CN108676838B - 一种隐球菌荚膜染色液及其制备和使用方法 - Google Patents

一种隐球菌荚膜染色液及其制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种隐球菌荚膜染色液，其原料包括以下组分：甲醇、磷酸盐缓冲液、瑞氏染粉、姬姆萨染粉、阿拉伯胶和碳烟，所述甲醇和所述磷酸盐缓冲液的混合体积比为1/(0.5～2)，所述磷酸盐缓冲液为PH值6.4～6.8的磷酸盐缓冲液；每1000毫升的所述甲醇和所述磷酸盐缓冲液的混合液中分散所述瑞氏染粉0.1～10克、所述姬姆萨染粉0.03～3克、所述阿拉伯胶2～20克、以及所述碳烟2～20克。本发明使隐球菌的孢子着色鲜艳，孢子内部结构清晰，更容易识别；标准的染色方法，试验成功率高；不需要印度墨汁；染色液性质稳定，可以长期存放。

Description

一种隐球菌荚膜染色液及其制备和使用方法
技术领域
本发明涉及一种隐球菌检测技术领域，特别是一种隐球菌荚膜染色液及其制备和使用方法。
背景技术
隐球菌是具有肥厚荚膜的真菌，而且其孢子与荚膜、荚膜与外周边缘清晰，这一特征具有独特性。因此，在怀疑人类感染新型隐球菌时，观察隐球菌的荚膜成为首选的、快速的试验，试验结果可以用于疾病诊断，国内外不过如此。而观察荚膜的方法即所谓墨汁染色-“负染法”，是一直未改变的试验方法。
负染法的特点在于：取隐球菌菌悬液、脑脊液或其他体液，加入印度墨汁(黑色背景)，在显微镜下观察，隐球菌荚膜不着色，染色效果见说明书附图1。
负染法存在的不足在于：
1.墨汁并不能够使隐球菌着色，隐球菌孢子、荚膜结构不清晰。
2.试验方法缺少标准，掌握不好时不能见到荚膜，隐球菌容易漏检，使人感到操作困难，阳性率低。
3.印度墨汁昂贵。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种隐球菌荚膜染色液，能够克服现有技术中负染法存在的不足。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种隐球菌荚膜染色液，包括其原料包括以下组分：甲醇、磷酸盐缓冲液、瑞氏染粉、姬姆萨染粉、阿拉伯胶和碳烟，所述甲醇和所述磷酸盐缓冲液的混合体积比为1/(0.5～2)，所述磷酸盐缓冲液为PH值6.4～6.8的磷酸盐缓冲液；每1000毫升的所述甲醇和所述磷酸盐缓冲液的混合液中分散所述瑞氏染粉0.1～10克、所述姬姆萨染粉0.03～3克、所述阿拉伯胶2～20克、以及所述碳烟2～20克。
本发明所述的碳烟为墨汁生产行业常用的原料。
作为上述技术方案的具体优选，所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：在每1000毫升的纯净水中分散无水磷酸二氢钾6.63克、无水磷酸氢二钠2.56克。
作为上述技术方案的具体优选，所述甲醇和所述磷酸盐缓冲液的混合体积比为1/1，每1000毫升的所述甲醇和所述磷酸盐缓冲液的混合液中分散所述瑞氏染粉1克、所述姬姆萨染粉0.3克、所述阿拉伯胶10克、以及所述碳烟10克。
所述的一种隐球菌荚膜染色液的制备方法，包括以下步骤：首先将所述瑞氏染粉和所述姬姆萨染粉分散在所述甲醇中，然后加入所述磷酸盐缓冲液进行混合，最后向所述甲醇和所述磷酸盐缓冲液的混合液中放入所述阿拉伯胶和所述碳烟。
所述的一种隐球菌荚膜染色液的使用方法，包括以下步骤：取待检测样品的离心沉淀物与所述隐球菌荚膜染色液按照1/(0.2～5)的体积比混合，置于35℃恒温箱中染色30分钟以上，然后取液于载玻片上加盖玻片，置于显微镜下观察即可。
与现有技术相比较，本发明的有益效果是：
本发明所提供的一种隐球菌荚膜染色液其具有以下优点：
1.隐球菌的孢子着色鲜艳，亮蓝色或深棕色，且孢子内部结构清晰，在染液的衬托下，隐球菌荚膜透亮，更容易识别，使人过目不忘。
2.标准的染色方法，操作简便，试验成功率高，可以提高阳性率。
3.不需要印度墨汁。
4.染色液性质稳定，室温、避光条件下可以长期存放，至少可以存放2年。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是负染法染色隐球菌样品在显微镜下获取的照片；
图2是具体实施例1在高倍镜(400×)下获取的观察结果照片；
图3是具体实施例1在油镜(1000×)下获取的观察结果照片。
具体实施方式
具体实施例1
本实施例提供的一种隐球菌荚膜染色液，其原料包括以下组分：
