CN106198170A - 一种生物组织包埋剂及包埋方法 - Google Patents

一种生物组织包埋剂及包埋方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生物组织包埋剂及其包埋方法。所述包埋剂包括A、B两个组分；所述A组分包括按重量份计，60至80份的环氧乙烯基树脂、10至20份的二甲基丙烯酸酯和0至10份的脂肪族二胺；所述B组分包括按重量份计，少于或等于10份的开环引发剂，还包括少于或等于10份的偶氮类引发剂和少于或等于10份的低温引发剂中的至少一种；所述A组分和B组分的重量配比在90:10至999:1之间。所述包埋方法应用所述包埋剂包埋。本发明包埋硬度高，透光率高，收缩率小，方法简单易操作，聚合温度低，内源性荧光蛋白和外源性荧光染料的荧光保持效果好，包埋成功率高。

Description

一种生物组织包埋剂及包埋方法
技术领域
本发明属于生物成像领域，更具体地，涉及一种生物组织包埋剂及包埋方法。
背景技术
包埋是将生物组织固定的物理过程，极大程度的影响了生物组织的成像效果。包埋剂的固定效果直接决定了生物样本的成像质量。市场上销售的包埋剂都是由英国、美国和德国进口的产品，单价超过6000元/500mL，有的超过8000元/500mL。环氧树脂型号较多，常见的有Shell Chemical公司生产的Epon 812以及替代产品EMbed 812和TED PELLA公司生产的Spurr树脂，这些产品作为环氧树脂包埋剂的代表，占据了较大的市场份额。德国Heraeus Kulzer研制的Technovit系列甲基丙烯酸酸酯树脂(如T7100、T8100、T9100)和德国AIRTEC公司研发的HM系列丙烯酸酯(如HM20、HM23)作为生物组织学包埋树脂的杰出代表，市场上占有率较高。
国内对高分子树脂作为生物组织包埋剂虽有研究，但是还没有形成产业化，目前国内所用的包埋剂，基本来源于国外进口。这种局面造成国内的树脂包埋剂市场出现经常性的缺货断货、价格居高不下等问题。因此，研发一种高分子树脂作为生物组织包埋剂，可以填补国内在塑性包埋剂领域的空白，打破国外在塑性生物组织包埋剂领域的垄断。
生物组织的填充型包埋剂主要有两大类：一类为环氧树脂与酸酐在叔胺的催化下引发聚合，环氧树脂作为包埋剂有着收缩率小、较好的保持细胞原始形貌以及较好的保持神经精细结构等优点，但是也不可避免的存在一些缺点诸如聚合温度高、自发荧光背景高、单体毒性大、在生物组织中渗透不均匀以及包埋程序复杂等；另一类为丙烯酸酯类树脂在偶氮类引发剂或者是过氧化物类引发剂的引发下进行聚合，丙烯酸酯树脂作为包埋剂有着聚合温度低、自发荧光背景低、单体毒性小、包埋工艺简单易操作等优点，但是也不可避免的存在着一些缺点诸如聚合后收缩率高、生物组织变形大以及保持神经精细结构较差等。其它的包裹型包埋剂诸如明胶、琼脂糖以及石蜡等也有一定范围的应用，但是也因其各自不可避免的缺陷从而限制其应用范围。
目前亟需一种包埋工艺简单、单体毒性小、背景荧光低、细节保留多的包埋剂及包埋方法，提高生物荧光成像质量。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种反应型交联生物组织包埋剂及包埋方法，其目的在于提供一种包埋工艺简单、单体毒性小、背景荧光低、细节保留多的包埋剂及包埋方法，由此解决生物组织荧光成像质量不高的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种生物组织包埋剂，包括A、B两个组分；
所述A组分包括按重量份计，60至80份的环氧乙烯基树脂、10至20份的二甲基丙烯酸酯和0至10份的脂肪族二胺；
