CN110982815A - 一种棉花钾转运体基因启动子及其应用 - Google Patents

一种棉花钾转运体基因启动子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种棉花钾转运体基因启动子及其应用。本发明中的一种钾转运体基因启动子pGhHAK5，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。该启动子序列具有根特异性表达调控元件ATAAAAT和参与低钾调控的ARF转录因子结合位点TGTCNN。该启动子能在拟南芥中驱动外源基因GUS的表达，其驱动的GUS主要在拟南芥成熟的根和地上部维管束组织中表达。上述启动子的植物表达载体pCAMBIA1381Z‑pGhHAK5可应用于制备转基因植物。本发明获得的钾转运体基因启动子，其克隆在提高植物钾吸收效率和目标基因在植物成熟根和地上部维管束组织中的精准特异性表达等方面具有应用价值。

Description

一种棉花钾转运体基因启动子及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及一种核苷酸序列及其应用，尤其涉及一种棉花钾转运体基因启动子及其应用，具体涉及一种棉花钾转运体基因启动子pGhHAK5及其应用。
背景技术
棉花是我国重要的经济作物，也是钾敏感作物。据估计，我国耕地有1/4～1/3的土壤缺钾或严重缺钾，土壤缺钾不仅会影响棉花产量和纤维品质的形成，也是引起棉花早衰的重要原因之一。研究表明，植物可以通过提高自身的钾吸收效率或调整内源钾的再分配与利用来适应外界的低钾环境，该过程主要通过钾转运体和钾离子通道蛋白两大钾转运系统来完成。近年来，对钾转运系统基因的研究已成为提高作物钾吸收特性，培育钾高效作物品种的一条新途径。
KUP/HAK/KT钾转运体是植物钾转运系统较早发现的一个基因家族，其成员在介导植物对K+的高亲和性吸收、转运与分配等方面都起着关键作用。AtHAK5是拟南芥KUP/HAK/KT家族成员之一，其表达受低钾胁迫诱导，也被认为是拟南芥响应钾缺乏的标志性基因。作为拟南芥
KUP/HAK/KT家族中唯一一个能在低于10μM钾浓度环境下参与钾吸收的高亲和性钾转运体基因，目前关于AtHAK5表达调控的分子机制已开展许多研究。研究者们发现，AtHAK5启动子区特定的顺式作用元件会与相应的转录因子结合来调控该基因的表达，使植物更好地适应外界低钾环境。例如，转录因子ARF2通过与AtHAK5启动子区生长素响应元件结合来抑制AtHAK5的表达，并可通过低钾引起的ARF2磷酸化来解除其对AtHAK5表达的抑制，使其在低钾条件下被诱导并大量表达；同样地，转录因子RAP2.11可通过与AtHAK5启动子区ERE结构域和GCC-box位点结合来正向调控AtHAK5在低钾条件下的表达。AtHAK5的表达除受转录水平调控外，近年来研究发现激酶CIPK23能磷酸化AtHAK5蛋白的N端，并在转录后水平调控AtHAK5蛋白的活性，增强其对环境中钾的吸收能力。这些研究表明，钾转运体基因的表达调控在植物适应外界低钾胁迫方面发挥着重要作用。
启动子对于基因的表达调控至关重要，其包含的顺式作用元件种类和数量会影响基因的表达模式和强度。因此，克隆和分析基因的启动子，有助于了解其表达调控机制及功能。陆地棉钾转运体基因GhHAK5是拟南芥AtHAK5的同源基因，其CDS序列已被克隆，关于其序列特征和表达特性已进行了初步研究。然而，关于该基因启动子功能的研究尚很少开展。
发明内容
针对以上问题，本发明提供一种棉花钾转运体基因启动子及其应用，本发明以陆地棉品种百棉1号为材料对GhHAK5基因启动子2000bp片段pGhHAK5进行克隆，并通过转化拟南芥、GUS组织定位和低钾诱导表达特性分析来研究其功能，该启动子的克隆和功能研究对于改良棉花的钾吸收特性及目标基因在植物成熟根和地上部维管束组织中的精准表达具有重要意义。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种棉花钾转运体基因启动子，包含选自以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO.1或其片段，其中所述片段包含SEQ ID NO.1的至少1000个连续核苷酸并且具有钾转运体基因启动子的组织特异性启动子活性；
(b)与(a)的核苷酸序列具有至少90％，优选95％序列一致性并具有钾转运体基因启动子的组织特异性启动子活性。
本发明中，所述SEQ ID NO.1所示的序列如下：
ATTGATTTCAAAAAAAAAATGATATGAACCCGTGAGGAAACTGCCCAGCACCTTCCAACAATTTCGTACTTCTTCAGTTGACTTTACATTTTCTATTTTGTAATTTTTAAGAAGTCAATGTCATTCGCCATCAAGATGGTGAATAAAATGATTTTTTTAGGTTATTAAACTTATTGAATTCTCAAGCAAAGTGGAAAAAATAATTTACATTATTAGTCATTAAATTGTGAGTAAATTTTTGTTTTAATCACTTAATTAAAAAATTACTATTTGATTATTAAATTATCAAAAGTTTCGTTTATGTCATTGAGTTATTAAAATTAATGTTATATGGCTTTACCTATTTGCACTATCTGTACCAATCGAAAACTCTCTTTCTCATTCTCTTCTATAGTTTAGTTTTTTCGATAAAACGACTTTCGACATCACGAATTTATGAATCAAAAGTTAAATAGCTTTTTTTTCCAATCTTTGATACTAATTGTCAGATCAACTTGGATATAAAGTATATTCTTTTACTTATCGATCGGTGTTGATCTACAGTACCGATCGTTGAATTGTGACTTAGAGCTCGCTGGCAAAGTTTTGTTTTTTTTTTAAAGAAAATTTTAAATAATTTAATAGTTTAAATGAAAAAATTTGAATAATTAAATTATAAATATTTTTAATTAAGTGAGCAGAATAGGTTGATTGAGAATTTCAGCTGTATTTGTCTTGTAGTGGTATTGAGAAAAAGAAGAATTATTGCAATAATGCAGGACAATATATTAGTTTTTCTCACTTTCAATGACATAGGCCACGTTGGTGATGAAAAGTCAATGTCTGTATTTTCAGCATTATTTTAATATTATTTGGTTCTCCTTCTCCATTGTAATTTAAATTTGACTTTTCCTTATTGCTCCCCATTTTTACTTGTTTTTTCTTATTGGAGAAGAGGATATTTGAACCCTAAATATTAACCCATCAACATAAAATTTCTTTTAAAAGGTGGATATAATATATATATTGTAATAATATCAACCCCTAAAAAGTTTTTGAAATATTTTAATTTCATATGGAAAACTTACCCTTCATCAAATAAGTAAGAATATTATTGTTCTCTCTTCAAAAAAAAAAAAAAGAATATTATTGTTCAATGTTATCATGTTCCTATAACTCAATTTCTTCTATGAAAGCCATTTTTAATAGATCCTATGATAACATAATCTTCCCTTCCTAGCCTAAAGGTACAACATAGGACATACTTCCAACACTAATTTATTAAAATAATATGTCTAACGTTGTACATTTATTTGGAAAGAGAAGGAAAAAAGAACATTAATTTATCATATTTTTATTTTAGACCTAGCATACATCAACAATATATTATTGAGTTTTACTAACTTTCTCTGACAAAAATGTTTGAATGGAATTTATTTTATTGAAAAGAAATCTATTTATGTCCATATAATTTTATATATAATTAATATTTAAACAGGTTTATAAAACATTAATCATAAAATCATATTAATTTTACATGGATATAAAAAAAAAATTTGTAGCCTCCGTTTTCACTATGTAAATTCATAAGGTAGTGCCAACTTATTTTATATTATCTTATTGCATTATTAAATGATAGTTTTACTTTTTTTAACCAAAATAATAAAATATTCCAAAAAAAAAAAGAAATGCTAAAGAGAAAAACTCCAAATTAACTTCTATGCCAAGATGGAAATCAAGGTATAAAATTGACATAACTTAGAAATTAAAATCCCTATTTAAGTTTTTTTTTAAAAAAAGAATTTTCCTATTTGTAAATATTTTTTTTACACAGAAGTGAACTATTAAAATAAATAAAAATAATTTTTTTAATGCTGTTCACATGTTGCATTATGCCATTCATTCATAAATCAAATTATAAATCCATTAATTAAGTTAAGCTTGAATCCAGATCGTTTGACCTTAATGCCTATAAATAAATTGCCAACCCTTCACTTCATTTCTCACCGTCATCGCAACTT
本发明中，发明人首次成功地将钾转运体基因GhHAK5上游2000bp启动子片段pGhHAK5克隆出来，为了研究pGhHAK5的功能，构建了植物表达载体pCAMBIA1381Z-pGhHAK5，通过转化拟南芥、GUS组织定位和低钾诱导表达特性分析来研究其功能。pGhHAK5除了含有基础元件外，还含有多个参与光、植物激素、逆境胁迫和生物钟等顺式作用元件。该启动子具有参与根特异性表达调控的元件ATAAAAT和参与低钾条件下转录调控的ARF转录因子结合位点TGTCNN；该启动子在拟南芥中能驱动外源基因GUS的表达，且其驱动的GUS主要在成熟的根和地上部维管束组织中表达。该棉花钾转运体基因启动子的克隆不仅有助于阐明钾转运体基因表达调控的分子机制，在植物钾吸收效率的提高和目标基因在植物成熟根和地上部维管束组织中的精准特异性表达等方面也具有应用价值。
在具体的实施例中，所述序列与(a)的核苷酸序列具有例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的序列。
在一个具体的实施例中，所述钾转运体基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明中，所述钾转运体基因启动子的核苷酸序列包含至少一个响应于光、逆境胁迫、植物激素或生物钟中的任意一种或至少两种顺式作用元件。
本发明中，所述钾转运体启动子的核苷酸序列包含至少一个参与根特异性表达调控的元件ATAAAAT和/或参与低钾条件下转录调控的ARF转录因子结合位点TGTCNN。在一个具体的实施例中，克隆所述钾转运体基因启动子的PCR扩增引物的序列如SEQ ID NO.2-3所示，具体如下：
pGhHAK5-F(SEQ ID NO.2):TTCACGCCCATCTTTATCTC；
pGhHAK5-R(SEQ ID NO.3):TCAACGTCCTTATCCAATCC.
