CN106198155B - 一种电镜超薄切片的真空染色法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于电镜切片技术领域，具体涉及一种电镜超薄切片的真空染色法。本发明提供的电镜超薄切片的真空染色法为：将捞有切片的铜网序装载在染色硅胶板上，放入抽真空保鲜盒内进行醋酸双氧铀染色，冲洗后，接着在真空条件下进行柠檬酸铅染色，即得。本发明提供的电镜超薄切片的真空染色法可以有效的隔绝空气中CO2与柠檬酸铅的接触，防止空气中CO2与铅盐反应生成碳酸铅沉淀从而污染切片，影响电镜观察。同时，使用本发明提供的电镜超薄切片的真空染色法制备得到的切片干净、无污染，而且结构清晰，反差效果好，更有利于超微结构的研究。
Description
技术领域
本发明属于电镜切片技术领域，具体涉及一种电镜超薄切片的真空染色法。
背景技术
对于生物样品的超薄切片来说，图像反差来源样品对于电子束的散射能力，而其散射能力取决于原子组成。原子序数越高，电子密度越高，散射电子能力越强，电镜下显黑色，原子序数越低，电子密度越低，散射电子能力越弱，电镜下显示白色。而生物样品主要由：C、H、O、N、P、S等低原子序数的元素组成，未经染色的超薄切片，反差很弱，特别是用于医学诊断的切片，反差效果差会导致结构不清晰，严重影响病理医生的诊断结果。
为了增强样品的反差效果，一般是使用醋酸双氧铀和柠檬酸铅进行染色处理。但是，醋酸双氧铀有微弱的放射性，而铅染液容易与空气中的二氧化碳结合形成碳酸铅颗粒污染切片，从而影响电镜观察，而且随着染色时间以及切片数量的增加而增加污染的可能性。
为了解决铅污染的问题，徕卡公司研究出了一款-Leica EM AC20全自动电镜铜网染色仪。该染色仪是把超薄切片放在仪器密闭的样品仓内，仪器自动完成染色工作，减少人为和环境中CO2的影响，是一款染色效果好的超薄切片自动染色仪。但是，该染色仪一次也只能染20张铜网，同时，对柠檬酸铅染色液的要求较高，必须要用原厂染色液，导致染色成本高。
陈庆林等发表了一篇题目为“超薄切片染色方法的改进”的论文，该论文公开了一种封闭式的染色盒，该染色方法是将待染超薄切片按编号装入制好的盒芯网孔内，然后将盒芯插入盒套，并用透明胶带纸将盒盖与盒套连接处封闭，然后在封密的条件下进行铀染和铅染。该染色方法可以隔绝空气与染液的接触，可以有效的防止尘埃和铅的污染。但是，该染色方法制备得到的切片在电镜下观察结构不够清晰，而且反差较弱，不利于电镜观察。
阎玲等发表了一篇题目为“自制电镜超薄切片染色盒及染色方法”的论文，该论文公开了一种自制电镜超薄切片染色盒，其是将LKB载片盒的底部及活动性盒盖相应部位打2mm小洞，在盒盖上方配以有机玻璃操作手柄制备而得。该染色方法是把载有超薄切片的铜网按编号顺序装入染色盒，染色盒底部放蜡板，然后加入饱和醋酸双氧铀染液，冲洗后，再加入柠檬酸铅染色。该自制超薄切片染色盒一次可同时染数十个铜网，而且可以有效的减少污染。但是，该染色方法的染色切片数量仍不能满足现代实验室的要求，需多次染色才能达到目的，然而多次染色会增加污染，同时也加重环境负担。
张丽芳等发表了一篇题目为“透射电镜超薄切片染色铅污染的补救方法”的论文，该论文提出了应用稀硝酸清除铅污染的方法，该方法是用稀硝酸溶液中的氢离子与碳酸铅的碳酸根离子发生化学反应，产生完全溶于水的碳酸和硝酸铅，从而可以将切片上的碳酸铅沉淀清除干净，可以有效的改善铅污染现象。但是，该方法中的稀硝酸的浓度难以控制，浓度过高时，清除铅污染的同时细胞结构反差亦不同程度减弱，甚至出现切片破碎、脱落的现象；而浓度过低，消除污染的效果差，不利于电镜观察。
发明内容
为了解决现有技术中电镜超薄切片染色法存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种电镜超薄切片的真空染色法，以解决以上缺陷。
本发明提供了一种电镜超薄切片的真空染色法，包括以下步骤：
S1将捞有切片的铜网按编号顺序装载80-100枚在染色硅胶板上，得染色板；
