CN108486144A

CN108486144A - Mrs6基因在提高烟草对重金属镉的耐受性中的应用

Info

Publication number: CN108486144A
Application number: CN201810125591.3A
Authority: CN
Inventors: 黄志伟; 沈裕虎; 程迅; 王桥; 刘宝龙; 王寒冬; 余圆圆
Original assignee: Donghua University; Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Current assignee: Donghua University; Northwest Institute of Plateau Biology of CAS; National Dong Hwa University
Priority date: 2018-02-07
Filing date: 2018-02-07
Publication date: 2018-09-04
Anticipated expiration: 2038-02-07
Also published as: CN108486144B

Abstract

本发明公开了一种来源于酿酒酵母S288C膜泡转运基因MRS6改良的高耐镉烟草及应用。基因MRS6核苷酸序列如SEQ ID NO：1；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明中，通过绿色荧光蛋白示踪观察发现MRS6编码蛋白主要在转基因植物根茎的导管细胞中大量表达。本发明中，经CdCl₂处理：与野生型烟草比，转基因烟草根茎组织所富集的镉含量显著增高，叶片中的镉含量显著降低，植株生长更迅速。证明MRS6过表达可以提高烟草对重金属镉的耐受性，增强对镉的富集能力及减少叶片镉的含量，提高烟草的生长速度。因此，本发明基因MRS6改良烟草具有高耐镉活性，在富集环境镉改善自然环境方面具有广阔的应用前景，经济效益潜力巨大。

Description

MRS6基因在提高烟草对重金属镉的耐受性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种MRS6蛋白在提高烟草对重金属镉的耐受性中的应用。

背景技术

环保部和国土资源部2014-04-17日联合发布的《全国土壤污染状况调查公报》指出，全国土壤总的超标率为16.1％，说明我们面临的耕地土壤环境安全问题相当严峻。无机污染物超标点位数占全部超标点位的82.8％，说明主要是重金属污染。重金属通常是指密度在5.0以上的金属，如铅、铬、铜、镉、汞等。重金属，尤其是镉、铬、汞、砷、铅为代表的“五毒即重金属，一旦被人体过量吸收便会向肝、骨骼、肾和脑等组织中积蓄，对人体健康造成巨大损伤。

我国自“七五”以来，特别是2001年加入世贸组织以后，随着制造业、对外贸易以及城市化迅猛发展，农村和城市的土壤环境出现了一些极棘手问题。标志性的事件包括“镉大米”事件和北京宋家庄地铁施工工人被“毒倒”等。同“七五”时期全国土壤环境背景值调查的点位坐标对比，表层土壤中无机污染物含量增加比较显著，其中镉的含量在全国范围内普遍增加，在西南地区和沿海地区增幅超过50％，在华北、东北和西部地区增加10％～40％。镉污染的传统治理主要有三种方法，它们分别是：物理治理方法，化学治理方法和生物治理方法，实际应用中一般根据镉污染程度、污染特性等选择合适的方法修复。然而，随着环保要求的提高，物理和化学传统的镉污染治理法受到很多限制，这些方法对环境的危害性、风险性也愈加明显。因此，开发出一种高效安全的修复措施显得尤为重要。植物和微生物修复技术以其操作简便、环境友好、修复成本低廉性和工程处理简易等优点受到人们重视，选择重金属耐性强、富集量大且还能高产优质的品种对修复生态中的重金属Cd污染具有实际意义。生物治理的关键在于得到Cd离子高耐受的植株或菌株，这成为Cd污染治理环境工程植物或菌株选育的一个热点领域。

植物修复是一项新兴的生物学技术，它是利用植物转化或富集作用对已污染的生态环境进行修复。烟草作为环境修复植物具有重要的理论意义和巨大应用前景，而且已有成功的先例。中美科学家合作先从微生物中分离出一种可将无机汞转化为气态汞的基因，将其转入烟草，这种烟草即可大量“吞食”土壤和水中的汞，转化为气态汞后，再释放到大气中，这在人类治理汞污染的道路上迈出了重要一步。英国的约克大学(University ofYork)的研究人员把吞噬毒素的生物基因转入到烟草，基因改良烟草能把TNT、RDX的分子结构转换成无毒形式，甚至转化为有机氮肥料被利用，对交战地区或军事垃圾污染土壤的修复有重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够提高烟草对重金属镉的抗性的基因，进而培育抗镉烟草新品种。