在一个具体的实施例中，克隆所述钾转运体基因启动子的PCR扩增反应体系包括：相对于50μL反应体系包括：10μL 5×Prime STAR GXL缓冲液(Mg2+plus)，4.0μL 2.5mmol L–1dNTPs，10mmol L–1正反向扩增引物各1.5μL，1μL 1.2UμL–1Prime STAR GXL DNA聚合酶(TaKaRa,R050A)，5.0μL DNA模板和27.0μL ddH2O。
在一个具体的实施例中，克隆所述钾转运体基因启动子的PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s,65℃退火2.5min,32个循环；72℃延伸10min。
本发明中，发明人采用上述特定的PCR扩增引物，经过PCR扩增反应体系和扩增程序的优化，发现采用上述PCR扩增引物、扩增体系和扩增程序，能够特异性地克隆到所述钾转运体基因GhHAK5上游2000bp启动子片段pGhHAK5的完整核苷酸序列。
本发明中，所述棉花钾转运体基因启动子的组织特异性启动子活性是在植物中，优选为拟南芥和/或棉花，进一步优选为野生型拟南芥(Cloumbia-0)。
在一个具体的实施例中，所述棉花钾转运体基因启动子具有组织特异性表达的启动子活性，进一步地，所述棉花钾转运体基因启动子可驱动目的基因在植物成熟根和/或维管束组织中特异性的表达。
在一个具体的实施例中，所述目的基因为GUS基因，所述的植物为野生型拟南芥(Cloumbia-0)。
本发明中，发明人发现所述棉花钾转体基因启动子在拟南芥幼苗幼嫩根中的表达很弱，且其表达不受低钾(100μM K+)胁迫诱导而增强，其主要在成熟根和维管束组织中表达，且是一个主要在成熟根中具有功能的低钾诱导型启动子。
第二方面，本发明提供一种植物表达载体，包含第一方面所述棉花钾转运体基因启动子的核苷酸序列，所述钾转运体基因启动子的核苷酸序列与编码目的基因的核苷酸序列可操作地连接。
本发明中，所述的植物表达载体可用于转化植物，获得转基因植株。
在一个具体的实施例中，所述植物表达载体为pCAMBIA1381Z-pGhHAK5，所述的植物为野生型拟南芥(Cloumbia-0)，所述目的基因为GUS基因。
在一个具体的实施例中，所述载体为pCAMBIA1381Z，其含有GUS基因，不含启动子，将该载体采用内切酶Nco I进行酶切并与pGhHAK5启动子相连，从而构建得到植物表达载体pCAMBIA1381Z-pGhHAK5。
在一个具体的实施例中，所述植物表达载体的构建所用的引物包括Nco I酶切位点，所述植物表达载体构建过程所使用的PCR引物序列如SEQ ID NO.4-5所示，具体如下：
pGhHAK5-GUS-F(SEQ ID NO.4):
5'-CATGCCATGGATTGATTTCAAAAAAAA AATGATATG-3'(下划线为内切酶Nco I的识别序列)；
pGhHAK5-GUS-R(SEQ ID NO.5):
5'-CATGCCATGGAAGTTGCGATGACGGTGAG-3'(下划线为内切酶Nco I的识别序列)。
在一个具体的实施例中，所述植物表达载体
pCAMBIA1381Z-pGhHAK5构建方式如下：
通过PCR扩增将酶切位点Nco I引入pGhHAK5的上下游，对PCR回收产物和载体pCAMBIA1381Z分别用内切酶Nco I进行酶切并胶回收，载体胶回收产物再用去磷酸化酶CIAP(2250A,TAKARA)进行去磷酸化并胶回收，载体酶切并去磷酸化后的胶回收产物和PCR酶切后的胶回收产物用T4连接酶进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，涂布含有卡纳霉素的LB抗性平板，37℃培养12h后，挑取单克隆，并进行菌液PCR检测。检测为阳性的菌液提取质粒后进行进一步的酶切验证，含有目的基因片段的菌液送华大基因公司测序；将测序结果与目标序列进行比对，序列一致且目的片段连入方向正确的菌液提取质粒后转化根癌农杆菌EHA105。
在一个具体的实施例中，采用农杆菌介导的蘸花法将第二方面所述植物表达载体转化野生型拟南芥(Cloumbia-0)，获得转基因拟南芥植株。
第三方面，本发明提供一种转基因植株，其包含权利要求7或8所述的植物表达载体。
在一个具体的实施例中，检测所述转基因植株的PCR引物核苷酸序列如SEQ IDNO.6-7所示，具体如下：
F(SEQ ID NO.6)：5'-ATTGATTTCAAAAAAAAAATGATATG-3'；
R(SEQ ID NO.7)：5'-AAGTTGCGATGACGGTGAGAAATG-3'.
