CN108715609A

CN108715609A - 植物钾转运体蛋白GhHAK5及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN108715609A
Application number: CN201810585354.5A
Authority: CN
Inventors: 田晓莉; 王逸茹; 李芳军
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-06-08
Filing date: 2018-06-08
Publication date: 2018-10-30

Abstract

本发明公开了植物钾转运体蛋白GhHAK5及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，获自棉花(Gossypium hirsutum)，命名为GhHAK5蛋白，是如下由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。编码GhHAK5蛋白的基因(命名为GhHAK5基因)也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种制备转基因植物的方法，是将目的植物中的GhHAK5基因沉默，得到耐低钾能力低于所述目的植物的转基因植物。本发明还保护一种制备转基因微生物的方法，是在出发微生物中导入GhHAK5基因，得到耐低钾能力高于所述出发微生物的转基因微生物。本发明对于研究植株耐钾，探究植物在逆境下的信号调控网络具有重大价值。

Description

植物钾转运体蛋白GhHAK5及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及植物钾转运体蛋白GhHAK5及其编码基因和应用。

背景技术

钾是植物生长所必须的三大营养元素之一，与光合作用、油脂合成、酶活性、气孔运动、蛋白质合成、离子平衡及抗逆性都密切相关。钾营养缺乏导致植株生长缓慢，植株矮小并且根系发育不良甚至发生腐烂，抗逆性、抗病性降低。

棉花是喜钾的经济作物，在其生长发育过程中需要大量的钾营养。钾能够促进棉花地上部和根系的生长发育，增加干物质积累。但近年来随着棉花复种指数和产量的逐步提高，以及转基因抗虫棉在黄河流域和长江流域棉区推广普及，我国棉花生产中的缺钾现象和缺钾程度越来越普遍和严重。另外，由于不合理的肥料运筹，我国棉花生产中的缺钾现象进一步加剧，常常导致早衰并严重影响产量提高和品质改善。

自上世纪90年代起，人们对植物钾营养性状的分子遗传机制进行了系统和深入的研究。植物中众多的钾离子通道、钾转运体以及相关的调控蛋白被相继克隆出来。它们在钾亲和性、选择性和能量的偶联上的作用都是不相同的。根据钾转运和通道蛋白结构和功能上的不同，可将其分为3个钾通道家族和3个钾转运体家族。分别是：Shaker钾通道、TPK钾通道、Kir-like钾通道和KUP/HAK/KT钾转运体、TPK/HKT转运体、CPA阳离子质子反向转运体。

棉花是我国重要的经济作物，对我国的经济发展具有重要意义。缺钾导致棉花早衰，严重影响棉花产量的提高和品质的改善。多年来，人们采用传统常规选育等方法解决棉花品种缺钾问题，但往往耗资大、工作量大和选择效率不高。随着分子生物学的不断发展，利用生物技术手段，培育耐低钾棉花品种成为可能。当前棉花的基因克隆工作虽然已经取得了一定的成果，但棉花的基因克隆工作远远落后于水稻、玉米、小麦等粮食作物。

发明内容

本发明的目的是提供植物钾转运体蛋白GhHAK5及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，获自棉花(Gossypium hirsutum)，命名为GhHAK5蛋白，是如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低钾相关的由序列1衍生的蛋白质；

(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与钾吸收相关的由序列1衍生的蛋白质；

(d)获自棉花的与(a1)具有98％以上同源性且与植物耐低钾相关的由其衍生的蛋白质；

(e)获自棉花的与(a1)具有98％以上同源性且与植物钾吸收相关的由其衍生的蛋白质。

为了使蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码GhHAK5蛋白的基因(命名为GhHAK5基因)也属于本发明的保护范围。

所述基因具体为如下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)的DNA分子：

(1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(2)在严格条件下(1)限定的DNA序列杂交且编码植物耐低钾相关蛋白的DNA分子；

(3)在严格条件下(1)限定的DNA序列杂交且编码植物钾吸收相关蛋白的DNA分子；

(4)来源于棉花的与(1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物耐低钾相关蛋白的DNA分子；

(5)来源于棉花的与(1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物钾吸收相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