为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

本发明首次发现了MRS6基因过表达可以使细胞表现超凡的镉离子抗性，将致死亡浓度提高三倍以上，根据真核生物膜泡运输的保守性，推测MRS6基因改良烟草可以显著提高转基因烟草的耐受性，提高植株镉离子的富集效果，那么一块镉污染严重的土壤，在生长三四茬转基因烟草后，镉含量即可明显降低。

本发明提供了MRS6基因、蛋白或其表达载体在提高植株对重金属镉的抗性或生产耐镉植株中的应用。

优选地，所述的烟草为三生烟(Nicotiana tabacum L.varXanthi)。

所述的MRS6基因源于酿酒酵母S288C，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

所述的MRS6蛋白所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

优选地，所述的MRS6基因的表达载体通过使用Ti质粒、植物病毒载体以及农杆菌介导方法中的至少一种转化植物细胞。

优选地，所述的植株为单子叶植株或双子叶植株。

优选地，所述的植株为烟草、水稻、玉米、小麦或黄瓜。

本发明还提供了一种MRS6基因的表达载体，其特征在于，其构建方法包括采用gateway重组技术，将MRS6目的基因插入到农杆菌的Ti质粒的T-DNA区中。根据是否带有绿色荧光蛋白标记基因，分别命名为Ti-MRS6-GFP和Ti-MRS6。

本发明还提供过了一种转基因烟草，其特征在于，该烟草侵染了MRS6基因的表达载体。

本发明还提供过了上述的转基因烟草的制备方法，其特征在于，包括：将上述的MRS6基因的表达载体转入烟草中，培养得到耐镉的转基因烟草。

优选地，所述的将上述的MRS6基因的表达载体转入烟草中的具体步骤包括：将上述MRS6基因的表达载体转化农杆菌，用所得的农杆菌侵染预培养24-48h的外植体叶盘，通过叶盘法将其导入三生烟烟草中。

优选地，所述的烟草为三生烟。

本发明通过设计引物，从酿酒酵母S288C中克隆MRS6基因，其核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了含有所述酿酒酵母S288C抗镉基因MRS6基因和MRS6-GFP基因的过表达载体。采用gateway重组技术，将MRS6基因和MRS6-GFP基因亚克隆插入到农杆菌的Ti质粒的T-DNA区中，将重组质粒转化农杆菌。分别将上述携带MRS6和MRS6-GFP基因的农杆菌侵染预培养24-48h的外植体叶盘，通过叶盘法分别将其导入三生烟烟草中。对转基因后代植株进行菌种鉴定，结果表明MRS6成功转入到烟草基因组中。

本发明利用该基因增强植物抗镉、富集镉的方法，在植物中过量表达上述植株抗镉性相关蛋白编码基因。

本发明构建的MRS6过表达载体可用于被转化的植物宿主既可以是单子叶植株，也可以是双子叶植株，如：烟草、水稻、玉米、小麦、黄瓜等。

本发明构建的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞。并将转化的植物细胞或组织培养成植株。

本发明采用根癌农杆菌介导和叶盘法将啤酒酵母MRS6基因转入烟草以获得高耐镉性转基因烟草植株。

本发明提供的MRS6转基因植株可用于如下应用：A.确认MRS6具有调控植株对重金属镉的抗性；B.选育对重金属镉的抗性增强，对镉富集能力增强的烟草；C.选育生长迅速且生长周期短的植株品种。

在本发明的实施例中，所述重金属镉为Cd²⁺，更为具体的为CdCl₂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的实验证明，在烟草中过表达MRS6基因，所得转基因植株与未经转基因的野生型烟草植株相比，生长速度更快，对重金属镉(Cd²⁺)的抗性明显增强。未经重金属镉处理，MRS6过表达烟草植株与野生型烟草植株相比，植株生长更为迅速，达到3叶期、6叶期、10叶期的时间更短。经重金属镉的胁迫处理后，未经转基因的野生型烟草随着镉浓度的升高，叶片由青变黄数量显著增加，植株生长缓慢。相比之下过表达MRS6基因的转基因烟草植株生长基本不受影响，且叶片发黄数目显著低于野生型烟草。表明MRS6烟草能够提高转基因烟草对重金属镉胁迫的抗性。随着镉处理浓度的增加，烟草植株根茎叶中的镉含量均明显上升，其中转基因烟草根茎中的镉含量高于野生型烟草，但是转基因烟草叶片中镉含量低于野生型烟草叶片中的镉含量，表明MRS6具有将烟草富集于根茎减少叶片镉含量，从而保护叶片免受损伤。因此，MRS6基因在作为抗重金属镉的遗传改良方面具有重要的应用价值。