S2将步骤S1制备得到的染色板放置在培养皿中，并将培养皿放于抽真空保鲜盒内，接着吸取醋酸双氧铀溶液的上清液，放入离心机中离心12-16min，取上清液；将上清液加入染色板上，盖好培养皿盖子，进行抽真空处理，在真空条件下染色30-40min；
S3将步骤S2染色后的醋酸双氧铀溶液回收，将染色板放在架子上，接着用双蒸水冲洗，甩干，干燥10-15min，得染色板I；
S4将步骤S3制备得到的染色板I放置于装有氢氧化钠的抽真空保鲜盒内，接着用注射器将柠檬酸铅溶液加入染色板I上，进行抽真空处理，在真空条件下染色8-16min后，将染色板I放在架子上，接着用双蒸水冲洗，甩干，干燥10-15min，即得。
进一步地，所述步骤S2中的醋酸双氧铀溶液的制备方法为：
将4g醋酸双氧铀粉末溶于100ml体积浓度为68％的甲醇中，搅拌溶解，用铝箔纸密封避光4℃冰箱保存。
进一步地，所述步骤S2中离心机的转速为6000r/min。
进一步地，所述步骤S2和步骤S4中的抽真空处理的真空度为30-40kpa。
进一步地，所述步骤S2和步骤S4中的抽真空处理的真空度为32-36kpa
进一步地，所述步骤S2和步骤S4中的抽真空处理的真空度为34.31kpa。
进一步地，所述步骤S3和步骤S4中的干燥方式为：红外烤灯或在50-60℃的烤箱干燥。
本发明提供的电镜超薄切片的真空染色法步骤S1中的装载要求是：根据铜网大小在染色硅胶板用刀片划隙以插入捞有切片的铜网，注意隙的间隙必须以铜网大小为参考，否则会造成浪费染液或冲洗不干净，并且不能压弯铜网，否者会影响染色及电镜观察效果。所述步骤S2中醋酸双氧铀溶液的上清液到染色板上时，注意要把铜网两面都覆盖住，而且在进行抽真空处理时，最好再盖一个毛巾或不透光的纸，避光染色，若是染色效果不佳，必要时可延长染色时间或升温至38-48℃进行染色。另外，所述步骤S3和步骤S4使用双蒸水冲洗时不要直接正对铜网冲水，否则易造成掉片或褶皱。
本发明提供的电镜超薄切片的真空染色法可以有效的隔绝空气中CO2与柠檬酸铅的接触，防止空气中CO2与铅盐反应生成碳酸铅沉淀从而污染切片，影响电镜观察。同时，使用本发明提供的电镜超薄切片的真空染色法制备得到的切片干净、无污染，而且结构清晰，反差效果好，更有利于超微结构的研究。
进一步地，本发明提供的采用一定真空度的电镜超薄切片的真空染色法可以根据技术人员的需求，延长染色时间或缩短染色时间，不会增加切片的污染，降低染色效果，符合更高要求的电镜切片要求，是一种适用性广，染色效果好的电镜染色切片。然而，真空度低于或高于30-40kpa，则会造成钢网上产生较多气泡而影响染色，严重影响染色效果。
本发明提供的电镜超薄切片的真空染色法可以大批量的进行超薄切片的染色，同时保证效果，而且每次染色的染液用量少，染液可回收，染色时间短，可以节约染色液，减少污染环节，保证切片染色质量，大大提高了电镜超薄切片的染色效率。同时，抽真空保鲜盒中的氢氧化钠染色完后可继续抽真空存放于真空盒中，由于存放于真空中，氢氧化钠持续重复使用，降低试剂成本。
与现有技术相比，本发明提供的电镜超薄切片的真空染色法具有以下优点：
(1)本发明提供的电镜超薄切片的真空染色法制备得到的切片干净、无污染，而且结构清晰，反差效果好，有利于切片的电镜观察；
(2)本发明提供的电镜超薄切片的真空染色法能大批量的进行超薄切片的染色，而且成本低，利于该真空染色法的推广和使用。
附图说明
图1和图2是在透射电镜800倍的视野下观察到的电镜图；
图3和图4是在透射电镜5000倍的视野下观察到的电镜图；
图5和图6是在透射电镜2000倍的视野下观察到的电镜图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。本发明使用的抽真空盒为常规市售产品，购于AIRSEE凯立信公司，型号是JS-ZKH-A1～JS-ZKH-B5。
实施例1、一种电镜超薄切片的真空染色法
S1将捞有切片的铜网按编号顺序装载80枚在染色硅胶板上，得染色板；