本发明还保护GhHAK5蛋白的应用，为如下①、②或③：

①提高植物对低钾的耐逆性；

②提高植物对钾的吸收能力；

③提高植物在低钾环境中对钾的吸收能力。

含有GhHAK5基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有GhHAK5基因的重组表达载体。使用GhHAK5基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用GhHAK5基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物或转基因微生物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在植物或微生物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植物或微生物。

所述重组载体具体可为重组质粒p416-GPD-GhHAK5。

重组质粒p416-GPD-GhHAK5为在p416-GPD载体的XbaI和SmaI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。

本发明还保护一种制备转基因植物的方法，是将目的植物中的GhHAK5基因沉默，得到耐低钾能力低于所述目的植物的转基因植物。

耐低钾能力低于所述目的植物的转基因植物具有如下(Ⅰ)和/或(Ⅱ)和/或(Ⅲ)的表型：

(Ⅰ)低钾胁迫下，与目的植物相比，干物质积累能力低；

(Ⅱ)低钾胁迫下，与目的植物相比，叶绿素含量低；

(Ⅲ)低钾胁迫下，与目的植物相比，钾含量低。

本发明还保护一种植物育种的方法，是降低目的植物中GhHAK5蛋白的含量和/或活性，从而使得目的植物对低钾的耐逆性降低。

对低钾的耐逆性降低体现为如下(ⅰ)和/或(ⅱ)和/或(ⅲ)：

(ⅰ)低钾胁迫下，干物质积累能力降低；

(ⅱ)低钾胁迫下，叶绿素含量降低；

(ⅲ)低钾胁迫下，钾含量降低。

本发明还保护一种制备转基因植物的方法，是在出发植物中导入GhHAK5基因，得到耐低钾能力高于所述出发植物的转基因植物。

耐低钾能力高于所述目的植物的转基因植物具有如下(Ⅳ)和/或(Ⅴ)和/或(Ⅵ)的表型：

(Ⅳ)低钾胁迫下，与目的植物相比，干物质积累能力高；

(Ⅴ)低钾胁迫下，与目的植物相比，叶绿素含量高；

(Ⅵ)低钾胁迫下，与目的植物相比，钾含量高。

本发明还保护一种植物育种的方法，是增加出发植物中GhHAK5蛋白的含量和/或活性，从而使得出发植物对低钾的耐逆性增高。

对低钾的耐逆性增高体现为如下(ⅳ)和/或(ⅴ)和/或(ⅵ)：

(ⅳ)低钾胁迫下，干物质积累能力增高；

(ⅴ)低钾胁迫下，叶绿素含量增高；

(ⅵ)低钾胁迫下，钾含量增高。

以上任一所述“是将目的植物中的GhHAK5基因沉默”的实现方法具体可为：在目的植物中导入抑制GhHAK5基因表达的物质。

抑制GhHAK5基因表达的物质也属于本发明的保护范围。

抑制GhHAK5基因表达的物质在制备转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。

以上任一所述钾含量具体可为钾离子含量。

以上任一所述叶绿素含量具体可为叶片中的叶绿素含量。

以上任一所述干物质积累能力具体可为地上部分干物质积累能力。

以上任一所述干物质积累能力具体可为全植株干物质积累能力。

以上任一所述抑制GhHAK5基因表达的物质可为pTRV1载体和重组质粒pTRV2-GhHAK5。

重组质粒pTRV2-GhHAK5为：在pTRV2载体的XbaI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第1367-1681位核苷酸所示的DNA分子。

以上任一所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物，具体可为是锦葵科植物，更具体可为棉属植物，更具体可为棉花，更具体可为鲁棉研22号。

以上任一所述出发植物可为单子叶植物或双子叶植物，具体可为是锦葵科植物，更具体可为棉属植物，更具体可为棉花，更具体可为鲁棉研22号。

以上任一所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，具体可为是锦葵科植物，更具体可为棉属植物，更具体可为棉花，更具体可为鲁棉研22号。