本发明中，通过荧光蛋白示踪法观察发现MRS6编码蛋白主要在转基因植物根茎的导管细胞中大量表达。本发明中，经CdCl₂处理：与野生型烟草比，转基因烟草根茎组织所富集的镉含量显著增高，叶片中的镉含量显著降低，植株生长更迅速。证明MRS6过表达可以提高烟草对重金属镉的耐受性，增强对镉的富集能力及减少叶片镉的含量，提高烟草的生长速度。因此，本发明基因MRS6改良烟草具有高耐镉活性，在富集环境镉改善自然环境方面具有广阔的应用前景，经济效益潜力巨大。

附图说明

图1为两种转基因烟草(MRS6，MRS6-GFP)及野生型烟草的PCR分子鉴定结果

图2为MRS6-GFP转基因烟草及野生型烟草各组织荧光照片。

图3为三种烟草的发芽率。

图4为三种烟草到达不同叶期所需时间统计。A.烟草达到3叶期及全部生长到三叶期所需时间；B图为烟草达到6叶期及全部生长到6叶期所需时间；C图为三种烟草出现2叶期至10叶期时间统计。

图5为三种烟草株高随时间变化曲线。A为植株培养8天后植株表型；B为植株30天后植株表型；C为0-50天内三种植株株高变化趋势。

图6为转基因烟草及野生型烟草在重金属镉的胁迫下的表型。A为重金属镉处理前的植株表型；B为经10mg/kg的CdCl₂处理十天后的植株表型；C为不同浓度CdCl₂处理十天后的植株叶片枯黄数。

图7为烟草经不同CdCl₂处理后，植株的干湿比重。

图8为烟草经不同CdCl₂处理后，植株内镉含量测定(占干重％)。A为烟草根茎组织镉含量；B为烟草叶片镉含量。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅用于说明本发明的一部分实施例，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买获得的常规产品。以上所述仅为本发明较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

(1)本发明所述的烟草抗镉基因MRS6的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

(2)本发明所述的烟草抗镉基因MRS6编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

(3)本发明中的定量实验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。

(4)下述方法，如无特殊说明，均属常规方法。下面以具体实施例对本发明做进一步说明：

实施例1

烟草的遗传转化和转基因烟草的PCR鉴定。

(1)MRS6基因的PCR扩增

根据酵母基因组数据库信息设计引物，以酿酒酵母S288C(PLoS Genet，2012，8(11)：e1003083)和MRS6-GFP菌株(根据Nature，2003.425：686-691.方法在S288C基础上构建)基因组为模板，进行MRS6和MRS6-GFP基因的PCR扩增，PCR反应体系(25μL)为：EmeraldAmp MAX PCR Master Mix(2×Premix)12.5μL，上引物(浓度为1OD)1μL，下引物(浓度为1OD)1μL，模板DNA(浓度为233ng/μL)1μL，ddH₂O9.5μL。PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，32个循环，最后72℃延伸10min，4℃保持。得到PCR扩增产物，将扩增获得的PCR产物通过凝胶电泳回收。

MRS6和MRS6-GFP引物(引物1)为：

5’aactgcagATCCTTATGTGACAAGAGTGAC 3’(SEQ ID NO：3)

5’ggggtaccGAACAAGGAACACTTATAGAC 3’(SEQ ID NO：4)

利用双酶切连接方法(PstI/Kpn1)将PCR产物与YEplac195质粒连接，其中YEplac195质粒来源于Invitrogen公司。质粒提取试剂盒生产厂家为生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为B518191-0100；PstI/Kpn1生产厂家为TaKaRa，货号分别为1073S、1068S；T4连接酶生产厂家为TaKaRa，货号为2011A。

双酶切连接步骤为：分别加入质粒或者目的基因PCR产物1ug、两种限制性内切酶各加入1μl及5μl M buffer(TaKaRa，货号分别为1073S、1068S)，加入ddH₂O配平至50μl反应液，37℃温度下反应3小时，目的基因酶切产物经凝胶电泳检测后，直接柱回收。质粒酶切产物需经过凝胶电泳，去除未切开的质粒，再进行胶回收。酶连体系为目的基因(21ng/ul)6μl，质粒(115ng/ul)2μl，T4连接酶1μl，Buffer(TaKaRa，2011A)1μl。室温连接3小时后，65℃水浴加热10分钟失活，进行DH5α感受态(生工生物工程(上海)股份有限公司，B528413)转化，挑取单克隆菌落作为模板，利用上述的MRS6引物(引物1)，进行PCR，PCR反应体系(25μL)为：EmeraldAmp MAX PCR Master Mix(2×Premix)12.5μL，上引物(浓度为1OD)1μL，下引物(浓度为1OD)1μL，模板DNA(单克隆菌落)1μL，ddH₂O9.5μL。PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，32个循环，最后72℃延伸10min，4℃保持。以D2000DNAladder(中科瑞泰，RTM415)作为对照，通过凝胶电泳，筛选出能够克隆出目的基因的阳性克隆，提质粒，进行基因测序，分别得到YEplac195-MRS6阳性转化子质粒以及YEplac195-MRS6-GFP质粒。