第四方面，本发明提供如第二方面所述的植物表达载体或如第三方面所述的转基因植株，用于目的基因在植物成熟根和/或维管束中的特异性表达。
在一个具体的实施例中，所述目的基因为GUS基因，所述的转基因植株为转基因拟南芥。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过特定的PCR扩增引物序列配合特定的PCR扩增反应体系和反应程序首次成功克隆到钾转运体基因GhHAK5上游2000bp启动子片段pGhHAK5。通过分析其序列发现，pGhHAK5除了含有基础元件外，还含有多个参与光、植物激素、逆境胁迫和生物钟等顺式作用元件，以及具有参与根特异性表达调控的元件ATAAAAT和参与低钾条件下转录调控的ARF转录因子结合位点TGTCNN；该启动子的发现不仅有助于阐明钾转运体基因表达调控的分子机制，也为改良棉花的钾营养性状提供了理论依据；
(2)本发明中采用钾转运体基因启动子pGhHAK5构建了植物表达载体pCAMBIA1381Z-pGhHA K5，通过转化拟南芥、GUS组织定位和低钾诱导表达特性分析来研究其功能，发现其是一个组织特异型启动子，其驱动的目地基因主要在拟南芥的成熟根和地上部维管束组织中表达，在幼嫩根中的表达很弱且不受低钾胁迫诱导，其还是一个主要在成熟根中具有功能的低钾诱导型启动子。
附图说明
图1为本发明实施例1棉花钾转运体基因启动子pGhHAK5的PCR扩增结果，其中，1-钾转运体基因启动子pGhHAK5的PCR扩增产物，2-DNA分子量标准；
图2为本发明GhHAK5同源基因启动子序列的比较分析；
图3为本发明T1代转基因拟南芥植株的PCR检测，其中，M-Marker，1-野生型拟南芥(阴性对照)，2-表达载体pCAMBIA1381Z-pGhHAK5质粒(阳性对照)，3～8-转基因拟南芥；
图4本发明转pGhHAK5拟南芥植株的GUS组织化学染色，其中，A-野生型拟南芥，B-转pGhHAK5拟南芥，1～4：拟南芥幼苗(1)及其叶片(2)、胚轴(3)和根(4)对应位置放大图；5～12：成熟期拟南芥植株的叶片(5)、茎(6)、花(7)、花对应位置放大图(8)、荚(9)、荚对应位置放大图(10)、根(11)和根对应位置放大图(12)；
图5为本发明转pGhHAK5拟南芥幼苗对低钾胁迫的响应分析，其中，WT-野生型拟南芥，HK-正常钾，LK-低钾，a-拟南芥幼苗，b-叶对应位置放大图，c-根对应位置放大图；
图6为本发明陆地棉GhHAK5基因的时空表达特性分析，其中，图6(A)为陆地棉GhHAK5基因时空表达特性的转录组分析，图6(B)为陆地棉GhHAK5基因时空表达特性的荧光定量PCR分析，图6(C)为不同发育时期棉花根系形态的比较。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实验材料
陆地棉品种百棉1号，由河南科技学院棉花课题组提供，用于GhHAK5基因启动子2000bp片段pGhHAK5的克隆。
实施例1：DNA的提取及pGhHAK5扩增
(1)以幼嫩的百棉1号根系为材料，采用DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP321)进行基因组DNA的提取，具体步骤和操作方法按照试剂盒说明书进行。根据pGhHAK5的序列信息，利用Primer5.0设计引物，引物序列如下：
pGhHAK5-F(SEQ ID NO.2):TTCACGCCCATCTTTATCTC；
pGhHAK5-R(SEQ ID NO.3):TCAACGTCCTTATCCAATCC；
(2)PCR扩增采用50μL反应体系，包括10μL 5×Prime STAR GXLbuffer(Mg2+plus)，4.0μL 2.5mmol L–1dNTPs，10mmol L–1正反向引物各1.5μL，1μL 1.2UμL–1Prime STAR GXLDNA Polymerase(TaKaRa,R050A)，5.0μL DNA模板和27.0μL ddH2O；
PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s,65℃2.5min,32个循环；72℃10min；
(3)PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，确定为目的基因的经胶回收试剂盒(Axygen，AP-GX-4)回收后送华大基因公司测序。
从图1可以看出，PCR产物电泳检测结果与预期的片段大小相符，片段大小为2600bp。PCR产物经测序后与陆地棉基因组数据库的pGhHAK5序列进行Blast比对分析发现，克隆的2600bp序列包含完整的目标pGhHAK5片段，且与TM-1基因组参考序列一致，表明本研究已成功克隆到钾转运体基因GhHAK5的启动子序列pGhHAK5。
实施例2：序列分析
(1)pGhHAK5顺式作用元件预测与分析
启动子的顺式作用元件分析利用植物顺式作用元件数据库PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线完成。