所述低钾可为钾离子浓度为0.1mM以下，具体可为钾离子浓度为0.05mM以下，更具体可为钾离子浓度为0.03mM以下。

本发明还保护一种制备转基因微生物的方法，是在出发微生物中导入GhHAK5基因，得到耐低钾能力高于所述出发微生物的转基因微生物。

所述出发微生物可为酵母菌，更具体可为酵母R5421。

耐低钾能力高于所述出发微生物的含义为：在低钾环境中，与出发微生物相比，生长能力强。

所述低钾可为钾离子浓度为5mM以下，具体可为钾离子浓度为1mM以下，更具体可为钾离子浓度为250μM以下。

本发明的发明人克隆了棉花GhHAK5基因，通过VIGS技术在棉花中沉默GhHAK5基因及在酵母中异源表达GhHAK5基因，探究了GhHAK5蛋白的生物学功能。本发明对于研究植株耐钾，探究植物在逆境下的信号调控网络具有重大价值。

附图说明

图1为GhHAK5基因的组织特异性表达的结果。

图2为实施例2中各组植株根系中GhHAK5基因的相对表达水平的结果。

图3为实施例2中的表型照片。

图4为实施例2中叶绿素含量、钾离子含量以及干重的结果。

图5为实施例3中转基因微生物表型鉴定的结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

棉花品种“鲁棉研22号”，简称鲁棉研22号。

VIGS即病毒诱导的基因沉默。现有技术中常见的VIGS系统由pTRV1载体和pTRV2载体组成。pTRV1载体和pTRV2载体均记载于如下文献：Gao XQ,Wheeler T,Li ZH,KenerleyCM,He P,Shan LB.2011.Silencing GhNDR1and GhMKK2 compromises cotton resistanceto Verticillium wilt.The Plant Journal 66,293-305.。

pTRV2-GhCLA1质粒是以pTRV2载体为出发载体得到的。GhCLA1蛋白为来源于陆地棉的1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase。采用pTRV1载体和pTRV2-GhCLA1质粒，利用VIGS干扰GhCLA1基因表达，可以引起棉花的白化表型。

pTRV2-GhCLA1质粒和pTRV2-GFP质粒记载于如下文献：Gao XQ,Wheeler T,Li ZH,Kenerley CM,He P,Shan LB.2011.Silencing GhNDR1and GhMKK2 compromises cottonresistance to Verticillium wilt.The Plant Journal 66,293-305.。

VIGS溶液：含10mM MES、200μM乙酰丁香酮和10mM MgCl₂，余量为无菌水。

实施例1、GhHAK5蛋白及其编码基因的发现、克隆及定位

一、GhHAK5蛋白及其编码基因的发现

从鲁棉研22号中获得一个新蛋白，将其命名为GhHAK5蛋白，如序列表的序列1所示(由816个氨基酸残基组成)。将编码GhHAK5蛋白的基因命名为GhHAK5基因，其cDNA的开放阅读框如序列表的序列2所示(由2451个核苷酸组成)。

二、GhHAK5基因的组织特异性表达

通过荧光实时定量PCR对鲁棉研22号中GhHAK5基因的表达部位进行分析。样本为正常营养水平下三叶期棉花植株各部位的总RNA反转录得到的cDNA。荧光实时定量PCR所用的仪器为ABI 7500Fast(Applied Biosystem)。以棉花Actin9基因作为参照基因。相对表达量采用2^-ΔΔCt方法计算。

用于检测GhHAK5基因的引物如下：

F1：5’-CAAGAGTTACGGTGGTCCA-3’；

R1：5’-TTCTGAACCCAACGGTGA-3’。

用于检测Actin9基因的引物对如下：

F1：5’-GCCTTGGACTATGAGCAGGA-3’；

R2：5’-AAGAGATGGCTGGAAGAGGA-3’。

以茎中GhHAK5基因的相对表达量作为参比1，各个部位中GhHAK5基因的相对表达水平见图1。GhHAK5基因在棉花不同组织中均有一定的表达量，在根中表达量最高。

实施例2、沉默植株的获得和表型鉴定

一、VIGS-GhHAK5沉默载体的构建

1、提取鲁棉研22号根系的总RNA并反转录为cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，用F3和R3组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F3：5’-GCTCTAGAAAAATATCGGTCACGCATATGG-3’；

R3：5’-CGGGATCCCTACCAGTTGCTTAATGTATTCC-3’。

3、用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切步骤2得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶XbaI和BamH1双酶切pTRV2载体，回收约9000bp的载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pTRV2-GhHAK5。根据测序结果，对重组质粒pTRV2-GhHAK5进行结构描述如下：在pTRV2载体的XbaI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第1367-1681位核苷酸所示的DNA分子。