所述B组分包括按重量份计，少于或等于10份的开环引发剂，还包括少于或等于10份的偶氮类引发剂和少于或等于10份的低温引发剂中的至少一种；
所述A组分和B组分的重量配比在90:10至999:1之间。
优选地，所述生物组织包埋剂，其所述开环引发剂为过氧开环引发剂为苯酚及其衍生物、三苯基膦和/或有机酸；所述苯酚及其衍生物优选为苯酚和2,4,6-三(二甲氨基甲基)苯酚；所述有机酸优选为乙酸、丙酸、丁二酸以及苯甲酸。
优选地，所述生物组织包埋剂，其所述开环引发剂为有机酸；优选地，所述有机酸为乙酸、丙酸、丁二酸以及苯甲酸；更优选地，所述有机酸为乙酸。
优选地，所述生物组织包埋剂，其所述环氧乙烯基树脂为脂肪族环氧乙烯基树脂。
优选地，所述生物组织包埋剂，其所述二甲基丙烯酸酯为含醚键的脂肪族二甲基丙烯酸酯。
优选地，所述生物组织包埋剂，其所述脂肪族二胺为C2-8脂肪族二胺衍生物。
按照本发明的另一个方面提供了一种生物组织包埋方法，其使用如权利要求1至6任意一项所述的包埋剂包埋生物组织。
优选地，所述物组织包埋方法，其包括以下步骤：
(1)生物组织预处理：将生物组织进行固定和脱水处理，得到预处理后的生物组织样本；
(2)渗透：将步骤(1)中获得的预处理后的生物组织在非引发温度下浸泡在所述包埋剂A组分和B组分的混合物中，使得所述包埋剂充分渗透所述生物组织，获得渗透后的生物组织；
(3)固化：将步骤(2)中获得的渗透后的生物组织在引发温度下固化。
优选地，所述物组织包埋方法，其所述包埋剂中B组分的引发剂为偶氮类引发剂；
步骤(2)所述非引发温度为-10℃至4℃；
步骤(3)所述引发温度为35℃至42℃，固化时间12小时至36小时。
优选地，所述物组织包埋方法，其所述步骤(3)具体为：
在引发温度35℃下固化8小时，然后在引发温度38℃下固化8小时，最后在引发温度42℃下固化16小时。
优选地，所述物组织包埋方法，其所述包埋剂中B组分的引发剂为低温引发剂；
步骤(2)所述非引发温度为-30℃至-20℃；
步骤(3)所述引发温度为-10℃至4℃，固化时间12小时至36小时。
本发明的有益效果是：采用本发明的反应型交联生物组织的包埋剂，其自发荧光背景低、透光率高、包埋工艺简单、树脂收缩率低且能较好的保持神经精细结构，兼具环氧树脂和丙烯酸酯树脂的优点，适用生物组织的塑性包埋，成功率高，特别适用于大体积样本及鼠脑全脑的包埋切削成像。
附图说明
图1是实施例1包埋的生物组织mCherry红色荧光蛋白电镜照片；
图2是实施例2包埋的生物组织GFP绿色荧光蛋白电镜照片；
图3是实施例3包埋的生物组织Avidin染色Alexa 488荧光染料电镜照片；
图4是实施例4包埋的生物组织DsRed红色荧光蛋白和GFP绿色荧光蛋白双色标记的电镜照片；
图5是实施例5包埋的生物组织GFP绿色荧光蛋白电镜照片；
图6是实施例6包埋的生物组织小清蛋白免疫组化Alexa 488荧光染料电镜照片；
图7是HM23树脂包埋的FITC免疫组化的电镜照片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的生物组织包埋剂，包括A、B两个组分；
所述A组分包括按重量份计，60至80份的环氧乙烯基树脂、10至20份的二甲基丙烯酸酯和0至10份的脂肪族二胺；
所述B组分包括按重量份计，少于或等于10份的开环引发剂，还包括少于或等于10份的偶氮类引发剂和少于或等于10份的低温引发剂中的至少一种；
所述A组分和B组分的重量配比在90:10至99:1之间。