利用在线启动子元件预测工具PlantCARE对pGhHAK5进行顺式作用元件分析，结果发现该启动子除具有CAAT-box和TATA-box等启动子基本核心元件外，还包括1个提高转录水平的5'UTR Py-rich stretch元件；5个参与光响应的元件(Box I、I-box、G-Box、AT1-motif和Box II 2)；1个生物钟调控元件(circadian)；4个参与植物激素响应的元件(包括1个水杨酸响应元件TCA-element，1个茉莉酸响应元件CGTCA-motif，1个生长素响应元件TGA-element和1个乙烯响应元件ERE)；5个逆境胁迫响应元件(包括4个热胁迫响应元件HSE和1个真菌诱导子元件Box-W1)；另外，还包括4个胚乳表达相关顺式作用调控元件(Skn-1_motif)和1个AT-rich DNA结合蛋白的结合位点(AT-rich element)等其它类顺式作用元件，具体如SEQ ID NO.1和表1所示：
SEQ ID NO.1具体如下：
ATTGATTTCAAAAAAAAAATGATATGAACCCGTGAGGAAACTGCCCAGCACCTTCCAACAATTTCGTACTTCTTCAGTTGACTTTACATTTTCTATTTTGTAATTTTTAAGAAGTCAATGTCATTCGCCATCAAGATGGTGAATAAAATGATTTTTTTAGGTTATTAAACTTATTGAATTCTCAAGCAAAGTGGAAAAAATAATTTACATTATTAGTCATTAAATTGTGAGTAAATTTTTGTTTTAATCACTTAATTAAAAAATTACTATTTGATTATTAAATTATCAAAAGTTTCGTTTATGTCATTGAGTTATTAAAATTAATGTTATATGGCTTTACCTATTTGCACTATCTGTACCAATCGAAAACTCTCTTTCTCATTCTCTTCTATAGTTTAGTTTTTTCGATAAAACGACTTTCGACATCACGAATTTATGAATCAAAAGTTAAATAGCTTTTTTTTCCAATCTTTGATACTAATTGTCAGATCAACTTGGATATAAAGTATATTCTTTTACTTATCGATCGGTGTTGATCTACAGTACCGATCGTTGAATTGTGACTTAGAGCTCGCTGGCAAAGTTTTGTTTTTTTTTTAAAGAAAATTTTAAATAATTTAATAGTTTAAATGAAAAAATTTGAATAATTAAATTATAAATATTTTTAATTAAGTGAGCAGAATAGGTTGATTGAGAATTTCAGCTGTATTTGTCTTGTAGTGGTATTGAGAAAAAGAAGAATTATTGCAATAATGCAGGACAATATATTAGTTTTTCTCACTTTCAATGACATAGGCCACGTTGGTGATGAAAAGTCAATGTCTGTATTTTCAGCATTATTTTAATATTATTTGGTTCTCCTTCTCCATTGTAATTTAAATTTGACTTTTCCTTATTGCTCCCCATTTTTACTTGTTTTTTCTTATTGGAGAAGAGGATATTTGAACCCTAAATATTAACCCATCAACATAAAATTTCTTTTAAAAGGTGGATATAATATATATATTGTAATAATATCAACCCCTAAAAAGTTTTTGAAATATTTTAATTTCATATGGAAAACTTACCCTTCATCAAATAAGTAAGAATATTATTGTTCTCTCTTCAAAAAAAAAAAAAAGAATATTATTGTTCAATGTTATCATGTTCCTATAACTCAATTTCTTCTATGAAAGCCATTTTTAATAGATCCTATGATAACATAATCTTCCCTTCCTAGCCTAAAGGTACAACATAGGACATACTTCCAACACTAATTTATTAAAATAATATGTCTAACGTTGTACATTTATTTGGAAAGAGAAGGAAAAAAGAACATTAATTTATCATATTTTTATTTTAGACCTAGCATACATCAACAATATATTATTGAGTTTTACTAACTTTCTCTGACAAAAATGTTTGAATGGAATTTATTTTATTGAAAAGAAATCTATTTATGTCCATATAATTTTATATATAATTAATATTTAAACAGGTTTATAAAACATTAATCATAAAATCATATTAATTTTACATGGATATAAAAAAAAAATTTGTAGCCTCCGTTTTCACTATGTAAATTCATAAGGTAGTGCCAACTTATTTTATATTATCTTATTGCATTATTAAATGATAGTTTTACTTTTTTTAACCAAAATAATAAAATATTCCAAAAAAAAAAAGAAATGCTAAAGAGAAAAACTCCAAATTAACTTCTATGCCAAGATGGAAATCAAGGTATAAAATTGACATAACTTAGAAATTAAAATCCCTATTTAAGTTTTTTTTTAAAAAAAGAATTTTCCTATTTGTAAATATTTTTTTTACACAGAAGTGAACTATTAAAATAAATAAAAATAATTTTTTTAATGCTGTTCACATGTTGCATTATGCCATTCATTCATAAATCAAATTATAAATCCATTAATTAAGTTAAGCTTGAATCCAGATCGTTTGACCTTAATGCCTATAAATAAATTGCCAACCCTTCACTTCATTTCTCACCGTCATCGCAACTT
表1