提取各5个阳性转化子质粒，并送生工测序，验证序列结果，取结果序列与基因组数据库数据完全相同的克隆开展后续工作。

(2)MRS6基因的植物表达载体构建

以gateway重组技术将质粒YEplac195-MRS6和YEplac195-MRS6-GFP目的基因MRS6和MRS6-GFP亚克隆到植物表达载体pJAM1502(购于Invitrogen公司)。引物序列是(引物2)：

AttB1：AAAAAGCAGGCTTCATGTTAAGTCCTGAACGTAGACCAT；(SEQ ID NO：5)

AttB2：AGAAAGCTGGGTCTCATATGTGGATTTCACCTA。(SEQ ID NO：6)

以(1)中YEplac195-MRS6质粒为模板，进行PCR(所采用的引物为AttB1和AttB2，PCR体系为上下引物(1OD)各2μl，模板(127ng/μl)1μl，ddH₂O20μl，PCR Master Mix(TaKaRa，RR320)25μl。PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，32个循环，最后72℃延伸10min，4℃保持)获得MRS6基因。

以(1)中YEplac195-MRS6-GFP质粒为模板，进行PCR(PCR体系及扩增程序与YEplac195-MRS6质粒相同，引物仍然为引物2，即AttB1和AttB2)，获得MRS6-GFP基因。

分别将MRS6和MRS6-GFP基因PCR产物与转移到目的载体质粒pJAM1502混合，加入重组酶混合物(Gateway BP Clonase酶)共同孵育5-10分钟，接着转化感受态大肠杆菌(生工生物工程(上海)股份有限公司，B528413)，获得包含目的基因的重组质粒克隆。将构建好的质粒经PCR反应及测序(所采用的引物仍然为上述引物2，PCR体系为上下引物(1OD)各2μl，模板(127ng/μl)1μl，ddH₂O20μl，PCR Master Mix(TaKaRa，RR320)25μl。PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，32个循环，最后72℃延伸10min，4℃保持)，鉴定正确的重组质粒。

(3)农杆菌介导的烟草转化将正确的重组质粒利用电激转化(11kv/cm)根癌农杆菌(TaKaRa，GV3101)，通过菌落PCR(所用引物为引物2，PCR体系和条件与步骤(2)中“将构建好的质粒经PCR反应及测序”时相同，模板为单克隆菌落)确定阳性农杆菌菌株，利用分别带有质粒Ti-MRS6和质粒Ti-MRS6-GFP的根癌农杆菌通过叶盘法转化烟草品种三生烟(Nicotianatabacumm L.xanthi)中。取出预培养24-48h的外植体叶盘(使用的培养基为MS培养基，购于Solarbio公司，货号M8520)，放入侵染液(50mL液体MS培养基中，农杆菌OD600值约为0.8-1.0)中进行侵染(即载体将外源基因转移并整合到植物细胞基因组中)30min。将叶片放回到共培养基(固体MS培养基)上，25℃黑暗条件培养3天，取出共培养的烟草叶片，洗去表面的农杆菌，转移到烟草诱芽培养基(MS+BA(苄基腺嘌呤)1.0mg/L+Hyg(潮霉素)25mg/L+Cef(头孢霉素)500mg/L，PH＝5.8，购于北京鼎国生物技术有限责任公司)上，定期更换新鲜培养基直至长出不定芽。切下再生的小苗，转入继代培养基(MS+BA 0.5mg/L+Hyg25mg/L+Cef 500mg/L PH＝5.8)分化培养获得携带MRS6基因的幼芽，转入到生根培养基(MS+NAA(萘乙酸，购于北京鼎国生物技术有限责任公司)0.5mg/L)，24℃，12h光照培养至长出粗壮根系，移栽至营养土中，温室培养。