所述环氧乙烯基树脂为脂肪族直链环氧乙烯基树脂；优选所述脂肪族直链环氧乙烯基树脂可以为环氧丁烯、烯丙基缩水甘油醚、1,2-环氧基-5-己烯、丙烯酸缩水甘油酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯中的一种或任意几种的混合物；更优选地，所述脂肪族直链环氧乙烯基树脂为烯丙基缩水甘油醚、丙烯酸缩水甘油酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯中的一种或任意几种的混合物。其中，所述脂肪族直链环氧乙烯基树脂以甲基丙烯酸缩水甘油酯效果最佳。所述脂肪族直链环氧乙烯基树脂单元的质量百分数小于树脂体系总质量的80％。优选地，所述脂肪族直链环氧乙烯基树脂小于或者等于树脂体系总质量的75％。
树脂的种类和配比将影响包埋块的背景荧光，本发明提供的包埋剂优选方案背景荧光弱，有利于高清成像。
所述二甲基丙烯酸酯为含醚键的脂肪族二甲基丙烯酸酯，所述含醚键的脂肪族二甲基丙烯酸酯的质量百分比小于或者等于聚合体系总质量的20％，使得包埋剂具有娇小的体积收缩率，保证被包埋的生物组织样本变形程度在高清成像可接受的范围内。
所述脂肪族二胺为C2-8脂肪族二胺衍生物。所述脂肪族二胺优选为C2-6脂肪族二胺衍生物。优选地，所述C2-8脂肪族二胺为乙二胺、1,3丙二胺、1,4-丁二胺、1,5-戊二胺、N,N'-双(3-氨基丙基)-1,4-丁二胺、二乙烯三胺和三乙烯四胺中的一种或任意几种的混合物。优选地，所述C2-8脂肪族二胺为丁二胺、戊二胺、二乙烯三胺和N,N'-双(3-氨基丙基)-1,4-丁二胺中的一种或任意几种的混合物。更优选地，所述C2-8脂肪族二胺为二乙烯三胺。所述脂肪族二胺和环氧乙烯基树脂的侧链反应，增大疏水性能，更合适化学层析成像。
所述偶氮类引发剂为油溶性偶氮类引发剂。优选地，所述油溶性引发剂包括含氰基的偶氮类引发剂和不含氰基的偶氮类引发剂。所述的含氰基的偶氮类引发剂包括偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈和偶氮二异戊腈。所述的不含氰基的偶氮类引发剂包括偶氮二异丁酸二甲酯和偶氮二咪唑啉基丙烷。更优选的，所述的油溶性偶氮类引发剂为不含氰基的偶氮二咪唑啉基丙烷。
所述过过氧化物类/苯胺类低温引发剂为油溶性过氧化物类引发剂，所述油溶性过氧化物类引发剂为油溶性酰类过氧化物引发剂。所述的油溶性酰类过氧化物引发剂包括过氧化苯甲酰和过氧化月桂酰。更优选的，所述油溶性酰类过氧化物引发剂为过氧化月桂酰。
所述的苯胺类引发剂包括二甲基苯胺和N,N,3,5-四甲基苯胺。优选的，所述的苯胺类引发剂为N,N,3,5-四甲基苯胺。
所述开环引发剂包括苯酚及其衍生物、三苯基膦和有机酸，所述苯酚及其衍生物为苯酚和2,4,6-三(二甲氨基甲基)苯酚。所述有机酸包括乙酸、丙酸、丁二酸及苯甲酸。优选的，所述开环引发剂为有机酸。更优选的，所述的开环引发剂为乙酸。
引发剂的选择影响着包埋时的聚合温度和荧光强度，本发明提供的包埋剂可在常温或者低温下引发，保证荧光蛋白活性从而保证荧光强度。本发明提供的包埋剂中含有开欢迎发髻，与生物组织的胺基反应，能大量保留生物组织的成像细节，成像效果有着突破性的提高。
本发明提供的生物组织包埋剂为反应型交联生物组织包埋剂，包埋剂的侧链分子环氧官能团可以与生物组织中的胺基发生反应进行交联，使得包埋树脂与生物组织结合更加紧密，且其硬度高，透光率高，收缩率小，包埋方法简单易操作，聚合温度低，内源性荧光蛋白和外源性荧光染料的荧光保持效果好，包埋成功率高，适用于生物组织片及大样本的包埋，尤其适用于自动切削系统和荧光显微镜联用技术的大样本自动化逐层成像。
包埋剂与生物组织反应原理如下：
本发明提供的生物组织包埋方法，采用本发明提供的包埋剂包埋生物组织，包括以下步骤：
(1)生物组织预处理：将生物组织进行固定和脱水处理，得到预处理后的生物组织样本；
