CN112414828A

CN112414828A - 一种类器官组织病理预包埋方法

Info

Publication number: CN112414828A
Application number: CN202011125916.1A
Authority: CN
Inventors: 陈世兴; 李刚; 朱宇
Original assignee: Accurate International Biotechnology Guangzhou Co ltd
Current assignee: Accurate International Biotechnology Guangzhou Co ltd
Priority date: 2020-10-20
Filing date: 2020-10-20
Publication date: 2021-02-26

Abstract

本发明提供一种类器官组织病理预包埋方法。其中，所涉及的类器官组织病理预包埋试剂包括以下终浓度的组分：琼脂糖10‑30mg/mL；蒸馏水40v％‑60v％；丙三醇40v％‑60v％。对类器官的包埋方法包括：将裸露的类器官固定后加入上述试剂混匀，得到凝胶混合物；将凝胶混合物于2‑8℃冷却至其充分凝固；将凝固后的混合物进行脱水及透明处理；之后进行浸蜡及石蜡包埋处理。本发明设计的类器官组织病理预包埋试剂及采用其的包埋方法可以很好的解决现有类器官包埋过程的技术难点，不但可以很好地保证类器官的完整性，而且在包埋过程中可以延长凝胶的使用时间，并且便于类器官的观察和利于后期的石蜡包埋操作。

Description

一种类器官组织病理预包埋方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种类器官组织病理预包埋方法。

背景技术

类器官是利用干细胞体外3D培育而成的培养物，不但具有和来源组织高度一致的遗传特征和组织结构，能够增殖传代，并实现部分器官功能。类器官技术是生命科学领域的重大突破。类器官拥有三维结构，多种细胞按照和体内一致的空间构象有序排列，形成和来源组织的组织结构和病理特征。类器官能更好的用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态。

类器官组织病理学分析是类器官研究不可或缺的技术，对于鉴定类器官来源，检测分子标志物表达，分析类器官对治疗的反应具有重要意义。但由于类器官体积小，培养体系复杂，制作病理切片难度较大。目前，可以用于类器官病理切片的制作，多少采用直接包埋、细胞蜡块专用试剂盒及一般琼脂包埋法。但这几种方法或多或少都存在以下一些问题：细胞涂片法的制备虽操作简单、耗时短，但是只能满足一次实验需求、以及在实验过程中易对类器官的外观形态造成破坏。直接包埋是指将类器官直接放入包埋纸，进行脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋等一系列步骤，该方法处理步骤少，但是对类器官数量和体积要求极高、处理过程损耗多以及极易对类器官造成破坏。细胞蜡块专用试剂盒成本高、操作步骤繁琐，同时对类器官也易造成损坏。一般琼脂包埋法则存在在加入琼脂过程中因温度原因极易凝固、脱水时易收缩、琼脂含水量高导致脱水时间过长等问题。此外，上述几种方法还存在成本高(培养类器官成本、试剂成本)、操作繁琐、样本来源珍贵的问题，故多用于样本量较多的单细胞以及可以多次取样的样本，并且到目前为止这几种方法仍然不能满足类器官的鉴定需求，在类器官鉴定领域尚无推广应用。

类器官培养是一门涉及面广而又复杂、细致的技术。在从取材、培养到观察、鉴定等一系列过程中，它包含有组织学、病理学、生物化学、微生物学、细胞和分子生物学以及遗传学等方面的技术因素。为了验证培养的类器官来源于对应脏器，其中病理鉴定是类器官必不可少的一部分，那么鉴定质量的好坏直接决定着所培养的类器官最后的方向，最终能够直接影响到前期培养方案，重复实验造成的时间成本、实验成本等。类器官预包埋对类器官的外观结构、细胞内容和细胞排列层次等都能得到完整的保留。

目前类器官应用过程中一般都会先进行包埋处理，目前常用的就是类器官石蜡切片方法，但这种方法对技术人员自身操作技术水平要求较高，且需要利用专门的仪器设备。而如果参考普通组织包埋方法，普通组织包埋一般最小能包买大小约0.1cm左右的组织，由于类器官的体积是微米级别的以及组成单一(类器官由单一的细胞组成)，而组织组成具有多样性(一般组织由结缔组织、肌肉和细胞组成)，处理时不易损坏。如类器官也采用和组织一样的处理方法，则会导致类器官不易收集、处理时不能保证类器官外观形态的完整性、处理过程中会造成类器官过多的丢失。故想要保证类器官在处理的完整性，就不能参考组织的处理方法。因此，亟需寻找一种新的处理方法来解决类器官应用过程的首要包埋问题。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提供一种类器官组织病理预包埋方法。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种类器官组织病理预包埋试剂，包括以下终浓度的组分：琼脂糖10-30mg/mL；蒸馏水40v％-60v％；丙三醇40v％-60v％。