(4)转基因烟草的鉴定

为了鉴定MRS6基因是否成功整合到烟草基因组中，对转基因烟草(转MRS6，MRS6-GFP植株)进行PCR检测，引物为(引物3)：

MRS6-F：5’-ATTGATGCCGCTCTAGAAGC-3’(SEQ ID NO：7)

MRS6-R：5’-GGTGACTACTTCATCATACG-3’(SEQ ID NO：8)

扩增条带大小为304bp。

CTAB法提取转基因与非转基因烟草DNA，以转基因植株的DNA为模板。未转化烟草DNA为对照，以MRS6引物3进行PCR扩增。PCR反应体系(25μL)为：EmeraldAmp MAX PCRMaster Mix(2×Premix)12.5μL，上引物(浓度为1OD)1μL，下引物(浓度为1OD)1μL，模板DNA(浓度为284ng/μL)1μL，ddH₂O 9.5μL。反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，32个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。结果显示，阳性菌株(MRS6，MRS6-GFP转基因植株)PCR扩增均得到了一条300bp左右的条带(图1)。

为了确定转基因植株MRS6蛋白表达部位以及表达量，通过检测绿色荧光蛋白表达位置和强度进行判断：为了解阳性植株转基因是否表达以及表达水平，通过荧光显微镜进行观察，MRS6-GFP蛋白在荧光显微镜下可以发出绿色荧光，因此可以根据荧光位置以及亮度可以判断MRS6蛋白是否表达，表达水平以及主要表达部位。非转基因植株作为阴性对照，MRS6-GFP转基因植株作为阳性植株，分别摘取植株的根、茎、叶，制作成组织切片。利用荧光显微镜对植物组织切片进行观察，发现非转基因植株没有荧光蛋白，转基因植株中出现荧光蛋白表明MRS6-GFP正常表达，且主要在植株的根茎部位的导管、筛管细胞中大量表达，而植株叶片表达并不丰富(图2)。

实施例2

MRS6及MRS6-GFP过表达对植株生长的影响。

(1)对野生型及实施例1获得的转基因三生烟种子进行消毒，其具体步骤为：

i.无菌条件下将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗3次；

ii.于70％乙醇溶液中浸泡1min；

iii.再用1％的次氯酸纳溶液浸泡10min，再用无菌水反复冲洗4～5次种子；

iv.最后将冲洗干净的种子置于无菌滤纸上，吸收多余水分。

(2)将消毒后的烟草种子各40颗播种于MS固体培养基上，置于人工气候培养箱中培养，暗培养3天。温度28℃，光暗(16h/8h)交替培养45-50天，期间观察植株生长，并记录相关数据。

(3)烟草植株经过培养5天左右后，种子萌发基本完成，统计三种烟草种子的发芽率，三种烟草种子的发芽率未发现显著性差异，种子发芽率均超过95％(图3)。表明MRS6过表达并不影响烟草种子的发芽率。

(4)种子发芽13天后MRS6植株出现3叶期，14天后MRS6-GFP植株出现3叶期，而野生型烟草直至15天才出现3叶期，并经统计发现野生型植株均生长至3叶期所需时间长于转基因植株(图4A)。以及达到6叶期，转基因植株均快于野生型植株(图4B)。

(5)直至培养到55天，野生型植株才生长至10叶期，而两种转基因烟草在培养不足四十天均达到了10叶期(图4C)。表明MRS6基因过表达显著缩短了植株的生长周期。

(6)为了探究MRS6过表达对烟草植株株高的影响，随后测定了培养不同时间，三种烟草植株株高的变化。选取两个时间段进行拍照观察，当培养15天及30天时，转基因植株明显比野生型植株更高(图5A)。培养55天，我们对整个时间内植株株高进行分析，当出现2叶期之后转基因烟草的株高增加速度均高于野生型株高(图5B)。表明MRS6可以促进烟草的生长。

实施例3

MRS6及MRS6-GFP过表达对植株镉耐受性及镉富集的影响。

(1)当烟草均生长至10叶期，取长势相同，数目相等的烟草植株各分成3组加入不同浓度CdCl₂进至MS培养基进行处理。配置浓度分别为0，250，500μg/mL的CdCl₂母液，每组分别加入3mLCdCl₂，最终培养基中CdCl₂的实际浓度为0mg/kg，15mg/kg及30mg/kg。处理12天后，MRS6和MRS6-GFP转基因烟草生长状况明显优于野生型烟草植株。烟草叶片由青变黄分为四个阶段，青色、浅黄、黄色、深黄(图6A)。随着CdCl₂处理浓度的增加，转基因烟草叶片轻度变黄数量较少，颜色较浅(浅黄色)，植株较高；而野生型烟草植株叶片发黄更为明显，大部分变黄甚至出现也变变成深黄色并且随着浓度增加植株生长也收到了抑制(图6B，C)。表明MRS6过表达的转基因烟草对于CdCl₂胁迫表现出较好的抗性，并维持植株的持续生长。