500毫升甲醇、500毫升磷酸盐缓冲液、1克瑞氏染粉、0.3克姬姆萨染粉、10克阿拉伯胶和10克碳烟。
所述磷酸盐缓冲液为PH值6.4～6.8的磷酸盐缓冲液；且所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：在每1000毫升的纯净水中分散无水磷酸二氢钾6.63克、无水磷酸氢二钠2.56克。
本实施例提供的一种隐球菌荚膜染色液的制备方法，包括以下步骤：
首先将1克所述瑞氏染粉和0.3克所述姬姆萨染粉分散在500毫升所述甲醇中，然后加入500毫升所述磷酸盐缓冲液进行混合，最后向所述甲醇和所述磷酸盐缓冲液的混合液中放入10克所述阿拉伯胶和10克所述碳烟。
制备获得的隐球菌荚膜染色液置于室温、避光条件下密封存放，备用。
本实施例提供的一种隐球菌荚膜染色液的使用方法，包括以下步骤：
取待检测样品的离心沉淀物与所述隐球菌荚膜染色液按照1/1的体积比混合(可根据菌量的多少，调整比例)，置于35℃恒温箱中染色30分钟以上，然后取液于载玻片上加盖玻片，置于显微镜下观察即可。
待检测样品可以是隐球菌菌悬液、或者脑脊液、或者其他体液。
本实施例染色隐球菌后在显微镜下的观察结果为：
低倍镜(100×)下，隐球菌因为荚膜不着色，像黑夜中的星星发亮，有提示作用；
高倍镜(400×)下，新型隐球菌荚膜特征可见，但欠典型，如附图2所示；
油镜(1000×)下，新型隐球菌孢子和荚膜结构清晰、典型，如附图3所示。
具体实施例2
本实施例提供的一种隐球菌荚膜染色液，其原料包括以下组分：
333毫升甲醇、667毫升磷酸盐缓冲液、0.1克瑞氏染粉、0.03克姬姆萨染粉、2克阿拉伯胶和2克碳烟。
本实施例提供的一种隐球菌荚膜染色液的制备和使用方法可参考具体实施例1，只是使用时待检测样品的离心沉淀物与所述隐球菌荚膜染色液按照5/1的体积比混合，除此以外其余步骤与具体实施例1相同。
本实施例染色隐球菌后在显微镜下的观察结果与具体实施例1相类似，只是清晰度、对比度不及具体实施例1。
具体实施例3
本实施例提供的一种隐球菌荚膜染色液，其原料包括以下组分：
667毫升甲醇、333毫升磷酸盐缓冲液、10克瑞氏染粉、3克姬姆萨染粉、20克阿拉伯胶和20克碳烟。
本实施例提供的一种隐球菌荚膜染色液的制备和使用方法可参考具体实施例1，只是使用时待检测样品的离心沉淀物与所述隐球菌荚膜染色液按照1/5的体积比混合，除此以外其余步骤与具体实施例1相同。
本实施例染色隐球菌后在显微镜下的观察结果与具体实施例1相类似，部分背景中颗粒变粗、沉淀析出，对比度不及具体实施例1。
以上对本发明的较佳实施方式进行了具体地说明，当然，本发明还可以采用与上述实施方式不同的形式，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下所作的等同的变换或相应的改动，都应该属于本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种隐球菌荚膜染色液，其特征在于，其原料包括以下组分：甲醇、磷酸盐缓冲液、瑞氏染粉、姬姆萨染粉、阿拉伯胶和碳烟，所述甲醇和所述磷酸盐缓冲液的混合体积比为1/（0.5～2），所述磷酸盐缓冲液为p H值6.4～6.8的磷酸盐缓冲液；每1000毫升的所述甲醇和所述磷酸盐缓冲液的混合液中分散所述瑞氏染粉0.1～10克、所述姬姆萨染粉0.03～3克、所述阿拉伯胶2～20克、以及所述碳烟2～20克。
2.根据权利要求1所述的一种隐球菌荚膜染色液，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：在每1000毫升的纯净水中分散无水磷酸二氢钾6.63克、无水磷酸氢二钠2.56克。
3.根据权利要求1所述的一种隐球菌荚膜染色液，其特征在于：所述甲醇和所述磷酸盐缓冲液的混合体积比为1/1，每1000毫升的所述甲醇和所述磷酸盐缓冲液的混合液中分散所述瑞氏染粉1克、所述姬姆萨染粉0.3克、所述阿拉伯胶10克、以及所述碳烟10克。
4.根据权利要求1-3中任一所述的一种隐球菌荚膜染色液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先将所述瑞氏染粉和所述姬姆萨染粉分散在所述甲醇中，然后加入所述磷酸盐缓冲液进行混合，最后向所述甲醇和所述磷酸盐缓冲液的混合液中放入所述阿拉伯胶和所述碳烟。
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