(2)渗透：将步骤(1)中获得的预处理后的生物组织在非引发温度下浸泡在所述包埋剂A组分和B组分的混合物中，使得所述包埋剂充分渗透所述生物组织，获得渗透后的生物组织；
(3)固化：将步骤(2)中获得的渗透后的生物组织在引发温度下固化。
当所述包埋剂中B组分的引发剂为偶氮类引发剂时：
步骤(2)所述非引发温度为-10℃至4℃；
步骤(3)所述引发温度为35℃至42℃，固化时间12小时至36小时，具体为：
在引发温度35℃下固化8小时，然后在引发温度38℃下固化8小时，最后在引发温度42℃下固化16小时。
当所述包埋剂中B组分的引发剂为低温引发剂时：
步骤(2)所述非引发温度为-30℃至-20℃；
步骤(3)所述引发温度为-10℃至4℃，固化时间12小时至36小时。
采用本发明的反应型交联生物组织的包埋剂，其自发荧光背景低、透光率高、包埋工艺简单、树脂收缩率低且能较好的保持神经精细结构，兼具环氧树脂和丙烯酸酯树脂的优点，适用生物组织的塑性包埋，成功率高，特别适用于大体积样本及鼠脑全脑的包埋切削成像。
以下为实施例：
实施例1至3
一种生物组织的包埋剂的两种包埋方法，为中低温固化包埋方法，包括以下步骤：
(1)生物组织预处理：首先，将鼠脑灌流后取出置于4％的多聚甲醛(PFA)中后固定24小时；然后，采用乙醇/蒸馏水溶液在4℃环境中按照梯度进行脱水，50％乙醇/2小时+75％乙醇/2小时+95乙醇/2小时+100％乙醇/2小时+100％乙醇24小时+二甲苯/12小时；
(2)渗透：包埋剂如表1所示，将上述环氧树脂单体及偶氮类引发剂混合后用氮气在一定的流速下进行鼓吹30分钟，将混合好的树脂单体贮存在-30℃的冰箱中备用；然后将脱水后的鼠脑置于混合好的树脂单体中2小时再换液置换3天
(3)固化：最后将渗透好的鼠脑置于胶囊中并加入混合好的树脂单体后在真空烘箱内静置10分钟，将其按照表1所示的固化条件进行固化，待其缓慢降至室温冷却后即可进行成像处理。
结果如图1至3所示。
实施例4至6
一种生物组织的包埋剂的两种包埋方法，为低温固化包埋方法，包括以下步骤：
(1)生物组织预处理：首先，将鼠脑灌流后取出置于4％的多聚甲醛(PFA)中后固定24小时；然后，采用乙醇/蒸馏水溶液在4℃环境中按照梯度进行脱水，50％乙醇/2小时+75％乙醇/2小时+95乙醇/2小时+100％乙醇/2小时+100％乙醇24小时+二甲苯/12小时；
(2)渗透：包埋剂如表1所示，将上述单体及过氧化物类引发剂混合后用氮气在一定的流速下进行鼓吹30分钟，将混合好的树脂单体贮存在-30℃的冰箱中备用；然后将脱水后的鼠脑置于混合好的树脂单体中2小时再换液置换3天；
(3)固化：最后将渗透好的鼠脑置于胶囊中并加入适量混合好的树脂单体，并加入0.2％的苯胺类引发剂，混合均匀后在真空烘箱内静置10分钟，将其按照表1所示的固化条件进行固化，包埋剂固化完后即可进行成像处理。
结果如图4至6所示。
表1
注：实施例4,5,6中，N,N,3,5-四甲基苯胺在聚合包埋前加入混合。
通过本发明的反应型交联生物组织的包埋剂及其包埋方法制备的包埋样品，其包埋树脂的自发荧光强度一般为160～400，优选为160～200；包埋树脂的邵氏硬度(Shore D)一般为60～80，优选为65～75；包埋树脂的热膨胀系数为一般为40～100ppm/K，优选为40～60ppm/K；包埋树脂的玻璃化转变温度(Tg)一般为100℃～120℃，优选为100℃～110℃。
按以下方法将实施例1-6制得的样品和现有的商业化包埋剂HM23树脂进行了各项性能的对比测试：
邵氏硬度测试:
根据ASTM D2240-05标准测试。样品：直径0.5cm，高1.0cm圆柱体。仪器：Shore D硬度计；
自发荧光测试：