(2)将上述经不同浓度CdCl₂处理的烟草整株取出进行用水洗净，吸干多余水分，进行称重，将植株置于恒温干燥箱中，50-60℃过夜烘干，再次进行称量，计算不同烟草经不同CdCl₂处理后植株的干湿重比率变化(图7)。发现随着CdCl₂处理浓度的增加，植株干湿比重逐渐增加，且转基因烟草与野生型烟草相比，干湿比重增加更加显著(图7)。表明MRS6过表达的转基因烟草细胞内金属离子含量可能发生改变。

(3)为了验证MRS6基因对烟草植株富集镉的影响，本发明同时测定培养基以及烟草植株中Cd的含量。

样品处理如下所示：

1)取相同质量的培养基，烘干，将上述烘干的植株根茎与叶进行分离，用研钵将组织和烘干的培养基研磨成粉末，称取相同重量的植株(10mg-15mg)和培养基，装入2ml EP管中；

2)向EP管中加入600ul的6M硝酸(5ml 65％硝酸：7ml去离子水)；

3)75℃水浴加热16h，再放入沸水浴中加热2h进行裂解硝化，使组织中的金属离子充分释放出来。冷却至室温。12000g离心8min；

4)将上清液转入新的试管中，加入3.24ml去离子水进行补平；

5)最终样品中硝酸介质水溶液不得高于5％；

6)样品送到检测中心利用MS-AES进行Cd离子检测，所测元素浓度在1-100ppm之间。

实验结果显示，随着CdCl₂处理浓度的增加，野生型烟草以及转基因烟草中根茎与叶片中镉含量呈逐渐上升趋势。MRS6与MRS6-GFP转基因烟草根茎组织细胞镉的含量显著高于野生型烟草根茎组织细胞镉的含量(图8A)。当CdCl₂处理浓度达到26.76mg/Kg时，MRS6与MRS6-GFP转基因烟草根茎组织细胞中镉含量达到了1.200198±0.0854mg/g(占干重)和1.186918±0.0786mg/g(占干重)。而野生型烟草每克根茎组织(干重)中镉的含量为0.69±0.1206mg。我们还发现三种烟草叶片中镉含量比重也在逐渐增加，但是野生型烟草叶片中镉含量显著高于两种转基因叶片中的镉含量(图8B)。通过测量培养基中镉含量发现，植株培养12天后，培养基镉中的含量出现不同程度的下降。其中在CdCl₂初始浓度为15mg/kg的培养基中，野生型吸收导致培养基中镉含量减少了0.624mg/kg，而转基因烟草吸收导致培养基中镉含量减少了1.45-1.65mg/kg。当在高浓度的时候，镉损失率更大，且转基因烟草降低培养基中镉含量更为显著(图8C)。说明MRS6过表达可以增强烟草根茎富集镉的能力，同时降低叶片中的镉含量，保护叶片免受重金属镉的伤害，增强烟草对镉的耐受。