二、VIGS-GhHAK5沉默植株的获得

1、将重组质粒pTRV2-GhHAK5导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。然后，用VIGS溶液悬浮所述重组农杆菌，得到OD_600nm＝1.5的菌液。

2、将pTRV1载体导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。然后，用VIGS溶液悬浮所述重组农杆菌，得到OD_600nm＝1.5的菌液。

3、将步骤1得到的菌液和步骤2得到的菌液等体积混合，得到混合液甲。

4、将pTRV2-GhCLA1导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。然后，用VIGS溶液悬浮所述重组农杆菌，得到OD_600nm＝1.5的菌液。

5、将步骤4得到的菌液和步骤2得到的菌液等体积混合，得到混合液乙。

6、将pTRV2-GFP导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。然后，用VIGS溶液悬浮所述重组农杆菌，得到OD_600nm＝1.5的菌液。

7、将步骤6得到的菌液和步骤2得到的菌液等体积混合，得到混合液丙。

8、分组注射

试验组：对子叶期的鲁棉研22号植株进行操作：在子叶下表面注射混合液甲(每株植株均对两片子叶进行注射，注射至充满子叶为止)。

阳性对照组：对子叶期的鲁棉研22号植株进行操作：在子叶下表面注射混合液乙(每株植株均对两片子叶进行注射，注射至充满子叶为止)。

阴性对照组：对子叶期的鲁棉研22号植株进行操作：在子叶下表面注射混合液丙(每株植株均对两片子叶进行注射，注射至充满子叶为止)。

各组植株均在Hoagland’s营养液中进行水培，每周更换新的营养液。

注射当天作为试验第1天，试验第14天后阳性对照组植株均出现白化表型。

试验第14天，分别取试验组植株和阴性对照组植株根系的总RNA，并反转录为cDNA，检测GhHAK5基因的表达情况(检测方法同实施例1的步骤二)。

以阴性对照组植株根系中GhHAK5基因的相对表达量作为参比1，计算各组植株根系中GhHAK5基因的相对表达水平。结果见图2。结果表明，试验组各个植株根系中GhHAK5基因的相对表达量均显著下降，下降幅度为50％-60％，均为VIGS-GhHAK5沉默植株。

三、VIGS-GhHAK5沉默植株的低钾敏感表型

步骤二的试验第14天，将部分试验组植株和部分阴性对照组植株转移至低钾营养液(LK)中培养30d(每周更换新的营养液)，然后观察表型并测量叶绿素含量和钾离子含量。步骤二的试验第14天，将另一部分试验组植株和另一部分阴性对照组植株转移至Hoagland’s营养液(CK)中培养30d(每周更换新的营养液)，然后观察表型并检测干重、叶绿素含量和钾离子含量。

低钾营养液与Hoagland’s营养液的差别仅在于硝酸钾的加入量，低钾营养液中的钾浓度为0.03mM。

钾含量测定方法：Xu J,Tian XL,Eneji A E,Li ZH.2014.Functionalcharacterization of GhAKT1,a novel Shaker-like K⁺channel gene involved in K⁺uptake from cotton(Gossypium hirsutum).Gene 545,61-71.。检测自下而上第一叶(1L)和第二叶(2L)、根(R)、茎(S)的钾含量。每种处理下每组植株抽取12个植株的样本，结果取平均值。

叶绿素含量测定方法：Tang DQ,Qian HM,Zhao LX,Huang DF,TangKX.2005.Transgenic tobacco plants expressing BoRS1gene from Brassica oleraceavar.acephala show enhanced tolerance to water stress.J.Biosci 30,647–655.。检测自下而上第一叶(1L)和第二叶(2L)的叶绿素含量。每种处理下每组植株抽取12个植株的样本，结果取平均值。