样品：将树脂聚合成直径1cm，高1.5cm圆柱，采用金刚石刀切平后进行成像。仪器：德国Zeiss双飞秒激光器多光子显微镜。测试条件：Laser488nm,4％；pinhole 32；gainmaster 550；像素1024×1024，16bit；成像深度60微米，×20W。
热膨胀系数测试:
样品：直径0.5cm，高0.5cm圆柱体。仪器：TA Instruments-Waters LIC TMA。测试条件：升温速率5℃/min，压缩模式；加载频率：1Hz；温度范围，室温～180℃。
玻璃化转变温度测试：
样品：直径0.5cm，高0.5cm圆柱体。仪器：PerkinElmer Instruments DiamondDMA。测试条件：升温速率5℃/min，压缩模式；加载频率：1Hz；温度范围，室温～180℃。
包埋鼠脑后的荧光显微镜测试：
样品：将转基因小鼠或者是免疫组化的鼠脑按照上述流程进行包埋成直径1cm，高1.5cm圆柱，采用金刚石刀切平后进行成像。仪器：德国Zeiss双飞秒激光器多光子显微镜。测试条件：视样品具体情况而定。
表2为实施例1～6制得的样品与商业化丙烯酸酯包埋树脂HM23的性能对比测试结果。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生物组织包埋剂，其特征在于，包括A、B两个组分；
所述A组分包括按重量份计，60至80份的环氧乙烯基树脂、10至20份的二甲基丙烯酸酯和0至10份的脂肪族二胺；
所述B组分包括按重量份计，少于或等于10份的开环引发剂，还包括少于或等于10份的偶氮类引发剂和少于或等于10份的低温引发剂中的至少一种；
所述A组分和B组分的重量配比在90:10至999:1之间。
2.如权利要求1所述的生物组织包埋剂，其特征在于，所述开环引发剂为过氧开环引发剂为苯酚及其衍生物、三苯基膦和/或有机酸；所述苯酚及其衍生物优选为苯酚和2,4,6-三(二甲氨基甲基)苯酚；所述有机酸优选为乙酸、丙酸、丁二酸以及苯甲酸。
3.如权利要求2所述的生物组织包埋剂，其特征在于，所述开环引发剂为有机酸；优选地，所述有机酸为乙酸、丙酸、丁二酸以及苯甲酸；更优选地，所述有机酸为乙酸。
4.如权利要求1所述的生物包埋剂，其特征在于，所述环氧乙烯基树脂为脂肪族环氧乙烯基树脂。
5.如权利要求1所述的生物包埋剂，其特征在于，所述二甲基丙烯酸酯为含醚键的脂肪族二甲基丙烯酸酯。
6.如权利要求1所述的生物包埋剂，其特征在于，所述脂肪族二胺为C2-8脂肪族二胺衍生物。
7.一种生物组织包埋方法，其特征在于，使用如权利要求1至6任意一项所述的包埋剂包埋生物组织。
8.如权利要求7所述的生物组织包埋方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)生物组织预处理：将生物组织进行固定和脱水处理，得到预处理后的生物组织样本；
(2)渗透：将步骤(1)中获得的预处理后的生物组织在非引发温度下浸泡在所述包埋剂A组分和B组分的混合物中，使得所述包埋剂充分渗透所述生物组织，获得渗透后的生物组织；
(3)固化：将步骤(2)中获得的渗透后的生物组织在引发温度下固化。
9.如权利要求8所属的生物组织包埋方法，其特征在于，所述包埋剂中B组分的引发剂为偶氮类引发剂；
步骤(2)所述非引发温度为-10℃至4℃；
步骤(3)所述引发温度为35℃至42℃，固化时间12小时至36小时。
10.如权利要求8所属的生物组织包埋方法，其特征在于，所述包埋剂中B组分的引发剂为低温引发剂；
步骤(2)所述非引发温度为-30℃至-20℃；
步骤(3)所述引发温度为-10℃至4℃，固化时间12小时至36小时。
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