S2将步骤S1制备得到的染色板放置在培养皿中，并将培养皿放于抽真空保鲜盒内，接着吸取醋酸双氧铀溶液的上清液，所述醋酸双氧铀溶液是将4g醋酸双氧铀粉末溶于100ml体积浓度为68％的甲醇中搅拌溶解制得；在转速为6000r/min的离心机中离心12min，取上清液；将上清液加入染色板上，盖好培养皿盖子，进行抽真空处理，所述真空度为30.41kpa，在真空条件下染色30min；
S3将步骤S2染色后的醋酸双氧铀溶液回收，将染色板放在架子上，接着用双蒸水冲洗，甩干，在50℃的烤箱干燥15min，得染色板I；
S4将步骤S3制备得到的染色板I放置于装有氢氧化钠的抽真空保鲜盒内，接着用注射器将柠檬酸铅溶液加入染色板I上，进行抽真空处理，所述真空度为30.41kpa，在真空条件下染色10min后，将染色板I放在架子上，接着用双蒸水冲洗，甩干，在50℃的烤箱干燥15min，即得。
实施例2、一种电镜超薄切片的真空染色法
S1将捞有切片的铜网按编号顺序装载90枚在染色硅胶板上，得染色板；
S2将步骤S1制备得到的染色板放置在培养皿中，并将培养皿放于抽真空保鲜盒内，接着吸取醋酸双氧铀溶液的上清液，所述醋酸双氧铀溶液是将4g醋酸双氧铀粉末溶于100ml体积浓度为68％的甲醇中搅拌溶解制得；在转速为6000r/min的离心机中离心14min，取上清液；将上清液加入染色板上，盖好培养皿盖子，进行抽真空处理，所述真空度为34.31kpa，在真空条件下染色30min；
S3将步骤S2染色后的醋酸双氧铀溶液回收，将染色板放在架子上，接着用双蒸水冲洗，甩干，在55℃的烤箱干燥12min，得染色板I；
S4将步骤S3制备得到的染色板I放置于装有氢氧化钠的抽真空保鲜盒内，接着用注射器将柠檬酸铅溶液加入染色板I上，进行抽真空处理，所述真空度为34.31kpa，在真空条件下染色12min后，将染色板I放在架子上，接着用双蒸水冲洗，甩干，在55℃的烤箱干燥12min，即得。
实施例3、一种电镜超薄切片的真空染色法
S1将捞有切片的铜网按编号顺序装载100枚在染色硅胶板上，得染色板；
S2将步骤S1制备得到的染色板放置在培养皿中，并将培养皿放于抽真空保鲜盒内，接着吸取醋酸双氧铀溶液的上清液，所述醋酸双氧铀溶液是将4g醋酸双氧铀粉末溶于100ml体积浓度为68％的甲醇中搅拌溶解制得；在转速为6000r/min的离心机中离心16min，取上清液；将上清液加入染色板上，盖好培养皿盖子，进行抽真空处理，所述真空度为39.21kpa，在真空条件下染色30min；
S3将步骤S2染色后的醋酸双氧铀溶液回收，将染色板放在架子上，接着用双蒸水冲洗，甩干，在60℃的烤箱干燥10min，得染色板I；
S4将步骤S3制备得到的染色板I放置于装有氢氧化钠的抽真空保鲜盒内，接着用注射器将柠檬酸铅溶液加入染色板I上，进行抽真空处理，所述真空度为39.21kpa，在真空条件下染色16min后，将染色板I放在架子上，接着用双蒸水冲洗，甩干，在60℃的烤箱干燥10min，即得。
对比例1、一种电镜超薄切片的真空染色法
其制备方法的不同：所述步骤S2中的醋酸双氧铀溶液是将4g醋酸双氧铀粉末溶于100ml体积浓度为70％的甲醇中搅拌溶解制得；其余步骤如实施例2类似。
对比例2、一种电镜超薄切片的真空染色法
其制备方法的不同：所述步骤S2中的醋酸双氧铀溶液是将4g醋酸双氧铀粉末溶于100ml体积浓度为70％的乙醇中搅拌溶解制得；其余步骤如实施例2类似。
对比例3、一种电镜超薄切片的真空染色法
其制备方法的不同：所述步骤S2和步骤S4的抽真空处理的的真空度为29kpa，其余步骤如实施例2类似。
对比例4、一种电镜超薄切片的真空染色法
其制备方法的不同：所述步骤S2和步骤S4的抽真空处理的的真空度为41kpa，其余步骤如实施例2类似。
试验例一、电镜染色切片检测试验
1、试验方法：采用实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4的电镜超薄切片的真空染色法进行染色，将染色好的切片放在同一电镜下观察切片的染色情况，所述电镜为日本电子厂家出产的透射电镜，型号：JEM-1400。
2、试验结果：
试验结果如表1所示。