Figure BDA0002104682360000131
从表1的结果表明GhHAK5基因的表达可能受光、植物激素、逆境胁迫和生物钟等外界环境条件的调控。
(2)GhHAK5与其同源基因启动子序列的比较分析
拟南芥AtHAK5(AT4G13420.1)，水稻OsHAK1(LOC_Os04g3292 0.1)，毛果杨PtHAK5.1(POPTR_0001s03680)是陆地棉GhHAK5的同源基因，其ATG上游2000bp的启动子序列从Phyzotome网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下载，海岛棉GbHAK5(GB_D01G2145)、雷蒙德氏棉GrHAK5(Gorai.002G213000.1)和亚洲棉GaHAK5(Ga02G1270)ATG上游2000bp的启动子序列从Cottongen网站(https://www.cottongen.org/)下载，利用Clustal软件进行序列比对后，使用Bioedit 7.0软件分析序列间的相似性。
对GhHAK5及其同源基因包括拟南芥AtHAK5、水稻OsHAK5、毛果杨PtHAK5四倍体棉种海岛棉GbHAK5以及二倍体祖先棉种雷蒙德氏棉(D5)GrHAK5和亚洲棉(A2)GaHAK5基因ATG上游2000bp的启动子序列进行比较分析，结果如图3所示，结果表明，pGhHAK5具有5个根特异性表达调控的元件ATAAAAT，其也是一个在根中特异性高表达的基因；与pPtHAK5一样，pPtHAK5.1也富含5个根特异性表达调控元件，其也是一个在根中特异性高表达的基因。另外，pGhHAK5含有1个在低钾条件下参与转录调控的ARF转录因子结合位点TGTCNN，但是不含有在拟南芥中可与转录因子RAP2.11结合来参与低钾条件下AtHAK5表达调控的GCC-box位点。这些结果表明pGhHAK5的表达可能受低钾调控，但是可能具有和其它植物不一样的转录调控机制。进一步对棉属四个种HAK5启动子序列进行比较分析发现，pGhHAK5与雷蒙德氏棉pGrHAK5在重要调控元件数量和位置分布上具有较高地一致性，均含有5个根特异性表达调控元件和1个ARF转录因子结合位点，且两者启动子间序列相似性达87.7％；与海岛棉pGbHAK5在元件数量和分布上差异次之，且两者启动子间序列相似性为68.9％，与亚洲棉pGaHAK5在元件数量和分布上差异最大，且两者启动子间序列相似性为40.5％。陆地棉是一个位于D亚组的基因，陆地棉pGhHAK5与二倍体祖先种雷蒙德氏棉(D5)pGrHAK5在核心元件数量和位置上较高的一致性，表明棉花启动子区重要的调控元件或位点在物种进化过程中可能是保守的。
实施例3：载体的构建及农杆菌介导的转化、转基因植株的筛选及鉴定
1、载体的构建及农杆菌介导的转化
(1)选用pCAMBIA1381Z(含有GUS基因，不含启动子)作为表达载体，根据GhHAK5启动子2000bp的序列设计特异性的引物，具体引物序列为：
pGhHAK5-GUS-F(SEQ ID NO.4):
5'-CATGCCATGGATTGATTTCAAAAAAAA AATGATATG-3'(下划线为内切酶Nco I的识别序列)；
pGhHAK5-GUS-R(SEQ ID NO.5):
5'-CATGCCATGGAAGTTGCGATGACGGTGAG-3'(下划线为内切酶Nco I的识别序列)；
通过PCR扩增将酶切位点Nco I引入pGhHAK5的上下游。对PCR回收产物和载体pCAMBIA1381Z分别用内切酶Nco I进行酶切并胶回收，载体胶回收产物再用去磷酸化酶CIAP(2250A,TAKARA)进行去磷酸化并胶回收，载体酶切并去磷酸化后的胶回收产物和PCR酶切后的胶回收产物用T4连接酶进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，涂布含有卡纳霉素的LB抗性平板，37℃培养12h后，挑取单克隆，并进行菌液PCR检测。检测为阳性的菌液提取质粒后进行进一步的酶切验证，含有目的基因片段的菌液送华大基因公司测序。最后，将测序结果与目标序列进行比对，序列一致且目的片段连入方向正确的菌液提取质粒后转化根癌农杆菌EHA105。
(2)采用农杆菌介导的蘸花法将上述重组表达载体转化野生型拟南芥(Cloumbia-0)，获得T0代转基因种子。
2、转基因拟南芥的筛选和鉴定
将T0代种子种在含有潮霉素抗性的培养基上进行筛选，经抗性筛选长出的植株为T1代植株，待T1植株长出两片真叶后移栽到蛭石中，在光照培养箱(22℃，光16h/暗8h)中进行培养。于幼苗期取T1转基因拟南芥植株的叶片，用于进一步PCR检测，检测为阳性的植株于成熟期收获T1代种子；PCR检测方法如下：首先是通过DNA提取试剂盒(提取转基因拟南芥植株和野生型拟南芥(阴性对照)叶片DNA；然后利用目的基因特异性引物：
F(SEQ ID NO.6)：5'-ATTGATTTCAAAAAAAAAATGATATG-3'；
R(SEQ ID NO.7)：5'-AAGTTGCGATGACGGTGAGAAATG-3'；
以叶片DNA和表达载体pCAMBIA1381Z-pGhHAK5质粒(阳性对照)为模板进行PCR扩增。扩增产物经脂糖凝胶电泳检测后，根据检测结果鉴定目标启动子片段是否插入拟南芥基因组DNA中。同样地方法继续对T1代种子进行抗性筛选和PCR检测，收获的T2代种子用于后续pGhHAK5的功能分析。