干重的检测方法：80℃(烘干至恒重)，称重。检测叶片(L)/根(R)/茎(S)的干重。每种处理下每组植株抽取12个植株的样本，结果取平均值。

表型照片见图3。图3A为全植株表型照片。图3B为植株自下而上第一叶和第二叶的表型照片。在低钾条件下，与阴性对照组植株相比，试验组植株的叶片黄化更为严重。

叶绿素含量、钾离子含量以及干重的结果见图4。在低钾条件下，与阴性对照组植株相比，试验组植株叶片的叶绿素含量更低、各部分钾离子含量更低、地上部干重(叶片和茎)更低。

以上结果表明，试验组植株(即GhHAK5基因沉默植株)对低钾更为敏感。

实施例3、转基因微生物的获得和表型鉴定

酵母R5421是以野生型酵母R757为出发菌，沉默trk1基因和trk2基因得到的钾吸收缺陷型酵母菌。p416-GPD载体为酵母转化载体。野生型酵母R757、酵母R5421、p416-GPD载体均记载于如下文献：Li,J,Long Y,Qi GN,Li J,Xu ZJ,Wu WH,W Y.2014.The Os-AKT1channel is critical for K⁺uptake in rice roots and ismodulated by therice CBL1-CIPK23complex.The Plant Cell 26,3387-3402.。

一、重组质粒的构建

1、提取鲁棉研22号根系的总RNA并反转录为cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，用F4和R4组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F4：5’-GCTCTAGAATGGAAGAGAACAAACCAGG-3’；

R4：5’-TCCCCCGGGCTAAATCTCGTACGCCATTCC-3’。

3、用限制性内切酶XbaI和SmaI双酶切步骤2得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶XbaI和SmaI双酶切p416-GPD载体，回收载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒p416-GPD-GhHAK5。根据测序结果，对重组质粒p416-GPD-GhHAK5进行结果描述如下：在p416-GPD载体的XbaI和SmaI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。

二、重组酵母的获得

将重组质粒p416-GPD-GhHAK5导入酵母R5421，得到重组酵母，将其命名为酵母R5421-GhHAK5。

将p416-GPD载体导入酵母R5421，得到重组酵母，将其命名为酵母R5421-V。

三、表型鉴定

待测酵母为：酵母R757、酵母R5421、酵母R5421-GhHAK5和酵母R5421-V。

1、将待测酵母接种至YPDA培养基，30℃、200rpm振荡培养至OD_600nm＝0.8。

2、完成步骤1后，采用无菌水作为溶剂，将整个体系进行10倍梯度稀释，然后将每个稀释度的菌液点样5μL于不同钾浓度的AP培养基上，点完在超净台吹干平皿，于30℃培养箱内黑暗培养2天拍照。

AP培养基的制备方法(用L-精氨酸调节pH值至6.5)：50×盐溶液20mL、H₃PO₄546μL、L-精氨酸1.742g、1000×维生素1mL、1000×微量1mL、缺少尿嘧啶的补充成分0.77g、100×Ura 10mL、葡萄糖20g、琼脂粉15g，KCl(按所需K⁺浓度确定加入量)，用水定容至1000mL。

50×盐溶液：100mM MgSO₄、10mM CaCl₂，余量为水。

1000×维生素的制备方法：Biotin 0.011g、Nicotinic acid 0.04g、Inositol0.2g、Pantothenic acid 0.04g，用水定容至100mL。

1000×微量的制备方法：KI 0.01g、H₃BO₃ 0.05g、MnSO₄·H₂O 0.0447g、ZnSO₄·7H₂O0.071g、CuSO₄·5H₂O 0.0078g、Na₂MnO₄·2H₂O 0.0235g，用水定容至100mL。

缺少尿嘧啶的补充成分(-Ura DO Supplement)：Cat#630416，厂家Clontech。

100×Ura的制备方法：Uracil粉末0.2g，用水定容至100mL。

结果见图5。图5中，10^-1代表点样前菌液稀释至10倍体积，10^-2代表点样前菌液稀释至100倍体积，10^-3代表点样前菌液稀释至1000倍体积。酵母R5421和酵母R5421-V在5mM及以下K⁺浓度的AP培养基上基本不能生长。酵母R5421-GhHAK5在各个K⁺浓度的AP培养基上可以生长。结果表明，GhHAK5蛋白在低钾条件下能介导钾离子的吸收。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 植物钾转运体蛋白GhHAK5及其编码基因和应用