SEQ ID NO：1：

SEQ ID NO：2

序列表

<110> 东华大学

<120> MRS6基因在提高烟草对重金属镉的耐受性中的应用

<130> 1

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1812

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1

atgttaagtc ctgaacgtag accatccatg gcagaacgcc gcccatcatt tttcagtttt 60

actcaaaatc caagtcctct agttgtcccg catttagccg gtattgaaga ccctttgcca 120

gccactacac cagataaagt tgatgtttta atcgcaggga ctggtatggt agagagtgta 180

ttggctgctg cattagcttg gcaaggttcc aatgtccttc atattgataa gaatgattat 240

tacggtgaca cttcagccac actaactgta gaccaaatca aaagatgggt aaatgaagtt 300

aatgaaggct cagtaagttg ctataaaaat gcgaagttgt atgtatccac gctaatcggt 360

agtggtaaat attcttcaag agatttcggt attgatcttt ccccgaagat cctatttgca 420

aaatctgatt tattatccat cttaatcaaa tcaagagttc accagtattt agaattccaa 480

tctttatcta atttccatac ttatgaaaat gattgtttcg aaaaactaac aaatacaaag 540

caagaaatat tcacggatca aaacctacca ctaatgacaa agaggaactt aatgaaattt 600

atcaaattcg tactcaactg ggaagcacaa acggaaatat ggcaacccta cgcggagagg 660

accatgtctg attttttagg ggaaaagttt aaattagaaa aaccacaagt cttcgaatta 720

atcttctcaa ttgggttatg ttatgatctc aacgtaaaag taccagaagc tttacaaagg 780

attcgtcgat atctaactag tttcgatgtt tatggaccat tccctgcact atgctccaag 840

tatggtgggc caggagaatt gtcgcaaggg ttttgtagat ctgccgctgt aggtggcgct 900

acttacaaac tcaatgagaa attggtatcc ttcaacccta caactaaagt ggccacattc 960

caagatggat ccaaagttga agtttcagag aaagtgataa tatcgcctac gcaagcacct 1020

aaagacagta agcatgtccc tcaacaacag taccaggttc atcgtttgac ctgtatagtt 1080

gaaaacccct gtactgaatg gttcaatgag ggtgaatcgg ccgccatggt agtcttccct 1140

cctggctctt tgaaatctgg taataaggaa gtagtacaag cctttattct cggtgctggc 1200

agcgaaattt gtccagaagg aactattgta tggtatttat cgaccacaga acaaggccca 1260

cgtgctgaaa tggacattga tgccgctcta gaagctatgg aaatggccct gctaagggaa 1320

tcgtcttcag gtttagagaa cgacgaagaa attgttcaac taacgggaaa tggtcataca 1380

atagtaaatt cagttaagtt aggccaatct tttaaggagt atgttcctag ggaaagatta 1440

cagttcttat ttaaacttta ttatacccaa tacacatcca cgccaccctt tggtgtagtt 1500

aactcctcct tctttgatgt aaatcaagat ttggaaaaaa agtatattcc cggtgcgagt 1560

gataatggcg tcatatatac aaccatgcct tctgctgaga tatcgtatga tgaagtagtc 1620

accgcagcca aagttttata cgaaaagata gttggcagtg atgatgactt cttcgattta 1680

gattttgaag atgaggatga aatacaggct agcggcgttg ctaatgcgga acaatttgaa 1740

aatgccatag acgatgacga cgatgtcaat atggaaggtt ccggtgaatt tgtaggtgaa 1800

atggagatat ga 1812

<210> 2

<211> 603

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 2

Met Leu Ser Pro Glu Arg Arg Pro Ser Met Ala Glu Arg Arg Pro Ser

1 5 10 15

Phe Phe Ser Phe Thr Gln Asn Pro Ser Pro Leu Val Val Pro His Leu

20 25 30

Ala Gly Ile Glu Asp Pro Leu Pro Ala Thr Thr Pro Asp Lys Val Asp

35 40 45

Val Leu Ile Ala Gly Thr Gly Met Val Glu Ser Val Leu Ala Ala Ala

50 55 60

Leu Ala Trp Gln Gly Ser Asn Val Leu His Ile Asp Lys Asn Asp Tyr

65 70 75 80

Tyr Gly Asp Thr Ser Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ile Lys Arg Trp

