CN102967499A - 一种细胞核dna染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞核DNA染色方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1固定：将标本片依次放入温度为30℃～40℃的BS固定液中固定20～30min，漂洗；步骤2水解：固定好的标本片，在温度为30℃～40℃的5N盐酸中水解20～30min，漂洗；步骤3染色：水解好后，在30℃～40℃的Thionin染液中染色30～40min，漂洗；步骤4封片：染色完后，采用快递梯度乙醇脱水、封片。综上所述，与其它Feulgen染色方法相比，本发明的技术方案在实用性、稳定性、效率、节省费用、可重复性以及和自动化设备的兼容性等方面均具有明显的优势，可满足临床DNA定量细胞学快速诊断的要求。
Description
技术领域
本发明涉及生物细胞、组织染色技术领域,特别涉及一种适用于DNA定量细胞学的细胞核DNA染色方法。
背景技术
DNA定量细胞学主要通过对细胞核内DNA进行染色，然后运用图像分析系统对细胞核DNA含量进行测定，从而判断细胞的生理状态和病理改变，它与流式细胞术一样，已广泛运用于科研和临床工作中，目前已成为国际上较先进的一种癌症和癌前病变的检查技术。
目前，用于DNA定量细胞学的DNA染色方法主要是传统改良Feulgen法以及快速Feulgen法。传统改良的Feulgen法首先对标本中的细胞进行固定，然后用盐酸对其进行水解，使细胞核DNA双链中的戊糖和嘌呤之间的糖苷键断开，戊糖端形成的醛基可以和Schiff’s试剂（或Thionin染液）发生特异性的结合并产成紫红色（或深蓝色）。通过对该颜色强度的定量检测和细胞定量分析可用于判断该细胞是否发生癌变。因此，在染色过程中，对固定、酸解和染色的条件控制非常关键。在传统改良Feulgen法中，染色全过程均在室温环境下进行，染液配制在26±2℃恒温箱中，整个染色全过程需要耗时接近4个小时。而在后来凌玉琴、龚志锦、夏潮涌等报道过的一些快速Feulgen法中，虽然固定和染色的总时间控制在了2小时以内，但酸解和染色的温度都要求在50～70℃，盐酸水解过于剧烈，盐酸和染液挥发速度很快，试剂只能使用一次，且结果很不稳定，对操作人员的时间控制和温度稳定性的要求极高，盐酸的高挥发和腐蚀性还会对人、设备（包括自动化设备）、环境产生严重的危害，因而这些方法都无法在临床广泛推广，也很难实现自动化操作。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种快速、稳定且极易推广的DNA染色技术，可从根本上解决传统改良Feulgen染色方法时间过长以及快速Feulgen染法染色结果不稳定，及对设备和环境要求高的缺点，而且还可以和自动染色机联合使用，实现染色的高度自动化。
为了达成上述目的，本发明的技术方案是：一种细胞核DNA染色方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1固定：将标本片依次放入温度为30℃～40℃的BS固定液中固定20～30min，漂洗；
步骤2水解：固定好的标本片，在温度为30℃～40℃的4-6N盐酸中水解20～30min，漂洗；
步骤3染色：水解好后，在30℃～40℃的Thionin染液或Schiff试剂中染色30～40min，漂洗；
步骤4封片：染色完后，采用快递梯度乙醇脱水、封片。
进一步，上述的漂洗方法为先用自来水漂洗1～2min，随后再用蒸馏水漂洗5min。
进一步，所述的固定、漂洗、染色步骤都在恒温箱或自动染色机中进行。
进一步，Thionin染液或Schiff试剂的配制过程需要在30℃～40℃恒温箱中进行，其配制用水需要提前预热至30℃～40℃。
进一步，所述的4-6N盐酸可反复使用3-5次，Thionin染液或Schiff试剂可反复使用2-3次。
（注：本发明方法采用的为5N盐酸，其保护范围很小，如果其他浓度也可以达到相同的结果，最好提供一个范围，另外固定液或染色液的品种请确认是否可以提供其他种类的固定液或染色液。）
采用上述方案后，本发明与传统细胞核DNA染色方法相比，具有以下优点：
1) 本发明采用在30℃～40℃条件下进行固定、酸解和染色，能同时减少固定、酸解和染色的时间，其中，固定时间比传统改良Feulgen染色减少了20分钟以上，酸解时间和染色时间均减少了35分钟以上，整体处理时间减少了一半以上，由接近4个小时减少为不到2小时;
2) 本发明方法采用在30℃～40℃恒温箱或自动染色机中进行固定、酸解和染色，染色方法操作简便，细胞核染色效果稳定，标本片背景干净，完全满足DNA定量细胞学的细胞DNA倍体分析的要求；克服了文献报道过的快速Feulgen法温度过高（50～70℃），染色效果极不稳定，一致性和可重复性较差，以及盐酸剧烈挥发对设备、环境条件以及人员带来的危害。此外，如果使用自动染色机，整个过程可全部由机器完成，染色的可重复性和结果的一致性更高；
3) 本发明所使用的Thionin染液可反复使用2-3次，克服了传统改良Feulgen法以及快速Feulgen法中Thionin染液只能用一次的缺点，大大节省了昂贵进口试剂的成本以及配制染液的人力。
综上所述，与其它Feulgen染色方法相比，本发明的技术方案在实用性、稳定性、效率、节省费用、可重复性以及和自动化设备的兼容性等方面均具有明显的优势，可满足临床DNA定量细胞学快速诊断的要求。
附图说明