表1电镜染色切片检测试验
| 组别 | 在透射电镜2000倍的视野下观察到的电镜图 |
| 实施例1 | 切片干净、无污染，结构清晰，反差效果好，无气泡。 |
| 实施例2 | 切片干净、无污染，结构清晰，反差效果好，无气泡。 |
| 实施例3 | 切片干净、无污染，结构清晰，反差效果好，无气泡。 |
| 对比例1 | 切片干净、无污染，结构不够清晰，反差效果好，无气泡。 |
| 对比例2 | 切片干净、无污染，结构不够清晰，反差效果一般，无气泡。 |
| 对比例3 | 切片干净、无污染，结构模糊，反差效果一般，有小气泡。 |
| 对比例4 | 切片干净、无污染，结构模糊，反差效果一般，气泡加多。 |
由表1可知，采用本发明实施例1-3的电镜超薄切片的真空染色法染色的电镜超薄切片干净、无污染，结构清晰，反差效果好，无气泡，更有利于细胞超微结构的研究。而采用对比例1-4的电镜超薄切片的真空染色法染色的电镜超薄切片效果较差，不利于电镜的观察，说明本发明提供的电镜超薄切片的真空染色法是一种较为理想的电镜染色方法。
试验例二、肾活检样品电镜超薄切片检测试验
1、试验方法：
将同一肾活检样品，由同一个人切片，捞取两张铜网，用同一配置的染液进行分别进行常规染色法和真空染色法，染色时长相同，然后在同一电镜同一条件下进行电镜图像的采集。其中：常规染色法是在常温常压下进行的醋酸双氧铀-柠檬酸铅染色，而真空染色法是采用实施例2的电镜超薄切片的真空染色法。
2、试验结果：
试验结果如图1-图6所示，其中图1和图2是在透射电镜800倍的视野下观察到的电镜图，图1为常规染色法的电镜图，切片部分有污染现象，图2为真空染色法的电镜图，整张切片干净、无污染；图3和图4是在透射电镜5000倍的视野下观察到的电镜图，图3为常规染色法的电镜图，切片结构稍欠清晰，反差较弱，图4为真空染色法的电镜图，切片结构清晰，反差较好；图5和图6是在透射电镜2000倍的视野下观察到的电镜图，图5为常规染色法的电镜图，切片结构稍欠清晰，反差较弱，图6为真空染色法的电镜图，切片结构清晰，反差较好。由图1-图6可知，使用常规染色的染色的超薄切片存在污染现象，而且结构不清晰，而本发明提供的真空染色法染色的超薄切片干净、无污染，而且结构清晰，反差效果好，有利于切片的电镜观察。
Claims (5)
1.一种电镜超薄切片的真空染色法，其特征在于，包括以下步骤：
S1将捞有切片的铜网按编号顺序装载80-100枚在染色硅胶板上，得染色板；
S2将步骤S1制备得到的染色板放置在培养皿中，并将培养皿放于抽真空保鲜盒内，接着吸取醋酸双氧铀溶液的上清液，放入离心机中离心12-16min，取上清液；将上清液加入染色板上，盖好培养皿盖子，进行抽真空处理，在真空度为30-40kpa条件下染色30-40min；所述醋酸双氧铀溶液是将4g醋酸双氧铀粉末溶于100ml体积浓度为68％的甲醇中搅拌溶解制得；
S3将步骤S2染色后的醋酸双氧铀溶液回收，将染色板放在架子上，接着用双蒸水冲洗，甩干，干燥10-15min，得染色板I；
S4将步骤S3制备得到的染色板I放置于装有氢氧化钠的抽真空保鲜盒内，接着用注射器将柠檬酸铅溶液加入染色板I上，进行抽真空处理，在真空度为30-40kpa的条件下染色8-16min后，将染色板I放在架子上，接着用双蒸水冲洗，甩干，干燥10-15min，即得。
2.如权利要求1所述的电镜超薄切片的真空染色法，其特征在于，所述步骤S2中离心机的转速为6000r/min。
3.如权利要求1所述的电镜超薄切片的真空染色法，其特征在于，所述步骤S2和步骤S4中的抽真空处理的真空度为32-36kpa。
4.如权利要求3所述的电镜超薄切片的真空染色法，其特征在于，所述步骤S2和步骤S4中的抽真空处理的真空度为34.31kpa。
5.如权利要求1所述的电镜超薄切片的真空染色法，其特征在于，所述步骤S3和步骤S4中的干燥方式为：红外烤灯或在50-60℃的烤箱干燥。
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