<130> GNCYX181170

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 816

<212> PRT

<213> Gossypium hirsutum

<400> 1

Met Glu Glu Asn Lys Pro Gly Met Ala Glu Asn Val Glu Lys Gly Glu

1 5 10 15

Glu Ile Glu Met Ala Val Ala Glu Ala Asp Lys Asn Arg Leu Lys Glu

20 25 30

Arg Lys Phe Ser Trp Ala Lys Leu Arg Arg Val Asp Ser Leu Asn Leu

35 40 45

Glu Ala Gly Arg Leu Ser Phe Ser Ser Thr Lys Ser Pro His Ser Lys

50 55 60

Val Asp Trp Ile Arg Thr Leu Ser Leu Ala Phe Gln Ser Ile Gly Val

65 70 75 80

Ile Tyr Gly Asp Ile Gly Thr Ser Pro Leu Tyr Val Tyr Ala Ser Thr

85 90 95

Phe Thr Asp Gly Ile Gly His Gln Asp Asn Leu Ile Ala Val Leu Ser

100 105 110

Leu Ile Ile Tyr Ser Ile Val Leu Ile Pro Phe Phe Lys Tyr Ala Phe

115 120 125

Leu Val Leu Arg Ala Asn Asp Asn Gly Glu Gly Gly Thr Phe Ala Leu

130 135 140

Tyr Ser Leu Leu Cys Arg His Val Lys Leu Ser Leu Leu Pro Asn Gln

145 150 155 160

Gln Pro Glu Asp Arg Glu Leu Ser Asn Tyr Gln Leu Asp Thr Pro Ser

165 170 175

Ser Gln Leu Asn Arg Ala Tyr Lys Ile Arg Gly Lys Met Glu Asn Ser

180 185 190

Leu Lys Ala Lys Leu Thr Ile Phe Val Val Thr Ile Leu Ala Thr Ser

195 200 205

Met Val Ile Gly Asp Gly Val Leu Thr Pro Ser Ile Ser Ile Leu Ser

210 215 220

Ala Val Gly Gly Ile Asp Ser Leu Gly Gln Asp Ala Val Val Gly Ile

225 230 235 240

Ser Val Val Ile Leu Val Ile Leu Phe Cys Val Gln Arg Phe Gly Thr

245 250 255

Asp Lys Val Gly Tyr Ser Phe Ala Pro Ile Ile Cys Leu Trp Phe Thr

260 265 270

Leu Leu Ser Gly Ile Gly Leu Tyr Asn Leu Phe Thr Tyr Gly Trp Gly

275 280 285

Val Leu Arg Ala Phe Asn Pro Leu Tyr Ile Val Asp Tyr Phe Lys Arg

290 295 300

Arg Gly Lys Asp Gly Trp Ile Ser Leu Gly Gly Val Val Leu Cys Ile

305 310 315 320

Thr Gly Thr Glu Ala Met Phe Ala Asp Leu Gly His Phe Asn Val Arg

325 330 335

Ala Val Gln Ile Ser Phe Ser Thr Ile Thr Leu Pro Ala Leu Leu Thr

340 345 350

Val Tyr Ser Gly Gln Ala Ala Tyr Leu Thr Lys His Pro Glu His Val

355 360 365

Gly Asp Thr Phe Tyr Lys Ser Ile Pro Asp Pro Ile Tyr Trp Pro Thr

370 375 380

Phe Val Val Ala Val Ala Ala Ser Ile Ile Ala Ser Gln Ala Met Ile

385 390 395 400

Ser Gly Ala Phe Ser Ile Ile Ser Gln Ser Leu Thr Leu Gly Cys Phe

405 410 415

Pro Arg Val Thr Val Val His Thr Ser Thr Glu Tyr Glu Gly Gln Val

420 425 430

Tyr Ile Pro Glu Val Asn Tyr Met Leu Met Ile Ala Cys Val Ala Val

435 440 445

Thr Val Gly Phe Arg Thr Thr Glu Asn Ile Gly His Ala Tyr Gly Ile

450 455 460

Ala Val Val Ala Val Met Val Ile Thr Thr Cys Met Val Thr Leu Ile

465 470 475 480

Met Leu Val Ile Trp Lys Thr Asn Ile Leu Trp Ile Ala Leu Phe Cys

485 490 495