进一步地，所述试剂还包括染料2～5mg/mL。

优选地，所述染料为伊红、苏木素、台盼蓝中的一种。

第二个方面，本发明提供上述类器官组织病理预包埋试剂的制备方法，包括：将所述预包埋试剂的各成分配料后混匀，加热溶解，冷却至室温即得。

第三个方面，本发明提供一种类器官组织病理预包埋方法，包括：

将裸露的类器官固定后加入上述预包埋试剂混匀，得到凝胶混合物；

将凝胶混合物于2-8℃冷却至其充分凝固；

将凝固后的混合物进行脱水及透明处理；

之后进行浸蜡及石蜡包埋处理。

进一步地，获得裸露的类器官的方法为：将类器官从其培养液中取出，加入细胞回收液后于2-8℃消化1-2h，然后于1000～1200rpm离心3～4min，保留沉淀。

进一步地，所述脱水处理是将凝胶混合物依次采用75％乙醇1次、85％乙醇1次、95％乙醇2次、无水乙醇2次分别脱水20～60min。

进一步地，所述透明处理是将脱水处理后的混合物依次采用二甲苯2次分别透明15-30min。

进一步地，所述浸蜡处理是将透明处理后的混合物依次采用石蜡2次分别浸蜡20min～40min，然后再次石蜡浸蜡至少40min。

本发明的有益效果是：

现有对类器官包埋的技术难点在于：保证类器官的完整性和一定的数量是类器官石蜡包埋的关键，并且还要保证类器官在处理过程中不易受到外界因素的损坏、处理过程中把类器官的损失降到最低，以及不会因时间关系而受到相应试剂的影响。本发明设计的用于类器官病理预包埋的试剂及采用其的包埋方法可以很好的解决这些技术难点，不但可以很好地保证类器官的完整性，而且在包埋过程中可以延长凝胶的使用时间，并且便于类器官的观察和利于后期的石蜡包埋操作。

附图说明

图1为本发明实施例1肠癌类器官病理切片结果。

图2为本发明实施例2正常肝类器官病理切片结果。

图3为本发明实施例3小鼠胰腺类器官病理切片结果。

图4为本发明对比例1肠癌类器官病理切片结果。

图5为本发明对比例2正常肝类器官病理切片结果。

图6为本发明对比例3小鼠胰腺类器官类器官病理切片结果。

图7为本发明实施例1中第9个步骤示意图。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

本实施例提供一种肠癌类器官病理预包埋方法，采用的包埋试剂为：琼脂糖20mg/ml；蒸馏水40v％；丙三醇60％，伊红3mg/mL，预包埋方法包括：

1)从装有类器官胶滴的培养皿吸出培养基，加入约2-3ml的cell recoverysolution；

2-8℃消化1-2h使类器官从胶滴中脱落；

2)将培养皿内的类器官转移到1.5mlEP管内；

3)1200rpm离心3min，弃上清；

4)用4％的甲醛2-3ml固定类器官15-30min；

5)1200rpm离心3min，弃去4％甲醛；

6)将琼脂糖、蒸馏水、丙三醇和伊红混合均匀，置于微波炉内约30S，加热溶解琼脂糖即得到琼脂凝胶。

7)加入150ul冷却至室温的琼脂凝胶于装有类器官沉淀的1.5mlEP管内，用枪头轻轻搅动琼脂凝胶与类器官混匀；

8)2-8℃冷却约20-60min，待琼脂凝胶充分凝固；

9)将1.5ml EP管倒置，用刀片从1.5ml EP管尖部轻轻切入，琼脂块自然脱离离心管，得到约2-3cm的琼脂块，将琼脂块对半切成两块放入脱水盒(本步骤示意图如图7所示)；