85 90 95

Val Asn Glu Val Asn Glu Gly Ser Val Ser Cys Tyr Lys Asn Ala Lys

100 105 110

Leu Tyr Val Ser Thr Leu Ile Gly Ser Gly Lys Tyr Ser Ser Arg Asp

115 120 125

Phe Gly Ile Asp Leu Ser Pro Lys Ile Leu Phe Ala Lys Ser Asp Leu

130 135 140

Leu Ser Ile Leu Ile Lys Ser Arg Val His Gln Tyr Leu Glu Phe Gln

145 150 155 160

Ser Leu Ser Asn Phe His Thr Tyr Glu Asn Asp Cys Phe Glu Lys Leu

165 170 175

Thr Asn Thr Lys Gln Glu Ile Phe Thr Asp Gln Asn Leu Pro Leu Met

180 185 190

Thr Lys Arg Asn Leu Met Lys Phe Ile Lys Phe Val Leu Asn Trp Glu

195 200 205

Ala Gln Thr Glu Ile Trp Gln Pro Tyr Ala Glu Arg Thr Met Ser Asp

210 215 220

Phe Leu Gly Glu Lys Phe Lys Leu Glu Lys Pro Gln Val Phe Glu Leu

225 230 235 240

Ile Phe Ser Ile Gly Leu Cys Tyr Asp Leu Asn Val Lys Val Pro Glu

245 250 255

Ala Leu Gln Arg Ile Arg Arg Tyr Leu Thr Ser Phe Asp Val Tyr Gly

260 265 270

Pro Phe Pro Ala Leu Cys Ser Lys Tyr Gly Gly Pro Gly Glu Leu Ser

275 280 285

Gln Gly Phe Cys Arg Ser Ala Ala Val Gly Gly Ala Thr Tyr Lys Leu

290 295 300

Asn Glu Lys Leu Val Ser Phe Asn Pro Thr Thr Lys Val Ala Thr Phe

305 310 315 320

Gln Asp Gly Ser Lys Val Glu Val Ser Glu Lys Val Ile Ile Ser Pro

325 330 335

Thr Gln Ala Pro Lys Asp Ser Lys His Val Pro Gln Gln Gln Tyr Gln

340 345 350

Val His Arg Leu Thr Cys Ile Val Glu Asn Pro Cys Thr Glu Trp Phe

355 360 365

Asn Glu Gly Glu Ser Ala Ala Met Val Val Phe Pro Pro Gly Ser Leu

370 375 380

Lys Ser Gly Asn Lys Glu Val Val Gln Ala Phe Ile Leu Gly Ala Gly

385 390 395 400

Ser Glu Ile Cys Pro Glu Gly Thr Ile Val Trp Tyr Leu Ser Thr Thr

405 410 415

Glu Gln Gly Pro Arg Ala Glu Met Asp Ile Asp Ala Ala Leu Glu Ala

420 425 430

Met Glu Met Ala Leu Leu Arg Glu Ser Ser Ser Gly Leu Glu Asn Asp

435 440 445

Glu Glu Ile Val Gln Leu Thr Gly Asn Gly His Thr Ile Val Asn Ser

450 455 460

Val Lys Leu Gly Gln Ser Phe Lys Glu Tyr Val Pro Arg Glu Arg Leu

465 470 475 480

Gln Phe Leu Phe Lys Leu Tyr Tyr Thr Gln Tyr Thr Ser Thr Pro Pro

485 490 495

Phe Gly Val Val Asn Ser Ser Phe Phe Asp Val Asn Gln Asp Leu Glu

500 505 510

Lys Lys Tyr Ile Pro Gly Ala Ser Asp Asn Gly Val Ile Tyr Thr Thr

515 520 525

Met Pro Ser Ala Glu Ile Ser Tyr Asp Glu Val Val Thr Ala Ala Lys

530 535 540

Val Leu Tyr Glu Lys Ile Val Gly Ser Asp Asp Asp Phe Phe Asp Leu

545 550 555 560

Asp Phe Glu Asp Glu Asp Glu Ile Gln Ala Ser Gly Val Ala Asn Ala

565 570 575

Glu Gln Phe Glu Asn Ala Ile Asp Asp Asp Asp Asp Val Asn Met Glu

580 585 590

Gly Ser Gly Glu Phe Val Gly Glu Met Glu Ile

595 600

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 3

aactgcagat ccttatgtga caagagtgac 30

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 4

ggggtaccga acaaggaaca cttatagac 29

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 5

aaaaagcagg cttcatgtta agtcctgaac gtagaccat 39

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 6

agaaagctgg gtctcatatc tccatttcac cta 33

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 7

attgatgccg ctctagaagc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence(人工序列)

<400> 8

ggtgactact tcatcatacg 20

Claims

1.MRS6基因、蛋白或其表达载体在提高植株对重金属镉的抗性或生产耐镉植株中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的烟草为三生烟。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的MRS6基因的表达载体通过使用Ti质粒、植物病毒载体以及农杆菌介导方法中的至少一种转化植物细胞。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的植株为单子叶植株或双子叶植株。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的植株为烟草、水稻、玉米、小麦或黄瓜。

6.一种MRS6基因的表达载体，其特征在于，其构建方法包括采用gateway重组技术，将MRS6目的基因插入到农杆菌的Ti质粒的T-DNA区中。

7.一种转基因烟草，其特征在于，该烟草侵染了MRS6基因的表达载体。

8.权利要求7所述的转基因烟草的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求6所述的MRS6基因的表达载体转入烟草中，培养得到转基因烟草。

9.如权利要求8所述的转基因烟草的制备方法，其特征在于，所述的将权利要求6所述的MRS6基因的表达载体转入烟草中的具体步骤包括：将上述MRS6基因的表达载体转化农杆菌，用所得的农杆菌侵染预培养24-48h的外植体叶盘，通过叶盘法将其导入三生烟烟草中。