将2000bp的启动子片段pGhHAK5通过单酶切法(NcoI)构建到含有GUS基因的表达载体pCAMBIA1381Z(有GUS，无启动子)上，并通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥，成熟后收获T0代转基因种子。收获的T0种子经含有潮霉素MS培养基筛选后，进一步对T1拟南芥幼苗进行PCR检测，结果如图3所示。
由图3可知，T1代植株幼苗和表达载体pCAMBIA1381Z-pGhHAK5质粒均能扩增到2000bp的目标条带pGhHAK5，而野生型拟南芥没有扩增到目标条带，表明本研究检测的T1代拟南芥植株幼苗为阳性植株，成熟后收获T1代种子。收获的T1代种子经含有潮霉素MS培养基筛选和PCR检测后，成熟后收获的T2代种子用于后续的功能分析。
实施例4：启动子pGhAK5的功能分析
对T2代转基因拟南芥植株的幼苗和处于成熟期的拟南芥植株的叶片、根、茎、花和荚等组织进行GUS染色，染色方法参照Jefferson等的方法并略加修改。首先，取待染色的各组织，加入GUS染色液；接着，置于37℃温育过夜24h；然后，用70％乙醇进行脱色，直至底色完全消失；最后在体视镜下观察染色结果并拍照。
GUS组织化学染色结果如图4所示，pGhHAK5驱动的GUS主要在转基因拟南芥幼苗的叶脉(图4-B1,B2)和胚轴维管束组织(图4-B1,B3)中表达，在根(图4-B1,B4)中表达量较低，而野生型拟南芥幼苗的各个组织均无染色(图4-A1～A4)。为了探究pGhHAK5驱动GUS在根中的表达是否受发育时期影响，本研究进一步对成熟期拟南芥植株的根、叶片、茎、花和荚等组织进行GUS染色。结果表明，转基因拟南芥的叶脉(图4-B5)、根(图4-B11，图4-B12)和花萼维管束组织(图4-B7，图4-B8)均染色较深，茎(图4-B6)和荚皮(图4-B9，图4-B10)染色较浅；野生型拟南芥的叶片(图4-A5)、茎(图4-A6)、花(图4-A7,A8)、荚(图4-A9,A10)和根(图4-A11,12)均没染色。这些结果表明，pGhHAK5驱动GUS主要在拟南芥成熟的根和地上部维管束组织中表达，且在拟南芥根中的表达受发育时期的影响。
实施例5：转基因拟南芥幼苗的低钾处理
转基因拟南芥种子经春化、消毒后分别播种在正常(MS)和低钾(LK,100uM K+)培养基上，然后置于相同条件的光照培养箱(22℃，光16h/暗8h)中进行培养，生长2周后，取整株拟南芥幼苗进行GUS染色，GUS染色方法同实施例4。
为了探究pGhHAK5驱动的GUS在转基因拟南芥幼苗根中微弱地表达是否会受低钾胁迫诱导而增强，接着又对转pGhHAK5拟南芥幼苗进行低钾胁迫处理。结果如图5所示。
图5的结果表明，与正常供钾(HK)相比，低钾(LK)处理后pGhHAK5驱动GUS在拟南芥幼苗根中的微弱表达并未显著增强，表明PGhHAK5驱动的GUS在拟南芥幼苗的幼嫩根中的表达不受低钾胁迫诱导，这可能是由于植株处于幼苗期时，植物本身对外界环境中钾元素需求量比较低的缘故。这些研究结果表明本研究克隆的pGhHAK5可能是一个主要在成熟根中具有功能的低钾诱导型启动子。
实施例6：基因的时空表达特性分析
不同生长发育时间点(24h、48h、72h、96h、120h和四片真叶期)棉花组织(根和叶)的转录组数据下载于NCBI网站SRA(Sequence read archive)数据库(SRA：PRJNA248163)。基因表达量的计算使用软件cufflinks(Version2.1.1)进行，该软件使用FPKM(Fragmentsper kilobase of exon model per million mapped reads)方法来计算基因的表达量。
采用荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法进一步分析GhHAK5的表达特性，内参基因为棉花组成型表达基因Actin(GenBank登录号为AY907703.1)。
内参基因Actin和GhHAK5基因的荧光定量PCR引物序列如下：
GhHAK5-F(SEQ ID NO.8):5'-GTAAGGACGGGTGGATA-3'；
GhHAK5-R(SEQ ID NO.9):5'-AGTAAAGCAGGCAAGGTA-3'；
Actin-F(SEQ ID NO.10):5'-GACCGCATGAGCAAGGAGAT-3'；
Actin-R(SEQ ID NO.11):5'-GCTGGAAGGTGCTGAGTGAT-3'；
qRT-PCR以反转录得到的cDNA为模板，于BIOER荧光定量PCR仪上进行，反应体系包括2×SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa,RR820L)10μL,10mmol L–1正反向引物各0.8μL，1μLcDNA模板和7.4μL ddH2O，共计20μL。反应程序为95℃30s；95℃5s,60℃20s,40个循环后增加熔解曲线。每个样品设3次重复，采用2–ΔΔCt法计算基因的相对表达量。