Val Phe Phe Gly Thr Ile Glu Thr Ile Tyr Leu Ser Ser Val Leu Tyr

500 505 510

Lys Phe Val Glu Gly Gly Tyr Leu Pro Leu Ala Phe Ser Leu Ile Leu

515 520 525

Met Thr Ile Met Gly Ile Trp His Tyr Val His Gln Lys Arg Tyr Glu

530 535 540

Phe Glu Leu Asn Asn Lys Val Ser Lys Glu Tyr Ile Lys Gln Leu Val

545 550 555 560

Glu Asp Pro Arg Ile Asn Arg Val Pro Gly Ile Gly Leu Leu Tyr Ser

565 570 575

Glu Leu Val Gln Gly Ile Pro Pro Ile Phe Pro His Phe Ile Ser Ser

580 585 590

Ile Pro Ser Ile His Ser Val Leu Val Phe Val Ser Ile Lys Lys Leu

595 600 605

Pro Ile Ser Lys Val Thr Leu Glu Glu Arg Phe Leu Phe Arg His Val

610 615 620

Glu Pro Arg Glu Tyr Arg Met Phe Arg Cys Val Val Arg Tyr Gly Tyr

625 630 635 640

Lys Asp Phe Met Gly Thr Pro Val Glu Phe Glu Gln Gln Leu Val Glu

645 650 655

Lys Leu Lys Glu Phe Ile Arg His Glu Tyr Phe Met Ala Glu Gly Glu

660 665 670

Ala Ala Ala Val Glu Asn Ser Pro Gln Ser Ser Asn Ile Leu Ala Asn

675 680 685

Gln Gly Lys Asp Lys Gly Ser Ser Arg Arg Ala Val Phe Val Glu Glu

690 695 700

Thr Leu Asn Gln Leu Asn Gln Ser His Arg Ser Ser Ala Ser Ile Gln

705 710 715 720

Ser Phe Asn Val Ala Lys Ser Asn Asn Ser Ser Ser Gly Ile Ile Ser

725 730 735

Ala Ala Pro Pro Ile Leu Gly Ala Glu Glu Glu Ile Gln Phe Val Gln

740 745 750

Lys Ala Lys Asp Glu Gly Ile Ile Tyr Leu Leu Gly Glu Ala Glu Val

755 760 765

Met Ala Lys Pro Asn Ser Ser Tyr Thr Lys Arg Met Ile Val Asp Tyr

770 775 780

Gly Tyr Asn Phe Leu Arg Arg Asn Phe Ser Gln Gly Glu Lys Val Met

785 790 795 800

Met Ile Pro Gln Thr Arg Leu Leu Arg Val Gly Met Ala Tyr Glu Ile

805 810 815

<210> 2

<211> 2451

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum

<400> 2

atggaagaga acaaaccagg tatggccgag aatgtggaga aaggtgagga gatagagatg 60

gcagtagcag aagctgataa aaaccgacta aaagaacgaa agttctcgtg ggccaagctg 120

cgccgtgtgg attctctcaa tttggaggct ggcagacttt cattttcttc aaccaagtcc 180

ccccattcca aggtggattg gataaggacg ttgagtttag catttcagtc tattggagtg 240

atatacggag atattggaac atctccactt tatgtatacg ccagtacttt cactgacggt 300

attggtcacc aagataacct tattgcggtt ctttccctca tcatctactc catagttcta 360

atcccttttt ttaagtatgc attcctcgtc ttgagagcca atgacaacgg tgaaggtgga 420

acgtttgcgc tgtattcttt gttgtgccga catgtgaaac tgagcttact tccgaatcaa 480

caaccagagg atagagagct gtctaactac cagttggaca ctccatccag ccagttgaat 540

cgagcatata aaattagagg aaagatggag aacagtttaa aagccaaact tactattttc 600

gtggtcacta tccttgcgac ttcaatggtt ataggtgatg gggttttgac cccatctatc 660

tcaattcttt ctgcggttgg tggcatcgac tccttggggc aagacgctgt ggtgggaatt 720

tctgtggtaa ttctggtcat cctgttctgc gttcaacgat ttggaactga caaagtggga 780