图1、4、6分别为实施例1、4、6中猪肝细胞涂片经本发明所述方法染色后的显微镜下（20×）细胞核图像。
图2、3、5分别为实施例2、3、5中宫颈液基细胞学标本片经本发明所述方法染色后的显微镜下（20×）细胞核图像。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。
实施例1
将猪肝细胞涂片依次放入BS固定液中固定25min，5N盐酸中水解20min， Thionin染液30min，每步之间均用自来水漂洗2min，随后再用蒸馏水漂洗5min，快速梯度乙醇脱水，封片。BS固定液、5N盐酸和Thionin染液均需先预置于35℃恒温箱，Thionin染液的配制过程也在35℃恒温箱中进行，其配制用水需要提前预热至35℃，BS固定过程、盐酸水解过程以及染色过程均在35℃恒温箱中进行。染色后的猪肝涂片在显微镜下（20×）细胞核图像如图1所示。
实施例2：
将宫颈液基细胞学标本片依次放入BS固定液中固定30min，5N盐酸中水解20min， Thionin染液30min，每步之间均用自来水漂洗2min，随后再用蒸馏水漂洗5min，快速梯度乙醇脱水，封片。BS固定液、5N盐酸和Thionin染液均需先预置于40℃恒温箱，Thionin染液的配制过程也在40℃恒温箱中进行，其配制用水需要提前预热至40℃，BS固定过程、盐酸水解过程以及染色过程均在40℃恒温箱中进行。染色后的宫颈液基细胞学标本片在显微镜下（20×）细胞核图像如图2所示。
实施例3
将宫颈液基细胞学标本片依次放入BS固定液中固定30min，5N盐酸中水解25min， Thionin染液40min，每步之间均用自来水漂洗2min，随后再用蒸馏水漂洗5min，快速梯度乙醇脱水，封片。BS固定液、5N盐酸和Thionin染液均需先预置于35℃自动染色机，Thionin染液的配制过程也在35℃自动染色机中进行，其配制用水需要提前预热至35℃，BS固定过程、盐酸水解过程以及染色过程均在35℃自动染色机中进行。染色后的宫颈液基细胞学标本片在显微镜下（20×）细胞核图像如图3所示。
实施例4
将猪肝细胞涂片依次放入BS固定液中固定25min，5N盐酸中水解30min， Schiff试剂染色40min，每步之间均用自来水漂洗2min，随后再用蒸馏水漂洗5min，快速梯度乙醇脱水，封片。BS固定液、5N盐酸和Schiff试剂均需先预置于30℃恒温箱，Schiff试剂的配制过程也在30℃恒温箱中进行，其配制用水需要提前预热至30℃，BS固定过程、盐酸水解过程以及染色过程均在30℃恒温箱中进行。染色后的猪肝细胞涂片在显微镜下（20×）细胞核图像如图4所示。
实施例5
将宫颈液基细胞学标本片依次放入BS固定液中固定25min，4N盐酸中水解30min， Thionin染液35min，每步之间均用自来水漂洗2min，随后再用蒸馏水漂洗5min，快速梯度乙醇脱水，封片。BS固定液、4N盐酸和Thionin染液均需先预置于40℃恒温箱，Thionin染液的配制过程也在40℃恒温箱中进行，其配制用水需要提前预热至40℃，BS固定过程、盐酸水解过程以及染色过程均在40℃恒温箱中进行。染色后的宫颈液基细胞学标本片在显微镜下（20×）细胞核图像如图5所示。
实施例6
将猪肝细胞涂片依次放入BS固定液中固定25min，6N盐酸中水解20min， Schiff试剂染色40min，每步之间均用自来水漂洗2min，随后再用蒸馏水漂洗5min，快速梯度乙醇脱水，封片。BS固定液、6N盐酸和Schiff试剂均需先预置于35℃恒温箱，Schiff试剂的配制过程也在35℃恒温箱中进行，其配制用水需要提前预热至35℃，BS固定过程、盐酸水解过程以及染色过程均在35℃恒温箱中进行。染色后的猪肝细胞涂片在显微镜下（20×）细胞核图像如图6所示。
尽管结合优选实施方案具体展示和介绍了本发明，但所属领域的技术人员应该明白，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内，在形式上和细节上对本发明做出各种变化，均为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种细胞核DNA染色方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1固定：将标本片依次放入温度为30℃～40℃的BS固定液中固定20～30min，漂洗；
步骤2水解：固定好的标本片，在温度为30℃～40℃的4-6N盐酸中水解20～30min，漂洗；
步骤3染色：水解好后，在30℃～40℃的Thionin染液或Schiff试剂中染色30～40min，漂洗；
步骤4封片：染色完后，采用快递梯度乙醇脱水、封片。
2.根据权利要求1所述的一种细胞核DNA染色方法，其特征在于：所述的漂洗的方法为先用自来水漂洗1～2min，随后再用蒸馏水漂洗5min。
3.根据权利要求1所述的一种细胞核DNA染色方法，其特征在于：所述的固定、漂洗、染色步骤在恒温箱或自动染色机中进行。
4.根据权利要求1所述的一种细胞核DNA染色方法，其特征在于：Thionin染液或Schiff试剂的配制过程需要在30℃～40℃恒温箱中进行，其配制用水需要提前预热至30℃～40℃。
5.根据权利要求1所述的一种细胞核DNA染色方法，其特征在于：所述的4-6N盐酸反复使用3-5次，Thionin染液或Schiff试剂反复使用2-3次。
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