对GhHAK5的时空表达特性进行了研究，结果如图6所示。由图6可以看到，在棉花幼苗发育前5天(生长24h～120h)，GhHAK5在根中表达量很低；在棉花四片真叶期，与发育前5天相比GhHAK5在根中的表达量迅速上升，在叶片中的表达量一直很低(图6(A))。进一步荧光定量PCR分析表明，在棉花四片真叶期，GhHAK5在根中的表达量迅速升高，而在叶片中的表达量一直处于较低水平(图6(B))，该结果与转录组分析结果相一致。另外，与子叶期幼嫩的根相比(图6(C))，GhHAK5在四叶期根中表达要显著高于其在子叶期幼嫩的根中的表达(图6(B))。这些结果表明GhHAK5在根中的表达受发育时期的影响，该结果与转pGhHAK5拟南芥植株根系GUS染色结果相一致；另外，本研究观察到的GhHAK5在叶片中较低的表达也与HAK5基因是一个主要在根中负责外界环境中钾离子吸收的功能相一致。
综上所述，本发明从陆地棉品种百棉1号中克隆了钾转运体基因GhHAK5上游2000bp的启动子片段pGhHAK5，并构建植物表达载体pCAMBIA1381Z-pGhH AK5。通过转化拟南芥表明pGhHAK5能在拟南芥中驱动GUS的表达，且主要在拟南芥的成熟根和维管束组织中表达，在幼嫩根中的表达很弱且不受低钾胁迫诱导，表明本发明克隆的pGhHAK5可能是一个主要在成熟根中具有功能的低钾诱导型启动子。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种棉花钾转运体基因启动子，其特征在于，包含选自以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO.1或其片段，其中所述片段包含SEQ ID NO.1的至少1000个连续核苷酸并且具有钾转运体基因启动子的组织特异性启动子活性；
(b)与(a)的核苷酸序列具有至少90％，优选95％的序列一致性并且具有钾转运体基因启动子的组织特异性启动子活性。
2.根据权利要求1所述的棉花钾转运体基因启动子，其特征在于，所述钾转运体基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，所述钾转运体基因启动子的核苷酸序列包含至少一个响应于光、逆境胁迫、植物激素或生物钟中的任意一种或至少两种顺式作用元件；
优选地，所述钾转运体启动子的核苷酸序列包含至少一个参与根特异性表达调控的元件ATAAAAT和/或参与低钾条件下转录调控的ARF转录因子结合位点TGTCNN。
3.根据权利要求1或2所述的棉花钾转运体基因启动子，其特征在于，克隆所述钾转运体基因启动子的PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.2-3所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的棉花钾转运体基因启动子，其特征在于，克隆所述钾转运体基因启动子的PCR扩增反应体系包括：相对于50μL反应体系包括：10μL 5×PrimeSTAR GXL缓冲液(含Mg2+)，4.0μL 2.5mmol L–1dNTPs，10mmol L–1正反向扩增引物各1.5μL，1μL 1.2U μL–1Prime STAR GXL DNA聚合酶，5.0μL DNA 模板和27.0μL ddH2O；
优选地，克隆所述钾转运体基因启动子的PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s,65℃退火2.5min,32个循环；72℃延伸10min。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的棉花钾转运体基因启动子，其特征在于，所述棉花钾转运体基因启动子的组织特异性启动子活性是在植物中，优选为拟南芥和/或棉花，进一步优选为野生型拟南芥Cloumbia-0。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的棉花钾转运体基因启动子，其特征在于，所述棉花钾转运体基因启动子具有组织特异性表达的启动子活性；
优选地，所述的棉花钾转运体基因启动子在植物成熟根和/或维管束组织中驱动目的基因的表达；
优选地，所述目的基因为GUS基因，所述的植物为野生型拟南芥Cloumbia-0。
7.一种植物表达载体，其特征在于，其包含所述权利要求1-6中任一项所述的棉花钾转运体基因启动子，所述钾转运体基因启动子的核苷酸序列与编码目的基因的核苷酸序列可操作地连接；
优选地，所述植物表达载体可用于转化植物，获得转基因植株；
优选地，所述植物表达载体为pCAMBIA1381Z-pGhHAK5；
优选地，所述植物为野生型拟南芥Cloumbia-0；
优选地，所述目的基因为GUS基因。
8.根据权利要求7所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体构建过程所使用的PCR扩增引物包括Nco I酶切位点，优选所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示。
9.一种转基因植株，其特征在于，其包含权利要求7或8所述的植物表达载体；
优选地，检测所述转基因植株的PCR引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6-7 所示。
10.如权利要求8所述的植物表达载体或如权利要求9所述的转基因植株，用于目的基因在植物成熟根和/或维管束中的特异性表达；
优选地，所述目的基因为GUS基因。
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