tattcatttg ccccaatcat atgcctgtgg tttaccttgc taagtggcat tggtttgtac 840

aacctcttca catatggttg gggtgtatta cgtgcgttta atccgttgta tatagtggat 900

tacttcaaaa gacgcggtaa ggacgggtgg atatcacttg gaggagtagt actttgcatt 960

acaggaactg aggctatgtt tgctgatctg ggtcacttca atgttcgagc agttcaaatt 1020

agtttctcca ctattacctt gcctgcttta cttactgtat atagtggcca agctgcctac 1080

ctcacaaaac accctgaaca cgttggggac actttctaca aatctattcc agatccaatc 1140

tattggccaa catttgtggt agctgtagct gcttccatca ttgcaagcca agctatgata 1200

tcaggagcat tttcaattat ctctcagtcg ttaacactgg gatgttttcc aagagttacg 1260

gtggtccaca cctccactga gtatgagggg caggtttata taccagaagt caactacatg 1320

ctcatgattg cctgtgttgc agtcaccgtt gggttcagaa ccacagaaaa tatcggtcac 1380

gcatatggaa ttgctgttgt agctgtaatg gtgatcacaa catgtatggt tacacttatc 1440

atgcttgtta tatggaagac aaacatatta tggattgctc tcttctgtgt gttcttcggc 1500

actatagaga ccatatatct ctcatcagtc ttgtataaat tcgttgaagg tggctacctt 1560

ccactggcct tctcacttat cctaatgaca atcatgggaa tatggcacta cgtgcaccaa 1620

aaaagatacg aatttgagct caacaataag gtttcaaagg aatacattaa gcaactggta 1680

gaagatccaa ggataaaccg ggtaccagga atcggtcttt tgtactcgga gttggttcaa 1740

ggcatacctc ccatatttcc tcatttcatt tccagcattc cttctatcca ttcagttcta 1800

gtctttgtct ccattaagaa acttccaatc agcaaggtaa cactagagga gcgttttctc 1860

ttcagacatg tggaaccaag agagtatcga atgttccgtt gtgttgtaag atatggttat 1920

aaggatttca tgggaacacc tgtagagttt gagcaacaac tggttgagaa gttgaaggaa 1980

ttcattcgtc atgaatattt catggctgaa ggagaggccg cagctgtaga gaactcgccc 2040

cagagctcca atattctagc aaatcaagga aaagataaag gaagtagtag aagggctgtt 2100

tttgtggagg aaacactgaa ccagctcaac caatctcatc gttcctcagc ctccatccag 2160

tcattcaatg tggccaaatc aaataactcg tcgagtggga tcatatcagc agcaccaccc 2220

atactggggg ctgaagaaga gattcagttt gttcagaaag caaaggatga aggaattatt 2280

tacctcctag gagaagctga agtgatggct aaacccaatt cttcctacac aaagaggatg 2340

attgtggatt atggctataa ttttctgagg agaaacttca gtcaagggga gaaagtgatg 2400

atgataccac aaaccaggct tctaagggtt ggaatggcgt acgagattta g 2451

Claims

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.含有权利要求2所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。

4.权利要求1所述蛋白质的应用，为如下①、②或③：

①提高植物对低钾的耐逆性；

②提高植物对钾的吸收能力；

③提高植物在低钾环境中对钾的吸收能力。

5.一种制备转基因植物的方法，是将目的植物中权利要求2所述基因沉默，得到耐低钾能力低于所述目的植物的转基因植物。

6.一种植物育种的方法，是降低目的植物中权利要求1所述蛋白质的含量和/或活性，从而使得目的植物对低钾的耐逆性降低。

7.一种制备转基因植物的方法，是在出发植物中导入权利要求2所述基因，得到耐低钾能力高于所述出发植物的转基因植物。

8.一种植物育种的方法，是增加出发植物中权利要求1所述蛋白质的含量和/或活性，从而使得出发植物对低钾的耐逆性增高。

9.物质或应用；

所述物质为用于抑制权利要求2所述基因表达的物质；

所述应用为用于抑制权利要求2所述基因表达的物质在制备转基因植物中的应用。

10.一种制备转基因微生物的方法，是在出发微生物中导入权利要求2或3所述基因，得到耐低钾能力高于所述出发微生物的转基因微生物。