH₂O洗根两次。

7)往EP管中加70％乙醇，并放于-20℃中，即可对根长期保存。

(2)、制片：

1)将根用ddH2O清洗2次，以去除根上的乙醇。

2)切下根尖部分置于酶液中，37℃条件下酶解1h。

3)用70％乙醇冲洗根尖2次，将酶液洗尽。

4)留少量乙醇，用针尖将根尖捣碎，离心(4000rmp，2min)后将EP管倒置，以控干乙醇。

5)往EP管中加入15-50μl乙酸，涡旋获得根尖细胞悬浮液。

6)在湿润的纸盒中滴片。

(3)杂交：

1)第一轮FISH：杂交液的配制:取实施例1制备的oligo探针C1-10-5、C1-10-6各1μl/片，杂交缓冲液(2×SSC：TE＝1：1(V:V),pH＝7.0)8μl/片。

2)37℃，黑暗条件杂交过夜。

3)DAPI染色盖上盖片，在Leica荧光显微镜DM2500下镜检。结果如图2a。

4)用70％乙醇洗片子5-10min，用洗耳球吹干备用。

5)第二轮FISH，利用Oligo-pTa535为探针，0.8μL/片；其余参照第一轮杂交的步骤1)-3)完成。步骤5)镜检图片与3)镜检图片叠加，结果如图2b)所示。

因为C1-10-5和C1-10-6的信号要弱于Oligo-pTa535的信号，如果混在一起杂交，在同样的曝光条件下，C1-10-5和C1-10-6的信号被Oligo-pTa535的信号盖住，不明显。而分开杂交，分开曝光，再将两次照相所得最佳照片叠加，而Oligo-pTa535由于多分布于簇毛麦部分染色体端部和着丝粒区，可达到使信号在簇毛麦染色体上涂布更满的效果。因此两轮杂交的效果较一轮合并杂交的效果更好。

由图2a可知，申请者开发的Oligo探针C1-10-5与C1-10-6结合可明显区分出簇毛麦2V、3V、4V、5V染色体；由图2b可知，本发明提供的Oligo探针C1-10-5与C1-10-6结合Oligo-pTa-535可显著区分出簇毛麦1-6V染色体。

Oligo-pTa535为已知探针(见文献Tang,Z.X.；Yang,Z.J.；Fu,S.L.Oligonucleotides replacing the roles of repetitive sequences pAs1,pSc119.2,pTa-535,pTa 71,CCS1,and PA WRC.1for FISH analysis.J.Appl.Genet.2014,55,313–318.)。

参照上述方法，使用Oligo探针Oligo-pSc119.2结合Oligo-(GAA)n相结合对硬粒小麦-簇毛麦双二倍体(2n＝42，ABV)进行杂交，其杂交效果图如说明书图2c所示。

参照上述方法，使用Oligo探针C1-10-5、Oligo探针C1-10-5、Oligo-pTa-535及Oligo-pSc119.2相结合对硬粒小麦-簇毛麦双二倍体(2n＝42，ABV)进行杂交，其杂交效果图如说明书图2d所示。

由图2c、图2d对照小麦-簇毛麦染色体模式图(图1a-c)可对小麦及簇毛麦所有染色体进行准确的身份识别。

Claims (8)

1.一对寡核苷酸，由核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示的第一链和核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的第二链组成。

2.一对核酸探针，由核酸探针1和核酸探针2组成；所述核酸探针1包括序列表SEQ IDNO.1所示的寡核苷酸和标记基团，其中寡核苷酸的5’端与标记基团连接；所述核酸探针2包括序列表SEQ ID NO.2所示的寡核苷酸和标记基团，其中寡核苷酸的5’端与标记基团连接。

3.根据权利要求2所述的核酸探针，其特征在于，所述标记基团为4-甲基-6羧罗丹明。

4.根据权利要求2所述的核酸探针，其特征在于，所述核酸探针1为序列表SEQ ID NO.1所示的寡核苷酸的5’端与4-甲基-6羧罗丹明连接得到，所述核酸探针2由序列表SEQ IDNO.2所示的寡核苷酸与4-甲基-6羧罗丹明连接得到。

5.权利要求2-4任一项所述核酸探针用于检测簇毛麦染色体的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述染色体为簇毛麦与小麦杂交品种中的簇毛麦染色体和/或染色体片段。

7.权利要求1所述寡核苷酸制备检测簇毛麦染色体的核酸探针的用途。

8.一种鉴定簇毛麦染色体的方法，包括以下步骤：

(1)对待检样品使用权利要求2-4任一项所述的核酸探针进行第一次荧光原位杂交，镜检；

(2)对步骤(1)杂交后的同一样品，使用核酸探针Oligo-pTa-535进行第二次荧光原位杂交，镜检；

(3)叠加步骤(1)和步骤(2)的镜检照片。