10)分别于75％乙醇1次、85％乙醇1次、95％乙醇2次、无水乙醇2次分别脱水20min；

11)将脱水处理后的混合物依次采用二甲苯2次分别透明20min；

12)将透明处理后的混合物依次采用石蜡2次分别浸蜡20min，然后再次石蜡浸蜡40min；

13)按常规操作石蜡包埋。

本实施例获得的预包埋类器官的结构形态图如图1所示，可以看出，所获得的类器官实心状，量多且相对集中，染色均匀，核浆对比分明，外观形状完整，背景清晰。

实施例2

本实施例提供一种正常肝类器官病理预包埋方法，采用的包埋试剂为：琼脂糖10mg/ml；蒸馏水50％；丙三醇50％，苏木精2mg/mL，预包埋方法同实施例1。

本实施例获得的预包埋类器官的结构形态图如图2所示，可以看出，所获得的类器官呈空泡状，量多且相对集中，染色均匀，核浆对比分明，外观形状完整，背景清晰。

实施例3

本实施例提供一种小鼠胰腺类器官病理预包埋方法，采用的包埋试剂为：琼脂糖30mg/ml；蒸馏水60％；丙三醇40％，台盼蓝5mg/mL，预包埋方法同实施例1。

本实施例获得的预包埋类器官的结构形态图如图3所示，可以看出，所获得的类器官呈环状，量多且相对集中，染色均匀，核浆对比分明，外观形状完整，背景清晰。

对比例1

采用和实施例1同一类器官，预包埋方法采用现有石蜡切片包埋方法。

本对比例获得的类器官结构形态图如图4所示，可以看出，所获得的类器官破碎并散在分布，无完整类器官，背景着色深。

对比例2

采用和实施例2同一类器官，预包埋方法采用现有石蜡切片包埋方法。

本对比例获得的现有石蜡切片包埋方法获得的类器官结构形态图如图5所示，可以看出，所获得的类器官量少，扭曲变形断裂，部分背景着色。

对比例3

采用和实施例3同一类器官，预包埋方法采用现有石蜡切片包埋方法。

本对比例获得的现有石蜡切片包埋方法获得的类器官结构形态图如图6所示，可以看出，所获得的类器官量少、着色较深，部分破碎成条状，背景着色。

对比例4

本对比例和实施例1的区别在于：将丙三醇换成丙二醇。所获得的预包埋类器官结构性能与实施例1区别不大，但在后续对包埋类器官的应用过程中发现：随着使用次数的增多和时间的延长，琼脂凝胶慢慢变得浓稠甚至凝固，移液枪不易吸出。根据以上结果得知丙三醇的保湿能力优于丙二醇。

对比例5

本对比例和实施例1的区别在于：未加入丙三醇。结果：在进行类器官病理预包埋的过程中，凝胶混合物冷却至室温时迅速凝固；而实施例1的琼脂凝胶可保持液体状态至少10min以上，可以确保在类器官进行包埋过程中不会发生快速凝固而使得包埋不均匀或是类器官受损。

对比例6

本对比例和实施例1的区别在于：将透明所用的二甲苯替换成环保透明剂。结果：将琼脂块放入环保透明剂中，无论时间长短，琼脂块始终呈白色不透明状(如进入琼脂块内部则呈无色透明状)，说明环保透明剂无法穿透琼脂块替换出内部的无水乙醇，再重新放入二甲苯，则琼脂块迅速剧烈收缩数十倍；而实施例1的二甲苯则可以进入琼脂块内部替换出无水乙醇。

综上，本发明的特点如下：

1)本发明方法胶滴消化方法温和，可最大程度的维持类器官的完整性。

2)本发明方法在进行类器官包埋的过程中，室温下凝胶试剂不容易蒸干，可延长琼脂凝胶的使用时间，并且缩短了后续的脱水时间。

3)本发明方法在进行类器官包埋的过程中便于类器官的观察，利于类器官的石蜡包埋操作，因琼脂凝胶经脱水透明后呈透明状而类器官形态微小，类器官轻微着色后便于包埋与后续的切片操作。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种类器官组织病理预包埋试剂，其特征在于：包括以下终浓度的组分：琼脂糖10-30mg/mL；蒸馏水40v％-60v％；丙三醇40v％-60v％。

2.根据权利要求1所述的一种类器官组织病理预包埋试剂，其特征在于：所述试剂还包括染料2～5mg/mL。

3.根据权利要求2所述的一种类器官组织病理预包埋试剂，其特征在于：所述染料为伊红、苏木素、台盼蓝中的一种。

4.权利要求1～3任意一项所述的一种类器官组织病理预包埋试剂的制备方法，其特征在于：包括：将所述预包埋试剂的各成分配料后混匀，加热溶解，冷却至室温即得。

5.一种类器官组织病理预包埋方法，其特征在于：包括：

将裸露的类器官固定后加入权利要求1～3任意一项所述的试剂混匀，得到凝胶混合物；

将凝胶混合物于2-8℃冷却至其充分凝固；

将凝固后的混合物进行脱水及透明处理；

之后进行浸蜡及石蜡包埋处理。

6.根据权利要求5所述的一种类器官组织病理预包埋方法，其特征在于：获得裸露的类器官的方法为：将类器官从其培养液中取出，加入细胞回收液后于2-8℃消化1-2h，然后于1000～1200rpm离心3～4min，保留沉淀。

7.根据权利要求5所述的一种类器官组织病理预包埋方法，其特征在于：所述脱水处理是将凝胶混合物依次采用75％乙醇1次、85％乙醇1次、95％乙醇2次、无水乙醇2次分别脱水20～60min。

8.根据权利要求5所述的一种类器官组织病理预包埋方法，其特征在于：所述透明处理是将脱水处理后的混合物依次采用二甲苯2次分别透明15-30min。

9.根据权利要求5所述的一种类器官组织病理预包埋方法，其特征在于：所述浸蜡处理是将透明处理后的混合物依次采用石蜡2次分别浸蜡20min～40min，然后再次石蜡浸蜡至少40min。